Summary
Een protocol wordt gepresenteerd voor de formulering van een bloedvrij kunstmatig dieet om Anopheles muggen in gevangenschap te voeden. Dit dieet heeft een vergelijkbare prestatie als gewerveld bloed en triggers oogenese en ei rijping en produceert levensvatbare volwassen nakomelingen.
Abstract
Malaria onderzoek vereist grootschalige broed- en productieomstandigheden voor muggen(Anopheles spp.) in gevangenschap. De duurzame en betrouwbare productie van muggen wordt momenteel geremd door de aanvoer van vers gewerveld bloed. Alternatieven voor bloed zijn nodig om efficiënte bestrijdingsstrategieën voor malaria en andere door vectoren overgedragen ziekten te bevorderen die worden overgedragen door bloedvoedende insecten. Met dit in gedachten werden kunstmatige vloeibare diëten geformuleerd als vervanging voor vers gewerveld bloed. Hierin rapporteren we een bloedvrij kunstmatig vloeibaar dieet dat voedingssnelheden levert die vergelijkbaar zijn met bloed en de fysiologische effecten van een verse gewervelde bloedmaaltijd nabootst. Het dieet induceert eierstokkanker en eirijping van Anopheles muggen en produceert ook goede larve overleving en ontwikkeling van functionele volwassenen. Het geformuleerde bloedvrije vloeibare dieet is een belangrijke vooruitgang in de richting van duurzame muggenveredeling in gevangenschap en zal de onderhoudskosten van muggenkolonies verlagen en de noodzaak van vers gewerveld bloed elimineren.
Introduction
Door vectoren overgedragen ziekten treffen wereldwijd miljoenen mensen en veroorzaken jaarlijks miljoenen doden. Ze worden overgedragen door insecten die besmet zijn met ziekteproducerende micro-organismen (protozoan, virussen) die zijn verkregen wanneer ze zich voeden met bloed van een geïnfecteerde gastheer. Vervolgens zal de geïnfecteerde vector de ziekteverwekker doorgeven aan een nieuwe gastheer tijdens de volgende bloedmaaltijd. Malaria is de dodelijkste door vector en overgedragen ziekte die wordt overgedragen door verschillende soorten Anopheles mug en treft 40% van de wereldbevolking1. De malaria protist parasiet is verantwoordelijk voor meer dan 400.000 sterfgevallen per jaar, waarvan de meeste kinderen jonger dan 5 jaar (World Health Organization). De vrouwelijke Mug anopheles brengt de malariaparasiet van het geslacht Plasmodium tussen mensen en andere dieren over wanneer het zich voedt met gewerveld bloed, een noodzakelijke stap voor eiproductie en ontwikkeling2.
De huidige strategieën voor de uitroeiing van malaria en andere opkomende dodelijke door muggen overgedragen ziekten zijn afhankelijk van de ontwikkeling van innovatieve muggenbestrijdingsstrategieën3,4,5, waaronder de introductie in het wild van grote aantallen muggen die in insecten worden gefokt. Een cruciale beperkende factor is echter de afhankelijkheid van een toevoer van vers bloed voor effectieve muggenteelt en -veredeling. De variabele samenstelling van gewerveld bloed kan een negatieve invloed hebben op de vruchtbaarheid van muggen en de geschiktheid van het nageslacht en kan de betrouwbaarheid en duurzaamheid van in gevangenschap levende broedkolonies beperken. Muggenafgifte- en controleprogramma's vereisen grootschalige muggenproductiesystemen en een regelmatige aanvoer van grote hoeveelheden gewerveld bloed. Dit is een belangrijk obstakel voor de productie van muggen en werpt een reeks ethische kwesties in verband met het gebruik van levende dieren en logistieke beperkingen veroorzaakt door de bijbehorende veeleisende veiligheidsvoorschriften. Dit maakt de kosten van onderhoud en veiligheid van muggenkolonies hoog en daagt de duurzaamheid van de huidige muggenkweekpraktijken in gevaar, met name in landen met een laag inkomen waar de dreiging van malaria veel groter is.
Recent onderzoek is gericht op de ontwikkeling van bloedvervangers die een gewervelde bloedmaaltijd na te bootsen, maar tot nu toe, slechts beperkt succes is bereikt6,7,8,9. Een succesvol kunstmatig dieet moet (1) volledige vrouwelijke muggenvertakking uitlokken, (2) vitellogenineproductie activeren, (3) grote partijen levensvatbare eieren produceren en (4) heidenakomelingen genereren10. Bovendien hebben kunstmatige diëten een standaardsamenstelling en zijn ze dus betrouwbaarder voor de productie van muggen voor onderzoeks- en controledoeleinden. Succesvolle bloedvrije diëten zijn ontwikkeld voor Aedes muggen (beoordeeld door Gonzales en Hansen11), maar niet voor Anopheles spp. Bestaande kunstmatige diëten bevatten een phagostimulant (bijvoorbeeld ATP10), een eiwitbron voor eirijping6,12, koolhydraten als energiebron, en aminozuren (aa)13 die fundamenteel zijn voor de productie van eieren en zijn een belangrijke beperkende factor voor de vruchtbaarheid van muggen14. Een kunstmatig bloedvrij dieet moet ook cholesterol15leveren, wat de eiproductie verbetert. Hier beschrijven we een kunstmatig bloedvrij dieet voor vrouwelijke Anopheles muggen en tonen aan dat het een consistente en gelijkwaardige prestatie heeft aan een hoogwaardige gewervelde bloedmaaltijd.
Protocol
Muizen werden verkregen uit het IHMT dierenhuis. Dierproeven werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de Portugese wet en richtlijnen voor het gebruik van proefdieren. De Direção-Geral de Veterinária, Ministério da Agricultura do Desenvolvimento Rural e das Pescas, Portugal keurde alle studieprotocollen goed (id-goedkeuringen: 023351 en 023355).
LET OP: Voer alle voedingstesten uit bij ~26 °C.
1. Muggen
- Behoud Anopheles coluzzii (voormalig Anopheles gambiae M-vorm) Yaoundé stam muggen bij 26 °C, 75% vochtigheid onder een licht-donkere cyclus van 12 uur.Maintain Anopheles coluzzii (former Anopheles gambiae M form) Yaoundé strain mosquitoes at 26 °C, 75% humidity under a 12 h:12 h light:dark cycle. Huismuggen die standaard insectenomstandigheden gebruiken om paring te garanderen.
- Verzamel muggenpoppen in een kleine watercontainer. Plaats de container in een muggenkooi om volwassen muggen te laten ontstaan en te paren. Zorg voor 10% glucosevoeding oplossing. Drie dagen na de opkomst verzamelen het benodigde aantal muggen uit de voorraad kooi met behulp van een aspirator.
- Verwijder een dag voor de voedingsproeven de 10% glucosevoedingsoplossing.
OPMERKING: 3 dag oude muggen werden gebruikt tijdens de experimenten.
2. Muggenvoeding
- Bereiding van kunstmatige vloeibare diëten
- Bereid de kunstmatige vloeibare diëten onder steriele omstandigheden in een laminaire stroomkast. Bereid het rijke vloeibare dieet (r-liq_diet) voor door het volgende toe te voegen aan het eerste vloeibare dieet (i-liq_diet; Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium [hoge glucose met L-glutamine], zie tabel 1):0,55 g/L ATP, 1 g/L cholesterol en 200 g/L runderserumalbumine (BSA). Meng alle ingrediënten grondig en filter met behulp van een 0,45 μm microfilter.
LET OP: Bewaar de diëten niet; bereiden diëten vers uit de voorraad oplossingen voor elk experiment als ze kwaliteit verliezen wanneer opgeslagen. Onderdelen van de diëten worden beschreven in tabel 1.
- Bereid de kunstmatige vloeibare diëten onder steriele omstandigheden in een laminaire stroomkast. Bereid het rijke vloeibare dieet (r-liq_diet) voor door het volgende toe te voegen aan het eerste vloeibare dieet (i-liq_diet; Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium [hoge glucose met L-glutamine], zie tabel 1):0,55 g/L ATP, 1 g/L cholesterol en 200 g/L runderserumalbumine (BSA). Meng alle ingrediënten grondig en filter met behulp van een 0,45 μm microfilter.
- De bloedinzameling van de muis
- Verdoven 6−8 week oude CD1 vrouwelijke muizen (Mus musculus) met ketamine (120 mg/kg) en xylazine (16 mg/kg) met behulp van de intraperitoneale route.
- Voer hartpunctie uit(figuur 1)wanneer de muis geen spierreactie vertoont in reactie op verschillende fysieke stimuli (bijvoorbeeld teen- en staartknijpers).
- Verzamel bloed met een steriele 1 mL-spuit met een naald van 0,4 x 12 mm2met een naald van 100 μL van 1 mg/mL heparine (natriumzout) om vorming van bloedstolsels te voorkomen. Houd het bloed op 37 °C met behulp van een waterbad.
- Kunstmatige voeding
- Verzamel ongeveer 30 vrouwelijke muggen uit de voorraadkooi met behulp van een aspirator.
- Breng de vrouwelijke muggen over op papierbekers van 500 mL en bedek met een fijn muskietennetgaas, zodat ze niet kunnen ontsnappen. Breng een glazen feeder aangesloten op plastic buizen om een constante waterstroom te handhaven naar de bovenkant van elke beker(figuur 2). Zorg voor een constante waterstroom naar de cilindrische buizen en feeder, zodat de temperatuur binnen op ongeveer 37,5 °C wordt gehouden.
OPMERKING: Een standaard glazen bel kunstmatige voeding apparaat16 werd gebruikt om de geformuleerde diëten te leveren aan vrouwelijke muggen. - Rek paraffine film membraan over de mond van de glazen feeder om de maaltijd te bevatten.
- Verwarm de i-liq_diet en r-liq_diet met een waterbad voor op 37 °C. Breng 1 mL aan in de glazen feeder. Voer de muggen gedurende 60 min in het donker met i-liq_diet, r-liq_diet of vers muisbloed. Voer testen uit bij 26 °C.
- Evaluatie van de voersnelheid.
- Na kunstmatige voeding, koud-verdoven de muggen op -20 °C voor 30 s. Plaats de muggen in een gekoelde petrischaal.
- Noteer het aantal volledig opgeslokte (Figuur 3) vrouwelijke muggen.
OPMERKING: Het percentage gevoede muggen wordt gebruikt als een proxy voor het voeden van succes.
3. Levensgeschiedenis eigenschappen
- Eiproductie en vruchtbaarheid
- Breng de volledig opgeslokte vrouwtjes met behulp van een borstel over op individuele kooien (20 cm x 20 cm x 20 cm).
- Houd de muggen op 26 ± 1 °C, 75% vochtigheid en een licht-:donkere cyclus van 12 uur met 10% glucose ad libitum.
- Achtenveertig uur na het voeden, voeg een bevochtigd filterpapier aan de onderkant voor het leggen van eieren (figuur 4). Tel de eieren op 48 uur en 72 uur na de toevoeging van het legpapier met een handvergrootglas. Overspoel het filterpapier met gedestilleerd water om de eieren te verzamelen.
- Larvensterfte
- Verzamel de eieren in trays (23 cm x 15 cm x 6 cm) gevuld met gedestilleerd water (figuur 5). Houd het waterniveau in de trays constant tijdens de experimenten.
- Voer de larven dagelijks met ongeveer 13 mg gemalen visvoedsel per lade. Breng een soortgelijk voerregime aan op alle replicerende trays.
- Verwijder dagelijks dode poppen en larven. Rond de experimenten af wanneer alle poppen zich hebben ontwikkeld tot volwassenen en tel het aantal volwassen mannetjes en vrouwtjes.
- Registreer de data van uitkomen en overlijden en bereken de sterftecijfers.
- Levensduur
- Verzamel 15 volwassen mannen en 15 volwassen vrouwtjes uit de F1-generatie van elke dieetgroep. Houd mannetjes en vrouwtjes in dezelfde kooi.
- Voer volwassenen met een 10% glucose oplossing ad libitum. Verwijder de dode volwassenen dagelijks.
- Houd de muggen op dezelfde temperatuur, vochtigheid, lichtcyclusomstandigheden en suikervoeding zoals hierboven beschreven.
- Registreer de overlijdensdata en bereken de levensduur.
- Meting vleugellengte
- Koud-verdoven de vijf dagen oude F1 volwassen muggen (mannelijke en vrouwelijke) uit elke dieetgroep op -20 °C voor 90 s.
- Onder een stereoscoop, voorzichtig grijpen de thorax van elke mug met tangen en plaats ze ventrale kant omhoog.
- Verzamel beide vleugels met behulp van een scalpel en leg ze op een schone microscoop dia met een gedroogde druppel van montage medium. Voeg met behulp van een naald van 20 G extra montagemedia toe aan de randen van de coverslip en laat de coverslip langzaam op de vleugels zakken.
- Meet de vleugellengte (figuur 6)met een stereoscoop met behulp van een micrometer.
Representative Results
De hieronder beschreven resultaten vergelijken de prestaties van vrouwelijke Anopheles-muggen die worden gevoed met de geformuleerde rijke kunstmatige maaltijd (r-liq_diet) en muggen die gevoed worden met het eerste vloeibare dieet (i-liq_diet) of een verse bloedmaaltijd. Het dieet werd getest volgens het schematisch protocol afgebeeld in figuur 7. De r-liq_diet die hierin wordt beschreven, maakt deel uit van een patent (PCT/IB2019/052967).
Percentage volledig opgeslokte vrouwtjes
Het aantal opgeslokte vrouwelijke muggen gevoed met de r-liq_diet (89%) was aanzienlijk hoger dan het aantal engorged vrouwtjes gevoed met bloed (56%) (Figuur 8).
Vruchtbaarheid en vruchtbaarheid
Vrouwelijke vruchtbaarheid en vruchtbaarheid voor de eerste gonotrofische cyclus werd gebruikt om de voedingswaarde van de i-liq_diet en r-liq_diet te evalueren. Gemiddeld 24 ± 11 eieren werden gelegd door vrouwtjes gevoed met vers gewerveld bloed, terwijl vrouwtjes gevoed met r-liq_diet legde een gemiddelde van 25 ± 5 eieren (tabel 2). Geen ei leggen werd waargenomen door vrouwtjes gevoed op de i-liq_diet.
F1-sterfte
De geschiktheid van F1-muggen werd geëvalueerd tussen kolonies gevoed met gewerveld bloed of de r-liq_diet. Larven, poppen en volwassen sterfte werden geregistreerd. Variabiliteit (standaardfout van het gemiddelde [SEM]) was hoger in de bloedgevoede muggen(figuur 9 en tabel 2)ten opzichte van muggen die de r-liq_diet voedden. De F1-generatie muggen gevoed met het bloed of de r-liq_diet had vergelijkbare sterfte en overlevingskansen.
F1 levensverwachting
Het Centrum voor Ziektebestrijding en Preventie schat dat wilde volwassen vrouwelijke muggen tot een maand leven, maar waarschijnlijk niet langer dan 1,2 week overleven en dat mannetjes ongeveer een week leven en zich uitsluitend voeden met nectar en andere suikerbronnen. Opgemerkt wordt dat verschillen in de inname van ouderlijk voedsel de overleving van het muggennageslacht kunnen beïnvloeden17. In ons experiment, volwassen vrouwtjes en mannen in het bloed (vrouwelijke 24,5 ± 6,8; mannelijke 18,5 ± 6,9) en r-liq_diet (vrouw: 22,5 ± 8,1; man: 11,9 ± 6,9) groepen hadden vergelijkbare gemiddelde levensduur gemiddeld (tabel 3) en vrouwtjes vertoonden een verhoogde levensduur ten opzichte van mannen.
F1 lichaamsgrootte
Vleugel lengte werd gebruikt als een indicator van volwassen lichaamsgrootte. In vergelijking met andere soorten zijn Anopheles volwassenen kleine tot middelgrote muggen met een vleugellengte van tussen de 2,8 en 4,4 mm vleugellengte18. Volwassen lichaamsgrootte van F1 Anopheles muggen gevoed de r-liq_diet was binnen het verwachte bereik en was vergelijkbaar met bloedgevoede insectenmuggen (Figuur 10).
Statistische analyse
De gepresenteerde gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde van ten minste drie onafhankelijke experimenten (tenzij anders vermeld). Foutbalken vertegenwoordigen de SEM. Toen de gegevens een Gaussische distributie volgden, werden onafhankelijke groepen vergeleken met behulp van de Student's t-test, anders werd de Mann-Whitney-test toegepast. Verschillen tussen de kunstmatige dieet-gevoede groepen werden geanalyseerd met behulp van de Fisher's exacte test en werden beschouwd als significant op P ≤ 0,05.
Figuur 1: CD1 muis bloedafname door intracardiale punctie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Standaard kunstmatige voedingsapparatuur. De glazen feeder bevat r-liq_diet die wordt gevoerd aan vrouwelijke Anopheles muggen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Anopheles muggen na kunstmatige voeding. Van links naar rechts: een volledig opgeslokt vrouwtje dat r-liq_diet werd aangeboden, niet-opgeslokt vrouwtje dat r-liq_diet, mannelijk en volledig opgeslokt vrouwtje werd aangeboden dat muisbloed werd aangeboden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Anopheles eieren gelegd 48 uur na het voeden van vrouwtjes met de r-liq_diet. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: L2-larven stadia die zich ontwikkelden uit de eieren en werden verzameld op filterpapier en geplaatst in trays met gedestilleerd water. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Rechtervleugel van een F1-generatie van een Anopheles coluzzii vrouwelijke mug. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: Schematisch protocol voor kunstmatige dieettesten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: Voedingspercentages van de vrouwelijke muggen voedden de kunstmatige diëten of bloed. Sterretjes wijzen op significante verschillen tussen de muggen gevoed de r-vloeibare en i-vloeibare diëten en de bloedgevoede controlegroep. Tweezijdige Fisher's exacte test: ****P ≤ 0,0001 (relatief risico: 0,4828, 95% zelfverzekerd niveau [CL]: 0,3776 tot 0,6194) voor r-vloeibaar dieet versus bloed, *P = 0,0335 (relatief risico: 1.379, 95% CL: 1.044 tot 1.836) voor bloed versus i-vloeibaar dieet. Blauw: ongevoed; rood: gevoed. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 9: Effect van de geformuleerde bloedvrije maaltijd op de mortaliteit en de verhouding tussen man en vrouw van F1 Anopheles coluzzii-muggen. Er werden drie onafhankelijke experimenten uitgevoerd, elk met 30 muggen per dieet. Een ongepaarde t-test toonde geen significante verschillen aan tussen de bloedgevoede groep en de r-liq_diet gevoede groep(P-waarden varieerden van 0,5047 tot 0,8491). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 10: Vleugellengte. De afstand van de axiale incisie tot de R4+5 ader met uitzondering van de franje seta werd gebruikt om de vleugellengte te bepalen. Grootte werd geëvalueerd voor 5 vrouwtjes en 5 mannetjes uit elke voedingsgroep (gemiddelde ± SEM). Waarden worden weergegeven als het gemiddelde ± SEM. Zalm: r-liq_diet; rood: gewerveld bloed. Niet-gekoppelde t-test; vrouwelijke linkervleugel: t = 1.300, df = 8, P = 0,2298; mannelijke linkervleugel: t = 2.400, df = 8, P = 0,0432; vrouwelijke rechtervleugel: t = 1.300, df = 8, P = 0,2298; mannelijke rechtervleugel: t = 2.277, df = 7, P = 0,0569. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Onderdelen | g/L |
| *Adenosine Trifosfaat | 0.55 |
| *Runderserum Albumin | 200 |
| *Cholesterol | 1 |
| Calciumchloride anhydrous | 0.2 |
| Cholinechloride | 0.004 |
| D-calcium pantothenaat (vitamine B5) | 0.004 |
| D-glucose waterewater | 4.5 |
| Ferric nitraat nonahydraat | 0.0001 |
| Foliumzuur | 0.004 |
| Glycine | 0.03 |
| I-inositol | 0.007 |
| L-arginine monohydrochloride | 0.084 |
| L-cystine dihydrochloride | 0.063 |
| L-glutamine | 0.584 |
| L-histidine monohydrochloride monohydraat | 0.042 |
| L-isoleucine | 0.105 |
| L-leucine | 0.105 |
| L-lysine monohydrochloride | 0.146 |
| L-methionine | 0.03 |
| L-fenylalanine | 0.066 |
| L-serine | 0.042 |
| L-threonine | 0.095 |
| L-tryptofaan | 0.016 |
| L-tyrosine dnatriumzoutdihydraat | 0.104 |
| L-valine | 0.094 |
| Magnesiumsulfaat anhydrous | 0.098 |
| Niacinamide (nicotinamide) | 0.004 |
| Fenol rood | 0.015 |
| Kaliumchloride | 0.4 |
| Pyridoxine Monohydrochloride | 0.004 |
| Pyruviczuur natriumzout | 0.011 |
| Riboflavine (vitamine B2) | 0.0004 |
| Natriumbicarbonaat | 3.7 |
| Natriumchloride | 6.4 |
| Natriumfosfaat monobasic anhydrous | 0.109 |
| Thiamine amonohydrochloride (vitamine B1) | 0.004 |
| *Alleen in r-liq_diet | |
Tabel 1: De samenstelling van het i-vloeibare dieet en r-vloeibaar dieet.
| Totaal eigetal (± SEM) | Eieren/vrouwtje (± SEM) | |
| Bloed | 733 ± 330 | 24 ± 11 |
| r-liq_diet | 763 ± 164 | 25 ± 5 |
| i-liq_diet | 0 | 0 |
Tabel 2: Eipartijen geproduceerd door Anopheles coluzzii vrouwtjes. Drie onafhankelijke experimenten werden uitgevoerd voor elk experimenteel dieet met behulp van 30 vrouwelijke muggen in elk.
| Vrouwtjes (dagen ± SEM) | Mannetjes (dagen ± SEM) | |
| Bloed | 24,5 ± 6,8 | 18,5 ± 6,9 |
| r-liq_diet | 22,5 ± 8,1 | 11,9 ± 6,9 |
Tabel 3: Levensverwachting van F1 Anopheles muggen. Levensduur van F1 muggen van kunstmatig gevoed F0 werd beoordeeld door het registreren van de data van geboorte en dood van elke mug afkomstig uit dezelfde voedingsgroep (15 vrouwtjes en 15 mannetjes werden gevolgd). De resultaten worden weergegeven als de gemiddelde levensduur van muggen per dieetgroep.
Discussion
Het succes van ons geformuleerde bloedvrij dieet is waarschijnlijk het resultaat van het synergetische fysiologische effect van alle componenten toegevoegd aan de i-liq_diet (rijk aan suiker, aminozuren, vitaminen en micro-elementen): BSA (eiwitbron), ATP (phagostimulant) en cholesterol (lipidebron). Suppletie van de r-liq_diet met de afzonderlijke componenten alleen was niet effectief in het stimuleren van de eierproductie (gegevens niet getoond). Een nadeel van het protocol kan de kosten van sommige van de componenten, zoals cholesterol. Toch is de aanwezigheid ervan fundamenteel, omdat insecten niet in staat zijn om het te synthetiseren19 en dit molecuul is de voorloper van de ecdysteroïde hormonen die dooiersynthese en eirijping reguleren in geleedpotigen20. Lagere hoeveelheden cholesterol moeten worden getest om de benodigde hoeveelheid te optimaliseren met als doel de kosten te verlagen en de voordelen van het kunstmatige dieet te verhogen.
Een andere beperking van de methode is dat het kunstmatige dieet vers moet worden bereid uit voorraad oplossingen, zoals eenmaal bereid in zijn uiteindelijke vloeibare vorm verliest kwaliteit na opslag. In de toekomst kan ons geformuleerde dieet worden bereid als een gedroogde kracht, vergelijkbaar met SkitoSnackt, een kunstmatige bloedmaaltijd vervanging voor Aedes aegypti muggen21.
Naast het leveren van de nodige voedingsstoffen, moet een kunstmatige maaltijd vrouwelijke muggen aantrekken en stimuleren om zich op dezelfde manier te voeden als wanneer ze zich voeden met vers bloed van gewervelde dieren. Het kunstmatige bloedvrije dieet hierin beschreven resulteerde in een 20% toename van volledig opgeslokte vrouwelijke muggen in vergelijking met de gewervelde bloed gevoedgroep. Deze indirecte aantrekkingskracht kan verder worden verduidelijkt door olfactometers te gebruiken om te bevestigen dat het kunstmatige dieet aantrekkelijker en aantrekkelijker is voor muggen dan vers bloed.
De hoogste impact van het dieet op de sterfte aan larven werd waargenomen voor larven afkomstig van muggen die met bloed worden gevoed, wat suggereert dat een kunstmatig dieet van stabiele samenstelling kan bijdragen aan het verminderen van sterfte en het verbeteren van het succes van muggenveredeling in vergelijking met vers bloed. De minder voorspelbare uitkomst van een bloedmaaltijd kan het gevolg zijn van gastheervariaties in samenstelling17 en de aanwezigheid in het bloed van moleculen die de muggenfysiologie kunnen verstoren22. De voorgaande feiten benadrukken de voordelen voor muggen van hoge kwaliteit die versbloedvrije diëten grootbrengen.
Over het geheel genomen was het gemiddelde aantal eieren dat in onze studie werd gelegd laag ten opzichte van eieren die in sommige insecten, maar het gemiddelde aantal eicellen werd gemeld, vergelijkbaar met de a. gambiae laboratorium-gefokte stam gevoed met menselijk bloed (22,6 ± 5,5 eieren/vrouwtje)23. Er werden geen significante statistische verschillen waargenomen tussen onze experimentele groepen die zich voedden met vers bloed of op de kunstmatige maaltijden(tabel 2),wat suggereert dat de implementatie van een kunstmatige membraanvoedingssystemen met ons geformuleerde dieet voldoende is om muggenkolonies anopheles in gevangenschap te behouden en te propageren.
Kunstmatige bloedvrije maaltijden kunnen Aedes kolonies22behouden, maar wanneer toegepast op Anopheles muggen zijn ze van beperkt of geen succes11. Onlangs werd een kunstmatige maaltijd op basis van plasma voor Anopheles-muggen beschreven 24, maar de voedingspercentages en het voortplantingspotentieel waren laag. Onze resultaten vertegenwoordigen een aanzienlijke vooruitgang in de state-of-art (beoordeeld door Gonzales en Hansen11) als onze geformuleerde r-liq_diet had een soortgelijke of betere prestaties dan de standaard gewervelde bloedmaaltijd. Verdere verbeteringen op het gebied van de stabiliteit en de kosten van de opslag moeten het toepassingsgebied ervan vergroten.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen Dinora Lopes (IHMT-NOVA Animal Facility) bedanken voor technische ondersteuning, Joana Gomes en Ana Catarina Alves (IHMT-NOVA Insectary Facility) voor het behoud van Anopheles muggenkolonies. Gefinancierd door de Bill and Melinda Gates Foundation (OPP1138841), Fundação para a Ciência e Tecnologia (UID/Multi/04413/201, UID/Multi/04326/2013, SFRH/BPD/89811/2012, CEECIND/00450/2017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | A2383 | |
| BSA-Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A790G | |
| Cholesterol | MP Biomedicals | 199342 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (high glucose with L-glutamine) | Lonza Bioscience | BE12-604F | |
| Entellan mounting medium | Merck | 1079610100 | |
| Glassfeeder | Local glazier | by design | |
| Heparin Sodium Salt | Pan Reac AppliChem | A3004,0001 | |
| Imalgène 1000 | Merial, Portugal | 01MER122 | |
| Needle 20 G x 1" 0.9 x 25 mm needle | Terumo Europe | NN-2025R | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | P6543-1EA | |
| Rompun | Bayer, Portugal | 7427831 | |
| Sterilization Millex-HV 0,45 | Millipore | SLHVR25KS | |
| Syringe, 1ml, 27 G x ½" 0.4 x 12 mm needle | Terumo Europe | BS-NIN2713 | |
| Teich Mix Astra Pond | Astra | 4030733100957 | |
| Tetra Goldfish Flakes | Tetra | 4004218742642 |
References
- WHO. World Malaria Report. , World Health Organization. (2016).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Rodriguez, S. D., Drake, L. L. Four-way regulation of mosquito yolk protein precursor genes by juvenile hormone-, ecdysone-, nutrient-, and insulin-like peptide signaling pathways. Frontiers in Physiology. 5, 103 (2014).
- Catteruccia, F., Crisanti, A., Wimmer, E. A. Transgenic technologies to induce sterility. Malaria Journal. 8, Suppl 2 7 (2009).
- Dame, D. A., Curtis, C. F., Benedict, M. Q., Robinson, A. S., Knols, B. G. J. Historical applications of induced sterilisation in field populations of mosquitoes. Malaria Journal. 8, Suppl 2 2 (2009).
- Lacroix, R., et al. Open Field Release of Genetically Engineered Sterile Male Aedes aegypti in Malaysia. PLoS One. 7, 42771 (2012).
- Lea, A. O., Knierim, J. A., Dimond, J. B., Delong, D. M. A Preliminary Note on Egg Production from Milk-Fed Mosquitoes. The Ohio Journal of Science. 55, 1-21 (1955).
- Kogan, P. H. Substitute blood meal for investigating and maintaining Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 27, 709-712 (1990).
- Griffith, J. S., Turner, G. D. Culturing Culex quinquefasciatus mosquitoes with a blood substitute diet for the females. Medical and Veterinary Entomology. 10, 265-268 (1996).
- Jason Pitts, R. A blood-free protein meal supporting oogenesis in the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus (Skuse). Journal of Insect Physiology. 64, 1-6 (2014).
- Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti. PeerJ. 3, 938 (2015).
- Gonzales, K. K., Hansen, I. A. Artificial Diets for Mosquitoes. International Journal of Environmental Research and Public Health. 13 (12), 1267 (2016).
- Cosgrove, J. B., Wood, R. J. Effects of variations in a formulated protein meal on the fecundity and fertility of female mosquitoes. Medical and Veterinary Entomology. 10, 260-264 (1996).
- Attardo, G. M., Hansen, I. A., Shiao, S. -H., Raikhel, A. S. Identification of two cationic amino acid transporters required for nutritional signalling during mosquito reproduction. Journal of Experimental Biology. 209, 3071-3078 (2006).
- Clements, A. N. The biology of mosquitoes: Development, nutrition, and reproduction. , Chapman & Hall. New York, NY. (1992).
- Talyuli, O. A., et al. The use of a chemically defined artificial diet as a tool to study Aedes aegypti physiology. Journal of Insect Physiology. 83, 1-7 (2015).
- Lopes, L. F., Abrantes, P., Silva, A. P., Dorosario, V. E., Silveira, H. Plasmodium yoelii: The effect of second blood meal and anti-sporozoite antibodies on development and gene expression in the mosquito vector, Anopheles stephensi. Experimental Parasitology. 115, 259-269 (2007).
- Phasomkusolsil, S., et al. Maintenance of mosquito vectors: effects of blood source on feeding, survival, fecundity, and egg hatching rates. Journal of Vector Ecology. 38, 38-45 (2013).
- Gillies, M. T., De Meillon, B. The Anophelinae of Africa South of the Sahara (Ethiopian zoogeographical region). Publications of the South African Institute for Medical Research. 54, 1 (1968).
- Canavoso, L. E., Jouni, Z. E., Karnas, K. J., Pennington, J. E., Wells, M. A. Fat metabolism in insects. Annual Review of Nutrition. 21, 23-46 (2001).
- Clifton, M. E., Noriega, F. G. The fate of follicles after a blood meal is dependent on previtellogenic nutrition and juvenile hormone in Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 58, 1007-1019 (2012).
- Gonzales, K. K., et al. The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota. Scientific Reports. 8, 11023 (2018).
- Vodovotz, Y., Zamora, R., Lieber, M. J., Luckhart, S. Cross-talk between nitric oxide and transforming growth factor-beta1 in malaria. Current Molecular Medicine. 4, 787-797 (2004).
- Sumba, L. A., et al. Daily oviposition patterns of the African malaria mosquito Anopheles gambiae Giles (Diptera: Culicidae) on different types of aqueous substrates. Journal of Circadian Rhythms. 2, 6 (2004).
- Baughman, T., et al. A highly stable blood meal alternative for rearing Aedes and Anopheles mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11, 0006142 (2017).
