Direktleverans av förmonterade Cas9/guide RNA ribonukleoprotein komplex är ett snabbt och effektivt sätt för genomredigering i hematopoietiska celler. Här använder vi denna metod för att ta bort en RUNX1 intronic ljuddämpare och undersöka transkriptionella svaren i OCI-AML3 leukemi celler.
Huvuddelen av människans arvsmassa (~ 98%) består av icke-kodningssekvenser. CIS-regulatoriska element (CREs) är icke-kodning DNA-sekvenser som innehåller bindande platser för transkriptionella tillsynsmyndigheter att modulera genuttryck. Förändringar av CREs har varit inblandade i olika sjukdomar inklusive cancer. Medan initiativtagare och förstärkare har varit den primära CREs för att studera genreglering, mycket lite är känt om den roll som ljuddämpare, som är en annan typ av CRE som förmedlar gen förtryck. CRISPR/Cas9, som ursprungligen identifierades som ett adaptivt immunitetssystem i prokaryoter, har utnyttjats för att vara ett kraftfullt verktyg för eukaryotisk genomredigering. Här presenterar vi användningen av denna teknik för att ta bort en intronic ljuddämpare i human RUNX1 Gene och undersöka effekterna på genuttryck i OCI-AML3 leukemi celler. Vårt förhållningssätt förlitar sig på Electroporation-medierad leverans av två förmonterade Cas9/guide RNA (grna) ribonukleoprotein (RNP) komplex för att skapa två dubbel-strand raster (DSBs) som flanera ljuddämparen. Borttagningar kan lätt kontrolleras genom fragmentanalys. Uttrycks analyser av olika mRNA som transkriberas från alternativa promotorer hjälper till att utvärdera Promotorns beroende effekter. Denna strategi kan användas för att studera andra CREs och är särskilt lämplig för hematopoietiska celler, som ofta är svåra att transfect med plasmid-baserade metoder. Användningen av en Plasmid-och virusfri strategi möjliggör enkla och snabba bedömningar av gen reglerande funktioner.
CIS-regulatoriska element (CREs) är icke-KODANDE DNA-sekvenser som innehåller bindningsställen för transkriptionella regulatorer för att kontrollera genuttryck1,2. Dessa element är vanligtvis 100 till 1 000 baspar (BP) lång. Initiativtagare och förstärkare är de två mest karakteriserade typer av CREs. Initiativtagarna är närvarande i nära anslutning till avskrift startplatser och utgör den grundläggande enheten för transkription. Många gener har mer än en promotor och deras alternativa användning bidrar till transkriptome mångfald och vävnad specificitet3,4. Å andra sidan, förstärkare aktivera transkription och kan lokaliseras uppströms, nedströms eller inom introner av målgener. Enhancers kan agera från långt avstånd (över en megabas) och oberoende av orientering1,2. CREs inkluderar även ljuddämpare och isolatorer5,6. Den förstnämnda agerar motsatt till förstärkare för att hämma genuttryck genom bindning till transkriptionella repressorer, medan den senare partitioner arvsmassan till diskreta topologiskt domäner att isolera gener från andra CREs från angränsande domäner. Dessa element fungerar i samförstånd med varandra genom kort-och/eller långväga kromatin interaktioner och är organiserade i regulatoriska nav för att direkt korrekt spatiotemporal genuttryck. Senaste framstegen i hög genomströmning sekvenserings tekniker har påskyndat identifiering och funktionell anteckning av många CREs som avsevärt har underlättat vår förståelse av transkriptionella nätverk som dikterar härstamnings-specifik gen uttryck i olika cell-och vävnadstyper7,8,9,10,11,12.
Med tanke på de grundläggande rollerna för CREs i regleringen av transkription, kan deras förändringar leda till avvikande genuttryck. Det har visats att CREs ofta störs av genetiska och epigenetiska förändringar i olika typer av mänskliga cancerformer, vilket bidrar till tumör initiering, progression och aggressivitet13,14. Dessutom är CRE-bindande faktorer ofta muterade och/eller misexpressed i olika cancertyper, ytterligare belysa betydelsen av CRE avreglering i Onkogenes15. CREs kan också påverkas av strukturella avvikelser, som exemplifieras av frekventa kromosomala omställningar av immunglobulin tunga (IgH) gen förstärkare som resulterar i onormal aktivering av angränsande onkogener i B-cells lymfkörtelcancer16. Vid akut myeloisk leukemi (AML), omplacering av en enda förstärkare av kromosom 3Q omordningar orsakar samtidig GATA2 nedreglering och EVI1 aktivering, som kan potentiellt riktas genom att satsa hämning av förstärkare funktioner 17. nyligen, vi kännetecknas en roman kromosom flyttning med störning av en RUNX1 intronic ljuddämpare som kan bidra till AML progression i en pediatrisk patient18. Således, dechiffrera icke-kodning cancer arvsmassa ger givande vägar för att belysa sjukdomens patogenes, biomarkör upptäckt och terapeutiska interventioner, som i slutändan förbättra patientens resultat.
Den CRISPR/Cas9 Nuclease väg, ursprungligen identifierats som ett adaptivt immunsystem i prokaryotiska celler, har utnyttjats som ett snabbt och kostnadseffektivt sätt för platsspecifik genomisk redigering i levande celler och organismer19,20 ,21,22. Den CRISPR/Cas9 systemet omfattar två huvudsakliga komponenter: den gRNA och Streptococcus pyogenes-derived Cas9 Nuclease. GRNA innehåller en specifik sekvens som kallas protospacer som känner igen målregionen och dirigerar Cas9 för redigering. Den gRNA består av två delar: CRISPR RNA (crRNA), typiskt en 20-mer nukleotid sekvens komplement till målet DNA, och en trans-aktiverande crRNA (tracrRNA), som fungerar som en bindande ställningen för Nuclease. Ett protospacer angränsande motiv (PAM) (5 ‘-NGG) omedelbart intill målplatsen krävs för Cas9 klyvning och klyvning platsen ligger 3 nukleotider uppströms PAM. CRISPR/Cas9-medierad genredigering utförs vanligen av transfecting celler med en Plasmid som kodar Cas9 och klonade gRNA23. Emellertid, detta tillvägagångssätt är utmanande för hematopoietiska celler, som ofta är svåra att transfect och kräver långa virusbaserade transduktionmetoder. En alternativ metod är direkt cellulära leverans av förmonterade Cas9/gRNA RNP komplex24. En vanlig metod för RNP leveransen är elektroporation, som genererar tillfälliga porer i cellmembranet, vilket möjliggör inträde av RNP-komplexen i cellerna25,26. Fördelarna med detta tillvägagångssätt är användarvänlighet, minskade off-Target effekter och stabiliteten i RNP komplexen. Här beskriver vi ett protokoll för att använda RNP leveransmetod för att undersöka den transkriptionella roll som en RUNX1 intronic ljuddämpare i OCI-AML3 leukemi cell linje18, som fastställdes från perifert blod av en AML-patient diagnostiserades med den fransk-amerikanska-brittiska M4 subtyp27. Protokollet omfattar utformningen av crRNA, beredning av RNP-komplex, elektroporation samt screening och efterföljande karakterisering av de önskade klonerna.
CRISPR/Cas9-systemet har använts i ett brett spektrum av gen redigeringsprogram såsom genknockout och Knock-in-studier35,36, transkriptionell reglering37,38, genteknik av olika modellorganismerna39,40,41,42,43,44 och genterapi45,46. Här demonstrerar vi användningen av CRISPR/Cas9 för att undersöka de funktionella konsekvenserna av att ta bort en intronic ljuddämpare på RUNX1 genen. Leveransen av CRISPR komponenter i vår strategi inte förlita sig på plasmid DNA, kloning av gRNA eller virus men elektroporation av förmonterade Cas9/gRNA RNP komplex. Det har visats att användning av EXOGEN DNA kan associeras med oönskad integration av främmande vektorsekvenser i värdens arvsmassa, ökad toxicitet och låg verkningsgrad25,47,48, medan virustransduktionmetoder är tidskrävande. Dessutom, långvarig uttryck av Cas9 från plasmid DNA kan öka off-mål effekter48. Tvärtom, den direkta RNP-baserade leveransmetoden har etablerats som den bästa metoden eftersom det är snabbt och enkelt med förbättrad redigering effektivitet, selektivitet och cellernas lönsamhet. Faktum är att en mängd olika metoder såsom lipofection49,50, elektroporation25,51, nanopartiklar52, cell-penetrerande peptider53, itop54 och triamf 55 har utvecklats för effektiv CRISPR/Cas9 leverans till olika celltyper samt djur-och växtarter24,25,26,56,57 , 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63. eftersom icke-kodning av DNA-sekvenser är hotspots för genetiska variationer64, kontrollera närvaron av gemensamma SNPs/indels i målet och angränsande pam sekvenser är särskilt relevant när man utformar grna som mål reglerande Element.
En flaskhals i CRISPR/Cas9 genom redigering innebär screening av önskade muterade kloner i ett stort antal prover. Vi anställda fluorescerande PCR tillsammans med kapillär gel elektrofores för screening som mål mutation är en liten genomisk radering av cirka 300 BP. Denna metod är snabb och känslig och kan utföras i en hög genomströmning mode. Dessutom tillåter denna metod korrekt uppskattning av muterade nivåer och borttagnings storlekar samtidigt. Dessutom stöds multiplex-analys av PCR-fragment som märkts med olika fluorescerande färgämnen. Vi har rutinmässigt använder denna teknik för att genotyp små införanden/borttagningar i myeloida neoplasmer65,66. Enligt vår erfarenhet kan vi konsekvent upptäcka fragment storlekar som skiljer sig med 4 BP med hög precision och Mutant börda ner till ~ 3%. Det bör dock noteras att denna metod har en fragmentstorlek gräns på 1 200 BP, och därmed är det inte lämpligt för screening av stora borttagningar. Dessutom kan inte bas ersättningar (resulterande i oförändrad fragmenstorlek) och potentiella händelser utanför mål i andra genomiska regioner upptäckas. För den senare, den kostsamma hela Genomsekvensering krävs för att utförligt profilera globala oönskade förändringar i mål klonerna. För att anta vår nuvarande strategi för utredning av stora icke-kodning regulatoriska sekvenser (> 1000 BP), en detaljerad radering och mutagenes analyser av förmodade transkriptionsfaktor bindningsställen med in vitro -reporter genanalyser kan utföras i förväg för att avgränsa den minimala funktionella regionen för CRISPR/Cas9 redigering18.
Eftersom många gener innehåller mer än en initiativtagare3,4, är det viktigt att vara medveten om förekomsten av alternativa initiativtagare i mål genen Locus som manipulerande reglerande faktorer kan påverka initiativtagarna Differentiellt. Transkriptionsvarianter som härleds från olika projektansvariga måste därför mätas individuellt för att utvärdera eventuella projektspecifika svar. Användning av TaqMan sond-baserade analyser är att föredra framför SYBR Green på grund av bättre specificitet och reproducerbarhet. Om det mer avancerade digitala PCR-systemet finns tillgängligt, kan transkriptionskvantifieringen utföras mer exakt utan behov av standardkurva konstruktion.
En viktig faktor i att utföra CRISPR/Cas9 experiment i cancer cellinjer är ploidi och mål gen kopia nummer i de celler som används som praktiskt taget alla cancer cellinjer Harbor genetiska förändringar inklusive strukturella och kopiera nummer variationer. I vårt fall, OCI-AML3 har en hyperdiploid karyotyp med 45 till 50 kromosomer. Dessutom konstaterades cellinjer att bära en normal RUNX1 kopia nummer som avslöjas från cancer cellinjer Encyclopedia67 och fluorescens in situ hybridisering studier18. När du riktar en gen med kopia antal Gain, leveransmetoden kan behöva optimeras för att ge tillräckliga nivåer av CRISPR komponenter för redigering. Dessutom kan fler kloner behöva screenas för att identifiera hela Knockouts. Framför allt har det visats att inriktning på förstärkta genomiska regioner, särskilt de som orsakas av strukturella omordningar, kan utlösa gen oberoende antiproliferativa reaktioner i cancerceller, vilket leder till falskt positiva resultat i gen funktionella studier68,69,70. I detta avseende bör alternativa metoder som RNA-interferens (RNAi) knockdown och/eller cDNA-överuttryck användas för att kontrollera CRISPR-fynden. Dessutom bör flera cellinjer användas för att undvika feltolkningar av celllinjespecifika men gen oberoende CRISPR-redigeringseffekter.
CRISPR/Cas9-systemet har revolutionerat grundläggande och translationell forskning genom att tillhandahålla ett enkelt och effektivt sätt att genomredigera. Här visar vi hur lätt det är att använda CRISPR/Cas9 för att störa en intronic ljuddämpare för transkriptionella studier i en cancer cells linje. Denna teknik möjliggör studiet av CREs på DNA-nivå och erbjuder möjligheter att undersöka CRE funktioner i endogena sammanhang snarare än den traditionella heterologa reporter gener. Nyligen har en CRISPR-baserade RNA-redigeringssystem också identifierats71 och kan fungera som ett nytt verktyg för att studera CREs genom att rikta RNA transkriberas från de reglerande elementen. Genom att kombinera med kromosom konformation fånga tekniker, CRISPR/Cas9 kommer säkerligen att hjälpa dechiffrera inblandning av CREs i förändrad arvsmassa organisation och genuttryck kopplade till olika hälsoproblem.
The authors have nothing to disclose.
Författarna skulle vilja tacka prof. MD Minden (Princess Margaret cancer Centre, University Health Network, Toronto, Kanada) för att tillhandahålla OCI-AML3 cellinjer. Dessutom skulle författarna vill tacka kärnan allmännyttiga cancer genomik och Pathobiology (Kinas universitet i Hongkong) för att tillhandahålla de faciliteter och stöd till stöd för denna forskning.
0.2 cm-gap electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652086 | |
1×TE buffer, pH7.5 | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
10mM dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | 18427013 | |
3500 Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | 4405673 | |
6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer | Thermo Fisher Scientific | None | |
7300 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | None | |
7300 System SDS Software | Thermo Fisher Scientific | None | Version 1.3.1 |
Bio-Rad Gene Pulser Xcell system | Bio-Rad | 1652660 | |
ChargeSwitch Direct gDNA Purification Kit, 96-well | Thermo Fisher Scientific | CS11205 | |
crRNA-1 | Integrated DNA Technologies | Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA | Components of the Cas9/gRNA complex |
crRNA-2 | Integrated DNA Technologies | Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA | Components of the Cas9/gRNA complex |
Deionized formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | |
fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270098 | |
Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32857 | |
GeneMapper Software 5 | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
GeneScan 600 LIZ Size Standard | Thermo Fisher Scientific | 4408399 | |
GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
PBS, 10X Solution, pH7.4 | Affymetrix | 75889 | |
Penicillin and streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 11304029 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
Recombinant S. pyogenes Cas9 nuclease | Integrated DNA Technologies | 1081058 | Components of the Cas9/gRNA complex |
RPMI 1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 31800-022 | |
RPMI 1640 medium without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11835030 | |
RUNX1a TaqMan gene expression assays | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Hs04186042_m1 |
RUNX1b/c TaqMan gene expression assays | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Hs00231079_m1 |
RUNX1c TaqMan gene expression assays | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Hs01021966_m1 |
SuperScript III First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher Scientific | 18080051 | |
TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4304437 | |
tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072533 | Components of the Cas9/gRNA complex |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
Unlabeled PCR reverse primer | Thermo Fisher Scientific | None |