Summary
우리는 성인 마우스에서 급성 조각에 단일 코르티코스트 리아 탈 글루타마티터지시냅스에서 글루타메이트 방출과 클리어런스 사이의 균형을 평가하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 글루타메이트 검출을 위해 형광 센서 iGluu, 신호 수집을 위한 sCMOS 카메라 및 초점 레이저 조명장치를 사용합니다.
Abstract
시냅스는 서로 독립적으로 작동하는 고도로 구획화된 기능 단위입니다. 헌팅턴병(HD) 및 기타 신경 퇴행성 질환에서 조미료 통관이 부족하고 유출 및 유출 효과로 인해 이러한 독립성이 손상될 수 있습니다. 시냅스 전 단말 및/또는 수지상 척추의 변경된 성상 세포 적 범위뿐만 아니라 글루타메이트 방출 사이트에서 글루타메이트 수송 클러스터의 감소 된 크기는 이긴장 / 과다 운동 장애의 증상을 초래하는 질병의 발병 기전에 연루되었습니다. 그러나, 헌정판에 있는 글루타마테르지시냅스의 역기능으로 이끌어 내는 기계장치는 잘 이해되지 않습니다. 시냅스 이미징을 개선하고 적용하면 움직임의 개시를 방해하는 메커니즘에 새로운 빛을 발산하는 데이터를 얻었습니다. 여기서, 우리는 새로운 유전자 부호코딩 된 초고속 글루타메이트 센서 iGluu,광시야 광학, 과학 적인 CMOS (sCMOS) 카메라, 473 nm 레이저 및 레이저 포지셔닝 시스템을 사용하여 단일 시냅스 분해능을 달성하기 위해 비교적 저렴한 접근법의 원리 요소를 설명하여 건강한 나이 또는 급성 슬라이스에서 코르티코스타탈 시냅스의 상태를 평가하였다. 글루타메이트 과도제는 활성 영역 및 ii 옆의 글루타메이트 농도[Glu]의 최대 고도에 기초하여 글루타메이트 방출의 추정치를 얻기 위해 단일 또는 다중 픽셀로부터 구성되었고, 글루아메이트 는 회음부[Glu]의 부패(TauD)의 시간 상수에 반영된 바와 같이 글루타메이트 섭취량이다. 휴식 bouton 크기와 단기 가소성의 대조 패턴의 차이는 내뇌 phalic (IT) 또는 피라미드 기관 (PT) 통로에 속하는 코르티코스테리아 말단의 식별을위한 기준으로 봉사했다. 이러한 방법을 사용하여, 우리는 증상 HD 마우스에서 ~ 40% PT 형 코르티코테리아 시냅스의 불충분 한 조미료 클리어런스를 전시 발견, 이러한 시냅스는 흥분 독성 손상에 위험이있을 수 있음을 시사. 결과는 hypokinetic 표현형을 가진 헌팅턴 마우스에 있는 역기능 시냅스의 biomarkers로 TauD의 유용성을 강조합니다.
Introduction
"단일 연결"(즉, 2개의 신경 세포 사이의 연결)에 속하는 각 시냅스 말단의 상대적 영향은 전형적으로 후진성 뉴런1,,2의초기 세그먼트에 미치는 영향에 의해 평가된다. 후성 신경세포로부터의 신체 및/또는 수지상 기록은 가장 흔한 것을 나타내며, 지금까지 가장 생산적인 수단은 하향식 또는 수직 관점 하에서 정보 처리를 명확히 하는수단3,4,,5.4 그러나, 그들의 이산성상체및(설치류에서) 중첩되지 않은 영토의 존재는 시냅스 사이트6,7,7,88,9,,10에서신호 교환, 통합 및 동기화의 국소 메커니즘에 기초한 수평 적 관점에 기여할 수 있다.
아스트로글리아가 노는 것으로 알려져 있기 때문에, 일반적으로, 퇴행성신경질환(11,,12)의 병인에 중요한 역할을 하며, 특히, 글루타마테르시냅스13,14, 15,,15,16의유지 및 가소성에 대한 역할을 하며, 다양한 표적 섬유의 공유 대상 영역에서 성상세포의 상태에 따라 시냅스 성능의 변질이 진화하는 것으로 생각된다., 건강과 질병에 있는 표적/astroglia 파생한 현지 규정 기계장치를 더 탐구하기 위하여는, 개별 적인 시냅스를 평가할 필요가 있습니다. 본 접근법은 기능성 글루타메이트 방출 및 클리어런스 지표의 범위를 추정하고 운동 개시와 가장 밀접한 관련이 있는 뇌 영역에서 기능 장애(또는 복구된) 시냅스를 식별하는 데 사용될 수 있는 기준을 정의하기 위해 노력되었다(즉, 모터 피질 및 등쪽 줄무늬에서 우선).
줄무늬는 본질적인 글루타마테르기뉴런이 부족합니다. 따라서, 엑스트라 스트리아탈 기원의 글루타마테르기성 구심을 식별하는 것은 비교적 쉽습니다. 후자는 주로 내측 시상과 대뇌 피질에서 발생합니다(17,,18,,19,,20 참조). 코르티코스타탈리탈 시냅스는 피질 층에 국한된 피라미드 뉴런의 축색에 의해 형성된다 2/3 과 5. 각각의 축삭은 섬유 계통을 통해 양측 내 말뇌파(IT) 연결 또는 동측 연결을 형성하여 피라미드 관(PT)을 더 많이 구성합니다. 또한 IT-및 PT 형 단말은 방출 특성 및 크기21,,22가다르다는 것이 더 제안되었다. 이러한 데이터를 고려할 때 글루타민산염 처리에 약간의 차이가 있을 수 있습니다.
줄무늬는 헌팅턴병(HD)에서 가장 영향을 받는 뇌영역5이다. 인간 헌 화는 심각한 유전상속 신경 퇴행성 질환이다. Q175 마우스 모델은 파킨슨병과 많은 공통점이 있는 HD의 저운동성 강성 형태의 세포 기반을 조사할 수 있는 기회를 제공합니다. 약 1년의 나이부터, 호모자이고트 Q175 마우스(HOM)는 개방된필드(23)에서운동 없이 소요된 시간을 측정함으로써 밝혀진 바와 같이 저운동증의 징후를 나타낸다. 본 실험에서 헤테로지고테 Q175 마우스(HET)를 사용하여 HOM에서 관찰된 이전 모터 적자를 확인하였고, 또한 관찰된 모터 결핍은 코르티코스테리아시냅스 말단24의바로 부근에서 성상세포성 흥분성 아미노산 수송기 2 단백질(EAAT2)의 감소된 수준을 수반하였다. 따라서 성상 성미 글루타메이트 섭취량의 적자가 각 시냅스의 기능 장애 또는 심지어 손실로 이어질 수 있다고 가설되었습니다25,,26.
여기에서, 우리는 방출된 신경 전달 물질의 양에 대하여 단 하나 시냅스 글루타메이트 정리를 평가할 수 있는 새로운 접근을 기술합니다. 새로운 글루타메이트 센서 iGluu는 코르티코스타탈 피라미드 뉴런으로 발현되었다. 카탈린터뢰크(27)에 의해 개발되었으며 이전에 도입된 높은 친화도이지만 느린 글루타메이트 센서 iGluSnFR28의변형을 나타낸다. 두 센서 모두 향상된 녹색 형광 단백질(EGFP)의 유도체입니다. 스펙트럼 및 운동 특성에 대한 경우 Helassa 등27을참조하십시오. 간단히 말해서, iGluu는 빠른 비활성화 역학을 가진 낮은 친화도 센서이므로 글루타메이트 방출 시냅스 터미널에서 글루타메이트 클리어런스를 연구하는 데 특히 적합합니다. iGluu의 해리 시간 상수는 정지-유동 장치에서 결정되었고, 이는 20°C에서 2.1 ms의 타우오프 값을 렌더링하지만, 34°C27의온도로 추정될 때 0.68 ms를 렌더링하였다. 2-광자 현미경 하에서 organotypic 해마 배양물의 CA1 영역에서 나선형 레이저 스캐닝으로 34°C에서 프로브된 단일 샤퍼 부수적 말단은 2.7 ms의 평균 시간 상수 로 나타내었다.
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Protocol
모든 작업은 동물 실험을 위한 EU 지침 2010/63/EU에 따라 수행되었으며 베를린 보건 보호 및 기술 안전 사무소(G0233/14 및 G0218/17)에 등록되었습니다.
참고 : Q175 와일드 타입 (WT) 및 이종 고트 (HET)의 녹음은 모든 연령과 성별에서 수행 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 51 76 주의 나이에 남성과 여성을 공부했습니다.
1. 코르티코스테리아탈 축산의 발현을 위한 글루타메이트 센서 iGluu의 주입
- 파이펫 풀러(1단계 모드)를 사용하여 바이러스 주입을 위한 보로실리케이트 유리 파이펫을 준비합니다. 당긴 후, 수동으로 파이펫을 부수어 30-50 μm의 팁 직경을 얻습니다.
- 바이러스 AAV9-CaMKIIa.iGluu를저장합니다. WPRE-hGH (7.5 x 1013gc/mL) -80 °C에서 10 μL aliquots. 주사가 바이러스 생산 직후 (6 개월 이내)에 수행되는 경우 5 °C에서 유지하십시오. 수술 전에 바이알을 꺼내 실온에서 유지하십시오.
- 유리 파이펫을 채우고 거품을 제거합니다.
- 87.5 mg/kg 케타민과 12.5 mg/kg 자일라진을 함유한 용액의 복강 내 주사로 동물을 마취시다. 피하 주사 0.25% 부피바카인 (8 mg/kg) 추가 통증 완화를 위해. 근육 톤을 모니터링하고 통증유발 반사작용이 없는 지 관찰하여 마취의 깊이를 확인합니다.
- 머리에 피부를 면도하고 70 % 알코올로 살균. 마우스를 입체 적 프레임에 맞춥습니다.
- 메스를 사용하여 피부를 제거하고 고속 (38,000 rpm) 드릴을 사용하여 모터 피질 위의 뼈에 1.2 mm 구멍을 만듭니다.
- 정밀 조작기의 홀더에 부착된 사출 파이펫으로 주사기를 장착합니다. 4 개의 다른 사이트에서 피질에 수직 지향 피펫을 삽입하십시오. 주사 좌표는, 브레그마(mm)에 대하여: 전방 1.5, 측측 1.56, 1.8, 2.04, 2.28이다. dura mater에 대한 깊이는 (mm): 1.5-1.7입니다.
- 주입 시스템을 사용하여 희석되지 않은 바이러스 용액의 부위당 0.3 μL을 0.05 μL/min의 속도로 주입하십시오. 각 분사 후, 파이펫을 천천히 인출하기 전에 1 분 동안 제자리에 두십시오 (1mm / 분).
- 나일론 봉합사로 수술 상처를 닫아 마무리하십시오.
- 깨끗한 케이지에 있는 가열 패드에 0.5-1시간 동안 마우스를 두고 원래 케이지로 되돌리십시오.
- 급성 뇌 슬라이스를 준비하기 전에 6-8 주 동안 12 시간 주간 밤 주기에 마우스를 유지하십시오.
참고: 세포 손상 및 시 냅 스 손실의 결과로 면역 반응을 피하기 위해, 여러 바이러스 성 구성물의 주입 동시에 또는 내에서 수행 해야 합니다 2-3 기본 주입 후 시간. iGluu 주입에 대한 좌표는 Paxinos 및 프랭클린29 뇌 아틀라스에 따라 선택되었다. 그들은 M1 모터 피질에 해당합니다. 주입된 두뇌의 면역 염색은 ipsi- 및 반대편 줄무늬 및 반대 측 M1 및 S1 코르티석에서 수많은 그러나 주로 잘 고립된 축삭 및 축삭 정맥류를 가시화했습니다.
2. 글루타메이트 센서 iGluu를 표현하는 글루타마테르틱 터미널 검색
- 교정 모드
- sCMOS 카메라와 카메라 제어 소프트웨어를 다음 설정으로 준비합니다. 판독 페이지 세트 픽셀 판독속도: 560MHz (= 가장 빠른 판독), 감도/동적 범위: 비트, 스퓨리어스 노이즈 필터: 예, 중복 판독: 예. 비닝/ROI 페이지에서 전체 화면을 선택합니다.
- 커버 슬립 아래에 5 mg/mL 루시퍼 옐로우(LY)가 들어 있는 유리 슬라이드를 준비합니다.
- LY 슬라이드를 63x 목표 아래에 놓고 레이저 셔터를 열고 픽셀 비닝: 1x1, 트리거 모드: 내부, 노출 시간: 최소 (결정)를 사용하여 직렬 수집을 수행합니다.
- 레이저 전력을 조정하여 직경 4 μm의 형광 지점을 생성합니다(이미지에 포화 픽셀이 포함되어서는 안 됨).
- 레이저 포지셔닝 시스템의 교정을 수행하려면 레이저 포지셔닝 소프트웨어에서 스팟 크기 직경: 10, 스캐닝 속도: 43.200 kHz의 설정을 선택하십시오. 오른쪽 패널에서 이미지 수집 시작 버튼을 클릭합니다. 실행설정 : 0, 지연 실행: 0, 시퀀스 페이지에서 TTL에서 실행 옵션을 선택합니다. 교정 페이지의 교정 버튼을 클릭하고 수집 화면의 왼쪽 상단 모서리에 표시된 지침에 따라 레이저 제어 소프트웨어를 보정합니다.
- 설정이 카메라 및 레이저 제어에 독립적인 소프트웨어를 사용하는 경우 카메라 수집 창에서 스크린샷을 수집하여 XY 좌표를 다시 계산하기 위해 레이저 제어 소프트웨어로 보냅니다. 소프트웨어가 다른 컴퓨터에 설치된 경우 비디오 그래버를 사용하여 이미지를 레이저 제어 소프트웨어로 가져옵니다. 레이저 제어 소프트웨어는 XY 스케일링 계수 및 오프셋에 대한 정보가 필요합니다. 이를 위해 레이저 제어 프로그램의 수집 창 내에서 이미지의 왼쪽 위, 왼쪽 아래 및 오른쪽 아래 모서리의 좌표를 결정합니다. 다음 방정식에 따라 배율 계수를 계산합니다: X 계수 = (X 오른쪽 - X 왼쪽 아래 왼쪽)/ X 오프셋 = X 왼쪽 아래, Y 요인 = (Y 왼쪽 - 왼쪽 아래 왼쪽)/2048, Y 오프셋 = Y 왼쪽 아래 왼쪽.
- 교정 절차가 끝나면 267x460 픽셀의 직사각형 영역(ROI)을 만들고 화면 중앙으로 이동한 다음 시퀀스 시작 버튼을 클릭합니다.
- 다음 카메라 제어 소프트웨어 설정으로 돌아가기: Binning: 2x2, 트리거 모드: 외부 노출, 노출 시간: 최소 (결정).
- 자동형광 보정 모드
참고 : 활성 시냅스 단자의 환경에서 [Glu]의 휴식 수준은 일반적으로 100 nM14,,30,,31,,32,,33,,34이하입니다. 따라서, 글루타민산염의 임의의 센서, 특히 iGluu와 같은 낮은 친화도 센서는 시냅스 글루타메이트 방출이 없는 경우에 다소 희미해질 것이다. 그럼에도 불구하고, 일부 iGluu 형광은 휴식 시에도 검출될 수 있지만, 조직 자가형광과 구별되어야 한다. 473 nm 조명은 iGluu 형광 및 자가형광을 모두 유도합니다(도1A-C). 후자는 파장의 넓은 범위를 차지, iGluu 형광은 480-580 nm로 제한됩니다 동안 (510 nm에서 최대). 자동 형광에 대한 보정은 서로 다른 하이 패스 필터를 가진 두 개의 이미지를 수집한 것을 기반으로 합니다.- 다른 곳에서 설명한 대로 뇌 조각을 미리준비35. 밀기울 슬라이스를 준비하십시오.
- 125 mM NaCl을 포함하는 산소화된 인공 뇌척수액 (ACSF)으로 침수, 기록 챔버로 슬라이스를 전송, 3 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4,25 mM NaHCO3,2 mM CaCl2,1mM MgCl2,10 mM 포도당 (pH 7.3, 303 mOsm/ L), 0.5 mM 나트륨 피루바테, 2.8 mM 나트륨 아스코르바테 및 0.00m. 유량 1-2 mL/min. 28-30 °C에서 목욕 온도를 유지 합니다.
- 20배 의 물 침지 목표 아래에 등쪽 줄무늬를 찾습니다. 백금 하프에 나일론 그리드로 슬라이스를 고정하여 조직 이동을 최소화합니다. 63x/NA 1.0 수몰입 목표로 전환합니다. 473 nm (이색 거울)에서 빛을 반사하고 파장 >510 nm (방출 필터)로 빛을 전달하는 필터를 선택하십시오.
- AD/DA 보드를 사용하여 조명, 자극 및 이미지 수집을 각각의 제어 소프트웨어와 동기화합니다. 레이저 노출 시간 180ms및 160 ms의 이미지 수집 시간으로 수집을 제어하는 트리거 프로그램을 설정하여 레이저 포지셔닝 장치를 사용하여 레이저 빔을 소정의 수의 지점으로 보내고 스캐닝 속도 및 스팟 크기에대한 설정을 정의합니다.
- 510 nm("노란색 이미지")에서 하이 패스 필터를 사용하여 자동 형광 및 iGluu-positive구조의 이미지를 획득합니다.
- 600nm("빨간색 이미지")의 하이패스 필터를 사용하여 자동 형광 만으로 이미지를 획득합니다.
- 빨간색과 노란색 이미지의 배율을 조정하여 가장 밝은 10개 및 가장 어두운 픽셀 10의 평균 강도를 사용하여 범위를 정의합니다. "노란색 에서 빨간색 이미지"를 빼고 빼기 이미지를 다시 조정하여 표준 8비트 tif 파일을 생성하여 관심 있는 부폰의 편리한 시각화를 생성합니다(그림1D). 그것은 iGluu-긍정적 인 구조에서 밝은 픽셀, 배경에서 회색 픽셀과 자동 형광 구조에서 어두운 픽셀이 포함되어 있습니다.
참고: 주어진 장비의 경우 평균 휴식 형광(F)은 700 A.U. 미만이 됩니다.
- 부톤 검색 모드
참고: iGluu-positive픽셀은 축산 나무의 기능적으로 다른 요소(예: 다른 차축 가지, 분기 부위, 소포 고갈 후 의 정맥류 또는 완전히 활성 정맥류)에 속할 수 있습니다. 그러나 육안으로만 기능성 시냅스 터미널을 식별하는 것은 거의 불가능합니다. 따라서, 각 글루타마테르증 시냅스 단자는 전기 탈분극에 대한 반응성에 의한 식별이 필요합니다. 자극에 반응하지 않는 사이트는 폐기해야 합니다. 코르티코스타리아탈 축색으로부터 글루타메이트 방출을 유도하는 생리학적 수단은 작용 전위를 유도하는 것입니다. 이는 적절한 스펙트럼 특성의 채널 로도프신을 사용하거나 iGluu 자체에 의해 시각화된 축색의 전기 자극에 의해 달성될 수 있다. 우발적 인 opsin 활성화를 피하기 위해, 우리는 후자의 approastep을 선호- 마이크로파이펫 풀러(4단계 모드)를 사용하여 보로실리케이트 유리 모세혈관에서 자극 파이펫을 생성합니다. 내부 팁 직경은 약 1 μm이어야 합니다. ACSF로 채워지면 전극 저항은 약 10MΩ이어야 합니다.
- 동일한 축에 부착된 시냅스 부톤 세트에서 글루타민산염의 작용 전위 의존적 방출을 유도하려면 63배 배율, 510 nm 방출 필터 및 감산 된 이미지를 사용하여 형광 정맥류 옆에 유리 자극 전극을 배치하십시오. . 추가 축색의 근접성을 피하십시오.
- 자극기를 켜서 자극 파이펫에 탈분극 전류 펄스를 전달합니다. 전류 강도는 약 2 μA(10 μA 이하)를 사용합니다.
- 한 채널이 표준 목욕 솔루션을 제공하고 다른 채널이 이온 채널, 운송기 또는 멤브레인 수용체의 필요한 차단제를 제공하는 다중 채널 목욕 응용 프로그램 시스템을 켭니다. 기록 부위의 흐름을 제어한 다음 테트로독신(TTX) 채널(욕조 용액+ 1 μM TTX)으로 전환합니다. 2-3 분 후, 다시 관심의 시합을 자극하지만, 지금 행동 잠재적 인 세대의 부재. 방출은 전압에 의존하는 칼슘 채널을 통해 칼슘 유입에 직접 기인합니다.
- 자극기의 강도 키를 돌려 자극 전류를 조정하여 동작 전위를 통해 유도된 것과 유사한 반응을 얻습니다. 전형적으로, 자극 전류는 0.5 ms 탈분극에 대해 약 6 μA일 것이다.
- 준비의 기본 테스트에 대 한, 적용 0.5 mM CdCl2. 이 칼슘 채널 차단제 글루타메이트 방출의 존재는 시냅스 글루타메이트 방출을 완전히 방지하여 직접 유발된 글루타메이트 신호의 칼슘 의존성을 검증한다.
참고: 다음 의 일반적인 권장 사항은 줄무늬에서 단일 시냅스 실험의 성공률을 높이는 데 도움이 될 수 있습니다. 그대로 방출 기계와 글루타마테르지 시냅스 터미널을 선택하려면, 정맥류해야 : (i) 부드러운 스핀들 모양의 모양을 가지고; (ii) 축색 분기와 연관되지 않음; (iii) "노란색 이미지"에 다른 구조보다 밝게; (iv) 섬유 소가 아닌 줄무늬 신경필에 상주; (v) 매우 얇은 축색 지점에 거주; (vi) 슬라이스의 더 깊은 부분에 상주하지 않습니다.
3. 글루타메이트 방출 및 클리어런스 시각화
- 레코딩 모드
참고: 자기형광(단계 2.2)과 관심 의 부폰의 응답성에 대한 몇 가지 초기 테스트(2.3단계)를 빼낸 후 데이터 수집이 시작될 수 있습니다. 단일 축슨 단자로부터 글루타메이트 방출의 전기적 활성화에 대한 반응은 추가 분석 도구를 적용하지 않고도 이미지에서 직접 관찰할 수있다(그림 2). 그러나, 시냅스 성능의 몇 가지 기본 지표를 즉시 추출하는 것이 매우 편리하다는 것이 입증되었다(그림3). 이 정보는 특정 말단 유형의 선택, HD 관련 변경의 신속한 평가, 수퍼퓨전 시스템에 적용될 임상시험 또는 약물의 수 및 빈도와 같은 후속 실험 과정에 대한 결정을 내리는 데 필요합니다. 또한 결국 나타나는 아티팩트를 처리해야 할 수도 있습니다. 먼저 데이터 기록의 표준 설정에 대해 설명합니다.- 현미경 XY 드라이브를 사용하여 테스트된 iGluu-positivebouton을 뷰필드 센터 가까이에 놓습니다. 중단 수집 단추를 사용하면 이미지 수집을 중지합니다. 마지막으로 획득한 사진에서 왼쪽 마우스 버튼을 클릭하여 휴식 부톤 센터의 XY 위치를 결정합니다. 설정 커서의 XY 좌표는 수집 창의 아래쪽 상태 패널에 표시됩니다.
- 교정 데이터(단계 2.1.6)를 사용하여 iGluu 형광의 여기를 위해 레이저 빔을 전송해야 하는 부위의 좌표를 계산합니다. 다음 방정식을 사용: X 레이저 = X 카메라 * X 계수 + X 오프셋, Y 레이저 = Y 오프셋 – Y 카메라 * Y 계수. 이 재계산을 수행하는 동안 카메라의 수직 또는 수평 플립 설정에 주의하십시오.
- 계산된 좌표를 사용하여 레이저 제어 소프트웨어에서 원포인트 시퀀스를 생성합니다. 이를 위해 레이저 제어 소프트웨어의 시퀀스 페이지에서 시퀀스 추가 상자에서 점을 선택합니다. 레이저 펄스 시간 동안 발병을 유발하는 지연에 대해 10 μs와 180 ms를 선택합니다. 계산된 좌표로 마우스를 이동하고 왼쪽 버튼을 클릭합니다.
- 레이저 제어 소프트웨어에서 다음 설정을 선택합니다: 실행: 0, 실행 지연: 0, 시퀀스: TTL에서 실행. 그런 다음 시퀀스 시작을 클릭합니다.
- 카메라 제어 소프트웨어에서 다음 설정을 선택: Binning/ROI 페이지에서 이미지 영역설정 : 사용자 정의, 픽셀 비닝: 2x2, 높이: 20, 너비 : 20, 왼쪽: 휴식 iGluu-포지티브 스팟 마이너스 10 px, 하단의 Kinetic Series LengthY 좌표 : 휴식 iGluu-positive 스팟 마이너스 10 px, 획득 모드 : Kine 시리즈 : Kine 시리즈 0 Exposure Time 0.0003744s(최소 값). 이러한 설정을 사용하면 획득 속도가 2.48 kHz가 됩니다.
- 트리거 모드 : 외부를선택합니다. 카메라 제어 소프트웨어에서 신호 찍기를 클릭합니다. 트리거 장치에 대해 마련된 실험 프로토콜을 시작합니다.
- 다음 타임 라인과 실험 프로토콜 시험을 구현: 0 ms – 시작 시험, 1 ms – 시작 레이저 조명, 20 ms – 카메라와 이미지 수집을 시작, 70 ms – 전기 자극을 시작 1, 120 – 전기 자극을 시작 2, 181 ms – 최종 시험 (레이저 및 카메라 끄기). 따라서 한 번의 시험에서 카메라는 2.48 kHz의 주파수로 400 프레임을 얻습니다. 2.3.3 단계 및 2.3.5 단계를 참조하십시오. 전기 자극에 대한 자세한 내용은
- 시냅스 소포 풀을 충분히 복구하려면 0.1Hz 이하의 반복 빈도로 프로토콜 평가판을 적용합니다.
- 병리학 적인 시냅스의 확인을 위한 글루타메이트 방출 및 정리의 글루타메이트 일시적이고 신속한 평가의 오프라인 건설
- 평가 루틴을 켭니다. 여기서는 사내 서면 소프트웨어 SynBout v. 3.2를 사용합니다. (저자: 안톤 드보르자크). 다음 단계는 그림 2의비디오에서와 같이 상승된 iGluu 형광을 가진 픽셀에서 ΔF/F 과도를 생성하는 데 필요합니다.
- bouton 크기를 결정하려면 자극이 시작되기 전에 휴식 시 ROI 형광 강도(F)의 평균 및 표준 편차(SD)를 계산합니다. F>평균 + 3 SD(그림3A)로픽셀단위로 점유된 영역을 결정하고 상자에 넣었다. 수임문수 영역의 원형 형태를 가정하여 가상 직경(μm)을 결정합니다.
- 최대 강도 값과 F. 플롯의 차이로 ΔF를 결정하고 시간에 대해 자극 전류와 ΔF/F를 플로팅합니다(그림3B). 나머지 에서 ΔF/F의 SD를 계산합니다(자극이 시작되기 전) 및 "피크 진폭"을 계산합니다. 최대 진폭이 3SD 이상인 픽셀을 사용하여 피크에서 감쇠에 대한 단일 엑스포니언트 피팅을 수행합니다. ΔF/F의 부패 타우D 시간 상수를 결정합니다.
- 지정된 시냅스에서 "최대 진폭"을 추정하려면 가장 높은 ΔF/F 값을 가진 픽셀을 선택합니다. 전형적으로 휴식부폰 iGluu 형광의 경계 안 또는 옆에 위치한다. "최대 진폭"은 단일 시냅스의 클리어런스 기계에 제시된 글루타메이트 하중의 가장 좋은 지표가 될 것입니다.
- iGluu 신호의 공간 확장을 추정하려면 결합된 모든 수임계 픽셀 영역의 지름을 결정하여 가상 원을 형성합니다. 각 직경을 "스프레드"라고 합니다. 용어 "피크 스프레드"는 평균 스프레드 과도의 피크 값을나타냅니다(그림 3C,점선 간의 차이).
- 가능한 아티팩트에 대한 수정
주: 전기 탈분극은 파이펫 내 용액의 외부 흐름과 관련이 있습니다. 이것은 작은 조직 변위 귀착될 수 있습니다. iGluu의 자극 유발 변화와 이미지의 초점이 벗어난 이동을 구별하기 위해 다음 접근 방식을 사용하여 변위 아티팩트를 식별하고 제거할 수있습니다(그림 4).- 변위 징후가 있는 ROI에서 파생된 수퍼임계값 픽셀의 공간특성을 분석합니다(그림 4F-H).
- 휴지시 부통의 처음 결정된 경계 밖에서 픽셀을 찾습니다(그림4F-H,빨간색 박스).
- 결국 기존의 음수 픽셀 강도 값을 식별합니다(그림4I, J). 사전 자극 평균 ±3 SD보다 큰 진폭을 가진 음의 방향의 ΔF/F는 아티팩트로 간주되어야 하며 레코드를 폐기해야 합니다.
- 초점이 다른 아티팩트를 피하려면 자극 전극을 시냅스 부통의 앞쪽 측면에 놓고, 양면 전기 자극을 사용하고 자극 강도/지속 시간을 최소화하십시오.
참고: 초점이 벗어난 아티팩트는 카메라에서 파생될 수도 있습니다. 후자가 현미경에 최적으로 고정되지 않으면 카메라 냉각 시스템의 작은 진동으로 인해 진동이 발생할 수 있습니다. 이러한 진동은 50Hz의 주파수로 회전하는 ΔF/F 이미지에서 "음과 양" 패턴을 생성합니다. 진동은 형광 신호에서 수학적으로 빼을 수 있지만 측정의 최종 품질은 기록 시간에 따라 크게 달라집니다. - 진동이 없는지 카메라를 현미경으로 고정합니다. 후자가 남아 있으면 카메라와 현미경 어댑터 사이에 고무 개스킷을 놓습니다.
참고: 관심 시 냅 스 주위 striatal neuropil iGluu를 표현 하지 않는 글루타마테르g성 varicosities 포함 하 고 따라서 보이지 않는 남아 있는 가능성을 무시할 수 없다. 그들의 공동 활성화의 경우 (TTX의 부재에서 가능성이 높음) 관심의 boutons에서 얻은 과도는 유출 오버에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 초점이 맞않은 iGluu-express터미널도 마찬가지입니다. 이 경우 특징적인 현상은 형광 과도가 훨씬 넓은 영역에서 유래한다는 것입니다. 이 응답은 TTX에 의해 제거되기 때문에 부당한 다중 섬유 활성화에 의해 유도된 비특이적 반응으로 해석할 수 있습니다. - 이 비특이적 다중 섬유 반응을 수정하려면 그림 5에설명된 절차를 따르십시오. 뷰필드 경계에서 픽셀의 형광 신호를 사용합니다. 배경 반응을 최소화하려면 자극 강도와 지속 시간을 최소화하거나 TTX를 사용합니다.
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Representative Results
코르티코스트리아탈 글루타마테르균 성 정맥류의 두 가지 유형의 식별
IT 및 PT 구심체는 각각 2/3 및 5층에서 발생하며, 동측 및 반대측(IT 단말만 해당) 줄무늬에서 차등 파급 효과 및 종료 패턴을 나타낸다. 아직도 거의 운동의 개시 동안 관찰 된 반복적 인 활성화 조건 하에서 글루타메이트 방출 및 클리어런스의 특성에 대해 알려져 있지만, 각각의 글루타메이트 방출 정맥류가 크기22에서다르다는 것이 잘 문서화되어 있다. 크기 기준을 적용하면 IT 및 PT 단말이 단기가소성(24)의대조적인 형태를 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 50ms의 자극 간격으로, 더 작은 IT 단말은 쌍펄스 불경기 (PPD)에 경향이 있었고 더 큰 PT 단말은 쌍펄스 촉진을 보여주었습니다. 이 차이는 또한 더 짧은 간격 (20 ms)에서 그리고 6 펄스의 시리즈를 통해 관찰되었다. 도 3 및 도 6은 시냅스 글루타메이트 방출이 생리적Ca2+/Mg2+2+ 농도에서 작용 전위 메커니즘을 통해 유도된 이러한 실험을 도시한다.
고급 헌팅턴병이 있는 마우스의 기능 장애 시냅스 식별
알츠하이머병, 파킨슨병 및 헌팅턴병과 같은 퇴행성 신경질환은 글루타마테르지시냅스(36)의 적36진행을 특징으로 한다. 새로운 치료는 이 치명적인 진행을 방해하거나 심지어 되돌리는 것을 목표로 합니다. 정확히 시냅스의 실종을 트리거 무엇, 언제, 크게 알 수없는. 추가 통찰력은 (a) 글루타마테르지시냅스의 특정 부류의 중요한 식별 및 (b) 일반적으로 수행 접촉대 기능 장애의 검출에 대한 기준을 제공하는 연구에서 기대할 수 있습니다. 여기서 PT형 단말으로부터 얻어진 TauD 값이 확인된 모터 표현형을 이용한 Q175 이종 시냅스의 분율을 추정하는 데 어떻게 사용되었는지 를 보여 줄 것이다.
단 하나 시냅스 화상 진찰 실험의 앞에, 마우스는 그들의 탐구적인 행동에 있는 변경을 위한 급속한 그러나 오히려 강력한 시험에 제출되었습니다. 이 테스트를 "단계별 테스트"라고 합니다. 동물은 페트리 접시의 중심에 배치되었다 (의 185mm 직경 과 28mm 벽 높이). 테스트는 비디오 카메라로 기록되었습니다. 오프라인 분석을 사용하여 실험자의 손을 떼는 시간과 동물이 접시에서 4 피트 를 모두 가지고있는 순간 사이의 시간을 결정할 수 있습니다. 12 개월에서 18 개월 사이의 나이에 100 WT 및 Q175 HET 이상의 데이터를 플로팅하면 >300s의 스텝 오버 대기 시간을 가진 마우스가 저동생으로 진단 될 수 있음을 시사합니다. 도 7A는 오픈 필드에서 실행된 전체 경로에 대해 얻어진 결과와 스텝오버 레이턴시 간의 유의한 양성 상관관계를 나타낸다.
단일 시냅스 iGluu 이미징은 이러한 증상 HD 마우스가 단일(또는 서열에서 최초) 자극으로부터 TauD 값에 반영됨에 따라 병착성 글루타메이트 붕괴의 속도에서 적자를 나타내었다는 것을 보여주었다(도7B,C). WT에서, 이러한 연장은 글루타메이트 섭취량의 선택적 비운반 성 억제제의 적용 후에만 관찰되었다―DL-스레오-β-벤실록시아스파산산(TBOA, 도 7threoD,E). 이것은 시냅스 글루타메이트 클리어런스의 규정에 있는 성상 세포 성 글루타메이트 수송기의 역할을 건의합니다. perisynaptic 공간에서 글루의 확산의 변화는 발견되지 않았습니다24. 그러나, 물론, 실제로 헌 티 야 식에서 둔화 조미료 클리어런스뿐만 아니라 파킨슨 병의 다른 형태의 원인을 식별하기 위해 훨씬 더 많은 작업이 필요합니다. 성상 세포근접(9)의 변화 및 감소된 slc1A2 발현(37)의 변화외에도, 하나뿐만 아니라 perisynaptic 성상 세포체 과정(PAPs)의 혈장 막에서 EAAT2의 질병 관련 불안정성을 고려할 수 있다.37 이는 EAAT2 상호 작용의 변경으로 인한 결과일 수 있습니다. 실제로, 실험실에서 최근 질량 분광 실험은 Striatal 성상 세포에서 EAAT2-디스트로핀 상호 작용의 손실을 가리킵니다 (히르슈베르크, 드보르자크, 키르히너, 메르틴및 그랜틴, 미공개).
헌HD의 진행과 시 냅 스 기능 장애의 타임 라인에 관한 거의 알려져 있다, 하지만 그것은 매우 가능성이 건강 한 시 냅 스 이미 장애인된 것 들과 공존. 분류 기준을 검색할 때 다른 마우스의 TauD 데이터를 조사했습니다. 이를 위해, 3개의 연속된 쌍예의 진폭 및 TauD 값은 첫 번째 반응으로 정규화되었고(실험 계획에 대한 도 6F 참조), 주어진 TauD 값의 발생 확률은 연령일치 WT와 Q175 HET(그림6G)에비교되었다. WT TauD에서 15 ms를 초과하지 않은 것으로 나타났으며, 증상 Q175 HET에서 시냅스의 40 %는 방출 된 글루타민산염의 양이 감소하는 경향에도 불구하고 16 및 58 ms 사이의 TauD 값을 나타냈다(그림 6H,I). TauD는 HD에서 기능 장애 시냅스를 위한 바이오마커로 간주될 수 있으며, 성상 세포성 글루타메이트 수송을 대상으로 하는 실험에서 기능적 회복을 검증하는 데 더 사용될 수 있습니다.
그림 1: iGluu-양성정맥류의 식별. (A)510 nm 하이 패스 필터("노란색 이미지")로 얻은 형광 이미지. (B)600 nm 하이 패스 필터 ("빨간색 이미지")로 획득 한 동일한 보기 필드. 검은 색 화살촉으로 표시된 스팟이 (B)에서 사라졌다는 점에 유의하십시오. (A) 및 (B)의 오버레이. 흰색 화살표 = 자동 형광, 검은 색 화살표 = iGluu-양성 정맥류. (D)(A)에서 (B)를 빼서 얻은 이미지. 자동 형광 반점은 어둡고 iGluu+ 반점은 밝습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 슬로우 모션 비디오에서 여전히 동영상(감속 계수 1240x). 위쪽 행: WT(왼쪽), Q175 HET(가운데) 및 HOM(오른쪽)의 이미지입니다. 아래쪽 행: 글루타메이트 고도가 가장 높은 픽셀에서 각 iGluu 과도(최대 ΔF/F). 빨간색 커서는 추적 위의 이미지에 해당하는 과도의 점을 나타냅니다. iGluu 형광의 장기간 상승 (빨간색 픽셀 및 ΔF / F 과도)을 주의하십시오. Dvorzhak외. 24의허가를 받아 수정 및재인쇄하여 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 코르티코테리아 뉴런에서 유전적으로 인코딩된 초고속 Glu 센서 iGluu의 단일 시냅스 이미지로부터 기능적 지표의 추출. (A, D) PT(A) 및 IT(D) 부톤의 예로 는 각각의 iGluu 형광을 rest에서(왼쪽) 및 AP 매개 iGluu 응답의 피크에서(오른쪽). (B, C, E, F)(A, D)에 도시된 부톤으로부터 기록된 iGluu 응답); 2 mM Ca2+ 및 1 mM Mg2 +에서 실험하십시오. (B)자극 전류(상부 추적)의 동시 기록과 수퍼 임계값 픽셀의 평균 강도(하단 추적). 모든 트레이스에 대해 동일한 시간 배율. 피크 진폭(점선 빨간색 수평선 사이)과 이 피크(빨간색 오버레이)의 감쇠에 장착된 단일 지수 함수입니다. 해당 TauD(θ) 값은 피팅 곡선 옆에 표시됩니다. (E, F) 시간에 대한 확산의 플롯. 피크 스프레드: 점선 빨간색 수평선 간의 차이입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 글루타메이트-유도 된 iGluu 과도(A-E)의 특성은 변위 아티팩트(F-J)와 반대한다. (A, B)및(F, G)은임의의 단위(au)에서 휴식(A, F) 및 자극 후(B, G)에서 절대 형광 강도를 보여준다. (C, H) 자극 (ΔF/F%)에 앞서 휴식 형광의 백분율에서 형광 변화. (D, I) 임의 단위의 모든 픽셀에서 iGluu 과도의 중첩. (E, J) ΔF/F %의 모든 픽셀에서 iGluu 과도의 중첩. 시냅스 글루타메이트 방출의 경우, 휴식 단말 옆의 픽셀은 자극 후 형광 증가를 나타내고, 초점이 벗어난 픽셀의 경우 시야의 전체 형광 강도가 동반증가하지 않고 ROI에서 자신의 위치를 변경하는 반면, 초점 이외 픽셀은 ROI에서 자신의 위치를 변경합니다. 변위 아티팩트는 음의 ΔF/F 신호(J)의 모양으로도 인식될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 비특이적 iGluu 응답에 대한 수정. (A-D) 비특이적 배경 반응에 의해 오염된 쌍시냅스 반응의 예. (E-H) 보정 후 동일합니다. (A, E) 자극하기 전에. (B, F) 자극 중. (C, G) 자극 후. (D, H) ROI의 모든 픽셀에서 해당 중첩 된 강도 과도 (ΔF / F). 이미지 수집 시간은 화살촉 위에 해당 작은 문자로 표시됩니다. 패널 C에서 백그라운드 응답은 매우 광범위하고 천천히 감소합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: iGluu 과도의 진폭 페어링 펄스 비(PPR)에서 뚜렷한 크기 및 크기 관련 차이. (a)코르티코스트리아순환체(22)의22단순화된 방식은, 간접통로 줄무늬 투영 뉴런(iSPN) 및 내손성 세포(IT) 뉴런에 대한 피라미드관(PT) 뉴런의 우대 투영 개념을 도시하며, IT와 PT 말단 간의 크기 차이로 직접 통로 SPN(dSPN)을 지시한다. (B)부통 직경의 바이모달 분포는 자극 전에 수프라-상하류 에 의해 결정된 형광을 쉬게 한다. 직경 ≥0.63 μm의 부톤은 "큰"으로 정의되었고 PT 축에 의해 발행된 것으로 가정되었다. PT- 및 IT 유형의 시냅스에서 원본 이미지 및 표본 추적은 그림 3을참조하십시오. (C)피크 진폭의 PPR과 부톤 직경 사이에 유의한 양성 상관관계가 보입니다. 각 데이터 포인트는 각 bouton의 처음 3번의 시험에서 나온 평균을 나타낸다. * P < 0.05, **P < 0.01, ***P & 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 저운동 표현형을 가진 Q175 마우스에서 기능 장애 시냅스의 식별. (A)단일 시냅스 이미징 당일 모터 테스트 결과. 스텝 오버 대기 시간 >300 ms는 병리학으로 간주되었다. 시험된 나이에 (평균 16 개월), 17/54 HET는 스텝 오버 테스트에서 뚜렷한 표현형을 나타냈다. hypokinesia에 관하여, 스텝 오버 테스트는 오픈 필드 테스트 보다 더 민감한 것 같다. 그럼에도 불구하고 스텝오버 테스트의 결과(배치와 장벽 사이의 시간)와 오픈 필드 테스트(즉, 총 경로가 5분 으로 실행)사이에는 상당한 상관 관계가 있었습니다. Y = -0.01511X + 458,7; P = 0.0044 (간단한 회귀). (B)평균 자극 된 단일 시냅스 iGluu 과도 는 합성 적으로 방출 된 글루타메이트의 클리어런스에서 HD 관련 차이를 설명하기 위해 동일한 피크 진폭으로 정규화. 각 피팅 곡선은 글루타메이트 과도 기능의 지속 시간의 차이를 강조 표시합니다. (C)야생형(회색), HET(적색) 및 HOM(마젠타)으로부터의 결과의 정량화. (D, E) TFB-TBOA의 100 nM에서 WT 슬라이스의 배양은 HOM에서 관찰된 글루타메이트 클리어런스의 우울증을 시뮬레이션했습니다. (F)시냅스 활성화 및 데이터 구성 방식. (G) #1 TauD 값의 누적 히스토그램. (H, I) 정규화된 #2 응답의 플롯입니다. 31 WT 및 30 HET 시냅스 (모든 PT 유형)의 데이터. WT 샘플에서 모든 TauDmax 값은 ≤15 ms. HET 샘플에서, 시냅스의 40%는 WT에서 가장 긴 TauDmax에 의해 정의된 15ms 임계값을 초과하는 TauDmax 값을 나타내었다. 이 그래프는 최대 진폭 범위(즉, iGluu 형광 증가가 가장 높은 픽셀의 값)와 TauDmax(가장 높은 고도를 가진 픽셀의 TauD)의 HD 관련 차이를 강조합니다. HET에서만 발생하는 TauDmax 값은 빨간색으로 표시되고 WT에서만 볼 수 있는 진폭 값은 회색으로 표시됩니다. * P < 0.05, **P < 0.01, ***P & 0.001. 사용된 통계 테스트는 각 그래프 옆에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 실험은 일반적인 관심사에 관한 것입니다 — 시냅스 독립성과 신경 변성 과정에서 의 가능한 손실, 우리는 노인 (>1 년) 마우스에서 급성 뇌 조각에 영향을받는 시냅스를 식별하는 새로운 접근 방식을 설명합니다. 최근 도입된 글루타메이트 센서 iGluu의 개선된 운동 특성을 활용하여 시냅스 글루타메이트 방출과 섭취량 사이의 관계를 이전에는 불가능했던 방식으로 조명하는 실험이 있었다.
조미료 클리어런스의 기능 및 유지에 미치는 영향은 잘 해명되지 않지만, 글루타메이트 유발 흥분독성이 신경 손실 및 시냅스 가지치기를 일으킬 수 있다는 가설은 간질, 뇌졸중 및 신경 퇴행성질환38,,39,,40,,41에대한 거의 모든 관련 검토에서 언급된다. 그러나, 가능한 증거는 아마도 문학에서 예상 보다 더 제한. 혼동은 총 자극 및 기록 기법42,,43으로얻어진 결과를 해석할 때 낮은 공간 및 시간적 해상도와 관련된 문제를 감안하여 선택된 실험 도구가 불충분할 수 있다는 사실에 의해 더욱 가산된다. 이것은 헌팅턴병만큼 심각한 신경학적 장애의 관점에서 불행한 것보다 더 많은 추가 연구를 낙담하는 거짓 부정으로 이어질 수 있습니다. 본 접근법은 더 나은 신호 차별을 보장하고 따라서 헌화에서 코르티코테리아 시냅스의 상당 부분이 손상된 글루타메이트 클리어런스의 징후를 나타낸다는 생각을 더욱 강하게 뒷받침합니다.
본 결과는 코르티코스테리아통로 내의 단기 가소성의 차이를 개시했다. 후자는 수많은 연구의 초점에 있었다 있지만17,,44,그것은 상부 피질 층에서 유래 하는 구심질 은 주파수 의존 우울증을 전시 할 것으로 예상 되지 않았습니다., 계층에서 유래 하는 피라미드 관 구심제대조적이 5. 후자는 우선적으로 방출의 주파수 의존적인 potentiation를 보여주었고, 그러므로 조미료 흡수 불충분을 위한 고위험에 있을 수 있습니다.
성인 마우스에서 급성 뇌 조각에 대 한 실험생활의 적절 한 나이에 시 냅 스 변화를 해명 에 대 한 중요 한. 성상 세포가 관심의 메커니즘에 관여 한 경우 제제의 연령 및 기능 상태는 특히 관련이 있다. 여기서, 성상세포는 글루타메이트 수송 활동 및 관련 염화물 항상성45의성인 수준을 나타낼 만큼 충분히 성숙해야 한다.
단일 시냅스 분석제는 그대로 뇌에서 글루타마테르지시냅스 전달의 HD 관련 변화에 대한 더 나은 이해를 향한 길을 열어줄 것이다46. 관심 시냅스가 대뇌피질(47)의표면 층에 국한되어 있는 경우, 단일 시냅스 분해능은 그대로 뇌에서도 달성될 수 있는 것으로 나타났다.
마지막으로, 현재의 실험적 접근법은 필요한 장비가 여전히 저가의 측면에 있기 때문에 많은 추종자들이 사용할 수 있다는 매력을 가지고 있습니다.
요컨대, 형광 신호보고 글루타메이트 방출 및 그대로 뇌의 조미료 농도의 병치 변화는 어떤 전기 생리학적 방법으로 달성 할 수없는 데이터를 제공 할 수 있습니다. 그러나 새로운 방법과 마찬가지로 이 방법은 2.2 단계와 3.3 단계에서 부분적으로 다루어진 한계와 단점이 있습니다. 빠르고 높은 친화도 iGluu 센서의 낮은 휴식 형광은 추가 테스트를 위해 적합한 정맥류를 식별하기 위해 약간의 운동 / 경험이 필요합니다. XCaMP-R48과 같은 유전자 부호화 칼슘 표시기(GECI)와 적어도 두 개의 조정된 레이저 조명 시스템의 공동 발현을 통해 기능성 축색 터미널의 검색이 훨씬 쉬워질 것입니다. 어쨌든 iGluu 녹화 전과 녹화 중에 가능한 한 적은 수의 준비를 흥미 진진한 빛에 노출하는 것이 중요합니다.
iGluu 형광을 유도하기 위해 473 nm 레이저 (일반 전체 필드 제거 대신)를 사용하는 것은 충분한 방출을 얻기위한 전제 조건이지만 표백을 유발합니다. 주어진 조건하에서, iGluu는 10개의 자극/획득 시험(50 ms의 인터 자극 간격에서 10개의 자극 쌍 및 1/10s의 반복 속도)을 완전히 표백하였다. 현재 사용되는 1 광자 레이저 시스템과 함께 정상 상태 데이터 수집을 위한 최대 총 조명 시간은 약 2ss였다. iGluu의 표백은 기하급수적으로, 조명 시작 후 처음 20 ms 동안 매우 강하고 그 후 훨씬 느립니다. 따라서 각 시험의 처음 20ms 동안 신호 수집을 피하고 총 10개의 응답 쌍을 획득하는 것이 좋습니다. 단일 자극에 대한 응답은 현재 사용되는 180 ms 대신 60-80 ms의 노출 시간으로 기록될 수 있습니다.
또 다른 중요한 문제는 iGluu의발현수준입니다. Helassa et al.27의선구적인 연구에서, 바이러스 구조는 배양된뉴런(27)에전기 천공에 의해 적용되었으며, 이는 센서의 더 높은 발현 수준을 생성하고 특히 2광자 레이저 스캐닝 장치가 1광자 현미경 대신 사용될 수 있는 경우에 특히 덜 표백된다. Dürst외. 49 보고 일상적인 취득의 iGluu의 ca1 피라미드 뉴런에서 ~100 시험 (각각 80 ms에 노출). 그러나, 배양 된 뇌 조직 은 실험 노화 된 뇌에서 성상 세포 의존 시 냅 스 기능을 명확히 하는 것을 목표로 할 때 옵션이 아닙니다. 더 강한 프로모터를 사용하는 iGluu의 CaMKII-Cre 의존적 발현은 더 적은 세포에서 더 강한 발현을 가진 제제를 제공할 수 있고, 따라서 방법의 분해능을 증가시키고 시냅스당 더 많은 임상시험을 획득하도록 허용할 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 CHDI (A-12467), 독일 연구 재단 (Exc 257/1 및 DFG 프로젝트 ID 327654276 - SFB 1315) 및 샤리테의 교내 연구 기금에 의해 지원되었다. 우리는 K. Török, 세인트 조지의, 런던 대학, N. Helassa, 리버풀 대학, iGluu 플라스미드와 많은 유용한 토론에 감사드립니다. D. 베턴스와 A. 숀허르는 우수한 기술 지원을 제공했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo microsope | WPI | PZMIII | Precision Stereo Zoom Binocular Microscope |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51500D | Digital Lab New Standard stereotaxic frame |
| High speed drill equipment | Stoelting | 514439V | Foredom K1070 cromoter Kit |
| Injection system | Stoelting | 53311 | Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) |
| Hamilton syringe 5 µl | Hamilton | 87930 | 75RN Syr (26s/51/2) |
| Laser positioning system | Rapp OptoElectronic | UGA-40 | UGA-40 |
| Blue laser for iGluu excitation | Rapp OptoElectronic | DL-473-020-S | 473 nm laser |
| Dichroic mirror for 473 nm | Rapp OptoElectronic | ROE TB-355-405-473 | Dichroic |
| 1P upright microscope | Carl Zeiss | 000000-1066-600 | Axioskop 2 FS Plus |
| Objective 63x/1.0 | Carl Zeiss | 421480-9900 | W Plan-Apochromat |
| 4x objective | Carl Zeiss | 44-00-20 | Achroplan 4x/0,10 |
| Dichroic mirror for iGluu | Omega optical | XF2030 | |
| Emission filter for iGluu | Omega optical | XF3086 | |
| Dichroic mirror | Omega optical | QMAX_DI580LP | |
| Emission filter for autofluorescence subtr. | Omega optical | QMAX EM600-650 | |
| sCMOS camera | Andor | ZYLA4.2PCL10 | ZYLA 4.2MP Plus |
| Acqusition software | Andor | 4.30.30034.0 | Solis |
| AD/DA converter | HEKA Elektronik | 895035 | InstruTECH LIH8+8 |
| Aquisition software | HEKA Elektronik | 895153 | TIDA5.25 |
| Electrode positioning system | Sutter Instrument | MPC-200 | Micromanipulator |
| Electrical stimulator | Charite workshops | STIM-26 | |
| Slicer | Leica | VT1200 S | Vibrotome |
| Brown/Flaming-type puller | Sutter Instr | SU-P1000 | P-1000 |
| Glass tubes for injection pipettes | WPI | 1B100F3 | |
| Glass tubes forstimulation pipettes | WPI | R100-F3 | |
| Tetrodotoxin | Abcam | ab120054 | TTX |
| iGluu plasmid | Addgene | 106122 | pCI-syn-iGluu |
| Q175 mice | Jackson Lab | 27410 | Z-Q175-KI |
References
- Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nature Reviews Neuroscience. 1, 181-190 (2000).
- Thome, C., et al. Axon-carrying dendrites convey privileged synaptic input in hippocampal neurons. Neuron. 83, 1418-1430 (2014).
- Larkum, M. E., Petro, L. S., Sachdev, R. N. S., Muckli, L. A Perspective on Cortical Layering and Layer-Spanning Neuronal Elements. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 56 (2018).
- Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neuroscience. 9, 206-221 (2008).
- Khakh, B. S., et al. Unravelling and exploiting astrocyte dysfunction in Huntington's disease. Trends in Neurosciences. 40, 422-437 (2017).
- Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32, 421-431 (2009).
- Perea, G., Araque, A. Astrocytes potentiate transmitter release at single hippocampal synapses. Science. 317, 1083-1086 (2007).
- Savtchenko, L. P., et al. Disentangling astroglial physiology with a realistic cell model in silico. Nature Communications. 9, 3554 (2018).
- Octeau, J. C., et al. An optical neuron-astrocyte proximity assay at synaptic distance scales. Neuron. 98, 49-66 (2018).
- Verkhratsky, A., Nedergaard, M. Physiology of astroglia. Physiological Reviews. 98, 239 (2018).
- Xie, Z., Yang, Q., Song, D., Quan, Z., Qing, H. Optogenetic manipulation of astrocytes from synapses to neuronal networks: A potential therapeutic strategy for neurodegenerative diseases. Glia. 10, (2019).
- Verkhratsky, A., Parpura, V., Pekna, M., Pekny, M., Sofroniew, M. Glia in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Biochemical Society Transactions. 42, 1291-1301 (2014).
- Dvorzhak, A., Melnick, I., Grantyn, R. Astrocytes and presynaptic plasticity in the striatum: Evidence and unanswered questions. Brain Research Bulletin. , 17-25 (2017).
- Rose, C. R., et al. Astroglial Glutamate Signaling and Uptake in the Hippocampus. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 451 (2018).
- Scimemi, A., Diamond, J. S. Deriving the time course of glutamate clearance with a deconvolution analysis of astrocytic transporter currents. Journal of Visualized Experiments. (10), (2013).
- Theodosis, D. T., Poulain, D. A., Oliet, S. H. Activity-dependent structural and functional plasticity of astrocyte-neuron interactions. Physiological Reviews. 88, 983-1008 (2008).
- Reiner, A., Deng, Y. P. Disrupted striatal neuron inputs and outputs in Huntington's disease. CNS Neuroscience & Therapeutics. 24, 250-280 (2018).
- Plotkin, J. L., Surmeier, D. J. Corticostriatal synaptic adaptations in Huntington's disease. Current Opinion in Neurobiology. 33, 53-62 (2015).
- Villalba, R. M., Smith, Y. Loss and remodeling of striatal dendritic spines in Parkinson's disease: from homeostasis to maladaptive plasticity. Journal of Neural Transmission (Vienna). 125, 431-447 (2018).
- Huerta-Ocampo, I., Mena-Segovia, J., Bolam, J. P. Convergence of cortical and thalamic input to direct and indirect pathway medium spiny neurons in the striatum. Brain Structure and Function. 219, 1787-1800 (2014).
- Kincaid, A. E., Zheng, T., Wilson, C. J. Connectivity and convergence of single corticostriatal axons. Journal of Neuroscience. 18, 4722-4731 (1998).
- Reiner, A., Hart, N. M., Lei, W., Deng, Y. Corticostriatal projection neurons - dichotomous types and dichotomous functions. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 142 (2010).
- Rothe, T., et al. Pathological gamma oscillations, impaired dopamine release, synapse loss and reduced dynamic range of unitary glutamatergic synaptic transmission in the striatum of hypokinetic Q175 Huntington mice. Neuroscience. 311, 519-538 (2015).
- Dvorzhak, A., Helassa, N., Torok, K., Schmitz, D., Grantyn, R. Single synapse indicators of impaired glutamate clearance derived from fast iGluu imaging of cortical afferents in the striatum of normal and Huntington (Q175) mice. Journal of Neuroscience. 39, 3970-3982 (2019).
- Rebec, G. V. Corticostriatal network dysfunction in Huntington's disease: Deficits in neural processing, glutamate transport, and ascorbate release. CNS Neuroscience & Therapeutics. 10, (2018).
- Friedman, A., et al. Chronic Stress Alters Striosome-Circuit Dynamics, Leading to Aberrant Decision-Making. Cell. 171, 1191-1205 (2017).
- Helassa, N., et al. Ultrafast glutamate sensors resolve high-frequency release at Schaffer collateral synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 5594-5599 (2018).
- Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nature Methods. 10, 162-170 (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier. (2003).
- Marcaggi, P., Attwell, D. Role of glial amino acid transporters in synaptic transmission and brain energetics. Glia. 47, 217-225 (2004).
- Bergles, D. E., Diamond, J. S., Jahr, C. E. Clearance of glutamate inside the synapse and beyond. Current Opinion in Neurobiology. 9, 293-298 (1999).
- Papouin, T., Dunphy, J., Tolman, M., Foley, J. C., Haydon, P. G. Astrocytic control of synaptic function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372, 20160154 (2017).
- Tzingounis, A. V., Wadiche, J. I. Glutamate transporters: confining runaway excitation by shaping synaptic transmission. Nature Reviews Neuroscience. 8, 935-947 (2007).
- Nedergaard, M., Verkhratsky, A. Artifact versus reality--how astrocytes contribute to synaptic events. Glia. 60, 1013-1023 (2012).
- Octeau, J. C., Faas, G., Mody, I., Khakh, B. S. Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain. Journal of Visualized Experiments. (10), (2018).
- Shrivastava, A. N., Aperia, A., Melki, R., Triller, A. Physico-Pathologic Mechanisms Involved in Neurodegeneration: Misfolded Protein-Plasma Membrane Interactions. Neuron. 95, 33-50 (2017).
- Langfelder, P., et al. Integrated genomics and proteomics define huntingtin CAG length-dependent networks in mice. Nature Neuroscience. 19, 623-633 (2016).
- Pal, B. Involvement of extrasynaptic glutamate in physiological and pathophysiological changes of neuronal excitability. Cellular and Molecular Life Sciences. 75, 2917-2949 (2018).
- Pekny, M., et al. Astrocytes: a central element in neurological diseases. Acta Neuropathologica. 131, 323-345 (2016).
- Bading, H. Therapeutic targeting of the pathological triad of extrasynaptic NMDA receptor signaling in neurodegenerations. Journal of Experimental Medicine. 214, 569-578 (2017).
- Pajarillo, E., Rizor, A., Lee, J., Aschner, M., Lee, E. The role of astrocytic glutamate transporters GLT-1 and GLAST in neurological disorders: Potential targets for neurotherapeutics. Neuropharmacology. 10, (2019).
- Jensen, T. P., Zheng, K., Tyurikov, aO., Reynolds, J. P., Rusakov, D. A. Monitoring single-synapse glutamate release and presynaptic calcium concentration in organised brain tissue. Cell Calcium. 64, 102-108 (2017).
- Reynolds, J. P., Zheng, K., Rusakov, D. A. Multiplexed calcium imaging of single-synapse activity and astroglial responses in the intact brain. Neuroscience Letters. 10, (2018).
- Kuo, H. Y., Liu, F. C. Synaptic Wiring of Corticostriatal Circuits in Basal Ganglia: Insights into the Pathogenesis of Neuropsychiatric Disorders. eNeuro. 6, 19 (2019).
- Untiet, V., et al. Glutamate transporter-associated anion channels adjust intracellular chloride concentrations during glial maturation. Glia. 65, 388-400 (2017).
- Burgold, J., et al. Cortical circuit alterations precede motor impairments in Huntington's disease mice. Scientific Reports. 9, 6634 (2019).
- Jensen, T. P., et al. Multiplex imaging relates quantal glutamate release to presynaptic Ca (2+) homeostasis at multiple synapses in situ. Nature Communications. 10, 1414 (2019).
- Inoue, M., et al. Rational Engineering of XCaMPs, a Multicolor GECI Suite for In Vivo Imaging of Complex Brain Circuit Dynamics. Cell. 177, 1346-1360 (2019).
- Durst, C. D., et al. High-speed imaging of glutamate release with genetically encoded sensors. Nature Protocols. 14, 1401-1424 (2019).
