Summary
Vi beskriver vårt protokoll för mätning av biologiska rytmer i proteinkatabolism via autofagi och proteasomen i mus levern.
Abstract
Celler använder flera metoder för att återvinna oönskade proteiner och annat material, inklusive lysosomala och icke-lysosomala vägar. Den viktigaste lysosome-beroende vägen kallas autofagi, medan den primära icke-lysosomala metoden för proteinkatabolism är ubiquitin-Proteasome systemet. Nyligen genomförda studier i modellorganismerna tyder på att aktiviteten hos både autofagi och ubiquitin-Proteasome-systemet inte är konstant över dagen utan i stället varierar beroende på en daglig (dygnsrytmen) rytm. Förmågan att mäta biologiska rytmer i protein omsättningen är viktig för att förstå hur cellulär kvalitetskontroll uppnås och för att förstå dynamiken i specifika proteiner av intresse. Här presenterar vi ett standardiserat protokoll för att kvantifiera autofagi och proteasomen Flux in vivo som fångar den cirkadiska komponenten i protein omsättningen. Vårt protokoll innehåller information för mushantering, vävnads bearbetning, fraktionering och autofagi Flux-kvantifiering med hjälp av mus levern som utgångsmaterial.
Introduction
Dygnsrytmen avser dagliga, förutsägbara variationer i biologisk funktion som är uppenbar i naturen. De finns i varje biologisk skala, från makroskopiska beteenden som sömn-vakna cykler, till molekylära fenomen som den rytmiska överflöd av biomolekyler. Under de senaste åren har forskning om dygnsrytmen omvandlats genom upptäckten av "klockgener" som är avgörande för den dygnsrytm generationen. Studier i Clock Gene knockout möss har avslöjat en central roll för dygnsrytmen i temporally organisera centrala cellulära processer såsom metabolism1. Bland de sätt dygns rytmer göra detta hända är genom att förmedla en tidsmässig struktur till protein katabolism.
Flera grupper inklusive vår har visat att de två stora vägar för cellulära proteinkatabolism, autofagi och ubiquitin-Proteasome systemet, är föremål för dygnsrytm2,3,4,5. Autofagi representerar den lysosome-beroende armen av proteinkatabolism där proteiner av intresse levereras till denna nedbrytande organell antingen genom byggandet av en roman vesikel (macroautofagi) eller genom direkt flyttning om en kanal (Chaperone medierad autofagi)6. Den ubiquitin-Proteasome systemet är den viktigaste icke-lysosomala vägen, där proteiner är Poly-ubiquitinated och sedan matas in i Proteasome, en makromolekylär nedbrytande maskin som finns i hela cytoplasman och Nucleus7,8. Rytmer i autofagi och proteasomen aktivitet är viktiga eftersom de sannolikt spelar en roll i cellulära städning. Som ett resultat, det är värdefullt att ha en standardiserad procedur som kan upptäcka dagliga svängningar i proteinkatabolism som är kompatibel med prekliniska sjukdomsmodeller.
Här, vi tillhandahåller vårt protokoll för kvantifiering av dygns variationer i autofagi Flux i mus levern, som har fungerat som grund för arbete i vårt laboratorium3,9. Vår metod klassificeras som en "omsättning assay"10, en metod som används av många grupper för att mäta proteolytisk aktivitet (eller Flux). I denna metod ges proteashämmare som är specifika för lysosomer eller proteasomer till möss och därefter erhålls vävnadsprov efter ett fast tidsintervall. Parallellt med detta erhålls vävnadsprover från möss som utsätts för simulerade injektioner. Vävnadsproverna är homogeniserade och sedan biokemiskt separerade för att få lysosome-berikade och cytoplasmiska fraktioner. Dessa fraktioner analyseras sedan parallellt via Western blotting med antikroppar som är specifika för makroautofagi markörer (LC3b och P62) eller proteasomen substrat (poly-ubiquitinated protein). Med tiden, djur injiceras med proteashämmare ackumulera proteiner som normalt skulle ha återvunnits. Som ett resultat av detta kan omsättningen härledas genom en jämförelse av förekomsten av markör proteiner i de behandlade proverna från proteashämmare till de simulerade proverna. Genom att upprepa denna metod vid fasta tidsintervall över dagen är det möjligt att rekonstruera cirkadiska variationer i proteolys (figur 1a).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet som beskrivs här godkändes av Washington University i St. Louis djuromsorg och användning kommittén (IACUC).
1. mus hus och experimentell design
- För att upptäcka dagliga rytmer i protein omsättningen, hus möss (manliga eller kvinnliga C57BL/6J, 4 − 8 vecka gammal, 20 − 25 g) under standard 12 h ljus/mörker cykler med mat som AD libitum. För att undvika att betona djuren, anpassa sig möss i minst en vecka i anläggningen före användning och undvika enstaka bostäder. För att bevisa att rytmer i proteinkatabolism är verkligen dygns (dvs., driven av djurets inre biologiska klocka), hus möss under konstant mörka förhållanden, noga med att undvika att utsätta möss för EXOGEN ljus.
Anmärkning: För detaljer om mus huset för dygnsrytm experiment se följande referens11. - För varje tidspunkt allokera tre möss som simulerade kontroller och minst tre möss för varje typ av proteashämmare som används (leupeptin för autofagi Flux och bortezomib för proteasomen Flux-mätningar). Planera för sex tid punkter jämnt fördelade på 4 h intervall över dag/natt cykel för att få vävnadsprover.
Anmärkning: En 24 h, 6 tid punkt experiment med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), leupeptin, och bortezomib kommer att kräva totalt 54 möss (3 per behandling x 3 behandlingar x 6 tid punkter).
2. beredning av Homogeniseringslösning, inhibitor stamlösningar, och injektionsflaskor för mus lever samling
- Förbered färsk homogeniseringsbuffert (HB) och håll på is: 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM sackaros, 5 mM EDTA pH 8,0 och 1 proteashämmare tablett per 100 mL.
Anmärkning: Ca 10 mL HB behövs per mus. - För nedströmsbearbetning av biologiska prover kräver varje prov ett 15 ml koniskt rör för att hålla det råa Homogenatet, ett 15 ml-rör för att hålla den post-nukleära supernatanten, två 1,5 ml microcentrifugrör för att hålla 3 000 x g och 20 000 x g inblandning pelleterat respektive ett 1,5 mL microcentrifugerör för att hålla cytoplasmiska fraktionen. Tillsätt 7 mL kallt HB till varje rör som är avsett för rå homogena och håll på isen.
- Bered en 2 mg/mL stamlösning av leupeptin Hemi-sulfat i steril PBS. Bered också en 50 mg/mL lösning av bortezomib i dimetylsulfoxid (DMSO). Och förvara lösningarna vid-80 ° c.
3. administrering av proteashämmare
- Tina leupeptin (2 mg/mL) och bortezomib (50 mg/mL) lagerlösningar till rumstemperatur 15 min före varje tidspunkt. Leupeptin-beståndet är redo för injektion. Späd bortezomib i steril PBS för att ge en 50 μg/mL arbetslösning.
Anmärkning: Bortezomib är ljuskänsligt, så skydda arbets beståndet från ljus till användning. - Väger möss och utför intraperitoneala injektioner av "Sham" PBS (0,5 mL), leupeptin (40 mg/kg) eller bortezomib (1,6 μg/kg). Returnera möss till lämpligt markerade burar grupperade efter vilken typ av injektion de fick. Registrera tiden som möss behandlas eller manipuleras i en standardiserad tabell (se kompletterande fil "exempel data").
Anmärkning: En dosräknare ingår som ett hjälpmedel i tilläggsfilen "Sample data". Det är viktigt att utföra injektioner snabbt och i samma ordning från tidpunkten till tidpunkten att minimera variationer.
4. vävnads anskaffning och-lagring
- Två timmar efter injektion, euthanize möss en i taget i enlighet med det institutionellt godkända iacuc protokoll. Till exempel, söva möss sedan euthanize av cervikal dislokation. Fortsätt till dissekera steg omedelbart efter eutanasi.
Anmärkning: Säkerställ fullständig anestesi innan cervikal dislokation genom att klämma fram tassar utan en observerbar reflex. - Ta bort den vänstra LOB i levern genom att göra en 1,5 till 2,0 cm snitt med Metzenbaum sax på musens ventrala buken. Externalize vänster LOB i levern och punktskatter den med kirurgisk sax. Sänk upp lever provet i 7 mL iskall HB i ett lämpligt märkt 15 mL koniskt rör. Håll provet på is under hela bearbetningen.
Anmärkning: Proverna kan förvaras på is eller vid 4 ° c över natten innan du fortsätter. Om standard markörer för makroautofagi och proteasomen aktivitet är de enda avsedda avläsning, kan leverprover frysas i flytande kväve och lagras vid-80 ° c för senare bearbetning. För att undersöka andra nedbrytnings mål (t. ex. via proteomik), bearbeta proverna utan att frysa. - Fortsätt till euthanize och dissekera nästa mus tills alla prover förvärvas. Bearbeta möss i samma Gruppordning de injicerades och registrera varaktigheten för det här steget (se kompletterande fil "exempel data"). Varje mus ska bearbetas på under 5 min för att begränsa skillnaden i exponeringstider för de injicerade inhibitorer.
5. biokemisk fraktionering av leverprover
Anmärkning: Figur 1b visar fraktioneringsschemat.
- Överför varje leverprov och 7 mL HB till en 15 mL kapacitet för Dounce Homogenisatorer. Homogenisera provet med 10 slag av den lösa kolven och 15 slag av den snäva kolven. Returnera den resulterande råa homogena till 15 mL koniska röret det härstammar från. Upprepa tills alla leverprover har homogeniserats.
- Spin rå homogena prover på 700 x g för 10 min vid 4 ° c till pellets kärnor och skräp. Överför de översta 4 mL av den postnukleära supernatanten (S1) till ett nytt 15 ml koniskt rör.
- Bestäm protein koncentrationen av fraktion S1 med hjälp av Bradford eller och Acid (BCA) analyser enligt tillverkarens anvisningar. Nästa utjämna koncentrationerna av alla prover till 2,1 mg/mL eller till önskad koncentration genom att tillsätta färsk HB till S1 vid behov. De normaliserade proverna är "total protein" (tot) fraktion. För analytiska ändamål i efterföljande led och kvalitetsförbättring, Ali quot 500 μL av tot -fraktionen och förvara vid-80 ° c.
- Överför 1,5 mL av den kvarvarande tot -fraktionen till ett microcentrifugerör och snurra på 3 000 x g i 15 minuter vid 4 ° c. Överför 1 mL av den resulterande supernatanten (S2) till ett nytt microcentrifugerör och Ställ på is.
- Aspirera återstående supernatanten och tvätta 3 000 x g pelleten (3kp) två gånger med 1,5 ml kallt HB. Den 3Kp pellets kan förvaras torrt vid-80 ° c om nedströms proteomik förväntas. Om endast västerländsk blotting förutses, Omsuspendera 3Kp pelleten i 200 μl av natriumdodecylsulfat polyakrylamidgelelektrofores (SDS-Page) prov buffert (tabell över material) och koka vid 95 ° c i 5 min.
- Snurra S2 -fraktionen vid 20 000 x g i 20 minuter vid 4 ° c. Överför den resulterande supernatanten (S3) till ett nytt microcentrifugerör. S3 är cytoplasmiska (CYTO) fraktion. För SDS-PAGE, kombinera 150 μL CYTO fraktion med 50 μl av 4x SDS-Page prov buffert och koka vid 95 ° c i 5 min.
- Aspirera återstående supernatanten från 20 000 x g pelleten (20kp) och tvätta två gånger med 1,5 ml kallt HB. Den 20Kp pelleten kan förvaras torrt vid-80 ° c om nedströms proteomik förväntas. Om endast västerländsk blotting förväntas, Omsuspendera 20Kp pelleten i 100 μl av SDS-Page prov buffert och koka vid 95 ° c i 5 min.
6. Western blotting avläsning
- För att kvantifiera makroautofagi och proteasomen Flux via Western blotting, komponera en stamlösning av renad gst-LC3b (2 μg/ml), P62-hans6 (2 μg/ml), och Lys48 länkade polyubiquitin (K48-UB, 50 μg/ml) i 1x SDS-sida exempelbuffert. Efter kokning vid 95 ° c i 5 min, alikvot och förvara vid-80 ° c för framtida bruk.
- Vid tidpunkten för SDS-sidan, generera en 6-punkts standardkurva av standard protein blandningen genom seriellt späda 1:3 i 1x SDS-sida exempelbuffert. Ladda 10 μL av varje standardkurva prov på en 26 väl 4 − 12% SDS-PAGE MIDI-gel, följt av före målat protein standarder (tabell över material), en kommersiell molekylvikt standard.
- För mätning av autofagi Flux, Ladda 12 μL av 3Kp prov i varje brunn.
Anmärkning: Förutsatt simulerad, bortezomib, och leupeptin behandlingar gjordes och antar 3 möss per behandling, varje gång punkt bör bestå av 9 prover. Därför kan varje MIDI-gel rymma 2 tid punkter plus standardkurvan och en typisk tidsserie experiment kommer att kräva 3 midi-gels för avläsning. - För mätning av proteasomen Flux, Fyll på 12 μl CYTO -fraktion i varje brunn.
- Separera proteinprover med SDS-PAGE och överför till polyvinylidenfluorid (PVDF) membran med hjälp av standardprotokoll. Om Western blotting för LC3b förväntas, överföra geler med 20% metanol-innehållande överföringbuffert. Annars, Använd 10% metanol-innehållande överföringbuffert eftersom detta kommer att möjliggöra en effektivare överföring av högmolekylära protein arter.
- Utför Western blotting med standardprotokoll. För analys av makroautofagi Flux, blot-membran som innehåller 3Kp prover med anti-P62 eller anti-LC3b antikroppar (1:1000) över natten vid 4 ° c. För att analysera proteasomen Flux, blot membran som innehåller CYTO prover med anti-Lys48 specifika polyubiquitin (1:1000) över natten vid 4 ° c.
- Image Western blotting med standard sekundära antikroppar och Imaging enheter. Bild alla membran som utgör ett givet tidsserie experiment tillsammans.
7. analys av data
Anmärkning: Se kompletterande fil "exempel data".
- För att utföra densitometri på Western blot-prov, Använd standard grafikprogram, image Studio, eller alternativt imagej.
- Utföra densitometriska mätningar på band av intresse för både standardkurvan och experimentella prover. I Image Studio, med hjälp av P62 som ett exempel, rita en lång rektangel som omfattar protein monomer längst ner och sträcker sig till toppen av membranet. Kopiera, klistra in och flytta rektangeln till de återstående exemplen. Det är viktigt att hålla den rektangel som används för kvantifiering konsekvent mellan proverna.
- Spara kvantifieringen i ett kalkylblad genom att trycka på rapportera och Starta kalkylbladet längst ned till höger i analysfönstret.
- Generera en Densitometrisk standardkurva med kalkylblad med seriellt utspädda standard provet och använda antingen linjär eller polynom regression för att få en bästa passning standardkurva ekvation. Med denna ekvation extrapolerar du kvantiteten av P62, LC3b-II eller Lys48-Poly UB i de experimentella proverna.
- För att erhålla Flux-mätningar subtrahera den extrapolerade proteinhalten för varje inhibitionbehandlat prov från det genomsnittliga värdet av PBS-proverna från samma tidpunkt (se kompletterande fil "exempel data").
- Utvärdera den statistiska betydelsen av temporala variationen i protein omsättningen med 1-vägs ANOVA. Detta kan göras med hjälp av standard kalkylprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa data presenteras i figur 2A, B, och kvantifieringen av dessa uppgifter finns i figur 2C, D (se även kompletterande fil "exempeldata"). För enkelhetens skull har vi inte avbildat lastnings kontrollerna i figur 2 , men dessa bör erhållas parallellt. Typiskt, västerländska blotting mot β-Actin används för detta ändamål, men en totalprotein fläck (såsom Ponceau S) kommer att räcka. Den primära avläsning för autofagi flöde vid en given tidpunkt är skillnaden i mängden av makroautofagi specifika markörer (P62 eller LC3b-II) mellan de leupeptin-behandlade kontra simulerade prover i lysosomen anrikad 3KP fraktion dividerat med 2 (antalet timmar mellan injektion av proteashämmare och vävnads skörd). Liknande data kan erhållas från 20KP prover, som också är Lysosomen berikade, men vår erfarenhet av mus lever är att de flesta av signalen segregerar i 3KP fraktionen. Vanligtvis normaliseras resultaten till medelvärdet som förenklar jämförelsen mellan oberoende experiment (figur 2C, D). Den primära avläsning för proteasomen omsättning är skillnaden i mängden Lys48-polyubiquitinated protein mellan bortezomib-behandlade kontra simulerade prover i cytosoliska ("CYTO") fraktion dividerat med 2. Eftersom P62 kan vara ett mål för både makroautofagi och proteasom3, är en alternativ markör för proteasomen Flux förändringen i P62 innehåll +/-bortezomib i 3kp fraktionen (se exempel data). Emellertid, vi tycker att denna markör är mindre robust jämfört med Lys48-polyubiquitinated protein och används bäst som stödjande data.
Figur 1: experiment steg och provbearbetning. (A) Schematisk av en typisk tidsserie experiment för att mäta dagliga rytmer i autofagi och proteasomen aktivitet (Flux) i mus levern. (B) fraktioneringsschema för att erhålla lysosome-berikade och cytosoliska lever protein fraktioner för Western blot-analys. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: prova experimentella resultat av Flux. Western blotting från en representativ tidsserie experiment för att mäta dagliga rytmer i autofagi Flux (a), och proteasomen Flux (B) i mus levern. Observera att under leupeptin-behandlade förhållanden, P62 körs som stege som sträcker sig från monomeriska form på ca 50 kDa till SDS-stabila komplex på ca 250 kDa. Tider på dagen avbildas i enheter av Zeitgeber Time (ZT), där ZT0 representerar lamporna på och ZT12 representerar belysningen. Observations tider som faller under belysningen är skuggade svarta. (C,D) Kvantifiering av dessa data. Varje datapunkt representerar medelvärdet ± SE (n = 3). Statistisk signifikans via enkelriktad ANOVA avbildas. Se den kompletterande filen "exempel data" för en tabell representation av dessa data. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tilläggsfil: exempeldata. Laboratorieanalys av densitometriska data och efterföljande statistisk analys. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vårt protokoll beskriver ett tekniskt enkelt sätt att mäta biologiska rytmer i protein omsättningen hos möss som använder allmänt tillgänglig molekylärbiologisk utrustning. På grund av tidsseriens experiment och antalet biologiska prover är det viktigt att vara konsekvent i hela experimentet när det gäller hur möss injiceras, tidpunkten för vävnads förvärvet och den biokemiska bearbetningen av Prover. I stegen för injektion, eutanasi och cervikal dislokation kan det krävas operatörs övning innan ett fullskaligt experiment inleds. Det är bäst för en enda operatör att utföra alla vävnad dissektioner eftersom olika individer dissekera i olika hastigheter, men om detta är omöjligt det kan vara värt att öka tiden mellan proteas inhibitor injektion och vävnad skörd från 2 h till 3 eller 4 h ( under förutsättning att detta görs konsekvent över tidspunkter).
Vanliga orsaker till felsökning är variationer i flödet mellan biologiska replikprover och dålig västerländsk blot-kvalitet. När det gäller prov variation kan detta bero på att flera operatorer används med olika dissekationshastigheter eller erfarenhetsnivåer. Detta kan mildras genom att köra övnings experiment tills genomsnittliga dissekera gånger är mindre än 5 min per mus. Alternativt kan en enda operatör användas för att utföra dissektioner. Hög bakgrund på västerländska blotting kan uppstå från ojämn överföring, otillräcklig blockering, låg kvalitet primär antikropp, eller otillräcklig tvättsteg. Bästa resultat uppnås genom över natten våt överföring av SDS-PAGE separerade proteinprover till PVDF i 10 − 20% metanol som innehåller överföringbuffert, med hjälp av 10% fettfri torrmjölk för blockering, och omfattande tvättning mellan steg (3x 10 min minimum på en mekanisk Rocker).
Denna teknik har flera begränsningar. För det första kräver det beskrivna protokollet ett betydande antal djur och är därför resursintensivt. Medan en minimal tidsserie experiment spänner över 24 h, experiment på minst 2 cykler är idealiska för att bekräfta att de dagliga variationer som observeras i protein omsättningen är reproducerbara, och för att uppskatta rytm egenskaper som periodicitet och fas12 . Eftersom tiden måste förflyta mellan när proteashämmare administreras till möss och tidssamplingar skördas (för att möjliggöra mål av proteolys att ackumuleras), den erhållna omsättningen mätningar representerar en genomsnittlig aktivitet över ett 2 h intervall snarare än en punkt uppskattning. Som ett resultat, det finns en gräns för den upplösning som denna analys kan ge för att upptäcka dynamiska förändringar i proteinkatabolism. Slutligen, detta protokoll är optimerad för mus lever och biokemiska fraktionering förfarande som presenteras här skulle sannolikt behöva ändras för att effektivt få lysosomer från andra vävnadstyper.
Detta är den första metoden för att direkt mäta dagliga rytmer i autofagi Flux som också möjliggör Proteome-wide observationer av detta fenomen. Framtida tillämpningar av denna teknik inkluderar analys av proteolytiska rytmer i olika sjukdomsmodeller, inklusive autoimmun sjukdom, cancer, och akut infektion. I rektor kan denna metod anpassas till andra mus organ och till explanterad människa tar prov, som föreställer en spännande framtida applikation med kicktranslational potentiellt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av RO1HL135846 och ett Children ' s Development Institute Grant (PD-II-2016-529).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4x SDS PAGE Sample Buffer | Invitrogen | Cat# NP0008 | |
| Bortezomib | EMD Millipore | Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7 | |
| Image Studio | LICOR | N/A | |
| Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron | Merck Millipore Ltd | Cat# IPFL00010 | |
| K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | Cat#8081S; RRID:AB_10859893 | |
| LC3a | Boston Biochem | Cat# UL-430 | |
| LC3b antibody | Novus | Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146 | |
| LC3b antibody | Cell Signaling Technology | Cat#2775; RRID:AB_915950 | |
| Leupeptin | Sigma | Cat# L2884; CAS: 103476-89-7 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | Cat# WG1403BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Fisher Scientific | Cat# NP0007 | |
| P62-his | Novus | Cat# NBP1-44490 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | Cat# 1610373 | |
| Rabbit Anti-p62/SQSTM1 | Millipore-Sigma | Cat#P0067; RRID:AB_1841064 | |
| rhPoly-Ub WT (2-7) (K48) | Boston Biochem | Cat# UC-230 | |
| SDS-PAGE Midi-size Gels | Invitrogen | Cat# WG1403 | |
| SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets | Millipore-Sigma | Cat# S8830 |
References
- Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J.
- Ma, B. Y., et al. LPS suppresses expression of asialoglycoprotein-binding protein through TLR4 in thioglycolate-elicited peritoneal macrophages. Glycoconjugate Journal. 24 (4-5), 243-249 (2007).
- Ryzhikov, M., et al. Diurnal Rhythms Spatially and Temporally Organize Autophagy. Cell Reports. 26 (7), 1880-1892 (2019).
- Martinez-Lopez, N., et al. System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy. Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).
- Desvergne, A., et al. Circadian modulation of proteasome activity and accumulation of oxidized protein in human embryonic kidney HEK 293 cells and primary dermal fibroblasts. Free Radical Biology and Medicine. 94, 195-207 (2016).
- Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W.
- Ciechanover, A. Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting. Cell Death & Differentiation. 12 (9), 1178-1190 (2005).
- Collins, G. A., Goldberg, A. L.
- Haspel, J., et al. Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay. Autophagy. 7 (6), 629-642 (2011).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
- Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P.
- Hughes, M. E., et al. Guidelines for Genome-Scale Analysis of Biological Rhythms. Journal of Biological Rhythms. 32 (5), 380-393 (2017).
