Summary
Her presenterer vi en protokoll for å kvantifisere hekker bygge oppførsel i mus, som er kjent for å være svekket i flere nevrologiske lidelser og sykdommer. Denne protokollen undersøker nytten av fire materialer og gir mulighet til å kvantifisere rater avtalen i scoring, forbedre gyldigheten og påliteligheten av analysen.
Abstract
Nest bygningen er en medfødt atferd i mannlige og kvinnelige gnagere, selv når reist i laboratoriet innstillinger. Som sådan, mange forskere gir gnagere syntetiske og/eller naturlige materialer (for eksempel hyssing, vev, bomull, papir og høy) som et mål på deres generelle trivsel og som en hjelpeutstyr vurdering å forutsi mulig nedgang i kognisjon. Vanligvis vil endringer i nesting virkemåter, for eksempel unnlatelse av å opprette et reir, indikere en endring i helse eller velferd. I tillegg er hekkende atferd følsom for mange miljømessige og fysiologiske utfordringer, samt mange genetiske mutasjoner underliggende patologiske sykdommer stater. Følgende protokoll beskriver et nesting atferds paradigme som utforsker bruken av fire typer hekkende materiale. I tillegg bruker protokollen intraclass sammenhenger å demonstrere at Inter-rater pålitelighet er høyere når reir er konstruert ut av revet papir i forhold til andre vanlige hekkende materialer som bomull firkanter, papir vendinger, og myk cob Sengetøy. Den valgte metodikk og statistiske hensyn (dvs. intraclass korrelasjon) for denne analysen kan være av interesse for de gjennomfører eksperimenter vurdere kvaliteten på levende av mus.
Introduction
Nest bygningen er en medfødt atferd i mange dyr som fugler, fisk, gnagere, og store aper, og det tiltrekker seg mer oppmerksomhet for sin potensielle nytte i studiet av nevrologiske sykdommer og lidelser preget av redusert trivsel og svekket dagliglivets aktiviteter1. Mus, både mannlige og kvinnelige, bygge tilsvarende store reir for reproduktive formål, varme bevaring, og ly; enda viktigere, fortsetter de å gjøre det selv når hevet i laboratorie innstillinger2. Hess, Petrovitsj, og Goodwin3 hevder at biologisk-hensiktsmessige stimuli er avgjørende for å indusere biologisk-passende atferd som hekkende; imidlertid har en rekke naturlige og kunstige materialer, slik som høy, hamp, bomull hyssing, papirstrimler, bomull Dental baller, og presset bomull firkanter, blitt brukt til å vurdere hekker bygge atferd2. Endringer i disse nesting atferd (dvs. unnlatelse av å opprette et reir ut av det oppgitte materialet) generelt indikerer en endring i helse eller velferd. I de fleste tilfeller, mangel på reir bygningen er tilskrevet flere faktorer som negativt påvirke trivsel. Slike eksempler som har alle effektivt redusert kvaliteten på reiret bygning i mus inkluderer ekstreme temperaturer; smertefull stimulering; indusert sykdom og infeksjon; genetiske mutasjoner; og hjerne lesjoner i midtre preoptic områder, septum, og hippocampus4,5,6.
Alzheimers sykdom er en progressiv nevrodegenerative sykdom karakterisert ved tap av hjernevev, akkumulering av ekstracellulære amyloid-β plaketter, og intracellulære neurofibrillary floker komponert hyperphosphorylated mikrotubulinettverket-assosiert protein, tau7. I tillegg er Alzheimers sykdom preget av, spesielt, underskudd i læring og hukommelse og nedskrivninger av daglige leve aktiviteter. Hos mus blir dagliglivets aktiviteter ofte undersøkt via døgn hjuls driften8,9,10,11, selv om nye alternativer, for eksempel nesting, vokser i popularitet. Nesting har vist å være følsomme for manipulasjoner (f. eks genetiske mutasjoner, miljømessige stressfaktorer) som har blitt identifisert som risikofaktorene og/eller årsaker til Alzheimers sykdom. Som sådan, nesting kan brukes som en ekstra eller komplementær analysen i mange mus stammer som modellen de karakteristikkene av Alzheimers sykdom. For eksempel, Deacon og kolleger12 målt reir bygging av Tg2576 mus med den svenske amyloid forløper protein (APPswe) og presenilin 1 (ps1) genetiske mutasjoner. Kvaliteten på reir konstruert av gruppe-huset Tg2576 mus var betydelig verre enn wildtype kontroller på både 3-og 12-måneders alder. I samråd med disse funnene, Filali et al.13 rapporterte at enkeltvis plassert APPSWE/ps1 mannlige mus gitt to stykker av 5 x 5 cm bomull bygget betydelig dårligere reir som vurdert på en skala fra 1-5 (1 = nestlet ikke rørt, 5 = en nær perfekt reir). Transgene mus bygget konsekvent verre reir på 6-, 9-, og 12-måneders alder i forhold til sine wildtype kolleger, og i noen tilfeller, Appswe/PS1 mus fullstendig klarte ikke å bygge et reir ut av den med følgende bomull.
Tidligere forskning fra laboratoriet vårt har vist at wildtype C57BL/6J-mus bygger betydelig bedre reir ut av bomulls ruter sammenlignet med CRND8 og CRND8/E4 mus9. Imidlertid ser flertallet av eksperimenter med pressede bomulls firkanter ut til å være variable, med wildtype mus som ikke viser forventede høye poengsummer sammenlignet med transgene mus som forventes å vise svært lave resultater i nesting2, noe som delvis kan føre til en mangel på forskjeller i estimerte parametre (dvs. bety forskjeller) og statistisk betydning. Mangelen på forskjeller kan skyldes delvis til utilstrekkelig aldring av mus eller tid avsatt til nesting. Eventuelt nesting materiale kan være en ekstra utfordring, noe som resulterer i mer variasjon på grunn av forskerne ' metodisk preferanser i mengde og type materiale, som kan også samhandle med musen belastning. For eksempel, Robinson-Junker og kolleger14 forutsatt behandlet eller ubehandlet sengetøy materiale av forskjellige størrelser (dvs. små eller store flak) til C3H/HeNCrl mus og BALB/cAnNCrl mus, som er ofte observert, henholdsvis som dårlig og sterk reir utbyggere. Da forutsatt ubehandlet sengetøy, C3H mus bygget mindre komplisert, men likevel lik i kvalitet reir i forhold til de av BALB/c mus. Likeledes, Martin og kolleger15 sammenlignet reir kompleksitet forskjellige hekkende materialer gitt til hjort mus, en fjern slektning av mus laboratoriemusmusculus arter som har distinkte evolusjonære forskjeller (dvs. mer sannsynlig å hule i trær og kratt og er mer aktive i fangenskap), men får tilsvarende husdyrhold omsorg som vanlige laboratoriet mus og bygge reir ut av alle tilgjengelige myke, fiber materiale16,17,18. Kvinner og oppdretter med pups inne hjemmet bur bygget flere innviklet reir enn hanndyr, og forfatternes foreslå det disse opptreden forskjellene kanskje skyldes forbundet endre inne progesteron konsentrasjonen inne hjort mus15. Enda viktigere, mus bygget mer komplekse reir bestående av brunt papir etterfulgt av bomull firkanter og bomull sylindere, og de minst komplekse reir ble bygget ut av hvitt papir og spredt mini-bomull firkanter.
Til tross for den økende populariteten til hekkende, betraktninger om vitenskapelig gyldig, kostnadseffektiv, og tidssensitiv praksis er minimalt diskutert. Gitt de nevnte metodisk og økonomiske utfordringer, undersøker denne protokollen nytten av ulike hekkende materialer-bomull firkanter, papir vendinger, revet papir, og bearbeidet sengetøy-i hekkende atferd. Spesielt ga vi alle hekkende materialer til både alderen C57BL/6J wildtype kontroller og Alzheimers sykdom APOE E4 mus for å undersøke eventuelle potensielle genotype av materielle interaksjoner i hekkende kvalitet. I tillegg forsøkte eksperimentet å vurdere Inter-rater pålitelighet av reir konstruert av forskjellige materialer. Til sammen demonstrerer denne protokollen overlegenhet ett hekkende materiale i denne prøven-revet papir-i form av reir kvalitet og scorer avtale, med den hensikt å forbedre gyldigheten og påliteligheten av hekkende analysen.
Protocol
Alle prosedyrer ble godkjent av George Mason University institusjonelle Animal Care og bruk komiteen og er i samsvar med retningslinjer fastsatt av Assessment og akkreditering av Laboratory Animal Care.
1. dyr og betraktninger før vurderingen
- For denne protokollen, bruk voksen, 9-12-måned gamle C57BL/6J (n = 10) (stock # 000664) wildtype mus og APOE E4 mus (n = 11) fra en hemizygous J20 (Stock #006293) x homozygote APOE E4 (lager #012307) korset.
- I bolig rommet, gruppe-House mus med littermates av samme kjønn med passende berikelse (for eksempel for denne protokollen, mus ble gitt et kjørende hjul, Igloo, og en liten nylon tygge leketøy). Gruppe-House 4-6 kvinnelige mus, og 4 hanner i en 356 mm L x 485 mm W x 218 mm H hjem buret.
Merk: forskerne kan vurdere å implementere strategier før og/eller etter nesting for å unngå Cage-kompis aggresjon når mus blir igjen etter nesting prøvelser. Slike strategier kan omfatte, men er ikke begrenset til, daglig håndtering før atferds testing for å bedre acclimate mus til håndtering under atferds testing, forskere og husdyrhold ansatte19, skille og individuelt bolig aggressive mus, eller redusere antall mus i homecage20, avhengig av alvorlighetsgraden av in-Cage kampene, observerte sår21, etc.
2. rom og hekkende oppsett
- Sørg for at hver mus fullfører fire forsøk (1 materiale per prøve). Bruk tilfeldig rekkefølge på neste materiale for hver mus for å unngå en ordre effekt.
- Forbered burene i et eget test rom. Record miljømessige forhold (f. eks 22,2-22.3 ° c, 45-47% fuktighet, lys på 9:00 AM-9:00 PM) slik at de er konsekvente på tvers av prøvelser og er identiske med bolig rommet. Gi mat og vann Ad lib.
- Gi hver mus et tilfeldig identifikasjonsnummer (ID) eller en bokstav. Fest den tilfeldige identifikatoren kortet til en 29,2 x 18,4 cm buret.
- Ta opp det opprinnelige dyret ID/Tag og annen nødvendig identifikasjon i en koloni posten for å sikre at assistenter og husdyrhold personalet forblir blind for forholdene.
- Tilfeldig rekkefølge på plassering av bur i testrommet slik at wildtype og transgene mus ikke feilaktig skilles (dvs. på hver sin side av rommet, på separate hyller, etc.).
- Forbered hekkende materialer ved tilstrekkelig dekke bunnen av buret. Bruk ca 100 g tørr vekt av corncob bedding for arealet, krølle, og filler papir rettssaker, og ca 100 g av det bløt cob bedding for det bløt cob prøve.
- Hvis du bruker et beger for å spre hekke materialet, må du fylle begeret ikke mer enn 100 mL med corncob sengetøy eller myke cob sengetøy.
- Plasser det første hekke materialet i sekvensen før du introduserer musen i buret. Denne protokollen benyttet (1) en enkelt presset bomulls plass, (2) en enkelt papir vri, (3) 100g av myke cob sengetøy bare (dvs. ingen ekstra sengetøy eller hekkende materiale lagt), og (4) 2,5 g ren (ingen blekk), revet hvitt skriveren papir skåret i 5-7cm strimler. Sprer hekkende materialer som vist i figur 1 (grunnlinje).
Figur 1: Cage satt opp for hvert materiale. Alle mus fullførte en rettssak med hver type materiale for totalt fire forsøk. Corncob sengetøy foret hele bunnen av bur som inneholder en papir vri, en presset bomulls plass, og revet papir. Soft cob sengetøy var jevnt spredt over buret for å oppmuntre mus til å skille ut de små bomulls rutene fra corncob. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
3. nesting rettssak
- Start første hekkende prøve på samme tidspunkt på dagen ved starten av lys syklusen (for eksempel 9:00 AM).
- Bring homecage som inneholder musene inn i testrommet. Fjerne hver musen fra det homecage og sted den i dens bestemt hekkende bur med det materiale allerede oppstilt inne byrået. Returner homecages til bolig rommet.
- Tillat mus å fullføre 1 rettssaken for 24 h uforstyrret.
- 24 timer etter starten av den første rettssaken, gå tilbake til testrommet.
- Forsiktig fjerne lokket av byrået og fotografi hver musen ' reir, fanger det bestemt ID inne fotografiet og minimere fremkomsten av alle materiale ytterside av byrået.
Merk: Vent til musen for å flytte av reiret før du prøver å fjerne den fra buret. Det er en kraftig anbefalt å fotografi det reir stund musa er inne byrået bortsett fra av reiret. Forsøker å fjerne musen fra buret før fotografere kan potensielt føre til at musen til å bli skremt, og dermed flytte på toppen av, og spre, hekkende materialer. - Mildt fjerne musa fra det hekkende bur og sted den inne en foreløpig avholde bur. Kast sengetøy og eventuelle hekkende materialer, erstatte sengetøy og gi neste hekkende materiale i sekvensen, og returnere musen til hekkende buret.
- Gjenta etter behov for å få poeng for alle fire forsøkene. Det anbefales å bruke revet papir og tilhørende scoring kriterier, selv om forskerne kan være interessert i å bruke alternative materialer diskutert i denne protokollen.
- Når alle forsøkene er ferdige, returner mus til sine hjem bur. Observer musene for enhver potensiell aggressiv atferd. Aggresjon kan forekomme hos eldre wildtype hanner.
Merk: ved anvendelsen av denne protokollen ble musene testet en gang på ca. 9 – 12 måneders alder. Nesting bør gjennomføres i flere aldre (dvs. i en tidligere alder, avhengig av den valgte belastningen, før utbruddet av fenotypiske trekk) for å dokumentere nedgangen i hekkende kapasitet over tid og demonstrere den sannsynlige utløsende rolle neurodegeneration.
4. scoring og vurdering Inter-rater pålitelighet
- Gi Baseline bilder for hvert hekkende materiale til minst 2 personer blinde til studien. Selv om det ikke er nødvendig, sikre at de skårer er kjent med begrepet hekkende. Når du skal trene, kan du gi en rekke eksempel reir (f.eks. figur 2 for papir som er revet ut) for å gjøre de som skårer, med hver type materiale (hvis aktuelt) og poengkriteriene.
- Evaluer hvert reir på en skala fra 1 – 5 ved hjelp av følgende skala informasjon (tilpasset fra Deacon, 2006)2. Se figur 2 som eksempel scoring ved hjelp av filler papir.
- Anvise en snes av 1 når det filler papir eller liten kvadrat være igjen spredt helt gjennom byrået, eller det hytten kvadrat eller krølle forble urørt;
- Tildel en poengsum på 2 når noe av materialet ble bygget inn i et reir, men over 50% av materialet ble ikke brukt til reir konstruksjon (dvs. forble spredt eller flertallet av det opprinnelige materialet forble urørt);
- Tildel en poengsum på 3 når en merkbar reir ble bygget, men flere brikker var fortsatt spredt;
- Tildel en poengsum på 4 når nesten alt materialet ble brukt for reiret, men få biter av materialet forble spredt eller var i nærheten av reiret;
- Tildel en poengsum på 5 når alt materiale ble brukt til å lage en identifiserbar reir.
Merk: skårer bør ta pauser og tilbake Baseline bilder for å unngå tretthet og bias underscoring prosedyren. Skårer bør ikke diskutere poengsummer med hverandre for å unngå skjevhet. Scoret bør diskutere score etter scoring er fullført, eller hvis videre diskusjon er nødvendig for å endre score, noe som kan potensielt løse problemer med intraclass sammenhenger (ICC). Intraclass sammenhenger vil bli gjennomført ved hjelp av trinnene oppført i § 4,2.
Figur 2: eksempel på scoring bruker kriteriene for revet papir, det foretrukne materialet. Fra venstre til høyre: 1 -den revet papiret forble urørt; 2 -noen av papiret ble bygget inn i et reir, men de fleste av bitene forble spredt; 3 -en merkbar reir ble bygget, men flere stykker var fortsatt spredt; 4 -de fleste brikkene ble brukt for reiret, men noen brikker ble spredt i nærheten av reiret; 5 -alle brikkene ble brukt til å lage reiret. Note det inne fotografiene, det dyr ' bestemt antallet er vist å unngå unblinding. Fargen på kortet er tilfeldig. Forskere bør la musen til å forbli i buret for å unngå oppsiktsvekkende musen, noe som potensielt kan spre reiret. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Samle inn og innspill score og formatere datafilen slik at hver scorer poeng for hvert materiale er i separate kolonner.
Merk: Hvis du bruker tilleggsfil 1, må du være oppmerksom på at kodings skriptet for denne analysen krever gratis, åpen kilde-programvare (for eksempel IRR -pakke i RStudio)22,23. Skriptet fjerner overskrifter og forsøks variabler (dvs. den øverste raden og dyre-ID-ene) for å utføre intraclass korrelasjon (ICC). Kjør skriptet til å gjennomføre en toveis, avtale, gjennomsnitt måler ICC ved å markere den avgrenset delen av koden og trykke CTRL + ENTER eller Command + ENTER. - Sammenlign ICC med eksisterende kriterier24,25,26. Vanligvis samsvarer ICC-verdier over 0,80 med sterk rater pålitelighet, og begrunner resultatene med å være gjennomsnittet på et gitt tidspunkt (tilleggsfil 2).
- Bruk samme ICC-kriterier for rater pålitelighet, som kan være av interesse for de som gjennomfører scoring for første gang.
FORSIKTIG: skårer bør score de samme fotograferte reir innen en uke etter den første vurderingen. Fortsett med forsiktighet med snitt data når ICC er lav, da dette kan forskyve data eller produsere null funn. Hvis ICC-verdiene er lave, kan (1) ytterligere opplæring for skårer kreves, (2) skårer må kanskje diskutere deres begrunnelse for nest score, (3) en annen uavhengig kontrollør kan være nødvendig for å foreta en dom samtale om score, eller (4) intra-rater kan det hende at påliteligheten må vurderes. Hvis intra-rater pålitelighet er dårlig, deretter ytterligere trening eller en annen målscorer kan være nødvendig.
5. statistiske hensyn
- Foreta statistiske analyser etter behov. For data som ikke bryter normalitet antagelser, men bruker flere materialer for hver mus (dvs. en effekt innenfor motivet), bruker du en blandet analyse av varians (ANOVA).
- Hvis du bruker koder gitt som supplerende filer, kan du laste ned ekstra add-on pakker som er spesifisert i skriptet27,28,29,30.
- Hvis gjennomfører en blandet ANOVA benytter det forsynt skriften, løpe manuskriptet å konvertere alle bred-formatter datafil-størrelse i lang-formatter (i.e., istedet for variabler gjentatt vannrett rekkene, konvertere cellene å gjentagelse vannrett rekkene). Et eksempel på en datafil er inkludert i dette manuskriptet for å demonstrere hvordan man konverterer en datafil fra bredt format til langt format.
- Gjennomfør blandet ANOVA, som angitt i skriptet. Merk at hvis Mauchly ' s test av Sfærisitet er krenket, deretter iverksette korreksjon faktorer som Greenhouse-Geisser korreksjon.
- Gjennomføre eventuelle nødvendige posthoc tester for å undersøke forskjellene mellom faktorer med mer enn 2 nivåer, som angitt i kodingen skriptet. I dette eksempelet utfører du Bonferroni posthoc tester for å sammenligne de ulike typene av hekke materiale.
Merk: Hvis bare ved hjelp av ett hekkende materiale, så ikke innlemme en innenfor-fag faktor. Hvis samle inn data på flere tid poeng, men innlemme disse gjentatte tiltak som om nivåer av en innenfor-fag faktor.
Merk: i noen tilfeller, wildtype mus kan ha perfekt score og dermed vil vise en tak effekt, som fører til en ikke-normalfordeling2. Vurder egnede statistiske tester (f.eks. parametriske tester med alternative målinger av sentrale tendenser og dispersjon), normalisering metoder eller robuste tilnærminger (blandede effekter modellering for gjentatte tiltak) når analysere data.
Representative Results
Resultatene fra de fire ulike hekke materialene som leveres til wildtype og APOE E4-mus forklares som følger. Basert på eksisterende kriterier viste ICC en sterk avtale mellom alle tre programmerere for alle fire hekkende materialer (revet papir ICC = 0,94; Square ICC = 0,91; bedding ICC = 0,87; Twist ICC = 0,87); Derfor var de tre score gjennomsnitt sammen for å lage en enkelt poengsum for hvert materiale som tilbys. A 2 x 4 blandet ANOVA gitt en betydelig viktigste effekten av genotype, F(1, 19) = 31,30, p < 0,01, ηp2 = 0,62. På tvers av alle fire leverte materialer, wildtype mus scoret høyere på reir kvalitet (3,18 ± 0,20) sammenlignet med APOE E4 mus (1,98 ± 0,16). I tillegg blandet ANOVA gitt en betydelig viktigste effekten av materiale, F(3, 57) = 57,48, p < 0,01, ηp2 = 0,75. Parvis sammenligninger med Bonferroni korreksjon viste at revet papir (4,11 ± 0,20) ble vurdert betydelig høyere (p < 0,05) i kvalitet enn plassen (1,95 ± 0,21), sengetøy (2,21 ± 0,21), eller vri (1,94 ± 0,20) materialer, uten forskjeller sett mellom torget, sengetøy, og vri materialer (alle p > 0,99). Det var ingen signifikant interaksjon mellom genotype og materiale. Data er vist i Figur 3.
Andre eksperimenter fra laboratoriet vårt har gitt lignende resultater i tidlig debut modeller av Alzheimers sykdom. For eksempel, som demonstrert i Figur 4, 5,5-måneder gamle P301L rTg4510 (htau) mus betydelig verre reir ut av revet papir i forhold til deres alder matchet wildtype kolleger31. Likeledes, dobbelt J20 (hAPP)/htau og enkelt htau mus bygget fattigere reir ut av revet papir i forhold til sine wildtype og CAMKIIa-promoter bare kolleger, både på 3,5-og 7-måneders alder32 (data ikke vist).
Figur 3: vurdert kvalitet av reir laget av forskjellige materialer levert til wildtype og APOE E4 mus. En hoved effekt av genotype (* p < 0,01) viste at wildtype mus konsekvent bygget bedre reir laget av revet papir, presset bomull firkanter, papir vri, og myke cob sengetøy sammenlignet med APOE E4 mus. Den viktigste effekten av materiale (* * p < 0,01) viste også at reir konstruert fra revet papiret ble vurdert høyere i kvalitet i forhold til de tre andre materialer. Den revet papir hadde den høyeste Inter-rater pålitelighet måle som vurdert av ICC. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: revet papir reir bygget av wildtype og htau mus, på eller av sink vann. (A) representative reir konstruert av 5,5 måneder gamle wildtype og htau mus, på kontroll (trykk) vann eller vann supplert med 10 deler per million sink (en biometal innblandet i Alzheimers sykdom). Reir ble scoret på 1-5 skala ved hjelp av de angitte kriteriene. Fra venstre til høyre: wildtype + sink vann (4.54 ± 0.52); wildtype + kontroll vann (4.15 ± 0.80); htau + kontroll vann (3,08 ± 0,64); htau + sink vann (2.46 ± 0.97). (B) en genotype * vann interaksjon demonstrert at htau mus på sink vann bygget betydelig verre reir i forhold til andre grupper (*); i tillegg viste enkle effekter at htau mus på sink vann bygget verre reir enn htau mus på kontroll vann. Wildtype mus på kontroll vann og sink vann-bygget reir av høyere, og lignende kvalitet, sammenlignet med sine htau kolleger. Gjengitt fra Journal of Alzheimers sykdom, 64 Vol, Craven, KM, Kochen WR, Hernandez CM, Flinn JM, sink forverrer tau patologi i en tau Mouse modell, 671-630, Copyright (2018), med tillatelse fra IOS trykk31. Publikasjonen er tilgjengelig på IOS press gjennom http://dx.doi.org/10.3233/JAD-180151. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tilleggsfil 1: Tilleggskode fil-nesting. R Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: AD Study nesting score. csv Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Nesting er en evolutionarily viktig gnager oppførsel og har blitt brukt til å vurdere aktiviteten til daglig livsopphold og generell trivsel i mus2. Den enkle å utføre testen, dets pålitelighet, og dens ansikt gyldighet gjør hekker et praktisk supplement til mange atferdsdata tester som gravende, døgnrytme, og grooming. Men, som hekkende blir mer vanlig utnyttet i laboratoriet, de ulike kombinasjonene å gjennomføre, kvantifisere, og tolke hekkende øke. Som sådan, er videre forskning nødvendig for å utforske de beste metodologisk og praktisk talt lyd prosedyrer for nesting, slik at gyldigheten og påliteligheten av analysen ikke er ofret for kostnader, tid for testing, og andre prosedyrer som reduserer testing byrde .
Nest bygningen kvalitet er virkelig følsom for den type senger som tilbys samt genotype. Totalt bygde wildtype mus betydelig bedre reir sammenlignet med APOE E4-mus, uavhengig av hekke materialet. men både wildtype og APOE E4 mus bygge betydelig høyere kvalitet reir ut av revet papir i forhold til de tre andre hekkende materialer. Annet studier skaffe bekrefter bevis angående det filler papir: mus bygget flere innviklet reir ute av filler papirstrimler enn med presser hytten kvadrat, tissue, og osp bedding33. Videre hekker bygget ut av revet papirstrimler er kvalitativt evaluert som mer "natur" enn de som er laget av andre materialer, som er preget av formen på reiret selv og høyden på veggene rundt reiret hulrom i for å danne en kuppel6,33. Som sådan, valg av riktig materiale for denne analysen er avgjørende for å bedre observere naturlig atferd i et relativt kontrollert miljø, dvs, laboratoriet innstillingen. Enda viktigere, selv om denne protokollen vurderte nesting en gang på 9 – 12 måneders alder, understreker vi at nesting bør gjennomføres i flere aldre. Enkelheten av denne protokollen tillater det å bli gjennomført flere ganger, ideelt før utbruddet av underskudd som følger neurodegeneration. Gjentatte målinger råd til muligheten til å dokumentere den sannsynlige utløsende rolle neurodegeneration i redusert hekkende evne.
Naturlig hekker bygningen har vist seg å være forskjellig blant mus av ulik bakgrunn stammer34, og som sådan, den generelle kvaliteten og formen på reiret kan avvike ikke på grunn av transgene av interesse, men på grunn av bakgrunnen belastning. For eksempel ble forfedrene til C57BL/6-musene betraktet som "Hole" byggere, mens forfedrene til BALB/C-musene ble betraktet som "Surface" byggere35. Mus på C3H bakgrunn eller krysser med denne belastningen, slik som hybrid C3H/he-C57BL/6 med E4 som brukes i Graybeal et al.9 er også ansett for å være dårlig byggere; Derfor bør forskerne sterkt vurdere å bruke kontroll mus på samme bakgrunn som transgene mus, noe som vil generelt bedre den direkte, utløsende rolle transgene (e), snarere enn bakgrunnen, i neurodegeneration og påfølgende underskudd i reir bygningen oppførsel.
Noen eksperimenter ofte bruke en enkelt scorer å kvalitativt bedømme kompleksiteten i reiret; Vi gjør imidlertid argumentet om å inkludere flere skårer, og enda viktigere, scoret blinde til eksperimentelle forhold. Gjennom denne tilnærmingen, benyttet vi tre uavhengige, blinde scoret og en intraclass korrelasjon for å vurdere avtalen blant de scoret, som, med grunnleggende opplæring, ga høy intraclass sammenhenger som var tegn på høy Inter-rater pålitelighet og sterk enighet om reir kvalitet. Videre, scorene til reir bestående av revet papir og bomull firkanter hadde den høyeste intraclass sammenhenger, en indikasjon på sterkere enighet og større konsistens blant de scoret. Den sterke avtalen gir også begrunnelse for gjennomsnittlig flere scorene sammen, en strategi måfå implementert i atferdsforskning. Selv om denne strategien krever flere individer og, antagelig, mer tid til å score reir, det effektivt reduserer skjevhet i kvalitative vurderinger som hekkende.
Den hekkende materialer som brukes i denne analysen var omtrent like i pris bortsett fra den myke cob sengetøy. Kommersielle sengetøy for hekkende kan være økonomisk ressurssterk for noen forskere; men Martin et al.15 Merk at bomulls firkanter, sammenlignet med andre materialer som plissert papir, er en av de dyreste materialene som er tilgjengelig for kjøp. Dette kan skyldes enkel tilgjengelighet, lagring og administrasjon, men andre forskere kan velge tilsvarende gyldige og pålitelige materialer, spesielt når de blir utfordret av et stort antall dyr i et anlegg, antall hekke forsøk, tidsbegrensninger for scoring reir, og høye bur kostnader. Således, filler papir kanskje være en flere gjennomførbar og passende valgmuligheten. I tillegg datafangst for vår metode kan gjennomføres umiddelbart (dvs. scoring i person), selv om fotografier bør være svært vurderes for å registrere, lagre og re-kvantifisere reir, hvis ønskelig for å vurdere Inter-og intra-rater påliteligheten til senere tider. Som nevnt, vi sterkt understreke inkludering av flere scoret for "test, re-test" praksis å vurdere for enighet, da disse metodologisk lyd prosedyrer er ofte oversett.
Avslutningsvis tror vi at metodikk og statistiske hensyn (dvs. intraclass korrelasjon) for denne analysen kan være av interesse for eksperimenter vurdere kvaliteten på levende, generell trivsel, og aktiviteter daglig bor i mus.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Kevin Quant, Mario Martinez, og Edwin Portillo for scoring reir, Rachel Barkey for å bistå i forberedelsene til filming, og Stephen Lippi og Deborah Neely for korrekturlesing dette manuskriptet. Vi vil også gjerne takke Department of Psychology for å dekke kostnadene ved bur for dette eksperimentet, og Krasnow Institute Animal Facility vaktmester for deres støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corncob bedding | Envigo | 7092 | 1/8 in bedding for cotton squares, shredded paper, and paper twist trials |
| Cotton Squares | Envigo | Iso-Blox | |
| Diamond Twists | Envigo | 7979C.CS | Paper twists used in protocol |
| Mouse - APOE4 e4 | Jackson Laboratories | #012307 | Homozygous APEO4 e4 mouse bred with hemizyous J20 mouse |
| Mouse - C57BL/6J | Jackson Laboratories | #000664 | Wildtype mouse for controls |
| Mouse - J20 | Jackson Laboratories | #006293 | Hemizygous mouse bred with the homozygous APOE e4 mouse to generate cross |
| Rstudio | R Core Team | V1.1.463 | Run with R version 3.5.3 (2019-03-11) -- "Great Truth". Note: additional R Packages are included in provided code and can be installed from CRAN |
| Soft Cob | Envigo | 7087C |
References
- Torres-Lista, V., Gimenez-Llorta, L. Impairment of nesting behavior in 3cTg-AD mice. Behavioural Brain Research. 247, 153-157 (2013).
- Deacon, R. Assessing nest building in mice. Nature Protocols. 1 (3), 1117-1119 (2006).
- Hess, E., Petrovich, S., Goodwin, E. Induction of Parental Behavior in Japanese Quail. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 90 (3), 244-251 (1976).
- Deacon, R. Hippocampal cytotoxic lesion effects on species-typical behaviors in mice. Behavioural Brain Research. 132, 203-213 (2002).
- Deacon, R. Effects of medial prefrontal cortex cytotoxic lesions in mice. Behavioural Brain Research. 139, 139-155 (2003).
- Gaskill, B. N., Karas, A. Z., Garner, J. P., Pritchett-Corning, K. R. Nest building as an indicator of health and welfare in laboratory mice. Journal of Visualized Experiments. (82), 51012 (2013).
- Mayeux, R., Stern, Y. Epidemiology of Alzheimer Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (8), 006239 (2012).
- Boggs, K. N., Kakalec, P. A., Smith, M. L., Howell, S. N., Flinn, J. M. Circadian wheel running behavior is altered in an APP/E4 mouse model of late onset Alzheimer's disease. Physiology and Behavior. 182, 137-142 (2017).
- Graybeal, J. J., et al. Human ApoE ε4 alters circadian rhythm activity, IL-1β, and GFAP in CRND8 mice. Journal of Alzheimer's Disease. 43 (3), 823-834 (2015).
- Leng, Y., Musiek, E. S., Hu, K., Cappuccio, F. P., Yaffe, K. Association between circadian rhythms and neurodegenerative diseases. The Lancet Neurology. 18 (3), 307-318 (2019).
- Zhou, L., Gao, Q., Nie, M., Gu, J. L., Hao, W., Wang, L., Cao, J. M. Degeneration and energy shortage in the suprachiasmatic nucleus underlie the circadian rhythm disturbance in ApoE-/- mice: Implications for Alzheimer's disease. Scientific Reports. 6, 36335 (2016).
- Deacon, R., et al. Age-dependent and -independent behavioral deficits in Tg2576 mice. Behavioural Brain Research. 189, 126-138 (2008).
- Filali, M., Lalonde, R., Riverst, S. Cognitive and non-cognitive behaviors in an APPswe/PS1 begenic model of Alzheimer's disease. Genes, Brain and Behavior. 8, 143-148 (2009).
- Robinson-Junker, A., Morin, A., Protchett-Corning, K., Gaskill, B. Sorting it out: Bedding particle size and nesting material processing method affects nest complexity. Laboratory Animals. 51 (2), 170-180 (2017).
- Martin, T., Balser, S., Young, G., Lewis, S. Cost and effectiveness of commercially available nesting substrates for Deer Mice (Peromyscus maniculatus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 55 (4), 412-418 (2016).
- Crossland, J. P., et al. Caring for Peromyscus spp. in research environments. Lab Animal. 43 (5), 162-166 (2014).
- Eisenberg, J. Studies on the Behavior of Peromyscus maniculatus gambelii and Peromyscus californicus parasiticus. Behaviour. 19 (3), 177-207 (1962).
- Joyner, C. P., Myrick, L. C., Crossland, J. P., Dawson, W. D. Deer mice as laboratory animals. ILAR Journal. 39 (4), 322-330 (1998).
- Neely, C., Lane, C., Torres, J., Flinn, J. The Effect of gentle handling on depressive-like behavior in adult male mice: Considerations for human and rodent interactions in the laboratory. Behavioural Neurology. , 2976014 (2018).
- Van Loo, P. L., Mol, J. A., Koolhaas, J. M., Van Zutphen, B. F., Baumans, V. Modulation of aggression in male mice: Influence of group size and cage size. Physiology & Behavior. 72 (5), 675-683 (2001).
- Kappel, S., Hawkins, P., Mendl, M. T. To group or not to group? Good practice for housing male laboratory mice. Animals. 7 (12), 88 (2017).
- Gamer, M., Lemon, J., Fellows, I., Singh, P. Irr: Various coefficients of interrater reliability and agreement. R package version 0.84. , Available from: http://CRAN.R-project.org/package=irr (2012).
- RStudio Team. RStudio: Integrated Development for R. RStudio, Inc. , Boston, MA. Available from: http://www.rstudio.com/ (2016).
- Cicchetti, D. V. Guidelines, criteria, and rules of thumb for evaluating normed and standardized assessment instruments in psychology. Psychological Assessment. 6 (4), 284-290 (1994).
- Hallgren, K. A. Computing inter-rater reliability for observational data: An overview and tutorial. Tutorials in Quantitative Methods for Psychology. 8 (1), 23-34 (2012).
- McGraw, K. O., Wong, S. P. Forming inferences about some intraclass correlation coefficients. Psychological Methods. 1 (1), 30-46 (1996).
- Ahlmann-Eltze, C. ggsignif: Significance Brackets for 'ggplot2'. R package version 0.5.0. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ggsignif (2019).
- Lawrence, M. A. ez: Easy Analysis and Visualization of Factorial Experiments. R package version 4.4-0. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ez (2016).
- Lenth, R. V. Least-Squares Means: The R Package lsmeans. Journal of Statistical Software. 69 (1), 1-33 (2016).
- Wickham, H. Ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , Springer-Verlag. New York. (2016).
- Craven, K. M., Kochen, W. R., Hernandez, C. M., Flinn, J. M. Zinc exacerbates tau pathology in a tau mouse model. Journal of Alzheimer's Disease. 64, 617-630 (2018).
- Lippi, S. L., Smith, M. L., Flinn, J. M. A novel hAPP/htau mouse model of Alzheimer's Disease: Inclusion of APP with tau exacerbates behavioral deficits and zinc administration heightens tangle pathology. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 382 (2018).
- Hess, S. E., et al. Home improvement: C57BL/6J mice given more naturalistic nesting materials build better nests. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 47 (6), 25-31 (2008).
- Jirkof, P. Burrowing and nest building behavior as indicators of well-being in mice. Journal of Neuroscience Methods. 234, 139-146 (2014).
- Van Oortmerssen, G. Biological significance, genetics and evolutionary origin of variability in behaviour within and between strains of mice (Mus musculus). A behavior genetic study. Behaviour. 38 (1), 1-92 (1971).
