Summary
يتم تقديم بروتوكول لصياغة نظام غذائي اصطناعي خال من الدم لإطعام البعوض الأنوفيليس في الأسر. هذا النظام الغذائي له أداء مماثل للدم الفقاريات ومشغلات تولد البويضات ونضوج البيض وتنتج ذرية الكبار قابلة للحياة.
Abstract
تتطلب أبحاث الملاريا ظروف تكاثر وإنتاج واسعة النطاق للبعوض(Anopheles spp.) في الأسر. ويعيق حالياً إنتاج البعوض بصورة مستدامة وموثوقة من جراء إمدادات الدم الفقاري الطازج. وثمة حاجة إلى بدائل للدم لتعزيز استراتيجيات فعالة لمكافحة الملاريا وغيرها من الأمراض المنقولة بالنواقل التي تنتقل عن طريق الحشرات المغذية للدم. مع وضع هذا في الاعتبار ، تم صياغة الوجبات الغذائية السائلة الاصطناعية كبدائل للدم الفقاري الطازج. في هذه الصدد نحن تقرير اتباع نظام غذائي سائل اصطناعي خالي من الدم الذي يسلم معدلات التغذية مماثلة للدم ويحاكي الآثار الفسيولوجية لوجبة الدم الفقارية الطازجة. النظام الغذائي يحفز نضوج المبيض والبيض من البعوض الأنوفيليس وتنتج أيضا بقاء اليرقات جيدة والتنمية من البالغين وظيفية. ويشكل النظام الغذائي السائل الخالي من الدم الصياغتها تقدما هاما نحو التكاثر المستدام للبعوض في الأسر، وسيقلل من تكاليف صيانة مستعمرات البعوض ويلغي الحاجة إلى الدم الفقاري الطازج.
Introduction
وتؤثر الأمراض المنقولة بالنواقل على عدة ملايين من البشر في جميع أنحاء العالم وتتسبب في وفاة الملايين كل عام. وهي تنتقل عن طريق الحشرات المصابة بالكائنات الحية الدقيقة المنتجة للأمراض (البروتوزوان والفيروسات) التي يتم الحصول عليها عندما تتغذى على الدم من مضيف مصاب. وفي وقت لاحق، الناقل المصاب سوف ينقل العامل الممرض إلى مضيف جديد خلال وجبة الدم التالية. الملاريا هي أكثر الأمراض المنقولة بالنواقل فتكاً التي تنتقل عن طريق عدة أنواع مختلفة من بعوضة الأنوفيليس وتصيب 40% من سكان العالم1. الطفيلي البروتي الملاريا هو المسؤول عن أكثر من 400،000 حالة وفاة كل عام، معظمهم من الأطفال دون سن الخامسة (منظمة الصحة العالمية). تنقل أنثى بعوضة الأنوفيليس طفيلي الملاريا من جنس البلازموديوم بين البشر والحيوانات الأخرى عندما تتغذى على الدم الفقاري ، وهي خطوة ضرورية لإنتاج البيض وتطويره2.
تعتمد الاستراتيجيات الحالية للقضاء على الملاريا وغيرها من الأمراض القاتلة الناشئة التي تنتقل عن طريق البعوض على تطوير استراتيجيات مبتكرة لمكافحة البعوض3و4و5والتي تشمل إطلاق أعداد كبيرة من البعوض الذي يولد في الحشرات في البرية. ومع ذلك ، فإن أحد العوامل الحاسمة التي تحد من الاعتماد على إمدادات من الدم الطازج لتربية البعوض وتكاثره بشكل فعال. يمكن أن يؤثر التكوين المتغير للدم الفقاري سلبًا على خصوبة البعوض واللياقة البدنية للذرية ويمكن أن يحد من موثوقية واستدامة مستعمرات التربية الأسيرة. وتتطلب برامج إطلاق البعوض ومكافحته نظماً واسعة النطاق لإنتاج البعوض وإمدادات منتظمة بكميات كبيرة من الدم الفقاري. وهذا يشكل عقبة رئيسية أمام إنتاج البعوض ويثير سلسلة من القضايا الأخلاقية المرتبطة باستخدام الحيوانات الحية والقيود اللوجستية الناجمة عن لوائح السلامة الصعبة المرتبطة بها. وهذا يجعل تكاليف صيانة وأمن مستعمرات البعوض مرتفعة ويتحدى استدامة الممارسات الحالية لتربية البعوض، لا سيما في البلدان المنخفضة الدخل حيث يكون خطر الملاريا أكبر بكثير.
وقد تركزت الأبحاث مؤخرا على تطوير بدائل الدم التي تحاكي وجبة الدم الفقارية ولكن حتى الآن، لم يتحقق سوى نجاح محدود6،7،8،9. يحتاج النظام الغذائي الاصطناعي الناجح إلى (1) إثارة الاحتقان الكامل للبعوض الأنثوي ، (2) إنتاج vitellogenin ، (3) إنتاج دفعات كبيرة من البيض القابل للحياة ، و (4) توليد ذرية هيثي10. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الوجبات الغذائية الاصطناعية لها تركيبة قياسية وبالتالي فهي أكثر موثوقية لإنتاج البعوض لأغراض البحث والمكافحة. وقد وضعت الوجبات الغذائية الخالية من الدم ناجحة للبعوض النظارات (استعرضها غونزاليس وهانسن11)ولكن ليس لأنوفيليس spp. الوجبات الغذائية الاصطناعية القائمة تحتوي على phagostimulant (على سبيل المثال، ATP10)،مصدر البروتين لنضوج البيض6،12،الكربوهيدرات كمصدر للطاقة، والأحماض الأمينية (aa)13 التي هي أساسية لإنتاج البيض وهي عامل رئيسي يحد منخصوبةالبعوض اتباع نظام غذائي خال من الدم الاصطناعي يحتاج أيضا إلى توفير الكوليسترول15، مما يحسن إنتاج البيض. هنا نصف نظام غذائي اصطناعي خال من الدم للبعوض الأنوفيليس الإناث وإثبات أن لديها أداء ثابت ومكافئ لوجبة دم فقارية عالية الجودة.
Protocol
تم الحصول على الفئران من بيت الحيوانات IHMT. وأجريت التجارب على الحيوانات وفقا للقانون البرتغالي والمبادئ التوجيهية لاستخدام الحيوانات المختبرية. وDireção-Geral دي Veterinária, Ministério دا Agricultura دو Desenvolvimento الريفية e das Pescas, البرتغال وافقت على جميع بروتوكولات الدراسة (الموافقات معرف: 023351 و 023355).
ملاحظة: تنفيذ جميع المقالات التغذية في ~ 26 درجة مئوية.
1- البعوض
- الحفاظ على Anopheles coluzzii (السابق أنوفيليس غامبيا M شكل) ياوندي سلالة البعوض في 26 درجة مئوية، 75٪ الرطوبة تحت 12 ساعة: 12 ح الضوء: دورة داكنة. منزل البعوض باستخدام الظروف الحشرية القياسية لضمان التزاوج.
- جمع الخوخ البعوض في وعاء صغير من المياه. ضع الحاوية داخل قفص البعوض للسماح للبعوض البالغ بالظهور ورفيقه. توفير 10٪ من محلول تغذية الجلوكوز. بعد ثلاثة أيام من ظهور جمع العدد اللازم من البعوض من قفص الأوراق المالية باستخدام aspirator.
- قبل يوم واحد من تجارب التغذية، قم بإزالة محلول تغذية الجلوكوز بنسبة 10٪.
ملاحظة: تم استخدام البعوض 3 أيام من العمر طوال التجارب.
2- تغذية البعوض
- إعداد الوجبات الغذائية السائلة الاصطناعية
- إعداد الوجبات الغذائية السائلة الاصطناعية في ظل ظروف معقمة في مجلس الوزراء تدفق لامينار. إعداد النظام الغذائي السائل الغني (r-liq_diet) عن طريق إضافة ما يلي إلى النظام الغذائي السائل الأولي (i-liq_diet; دلبيكو تعديل النسر المتوسط [ارتفاع الجلوكوز مع L-الجلوتامين]، انظر الجدول 1):0.55 غرام/ L ATP، 1 غرام / لتر الكوليسترول، و 200 غرام / لتر الألبومين مصل البقر (BSA). اخلطي جميع المكونات جيداً واصفّي باستخدام فلتر ميكروفلتر 0.45 ميكرومتر.
ملاحظة: لا تخزن الوجبات الغذائية; إعداد الوجبات الغذائية الطازجة من حلول الأسهم لكل تجربة لأنها تفقد الجودة عند تخزينها. ويرد وصف مكونات الوجبات الغذائية في الجدول 1.
- إعداد الوجبات الغذائية السائلة الاصطناعية في ظل ظروف معقمة في مجلس الوزراء تدفق لامينار. إعداد النظام الغذائي السائل الغني (r-liq_diet) عن طريق إضافة ما يلي إلى النظام الغذائي السائل الأولي (i-liq_diet; دلبيكو تعديل النسر المتوسط [ارتفاع الجلوكوز مع L-الجلوتامين]، انظر الجدول 1):0.55 غرام/ L ATP، 1 غرام / لتر الكوليسترول، و 200 غرام / لتر الألبومين مصل البقر (BSA). اخلطي جميع المكونات جيداً واصفّي باستخدام فلتر ميكروفلتر 0.45 ميكرومتر.
- جمع دم الفأر
- تَسْنَح الفئران الأنثوية CD1 التي يبلغ عمرها 6-8 أسابيع(Musculus)مع الكيتامين (120 ملغم/كغ) والزيلازين (16 ملغم/كغ) باستخدام الطريق داخل البلص.
- قم بإجراء ثقب القلب(الشكل 1)عندما لا يعرض الماوس أي رد فعل عضلي استجابة للمحفزات الجسدية المختلفة (على سبيل المثال، إصبع القدم وقرصات الذيل).
- جمع الدم باستخدام حقنة معقمة 1 مل مع 27 G × 1/2 ( 0.4 × 12 مم2)إبرة تحتوي على 100 ميكرولتر من 1 ملغ / مل الهيبارين (ملح الصوديوم) لمنع تكوين جلطات الدم. الحفاظ على الدم في 37 درجة مئوية باستخدام حمام مائي.
- التغذية الاصطناعية
- جمع ما يقرب من 30 البعوض الإناث من قفص الأوراق المالية باستخدام aspirator.
- نقل البعوض الإناث إلى 500 مل أكواب الورق وتغطية مع شبكة ناموسية غرامة حتى لا يتمكنوا من الهرب. تطبيق وحدة تغذية زجاجية متصلة بأنابيب بلاستيكية للحفاظ على تدفق المياه المستمر إلى أعلى كل كوب(الشكل 2). توفير تدفق المياه المستمر إلى أنابيب أسطواني ة والمغذية بحيث يتم الاحتفاظ درجة الحرارة داخل في ما يقرب من 37.5 درجة مئوية.
ملاحظة: تم استخدام جهاز تغذية اصطناعي قياسي للجرس الزجاجي16 لتزويد البعوض الإناث بالوجبات الغذائية المصاغة. - تمتد غشاء فيلم البارافين عبر فم المغذية الزجاجية لاحتواء الوجبة.
- قبل الدفء i-liq_diet و r-liq_diet في 37 درجة مئوية باستخدام حمام مائي. تطبيق 1 مل في المغذية الزجاج. إطعام البعوض لمدة 60 دقيقة في الظلام إما مع ط liq_diet، r-liq_diet أو دم الفأر الطازج. إجراء المقالات في 26 درجة مئوية.
- تقييم معدل التغذية.
- بعد التغذية الاصطناعية ، قم بتلقيح البعوض عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 30 s. ضع البعوض في طبق بيتري مبرد.
- تسجيل عدد البعوض الإناث المحفوربالكامل(الشكل 3).
ملاحظة: يتم استخدام النسبة المئوية للبعوض المغذي كوكيل لنجاح التغذية.
3. سمات تاريخ الحياة
- إنتاج البيض والخصوبة
- نقل الإناث المحفورة بالكامل، باستخدام فرشاة، إلى أقفاص فردية (20 سم × 20 سم × 20 سم).
- الحفاظ على البعوض في 26 ± 1 درجة مئوية، 75٪ الرطوبة و 12 ساعة:12 ساعة الضوء: دورة مظلمة مع 10٪ جلوكوز إعلانية libitum.
- ثمانية وأربعون ساعة بعد التغذية، إضافة ورقة تصفية الترطيب في الجزء السفلي لوضع البيض(الشكل 4). عد البيض في 48 ساعة و 72 ساعة بعد إضافة ورقة وضع البيض باستخدام عدسة مكبرة محمولة. إغراق ورقة التصفية بالماء المقطر لجمع البيض.
- وفيات اليرقات
- جمع البيض في الصواني (23 سم × 15 سم × 6 سم) مليئة بالماء المقطر(الشكل 5). الحفاظ على مستوى المياه في الصواني ثابت أثناء التجارب.
- إطعام اليرقات يوميا مع ما يقرب من 13 ملغ من المواد الغذائية الأسماك المطحونة لكل صينية. تطبيق نظام تغذية مماثلة على جميع الصواني النسخ المتماثل.
- إزالة الخواب الميت واليرقات يوميا. وضع اللمسات الأخيرة على التجارب عندما تطورت جميع pupae إلى البالغين وحساب عدد من الذكور والإناث البالغين.
- تسجيل تواريخ الفقس والوفاة وحساب معدلات الوفيات.
- طول العمر
- جمع 15 من الذكور البالغين و 15 الإناث البالغين من جيل F1 من كل مجموعة النظام الغذائي. إبقاء الذكور والإناث في نفس القفص.
- إطعام البالغين مع 10٪ من الجلوكوز حل الإعلانية libitum. إزالة البالغين القتلى يوميا.
- الحفاظ على البعوض في نفس درجة الحرارة والرطوبة وظروف دورة الضوء ونظام تغذية السكر على النحو المبين أعلاه.
- تسجيل تواريخ الوفاة وحساب طول العمر.
- قياس طول الجناح
- بعوض الفورمولا 1 البالغ (ذكور وإناث) من كل مجموعة حمية غذائية عند -20 درجة مئوية لمدة 90 درجة مئوية لمدة 90 درجة مئوية.
- تحت منظار ستيريو، وبلطف فهم الصدر من كل البعوض مع ملقط ووضعها الجانب البطني حتى.
- جمع كلا الجناحين باستخدام مشرط ووضعها على شريحة المجهر نظيفة تحتوي على قطرة المجففة من وسط تصاعد. مع المعونة من إبرة 20 G إضافة وسائل الإعلام تصاعد اضافية إلى حدود قسيمة الغطاء وخفض ببطء غطاء على الأجنحة.
- قياس طول الجناح(الشكل 6)مع ستيريوسكوب باستخدام ميكرومتر.
Representative Results
تقارن النتائج الموضحة أدناه أداء أنثى البعوض الأنوفيليس الذي يتم تغذيته بالوجبة الاصطناعية الغنية (r-liq_diet) والبعوض الذي يتغذى على النظام الغذائي السائل الأولي (i-liq_diet) أو وجبة دم طازجة. تم اختبار النظام الغذائي بعد البروتوكول التخطيطي المبين في الشكل 7. liq_diet الوارد ة هنا هي جزء من براءة الاختراع (PCT/IB2019/052967).
النسبة المئوية للإناث المحفورات بالكامل
عدد البعوض الأنثوي المحفور الذي يتم تغذيته بـ r-liq_diet (89%) كان أعلى بكثير من عدد الإناث المحفورات التي تتغذى على الدم (56%). (الشكل8).
الخصوبة والخصوبة
تم استخدام خصوبة خصوبة الإناث في الدورة الغنوتوفية الأولى لتقييم الجودة الغذائية liq_diet وr-liq_diet. تم وضع ما متوسطه 24 ± 11 بيضة من قبل الإناث التي تتغذى على الدم الفقاري الطازج ، في حين أن الإناث اللائي يتم تغذيتهن على r-liq_diet وضع متوسط 25 ± 5 بيضات(الجدول 2). لم يلاحظ وضع البيض من قبل الإناث التي تتغذى على i-liq_diet.
وفيات F1
تم تقييم لياقة البعوض F1 بين المستعمرات التي تتغذى على الدم الفقاري أو r-liq_diet. وسُجلت اليرقات والجراء ووفيات البالغين. كان التغير (الخطأ القياسي للمتوسط [SEM]) أعلى في البعوض الذي يتغذى على الدم(الشكل 9 والجدول 2)بالنسبة للبعوض الذي يغذي r-liq_diet. وكان جيل F1 من البعوض الذي يتغذى إما على الدم أو liq_diet معدلات وفيات وبقاء مماثلة.
متوسط العمر المتوقع F1
ويقدر مركز مكافحة الأمراض والوقاية منها أن البعوض الإناث البالغات البرية يعيش لمدة تصل إلى شهر ولكن ربما لا البقاء على قيد الحياة لأكثر من 1-2 أسابيع وأن الذكور يعيشون لمدة أسبوع تقريبا ً وتتغذى حصراً على الرحيق ومصادر السكر الأخرى. ويلاحظ أن الاختلافات في تناول الطعام الأبوي قد تؤثر على بقاء ذرية البعوض17. In our experiment, adult females and males in the blood (female 24.5 ± 6.8; male 18.5 ± 6.9) and r-liq_diet (female: 22.5 ± 8.1; male: 11.9 ± 6.9) groups had similar average life expectancies average (Table 3) and females showed an increased life span relative to males.
حجم الجسم F1
تم استخدام طول الجناح كمؤشر على حجم الجسم الكبار. بالمقارنة مع الأنواع الأخرى ، فإن الأنوفيليس البالغين هم بعوض صغير إلى متوسط الحجم بطول جناح يتراوح بين 2.8 إلى 4.4 مم طول الجناح18. حجم جسم البالغين من البعوض F1 Anopheles تغذية r-liq_diet كان ضمن النطاق المتوقع وكان مماثلا للبعوض الحشري الذي يتغذى على الدم(الشكل 10).
التحليل الإحصائي
وتمثل البيانات المقدمة متوسط ثلاث تجارب مستقلة على الأقل (ما لم ينص على خلاف ذلك). تمثل أشرطة الخطأ SEM. عندما اتبعت البيانات توزيع غاوسي، تمت مقارنة المجموعات المستقلة باستخدام اختبار t للطالب، وإلا تم تطبيق اختبار Mann-Whitney. تم تحليل الاختلافات بين المجموعات الاصطناعية التي تغذيها الحمية باستخدام اختبار فيشر الدقيق واعتبرت كبيرة في P ≤ 0.05.
الشكل 1: جمع دم الفأر CD1 عن طريق ثقب داخل القلب. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: جهاز التغذية الاصطناعي القياسي. يحتوي المغذي الزجاجي على r-liq_diet التي يتم تغذيتها بالبعوض الأنوفيليس الإناث. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: البعوض الأنوفيليس بعد التغذية الاصطناعية. من اليسار إلى اليمين: أنثى محفورة بالكامل التي عرضت r-liq_diet، غير engorged أنثى التي عرضت r-liq_diet، الذكور، وأنثى المهندسة بالكامل التي عرضت دم الفأر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: وضع بيض الأنوفيليس 48 ساعة بعد تغذية الإناث مع r-liq_diet. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مراحل اليرقات L2 التي تطورت من البيض وتم جمعها على ورق التصفية ووضعها في صواني تحتوي على الماء المقطر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: الجناح الأيمن من جيل F1 من بعوضة أنثى أنوفيليس كوزيزي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: البروتوكول التخطيطي لاختبار النظام الغذائي الاصطناعي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: معدلات تغذية البعوض الأنثوي تغذي إما الوجبات الغذائية الاصطناعية أو الدم. تشير العلامات النجمية إلى اختلافات كبيرة بين البعوض الذي يغذي الوجبات الغذائية السائلة r وi-liquid ومجموعة التحكم التي تغذيها الدم. اختبار فيشر الدقيق على الوجهين: ****P ≤ 0.0001 (الخطر النسبي: 0.4828، 95٪ واثق مستوى [CL]: 0.3776 إلى 0.6194) لنظام غذائي r-liquid مقابل الدم، *P = 0.0335 (الخطر النسبي: 1.379، 95٪ CL: 1.044 إلى 1.836) للدم مقابل i-liquid النظام الغذائي. الأزرق: غير مغذ؛ الأحمر: تغذية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: أثر الوجبة الخالية من الدم المصاغة على معدل وفيات ونسبة الذكور إلى الإناث من بعوض F1 Anopheles coluzzii. وأجريت ثلاث تجارب مستقلة، استخدم كل منها 30 بعوضة لكل نظام غذائي. لم يظهر اختبار t غير المقترنة أي اختلافات كبيرة بين المجموعة التي تتغذى على الدم ومجموعة r-liq_diet (تراوحت قيمP من 0.5047 إلى 0.8491). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 10: طول الجناح. تم استخدام المسافة من الشق المحوري إلى الوريد R4 +5 باستثناء seta الهامشية لتحديد طول الجناح. تم تقييم الحجم ل5 إناث و 5 ذكور من كل مجموعة غذائية (متوسط ± SEM). يتم تمثيل القيم كمتوسط ± SEM. سمك السلمون: r-liq_diet; الأحمر: الدم الفقاري. غير مقترنة تي اختبار; الجناح اليساري الأنثوي: t = 1.300، df = 8، P = 0.2298؛ الجناح الأيسر الذكور: t = 2.400، مدافع = 8، P = 0.0432؛ الجناح الأيمن الأنثوي: t = 1.300، مدافع = 8، P = 0.2298؛ الجناح الأيمن الذكور: t = 2.277، df = 7، P = 0.0569. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| مكونات | ز/لتر |
| * أدينوسين ثلاثي الفوسفات | 0.55 |
| * بومبل بومبل بوفين | 200 |
| * الكوليسترول | 1 |
| كلوريد الكالسيوم اللامائية | 0.2 |
| كلوريد الكولين | 0.004 |
| البانتوثينات D-الكالسيوم (فيتامين B5) | 0.004 |
| D-الجلوكوز اللامائي | 4.5 |
| نترات فيرك نوناهيدرات | 0.0001 |
| حمض الفوليك | 0.004 |
| الجليسين | 0.03 |
| I-إينووزيتول | 0.007 |
| ارجينين مونوهيدروكلوريد | 0.084 |
| L-كيستين ديهيدروكلوريد | 0.063 |
| إل غلوتامين | 0.584 |
| L-هيستيدين مونوهيدروكلوريد مونوهيدرات | 0.042 |
| L-isoleucine | 0.105 |
| L-ليسين | 0.105 |
| L-ليسين مونوهيدروكلوريد | 0.146 |
| إل ميثيونين | 0.03 |
| L-فينيلألانين | 0.066 |
| إل سيرين | 0.042 |
| L-ثريونين | 0.095 |
| L-تريبتوفان | 0.016 |
| L-التيروسين ديزيوم ملح ديهيدرات | 0.104 |
| L-فالين | 0.094 |
| سلفات المغنيسيوم اللامائية | 0.098 |
| النياسيناميد (نيكوتيناميد) | 0.004 |
| الفينول الأحمر | 0.015 |
| كلوريد البوتاسيوم | 0.4 |
| بيريدوكسين مونوهيدروكلوريد | 0.004 |
| ملح الصوديوم حمض بيروفيك | 0.011 |
| ريبوفلافين (فيتامين ب2) | 0.0004 |
| بيكربونات الصوديوم | 3.7 |
| كلوريد الصوديوم | 6.4 |
| فوسفات الصوديوم أحادي اللامائية | 0.109 |
| الثيامين الأيمونوهيدروكلوريد (فيتامين B1) | 0.004 |
| * فقط في r-liq_diet | |
الجدول 1: تكوين النظام الغذائي السائل i والنظام الغذائي r-السائل.
| إجمالي عدد البيض (± SEM) | البيض / أنثى (± SEM) | |
| الدم | 733 ± 330 | 24 ± 11 |
| r-liq_diet | 763 ± 164 | 25 ± 5 |
| i-liq_diet | 0 | 0 |
الجدول 2: دفعات البيض التي تنتجها الإناث أنوفيليس coluzzii. وأجريت ثلاث تجارب مستقلة لكل نظام غذائي تجريبي باستخدام 30 بعوضة أنثوية في كل منها.
| الإناث (أيام ± SEM) | الذكور (أيام ± SEM) | |
| الدم | 24.5 ± 6.8 | 18.5 ± 6.9 |
| r-liq_diet | 22.5 ± 8.1 | 11.9 ± 6.9 |
الجدول 3: متوسط العمر المتوقع للبعوض F1 Anopheles. تم تقييم طول عمر البعوض F1 من F0 الذي يتم تغذيته اصطناعيًا من خلال تسجيل تواريخ ميلاد ووفاة كل بعوضة قادمة من نفس المجموعة الغذائية (تمت متابعة 15 أنثى و15 ذكرًا). يتم تمثيل النتائج كمتوسط عمر البعوض لكل مجموعة نظام غذائي.
Discussion
من المرجح أن يكون نجاح نظامنا الغذائي الخالي من الدم نتيجة للتأثير الفسيولوجي التآزري لجميع المكونات المضافة إلى i-liq_diet (الغني بالسكر والأحماض الأمينية والفيتامينات والعناصر الدقيقة): BSA (مصدر البروتين) وATP (المنبه) والكوليسترول (مصدر الدهون). مكملات r-liq_diet مع المكونات الفردية وحدها لم تكن فعالة في تحفيز إنتاج البيض (البيانات غير مبين). قد يكون أحد عيوب البروتوكول تكلفة بعض المكونات، مثل الكوليسترول. ومع ذلك ، فإن وجودها أساسي ، حيث أن الحشرات غير قادرة على توليفها19 وهذا الجزيء هو مقدمة هرمونات ecdysteroid التي تنظم تخليق الصفار ونضوج البيض في المفصليات20. وينبغي اختبار كميات أقل من الكوليسترول من أجل تحسين الكمية اللازمة بهدف خفض التكاليف وزيادة فوائد النظام الغذائي الاصطناعي.
وثمة قيد آخر للطريقة هو أن النظام الغذائي الاصطناعي يجب أن تكون مستعدة حديثا من حلول الأسهم، كما أعدت مرة واحدة في شكله السائل النهائي فإنه يفقد الجودة بعد التخزين. في المستقبل يمكن إعداد نظامنا الغذائي وضعت كقوة المجففة، على غرار SkitoSnackt، بديل وجبة الدم الاصطناعية للبعوض Aedes aegypti 21.
وإلى جانب توفير المواد الغذائية الضرورية، تحتاج الوجبة الاصطناعية إلى جذب البعوض الأنثوي وتحفيزه على التغذية بنفس الطريقة التي تتغذى بها على الدم الطازج الفقاري. أدى النظام الغذائي الاصطناعي الخالي من الدم الموصوف هنا إلى زيادة بنسبة 20٪ في البعوض الأنثوي المحفور بالكامل بالمقارنة مع مجموعة تغذية الدم الفقارية. يمكن زيادة توضيح هذا المقياس غير المباشر للجاذبية باستخدام أجهزة قياس الميل للتأكد من أن النظام الغذائي الاصطناعي أكثر جاذبية وأكثر جاذبية للبعوض من الدم الطازج.
ولوحظ أكبر أثر للنظام الغذائي على وفيات اليرقات المشتقة من البعوض الذي يتغذى على الدم، مما يشير إلى أن اتباع نظام غذائي اصطناعي مستقر التكوين يمكن أن يسهم في الحد من الوفيات وتحسين نجاح تكاثر البعوض بالمقارنة مع الدم الطازج. قد تنشأ النتيجة الأقل توقعًا لوجبة الدم من اختلافات المضيف في التكوين17 ووجود جزيئات في الدم قد تتداخل مع فسيولوجيا البعوض22. تؤكد الحقائق السابقة على مزايا تربية البعوض عالي الجودة للوجبات الغذائية الطازجة الخالية من الدم.
بشكل عام كان متوسط عدد البويضات المزروعة في دراستنا منخفضًا مقارنة بتلك المبلغ عنها في بعض الحشرات ، ولكن متوسط عدد البيض الأوبوزيتي كان مشابهًا للسلالة الـA. التربية المختبرية في غامبيا التي تتغذى على دم الإنسان (22.6 ± 5.5 بيضة / أنثى)23. لم تلاحظ فروق إحصائية كبيرة بين مجموعاتنا التجريبية التي تتغذى على الدم الطازج أو على الوجبات الاصطناعية(الجدول 2)، مما يشير إلى أن تنفيذ أنظمة تغذية الأغشية الاصطناعية مع نظامنا الغذائي المصاغ يكفي للحفاظ على مستعمرات البعوض الأنوفيليس ونشرها في الأسر.
يمكن للوجبات الاصطناعية الخالية من الدم الحفاظ على مستعمرات Aedes 22، ولكن عند تطبيقها على البعوض Anopheles فهي محدودة أو معدومة النجاح11. وفي الآونة الأخيرة، وُصفت وجبة اصطناعية تعتمد على البلازما لبعوض الأنوفيليس بأنها24 وجبة، ولكن معدلات التغذية والإمكانات الإنجابية كانت منخفضة. نتائجنا تمثل تقدما كبيرا في دولة من الفن (استعرضت من قبل غونزاليس وهانسن11)كما لدينا وضعت r-liq_diet كان أداء مماثل أو أفضل من وجبة الدم الفقارية القياسية. وينبغي أن تؤدي التحسينات الإضافية المتعلقة باستقرار التخزين وتكلفته إلى توسيع نطاق تطبيقه.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
نود أن نشكر دينورا لوبيز (مرفق IHMT-NOVA Animal facilit) على الدعم الفني ، وجوانا غوميز وأنا كاتارينا ألفيس (مرفق IHMT-NOVA للحشرات) للحفاظ على مستعمرات البعوض Anopheles. بتمويل من مؤسسة بيل وميليندا غيتس (OPP1138841)، Fundação para a Ciência e Tecnologia (UID/Multi/04413/2011، UID/Multi/04326/2013، SFRH/BPD/89811/2012، CEECIND/00450/2017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | A2383 | |
| BSA-Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A790G | |
| Cholesterol | MP Biomedicals | 199342 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (high glucose with L-glutamine) | Lonza Bioscience | BE12-604F | |
| Entellan mounting medium | Merck | 1079610100 | |
| Glassfeeder | Local glazier | by design | |
| Heparin Sodium Salt | Pan Reac AppliChem | A3004,0001 | |
| Imalgène 1000 | Merial, Portugal | 01MER122 | |
| Needle 20 G x 1" 0.9 x 25 mm needle | Terumo Europe | NN-2025R | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | P6543-1EA | |
| Rompun | Bayer, Portugal | 7427831 | |
| Sterilization Millex-HV 0,45 | Millipore | SLHVR25KS | |
| Syringe, 1ml, 27 G x ½" 0.4 x 12 mm needle | Terumo Europe | BS-NIN2713 | |
| Teich Mix Astra Pond | Astra | 4030733100957 | |
| Tetra Goldfish Flakes | Tetra | 4004218742642 |
References
- WHO. World Malaria Report. , World Health Organization. (2016).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Rodriguez, S. D., Drake, L. L. Four-way regulation of mosquito yolk protein precursor genes by juvenile hormone-, ecdysone-, nutrient-, and insulin-like peptide signaling pathways. Frontiers in Physiology. 5, 103 (2014).
- Catteruccia, F., Crisanti, A., Wimmer, E. A. Transgenic technologies to induce sterility. Malaria Journal. 8, Suppl 2 7 (2009).
- Dame, D. A., Curtis, C. F., Benedict, M. Q., Robinson, A. S., Knols, B. G. J. Historical applications of induced sterilisation in field populations of mosquitoes. Malaria Journal. 8, Suppl 2 2 (2009).
- Lacroix, R., et al. Open Field Release of Genetically Engineered Sterile Male Aedes aegypti in Malaysia. PLoS One. 7, 42771 (2012).
- Lea, A. O., Knierim, J. A., Dimond, J. B., Delong, D. M. A Preliminary Note on Egg Production from Milk-Fed Mosquitoes. The Ohio Journal of Science. 55, 1-21 (1955).
- Kogan, P. H. Substitute blood meal for investigating and maintaining Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 27, 709-712 (1990).
- Griffith, J. S., Turner, G. D. Culturing Culex quinquefasciatus mosquitoes with a blood substitute diet for the females. Medical and Veterinary Entomology. 10, 265-268 (1996).
- Jason Pitts, R. A blood-free protein meal supporting oogenesis in the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus (Skuse). Journal of Insect Physiology. 64, 1-6 (2014).
- Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti. PeerJ. 3, 938 (2015).
- Gonzales, K. K., Hansen, I. A. Artificial Diets for Mosquitoes. International Journal of Environmental Research and Public Health. 13 (12), 1267 (2016).
- Cosgrove, J. B., Wood, R. J. Effects of variations in a formulated protein meal on the fecundity and fertility of female mosquitoes. Medical and Veterinary Entomology. 10, 260-264 (1996).
- Attardo, G. M., Hansen, I. A., Shiao, S. -H., Raikhel, A. S. Identification of two cationic amino acid transporters required for nutritional signalling during mosquito reproduction. Journal of Experimental Biology. 209, 3071-3078 (2006).
- Clements, A. N. The biology of mosquitoes: Development, nutrition, and reproduction. , Chapman & Hall. New York, NY. (1992).
- Talyuli, O. A., et al. The use of a chemically defined artificial diet as a tool to study Aedes aegypti physiology. Journal of Insect Physiology. 83, 1-7 (2015).
- Lopes, L. F., Abrantes, P., Silva, A. P., Dorosario, V. E., Silveira, H. Plasmodium yoelii: The effect of second blood meal and anti-sporozoite antibodies on development and gene expression in the mosquito vector, Anopheles stephensi. Experimental Parasitology. 115, 259-269 (2007).
- Phasomkusolsil, S., et al. Maintenance of mosquito vectors: effects of blood source on feeding, survival, fecundity, and egg hatching rates. Journal of Vector Ecology. 38, 38-45 (2013).
- Gillies, M. T., De Meillon, B. The Anophelinae of Africa South of the Sahara (Ethiopian zoogeographical region). Publications of the South African Institute for Medical Research. 54, 1 (1968).
- Canavoso, L. E., Jouni, Z. E., Karnas, K. J., Pennington, J. E., Wells, M. A. Fat metabolism in insects. Annual Review of Nutrition. 21, 23-46 (2001).
- Clifton, M. E., Noriega, F. G. The fate of follicles after a blood meal is dependent on previtellogenic nutrition and juvenile hormone in Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 58, 1007-1019 (2012).
- Gonzales, K. K., et al. The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota. Scientific Reports. 8, 11023 (2018).
- Vodovotz, Y., Zamora, R., Lieber, M. J., Luckhart, S. Cross-talk between nitric oxide and transforming growth factor-beta1 in malaria. Current Molecular Medicine. 4, 787-797 (2004).
- Sumba, L. A., et al. Daily oviposition patterns of the African malaria mosquito Anopheles gambiae Giles (Diptera: Culicidae) on different types of aqueous substrates. Journal of Circadian Rhythms. 2, 6 (2004).
- Baughman, T., et al. A highly stable blood meal alternative for rearing Aedes and Anopheles mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11, 0006142 (2017).
