A entrega direta de complexos de ribonucleoproteína de RNA de Cas9/guia pré-montados é um meio rápido e eficiente para a edição de genoma em células hematopoiéticas. Aqui, nós utilizamos esta aproximação para suprimir de um silenciador intronic RUNX1 e para examinar as respostas transcricional em pilhas leucêmicas OCI-AML3.
A maior parte do genoma humano (~ 98%) é composto de seqüências de não-codificação. Os elementos cis-Regulatory (cres) são seqüências do ADN da não-codificação que contêm locais obrigatórios para reguladores do transcricional para modular a expressão de Gene. As alterações de CREs foram implicadas em várias doenças que incluem o cancro. Quando os promotores e os potenciadores forem o cres preliminar para estudar a regulação genética, muito pouco se sabe sobre o papel do silenciador, que é um outro tipo de cre que medeia a repressão genética. Originalmente identificado como um sistema de imunidade adaptativa em procariontes, CRISPR/Cas9 tem sido explorado para ser uma ferramenta poderosa para a edição do genoma eucariótico. Aqui, nós apresentamos o uso desta técnica para suprimir de um silenciador intronic no gene RUNX1 humano e para investigar os impactos na expressão de gene em pilhas LEUCÊMICAS OCI-AML3. A nossa abordagem baseia-se na entrega mediada por electroporação de dois complexos de ribonucleoproteína (RNP) de RNA de Cas9/guia (gRNA) pré-montados para criar duas quebras de dupla vertente (DSBs) que flanqueiam o silenciador. As eliminações podem ser prontamente rastreadas por análise de fragmento. As análises de expressão de diferentes mRNAs transcritas de promotores alternativos ajudam a avaliar os efeitos dependentes do promotor. Esta estratégia pode ser usada para estudar outros CRE e é particular apropriada para pilhas hematopoietic, que são frequentemente difíceis de transfecção com os métodos Plasmid-baseados. O uso de uma estratégia de plasmídeo e livre de vírus permite avaliações simples e rápidas das funções regulatórias do gene.
Os elementos cis-Regulatory (cres) são seqüências do ADN da não-codificação que contêm locais obrigatórios para reguladores do transcricional para controlar a expressão de gene1,2. Esses elementos são tipicamente 100 a 1.000 pares de base (BP) de comprimento. Promotores e potenciadores são os dois tipos mais caracterizados de CREs. Os promotores estão presentes em estreita proximidade com os sítios de início da transcrição e constituem a unidade básica de transcrição. Muitos genes têm mais de um promotor e seu uso alternativo contribui para a diversidade do transcriptoma e a especificidade do tecido3,4. Por outro lado, potenciadores ativam a transcrição e podem ser localizados a montante, a jusante ou dentro de íntrons dos genes alvo. Potenciadores podem atuar de longe distância (sobre uma megabase) e independente da orientação1,2. CREs também incluem silenciadores e isoladores5,6. Os atos anteriores oposta aos potenciadores para inibir a expressão de gene ligando aos repressores transcricional, visto que o último divide o genoma em domínios topologicamente discretos para isolar genes de outros cres dos domínios vizinhos. Esses elementos atuam em conjunto uns com os outros através de interações de cromatina de curto e/ou longo alcance e são organizados em hubs regulatórios para direcionar a expressão genética espaciotemporal adequada. Os avanços recentes em técnicas de sequenciamento de alta taxa de transferência aceleraram a identificação e a anotação funcional de muitos cre que facilitaram muito nossos entendimentos das redes transcricional que ditam o gene linhagem-específico expressão em diferentes tipos de células e tecidos7,8,9,10,11,12.
Dado os papéis fundamentais de CREs em regular a transcrição, suas alterações podem conduzir à expressão de gene aberrante. Tem sido demonstrado que os CRE são freqüentemente interrompidos por alterações genéticas e epigenéticas em diferentes tipos de cânceres humanos, contribuindo assim para a iniciação tumoral, progressão e agressividade13,14. Além disso, os fatores de ligação CRE são freqüentemente mutantes e/ou misexpressionados em vários tipos de câncer, destacando ainda mais o significado da desregulamentação CRE na oncogênese15. CREs pode igualmente ser afetado por aberrações estruturais, como exemplificado por rearranjos cromossomáticos freqüentes do potenciador de gene pesado da imunoglobulina (igh) que resultam na ativação anormal dos oncogenes vizinhos em linfomas da B-pilha16. Na leucemia mielóide aguda (LMA), o reposicionamento de um único potenciador por retrações do cromossomo 3Q provoca a GATA2 concomitante de downregulation e EVI1 , o que pode ser potencialmente direcionado pela inibição Bet das funções do potenciador 17. recentemente, nós caracterizamos um translocação cromossomático novo que envolve o perturbação de um silenciador intronic RUNX1 que possa contribuir à progressão de AML em um paciente pediatra18. Assim, decifrar o genoma não-codificante do cancro fornece avenidas frutíferas para elucidar a patogénese da doença, a descoberta do biomarcador e as intervenções terapêuticas, que melhoram finalmente resultados pacientes.
A via de nuclease crispr/Cas9, originalmente identificada como um sistema imunológico adaptativo em células procarióticas, tem sido explorada como um meio rápido e rentável para a edição genômica específica do local em células vivas e organismos19,20 ,21,22. O sistema CRISPR/Cas9 envolve dois componentes principais: o gRNA e o Streptococcus nuclease de Cas9 derivado de pyogenes. O gRNA contém uma seqüência específica chamada protospacer que reconhece a região de destino e direciona Cas9 para edição. O gRNA é compor de duas porções: RNA de CRISPR (crRNA), tipicamente uma seqüência do nucleotide de 20 Mer complementar ao ADN do alvo, e um crRNA trans-ativando (tracrRNA), que sirva como um andaime obrigatório para o nuclease. Um motivo adjacente ao protoespaçador (PAM) (5 ‘-NGG) imediatamente adjacente ao local de destino é necessário para a clivagem de Cas9 e o local de clivagem está localizado a 3 nucleotídeos a montante do PAM. a edição de genes mediados por CRISPR/Cas9 é comumente realizada por células transfecting com um plasmídeo que codifica Cas9 e o gRNA clonado23. Entretanto, esta aproximação é desafiante para pilhas hematopoietic, que são frequentemente duras ao transfecção e exigem métodos Virus-based longos da transdução. Uma aproximação alternativa é entrega celular direta de complexos pré-montados de Cas9/gRNA RNP24. Um método comum para a entrega da RNP é a eletroporação, que gera poros temporários na membrana celular, permitindo assim a entrada dos complexos RNP nas células25,26. As vantagens desta abordagem incluem a facilidade de uso, efeitos off-Target reduzidos e estabilidade dos complexos RNP. Aqui, nós descrevemos um protocolo de usar o método da entrega de RNP para investigar o papel transcricional de um silenciador intronic RUNX1 na linha de pilha18da leucemia OCI-AML3, que foi estabelecida do sangue periférico de um paciente de AML diagnosticado com o subtipo francês-americano-britânico M427. O protocolo inclui o delineamento de crRNA, preparo de complexos RNP, eletroporação, bem como triagem e posterior caracterização dos clones desejados.
O sistema crispr/Cas9 tem sido usado em uma ampla gama de aplicações de edição de genoma, como nocaute genético e knock-in Studies35,36, regulamento transcripcional37,38, engenharia genética de vários organismos modelo39,40,41,42,43,44 e terapia genética45,46. Aqui, demonstramos o uso de CRISPR/Cas9 para investigar as conseqüências funcionais da exclusão de um silenciador intrônico no gene RUNX1 . A entrega dos componentes de CRISPR em nossa aproximação não confiou no ADN do plasmídeo, na clonagem do gRNA ou no vírus mas no Electroporation de complexos pré-montados de Cas9/gRNA RNP. Demonstrou-se que o uso de DNA exógeno pode ser associado à integração indesejável de sequências vetoriais estrangeiras no genoma hospedeiro, aumento da toxicidade e baixa eficiência25,47,48, enquanto métodos de transdução de vírus são demorados. Além disso, a expressão prolongada de Cas9 do DNA plasmídeo pode aumentar os efeitos fora do alvo48. Pelo contrário, a abordagem de entrega direta baseada em RNP foi estabelecida como o método preferencial, pois é rápido e direto, com melhor eficiência de edição, seletividade e viabilidade celular. De fato, uma variedade de métodos como lipofecção49,50, Electroporation25,51, nanopartículas52, peptídeos penetrantes de células53, iTop54 e triamf 55 foram desenvolvidos para a entrega eficiente de crispr/Cas9 em tipos diferentes da pilha assim como a espécie animal e de planta24,25,26,56,57 , 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63. uma vez que as sequências de ADN não codificantes são hotspots de variações genéticas64, a verificação da presença de SNPs/indels comuns no alvo e das sequências vizinhas do Pam é particularmente relevante na conceção do grna que visa a regulamentação Elementos.
Um gargalo na edição do genoma CRISPR/Cas9 envolve a triagem de clones mutantes desejados em um grande número de amostras. Nós empregamos o PCR fluorescente acoplado com a electroforese capilar do gel para a seleção porque a mutação do alvo é um apagamento genomic pequeno de aproximadamente 300 BP. Este método é rápido e sensível e pode ser realizado em uma forma de alta taxa de transferência. Também, este método permite a estimativa exata de níveis do mutante e de tamanhos do apagamento simultaneamente. Além disso, a análise multiplex de fragmentos de PCR rotulados com diferentes corantes fluorescentes é suportada. Nós temos usado rotineiramente esta técnica para genótipo pequenas inserções/deleções em neoplasma Myeloid65,66. Em nossa experiência, nós podemos consistentemente detectar tamanhos de fragmento que são diferentes por 4 BP com alta precisão e carga mutante para baixo para ~ 3%. No entanto, deve-se notar que este método tem um limite de tamanho de fragmento de 1.200 BP, e, portanto, não é adequado para a triagem de grandes deleções. Além disso, as substituições de base (resultando em tamanho de fragmento inalterado) e potenciais eventos fora do destino em outras regiões genômica não podem ser detectadas. Para este último, o sequenciamento de genoma todo caro é necessário para analisar globalmente as mudanças indesejáveis globais nos clones-alvo. Para adotar nossa abordagem atual para investigação de grandes seqüências reguladoras não codificantes (> 1000 BP), uma análise detalhada de deleção e mutagenese de sítios de ligação de fatores de transcrição putativos usando ensaios de genes in vitro Reporter pode ser realizada de antemão para delinear a região funcional mínima para a edição de CRISPR/Cas918.
Como muitos genes contêm mais de um promotores3,4, éimportante estar ciente da existência de promotores alternativos no locus do gene alvo como manipular elementos regulatórios pode afetar os promotores diferencialmente. Assim, as variantes de transcrição derivadas de diferentes promotores precisam ser medidas individualmente para avaliar quaisquer respostas específicas do promotor. O uso de ensaios à base de sonda TaqMan é preferível ao SYBR Green devido à melhor especificidade e reprodutibilidade. Se o sistema digital mais avançado do PCR está disponível, a quantificação do transcrito pode ser executada mais precisamente sem a necessidade da construção padrão da curva.
Uma consideração importante na realização de experimentos crispr/Cas9 em linhagens de células cancerosas é o número de cópia do gene ploidia e alvo nas células utilizadas como virtualmente todas as linhas de células cancerosas que abrigam alterações genéticas, incluindo variações estruturais e de número de cópias. Em nosso caso, OCI-AML3 tem um karyotype celular com 45 a 50 cromossomas. Também, a linha de pilha foi encontrada para carreg um número normal da cópia de RUNX1 como revelado do cancer Cell line enciclopédia67 e estudos in situ da hibridação da fluorescência18. Ao segmentar um gene com ganho de número de cópia, o método de entrega pode precisar ser otimizado para fornecer níveis suficientes dos componentes CRISPR para a edição. Também, mais clones podem precisar de ser selecionados a fim identificar os Knockouts completos. É importante ressaltar que a segmentação em regiões genómicas amplificadas, particularmente aquelas causadas por rearranjos estruturais, pode desencadear respostas antiproliferativas de genes independentes em células cancerosas, levando a resultados falsos positivos no gene estudos funcionais68,69,70. Neste sentido, as aproximações alternativas como o knockdown da interferência do RNA (RNAi) e/ou o superexpressão do cDNA devem ser empregadas para verificar os resultados de crispr. Além disso, várias linhas de células devem ser usadas para evitar interpretações incorretas de efeitos de edição de CRISPR específicos da linha de célula, mas independentes de genes.
O sistema CRISPR/Cas9 revolucionou a pesquisa básica e translacional, proporcionando um meio simples e eficiente para a edição do genoma. Aqui nós Demonstramos a facilidade de usar CRISPR/Cas9 para interromper um silenciador intrônico para estudos transcripcionais em uma linha de células cancerosas. Esta técnica permite o estudo de Cres no nível do ADN e oferece as oportunidades de examinar funções de CRE no contexto endógeno um pouco do que os genes heterólogo tradicionais do repórter. Recentemente, um sistema de edição de RNA baseado em CRISPR também foi identificado71 e pode servir como uma nova ferramenta para estudar Cres, visando o RNA transcrito a partir dos elementos regulatórios. Combinando com técnicas da captação do conformação do cromossoma, crispr/Cas9 ajudará certamente a decifrar os envolvimentos de Cres na organização alterada do genoma e na expressão de gene lig aos vários problemas de saúde.
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer ao Prof. M.D. Minden (Princess Margaret Cancer Centre, Universidade de saúde da rede, Toronto, Canadá) por fornecer a linha celular OCI-AML3. Além disso, os autores gostariam de agradecer as principais utilidades do cancer Genomics e Pathobiology (a universidade chinesa de Hong Kong) para fornecer as facilidades e o auxílio no apoio desta pesquisa.
0.2 cm-gap electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652086 | |
1×TE buffer, pH7.5 | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
10mM dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | 18427013 | |
3500 Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | 4405673 | |
6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer | Thermo Fisher Scientific | None | |
7300 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | None | |
7300 System SDS Software | Thermo Fisher Scientific | None | Version 1.3.1 |
Bio-Rad Gene Pulser Xcell system | Bio-Rad | 1652660 | |
ChargeSwitch Direct gDNA Purification Kit, 96-well | Thermo Fisher Scientific | CS11205 | |
crRNA-1 | Integrated DNA Technologies | Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA | Components of the Cas9/gRNA complex |
crRNA-2 | Integrated DNA Technologies | Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA | Components of the Cas9/gRNA complex |
Deionized formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | |
fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270098 | |
Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32857 | |
GeneMapper Software 5 | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
GeneScan 600 LIZ Size Standard | Thermo Fisher Scientific | 4408399 | |
GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
PBS, 10X Solution, pH7.4 | Affymetrix | 75889 | |
Penicillin and streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 11304029 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
Recombinant S. pyogenes Cas9 nuclease | Integrated DNA Technologies | 1081058 | Components of the Cas9/gRNA complex |
RPMI 1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 31800-022 | |
RPMI 1640 medium without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11835030 | |
RUNX1a TaqMan gene expression assays | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Hs04186042_m1 |
RUNX1b/c TaqMan gene expression assays | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Hs00231079_m1 |
RUNX1c TaqMan gene expression assays | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Hs01021966_m1 |
SuperScript III First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher Scientific | 18080051 | |
TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4304437 | |
tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072533 | Components of the Cas9/gRNA complex |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
Unlabeled PCR reverse primer | Thermo Fisher Scientific | None |