Summary
نحن نصف تقنيات الاستقراء التمايز من اثنين من خطوط الظهارية الثدي، HC11 و EpH4. في حين أن كلا تتطلب مصل ربلة الساق الجنين, الأنسولين, والبرولاكتين لإنتاج بروتينات الحليب, خلايا EpH4 يمكن أن تفرق تماما في الغلاف الشعاعي للثدي في ثقافة ثلاثية الأبعاد. وهذه النماذج التكميلية مفيدة لدراسات نقل الإشارات عن التمايز والأورام.
Abstract
الكادهيرين تلعب دورا هاما في تنظيم التمايز الخلية وكذلك الأورام. هنا نصف أصول وأساليب تحريض التمايز من اثنين من خطوط الخلايا الظهارية الثدي الماوس، HC11 وEpH4، واستخدامها لدراسة المراحل التكميلية لتطوير الغدة الثديية والتحول النيوبلاستيك.
وHC11 الماوس الثدي الظهارية خط الخلية نشأت من الغدة الثديية من حبل الحمل / ج الماوس. فإنه يميز عندما نمت إلى التقاء تعلق على سطح طبق بيتري البلاستيك في المتوسط التي تحتوي على مصل ربلة الساق الجنين وHydrocortisone، أناnsulin وProlactin (HIP المتوسطة). في ظل هذه الظروف، تنتج خلايا HC11 بروتينات الحليب α-casein وبروتين مصل اللبن الحمضية (WAP)، على غرار الخلايا الظهارية الثديية المرضعة، وتشكل هياكل بدائية تشبه الغدة الثديية يطلق عليها "القباب".
تم اشتقاق خط الخلية EpH4 من خلايا الغدة الثديية الظهارية للفأر ة الخالدة تلقائيًا والمعزولة عن فأر ة Balb/c الحامل. على عكس HC11، يمكن لخلايا EpH4 أن تفرق بشكل كامل إلى كرويدات (تسمى أيضًا الغلاف الشعاعي للثدي) عندما يتم استزراعها في ظل ظروف نمو ثلاثية الأبعاد (3D) في وسط HIP. الخلايا هي التربس، علقت في مصفوفة 20٪ تتكون من خليط من البروتينات مصفوفة خارج الخلية التي تنتجها Engelbreth-Holm-سرب (EHS) خلايا ساركوما الماوس، مطلي على الجزء العلوي من طبقة من مصفوفة مركزة طلاء طبق بيتري البلاستيك أو لوحة متعددة الآبار، وتغطي مع طبقة من 10٪ المتوسطة HIP التي تحتوي على مصفوفة. في ظل هذه الظروف، تشكل خلايا EpH4 كرويات جوفاء تحمل قطبية أبوية القاعدية، وهي تجويف أجوف، وتنتج الفيسين والواب.
باستخدام هذه التقنيات، أظهرت نتائجنا أن شدة إشارة الكادهيرين/راك أمر بالغ الأهمية للتمايز بين خلايا HC11. في حين أن Rac1 ضروري للتمايز والمستويات المنخفضة من تنشيط RacV12 زيادة التمايز، وارتفاع مستوياتV12 Rac كتلة التمايز في حين حفز الأورام. في المقابل ، تمثل خلايا EpH4 مرحلة مبكرة في التمايز الظهاري mammary ، والذي يتم تثبيطه حتى من خلال مستويات منخفضة من RacV12.
Introduction
في الأنسجة العادية أو الأورام ، والخلايا لديها فرص واسعة للالتصاق لجيرانها في منظمة ثلاثية الأبعاد ، وهذا يحاكي في الثقافة من قبل نمو الخلايا عالية الكثافة. يتم التوسط في الالتصاق من خلية إلى خلية بشكل رئيسي من خلال مستقبلات الكادهيرين ، والتي تحدد بنية الخلايا والأنسجة. ومن المثير للاهتمام، وقد ثبت مؤخرا أن الكاديرين تلعب أيضا دورا قويا في نقل الإشارات، وخاصة في البقاء على قيد الحياة إشارة1. ومن المفارقات أن بعض إشارات الالتصاق من الخلية إلى الخلية الصادرة من الكادهيرين وجدت مؤخراً أن كل من التمايز والأورام2مشتركة. هنا، ونحن نصف أساليب التعريفي وتقييم التمايز في نوعين تمثيليين من خطوط الخلايا الظهارية الثدي الماوس، HC11 وEpH4.
يمكن أن يوفر خط الخلية الظهارية للثدي من طراز HC11 نموذجًا مفيدًا لدراسة تمايز الخلايا الظهارية. خلايا HC11 هي خط خلية مشتق من COMMA-1D ، منتقاة من الغدة الثديية لفأرة Balb/c 3 الحامل متوسطةالحمل. على النقيض من غيرها من المستنسخين المشتقة COMMA-1D ، فإن استنساخ HC11 ليس لديه أي شرط لمصفوفة خارج الخلية المضافة أو الزراعة المشتركة مع أنواع الخلايا الأخرى للتحريض المختبري لجين اللاكسين الذاتي ة الذاتية بواسطة الهرمونات اللاكتراجينية3. وقد استخدم هذا الخط الخلية على نطاق واسع في دراسات التمايز لأنه احتفظ بخصائص هامة للظهارة الثديية العادية: يمكن لخلايا HC11 إعادة تشكيل ظهارة القناة جزئيًا فيوسادةالدهون الثديية 4 . وعلاوة على ذلك، فإنها يمكن أن تميز في ثقافة ثنائية الأبعاد (2D) عندما نمت إلى التقاء تعلق على سطح طبق بيتري البلاستيك في وجود الستيرويد مثل H ydrocortisone أو ديكساميثازون، بالإضافة إلى أناnsulin و P rolactin (HIP المتوسطة) تفتقر إلى عامل نمو البشرة (EGF)، وهو مثبط للتمايز 5،6،7. في ظل هذه الظروف، تنتج خلايا HC11 بروتينات الحليب مثل الفيسين والواب، والتي يمكن اكتشافها عن طريق النشاف الغربي في غضون 4 أيام بعد الحث. في الوقت نفسه ، يشكل جزء من خلايا HC11 هياكل بدائية تشبه الغدة الثديية يطلق عليها "القباب" بطريقة عشوائية. القباب مرئية 4-5 أيام بعد الاستقراء وزيادة تدريجية في الحجم حتى اليوم 10، بالتزامن مع زيادة في إنتاج الكيسينα 8. ومن المثير للاهتمام، خلايا HC11 تمتلك متحولة p539،وبالتالي تمثل حالة preneoplastic. لهذا السبب، فإن نموذج HC11 مناسب بشكل مثالي لدراسة إشارات شبكات التمايز بالاقتران مع الأورام في نفس نظام الخلية.
خلايا EpH4 ، وهي مشتقة من خلايا IM-2 ، هي خط خلية غير مورم مشتق في الأصل من خلايا الغدة الثديية الماوس الخالدة تلقائيًا المعزولة عن الفأر ة Balb /c متوسطة الحمل10. تشكل خلايا EpH4 أحادية ظهارية مستمرة في ثقافة ثنائية الأبعاد ، ولكنها لا تفرق إلى هياكل تشبه الغدية10،11. ومع ذلك، بعد نمو 3D في مادة تتكون من خليط من البروتينات مصفوفة خارج الخلية التي تنتجها خلايا ساركوما الماوس EHS12 (مصفوفة EHS، مصفوفة، أو Matrigel، انظر جدول المواد)،بالإضافة إلى التحفيز مع HIP، يمكن لخلايا EpH4 تلخيص المراحل الأولية للتمايز الغدة الثديية. في ظل هذه الظروف، تشكل خلايا EpH4 كرويات (تسمى أيضًا الغلاف الشعاعي للثدي) التي تحمل قطبية أبوية والقاعدية وتجويف أجوف، وهي قادرة على إنتاج بروتينات الحليب α-casein و WAP، على غرار الخلايا الظهارية الثديية المرضعة. على عكس خلايا HC11 ، والتي هي غير متمايزة ، وبعض علامات mesenchymal التعبير13، EpH4 الخلايا يحمل مورفولوجيا مضيئة بحتة14. وقد أفيد أيضا خلايا EpH4 لإنتاج بروتينات الحليب في ثقافة 2D من خلال التحفيز مع ديكساميثازون, الأنسولين, والبرولاكتين15. ومع ذلك، فإن هذا النهج يمنع دراسة الآثار التنظيمية التي تحاكي البيئة الدقيقة للغدة الثديية في الثقافة ثلاثية الأبعاد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. طلاء خلايا HC11
- في غطاء تدفق لامينار باستخدام تقنيات معقمة إعداد زجاجة مع 50 مل من وسط الخلية HC11: RPMI-1640 مع 10٪ مصل الأبقار الجنين (FBS)، 5 ميكروغرام / مل الأنسولين، و 10 نانوغرام / مل EGF (انظر جدول المواد).
- لوحة ما يقرب من 400،000 خلية لكل 3 سم طبق بيتري: تمرير اثنين من 10 سم، 50٪ أطباق بيتري confluent في عشرين أطباق 3 سم في وسط HC11. يجب أن تكون الخلايا منتشرة بشكل جيد ولكن يجب تجنب التجفيف.
- استنشق الوسط إلى قارورة باستخدام مضخة فراغ.
- إضافة 250 ميكرولتر من التربسين (انظر جدول المواد)لكل لوحة 10 سم. دوامة وضرب لوحة من الجانبين مع الاحتفاظ بها أفقية لنشر التربسين وإزاحة الخلايا المرفقة
- مراقبة تحت المجهر على النقيض من المرحلة مع هدف 4x للتأكد من أن الخلايا قد بدأت في الانفصال عن الحواف قبل الأنابيب.
- يستنشق ما يقرب من 1.5 مل من وسط HC11 في معقمة, 9 بوصة باستور ماصة وبخ عموديا ضد الخلايا. تدوير طبق بيتري في حين بخ لطرد جميع الخلايا. يجب أن تعمل بسرعة لتجنب تجفيف الخلايا.
- نقل جميع الخلايا إلى زجاجة مع وسط HC11 ودوامة.
- ماسيت 2 مل من تعليق الخلية في كل طبق بيتري 3 سم. صخرة أطباق بيتري عبر الحدود لنشر بالتساوي. وضع الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية، 5٪CO2.
- في اليوم التالي، أو عندما تكون الخلايا حوالي 90-100٪ تتشنج، وتذوق المتوسطة، واستبدالها مع المتوسطة مع FBS والأنسولين ولكن تفتقر إلى EGF.
2. التمايز التعريفي، والرصد، وكمية من خلايا HC11
- بعد نمو الخلايا في المتوسط تفتقر إلى EGF لمدة 24 ساعة، إضافة متوسط التمايز (HIP المتوسطة) إلى عشرة لوحات 3 سم: RPMI-1640 تكملها مع FBS 10٪، 1 ميكروغرام /مل Hydrocortisone (انظر جدول المواد)،5 ميكروغرام/مل أناnsulin و 5 ميكروغرام/مل Prolactin (انظر جدول المواد)لمدة تصل إلى 10 أيام.
- الحفاظ على لوحات العشرة الأخرى 3 سم كضوابط: تغيير إلى وسط مع 10٪ FBS و 5 ميكروغرام / مل الأنسولين تفتقر إلى EGF وHIP.
- قم بتغيير الوسيط كل يومين إلى ثلاثة أيام إلى كل من الخلايا والضوابط المعالجة بـ HIP. ماصة المتوسطة بعناية للتأكد من أن الخلايا لا تنفصل.
- لرصد التمايز (أي تشكيل "القباب") ، ومراقبة الخلايا تحت المجهر على النقيض من المرحلة(الشكل 1ألف، لوحة اليسار). إذا كانت الخلايا تعبر عن بروتين الفلورسينس الأخضر (GFP) ، فلاحظ تحت المجهر المجهري الفلوري (الإثارة = 485/20 ؛ الانبعاثات = 530/25 ؛ التكبير 240x ؛ هدف 20x)(الشكل 1A، اللوحة اليمنى).
- لكمية درجة التمايز، استخراج البروتينات من طبق بيتري واحد كل من الخلايا والضوابط التي تعالج HIP، مرة واحدة في اليوم لما مجموعه 10 أيام وتحقيقات بقع الغربية لα-casein (انظر جدول المواد)(الشكل 1B).
- كشط الخلايا على الجليد مع 1.5 مل من الجليد البارد الفوسفات العازلة المالحة (PBS) في 1.8 مل البلاستيك أنبوب الطرد المركزي.
- بيليه الخلايا في 350 × ز، 1 دقيقة ، 4 درجة مئوية.
- غسل بسرعة بيليه 2x مع الجليد الباردة PBS. استنزاف أي بقايا.
- جعل المخزن المؤقت ليسيس: 50 mM HEPES (درجة الحموضة = 7.4)، 150 mM NaCl، 10 mM EDTA, 10 mM Na4P2O7,1% NP-40, 100 mM NaF, 2 mM Na3VO4,0.5 mM phenylmethylsulphonyl فلوريد (PMSF), 10 ميكروغرام/مل aprotinin, 10 ميكروغرام/مل leupeptin16. أضف 100 ميكرولتر لكل طبق بيتري مقاس 3 سم.
- توضيح lysate عن طريق الطرد المركزي في 10،000 ز لمدة 10 دقيقة في البرد.
- تحديد تركيز البروتين (انظر جدول المواد)وتحميل 10-20 ميكروغرام من البروتين من كل عينة على هلام البولي أكريلاميد-SDS 10٪.
- Electrophorese لمدة 15 ساعة في 45 V، أو في 100 V ل ~ 2-2.5 ساعة.
- نقل على النيتروسليلوز أو PVDF غشاء باستخدام جهاز نقل التنبل (انظر جدول المواد).
- كتلة مع 5٪ بومالين مصل البقر (BSA) في المحلول المالحة تريس العازلة مع 0.1٪ Tween-20 (TBST).
- إضافة الأجسام المضادة الأولية، الماعز المضادة للحالة المخففة 1:2،000 أو الماوس المضادة للاكتين المخفف 1:1،000 (انظر جدول المواد).
- غسل 3x مع TBST، 5 دقيقة في كل مرة.
- إضافة الأجسام المضادة الثانوية، البيروكسيديز الفجل (HRP) ربط الحمار المضادة للماعز المخفف 1:2،500، أو HRP ربط الحصان المضادة للفأرة الأجسام المضادة المخففة 1:10،000.
- غسل 3x مع TBST، 5 دقيقة في كل مرة.
- إضافة الكواشف ECL إلى الغشاء وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
3. الطلاء ونمو 3D من خلايا EpH4 في مصفوفة EHS
ملاحظة: المصفوفة سائلة في درجات الحرارة < 10 درجة مئوية وصلبة في درجات الحرارة أعلاه. تخزين في -80 درجة مئوية. إذابة عند 4 درجات مئوية في الليلة السابقة للاستخدام. ما قبل البرد لوحات زراعة الأنسجة ونصائح ماصة في -20 درجة مئوية قبل التعامل مع والحفاظ على المصفوفة، لوحات، ونصائح ماصة على الجليد لمنعها من ترسيخ.
- تنمو خلايا EpH4 في 2D في RPMI-1640 المتوسطة مع 10٪ FBS و 5 ميكروغرام / مل الأنسولين (EGF غير مطلوب).
- إعداد متوسط نمو EpH4 مع 10٪ (v/v، 3,500 ميكرولتر) أو 20٪ (v/v 2,000 μL) مصفوفة في اثنين من أنابيب مخروطية 50 مل. الحفاظ على الجليد حتى جاهزة للاستخدام.
- معطف 10 الآبار (1 سم2 لكل منهما) من لوحة بئر 24 مع 150 ميكرولتر من مصفوفة غير مخففة. انشر المصفوفة باستخدام طرف ماصة. تجنب خلق فقاعات. اضغط برفق على جانبي اللوحة مع الاحتفاظ بها أفقيًا لضمان توزيع المصفوفة بالتساوي عبر الجزء السفلي من البئر.
- احتضان لوحة بئر 24 في 37 درجة مئوية ل1 ساعة للسماح للمصفوفة لترسيخ.
- التربسينيس خلايا EpH4 كما هو موضح أعلاه لخلايا HC11 وعدها مع مقياس الهيموكيتومتر. نقل 5 × 104 خلايا لكل بئر إلى 1.5 مل أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم وتدور في 250 × ز لمدة 5 دقيقة.
- يستنشق بعناية المتوسطة ووضع أنبوب على الجليد.
- إعادة تعليق الخلايا في 350 ميكرولتر من متوسط نمو EpH4 تستكمل مع مصفوفة 20٪ باستخدام تلميح ماصة 1 مل مع الحفاظ على أنبوب مخروطي على الجليد. تجنب الفقاعات. من المهم ضمان تعليق خلية واحدة.
- بمجرد أن توطدت مصفوفة الطبقة السفلية (يجب أن تظهر المصفوفة شفافة وأخف في اللون مقارنة بالطلاء الأولي للآبار) ، أضف 350 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل جيد مغلف وضع في حاضنة CO2 عند 37 درجة مئوية مقابل 1 ساعة ~ للسماح لطبقة المصفوفة 20٪ بترسيخها.
- مراقبة الخلايا مجهريا تحت المرحلة على النقيض من هدف 4x. يجب أن تكون الخلايا المفردة مرئية.
- أضف 200 ميكرولتر من وسيط EpH4 يحتوي على مصفوفة 10٪ فوق 350 ميكرولتر من الخلايا المعلقة في مصفوفة 20٪. الاحتضان في 37 درجة مئوية.
4. تمايز التعريفي من خلايا EpH4 نمت في 3D(الشكل 2)
ملاحظة: إلى جانب التمايز، يمكن أن تخضع خلايا EpH4 أيضًا لتكوين الأنابيب عند تحفيزها باستخدام HGF (عامل نمو الكبد) في الثقافة ثلاثية الأبعاد. يمكن رؤية النمو الأنبوبي بعد 10 أيام من تحفيز HIP و HGF.
- بدء تحريض التمايز من خلايا EpH4 بعد يوم واحد من الطلاء في المصفوفة. قم بإزالة 150 ميكرولتر من المتوسط العلوي الذي يحتوي على مصفوفة 10٪ من الآبار باستخدام طرف ماصة بلاستيكية. أضف 200 ميكرولتر من وسيط EpH4 الذي يحتوي على HIP ومصفوفة 10٪.
- استبدل متوسط مصفوفة HIP بنسبة 10٪ كل يومين لمدة تصل إلى 10 أيام. تنمو خلايا التحكم في نفس متوسط مصفوفة 10٪ دون HIP.
- رصد تكوين الغلاف الشعاعي تحت تباين المرحلة(الشكل 3A، اللوحة السفلية).
5. Tubulogenesis التعريفي EpH4 الخلايا نمت في 3D(الشكل 3A و 3C)
- إعداد 24 لوحات بئر وخلايا EpH4 للنمو في مصفوفة كما هو مفصل في الخطوات 3.1-3.9. في اليوم التالي لطلاء الخلايا في المصفوفة، وإزالة 150 ميكرولتر من وسط EpH4 تحتوي على مصفوفة 10٪ من الآبار باستخدام طرف ماصة بلاستيكية. إضافة 200 ميكرولتر من وسط EpH4 يحتوي على مصفوفة 10٪ ، HIP ، و 20 نانوغرام / مل HGF (انظر جدول المواد).
- استبدل متوسط المصفوفة بنسبة 10٪ /HIP/HGF كل يومين لمدة تصل إلى 12-14 يومًا.
- رصد تشكيل tubule مجهريا باستخدام هدف 20x أو 40x(الشكل 3A، اللوحة اليمنى).
6. كمية التمايز: النشاف الغربي لـ α-casein
- ماصة بعناية قبالة 10٪ مصفوفة-HIP المتوسطة من الآبار. شطف 20٪ طبقة مصفوفة 2x مع 350 ميكرولتر من الجليد الباردة PBS. يجب أن تكون الكرويدات لا تزال موجودة في طبقة المصفوفة.
- أضف 700-1000 ميكرولتر من PBS الجليدي البارد مع 1 مل من حمض الإيثيلينديامينتراستيك (EDTA) مباشرة إلى الآبار. فصل بلطف الطبقة السفلى من مصفوفة 100٪ من البئر مع طرف ماصة لاسترداد spheroids الموجودة في تلك الطبقة. يهز بلطف لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية.
- نقل بعناية تعليق كروي ة إلى أنبوب مخروطي. شطف الآبار مع ~ 500 ميكرولتر من PBS-EDTA لاسترداد أي كرويدات المتبقية في الآبار وإضافة إلى أنبوب مخروطي.
- صخرة على الجليد لمدة 30 دقيقة إضافية تأكد من أن المصفوفة قد ذابت بالكامل. إذا شوهدت كتل مصفوفة مرئية، أضف المزيد من PBS-EDTA أو هز لفترة أطول.
- الطرد المركزي الحل لبيليه كرويلويدات في 350 × ز لمدة 5 دقيقة.
- يستنشق supernatant، ليس البرولويدات في الجليد البارد ة العازلة، والتحقيق لα-casein، cyclin D1، وp120RasGAP من قبل النشاف الغربية كما هو الحال في الخطوة 2.5 أعلاه16. كأجسام مضادة أولية، استخدم الماعز المضاد للحالة المخففة 1:2,000، والأرنب المضاد للسيكلين D1 المخفف 1:2,000، والفأر المضاد p120 المخفف 1:2,000. للأجسام المضادة الثانوية، واستخدام HRP ربط حمار المضادة للماعز المخفف 1:2،500، HRP ربط الحمار المضادة للأرانب المخفف 1:2،500، وHRP ربط الحصان المضادة للفأر المخفف 1:10،000.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ومن المعروف منذ فترة طويلة أن التمايز من الخلايا الظهارية والخلايا الشحمية يتطلب التقاء والاشتباك من الكاديرين2. نحن وآخرون أظهرنا أن الالتصاق من خلية إلى خلية والاشتباك من E- أو N-cadherin وcadherin-11، كما يحدث مع التقاء الخلايا المستزرعة، يؤدي إلى زيادة كبيرة في نشاط GTPases الصغير وخلية انقسام بروتين التحكم 42 (Cdc42)، وهذه العملية تؤدي إلى تفعيل interleukin-6 (IL6) السيتوكينات الأسرة وStat3 (محول إشارة والمنشط من النسخ-3،17)1،18،19. لأن العديد من مكونات مسار cadherin/Rac/IL6/Stat3 قد تشارك في كل من التمايز والتحول النيوبلاستيك، فإنها توفر مقابض جزيئية لدراسة الترابط بين هاتين العمليتين المتعارضتين تماما.
باستخدام التقنيات المذكورة أعلاه ، أظهرنا اعتمادًا لافتًا للتمايز على قوة إشارة Rac في خلايا HC11: في حين أن cRac1 الذاتيمطلوب للتمايز ، وعند مستويات منخفضة من الطفرات المنشطة RacV12 يسبب زيادة متميزة في قدرة التمايز ، تؤدي مستويات RacV12 العالية إلى كتلة مثيرة من التمايز أثناء تحفيز الأورام(الشكل 1B). في المقابل، حتى مستويات منخفضة من التعبيرV12 Rac منعت التمايز في خلايا EpH42. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن RacV12 ينشط Stat3 في العديد من أنظمة الخلايا، بما في ذلك HC1116، طفرات تنشيط Stat3C منعت التمايز في حين حفز التحول النيوبلاستيك20.
استكشفنا كذلك خصائص التمايز لخلايا EpH4 في ثقافة مصفوفة ثلاثية الأبعاد. في حين بلغ إنتاج الكيسين ذروته في 8-10 أيام ، كان تعبير السيكلين D-1 أقصى حد في 4-6 أيام بعد تحفيز HIP(الشكل 3B). وتدعم هذه النتائج وجود علاقة عكسية بين الانتشار والتمايز في نموذج EpH4. باستخدام DAPI (النووية) تلطيخ والمجهر البؤري لتحديد تحديد موضع الخلايا الظهارية الفردية، لاحظنا موت الخلايا الداخلية وتشكيل تجويف جوفاء في الغلاف الشعاعي للثدي(الشكل 3A، C). أظهرنا كذلك أن إضافة HGF (20 نانوغرام / مل) في 48 ساعة إلى وسط HIP أدى إلى تشكيل هياكل أنبوبي(الشكل 3A، C)،بما يتفق مع دراسات المجهر الإلكتروني في وقت سابق21. تسمح هذه المناهج باستخدام نموذج EpH4 بتوصيف السمات المحددة للتمايز الظهاري mammary وارتباطها بمسارات نقل الإشارات المتميزة.
الشكل 1: تقييم وكمية تمايز خلايا HC11. (أ)قبة تشكلت في خلايا HC11 التي تعبر عن مستويات منخفضة من GFP-RacV12 في 10 أيام بعد تحريض التمايز. إلى اليسار: تباين الطور؛ اليمين: مضان نفس الحقل (صور لم تنشر من قبل). مقياس شريط = 100 ميكرون؛ التكبير = 240x; 20x الهدف. (ب)تأثير RacV12 على تمايز HC11: منخفض (الممرات 19-24)، أو متوسط (الممرات 13-18)، أو مستويات عالية (الممرات 7-12) تم التعبير عن بناء الانصهار RacV12-GFP في خلايا HC11. بعد النمو في غياب EGF لمدة 24 ساعة ، تم حث الخلايا على التمييز مع إضافة HIP ، أم لا ، كما هو مبين. تم إعداد مستخلصات المنظفات في العدد المشار له من الأيام في وقت لاحق وبحثت عن α-casein أو α-actin كمراقبة التحميل. لاحظ الزيادة الهائلة في الكيسين في خلايا التعبير المنخفضة RacV12-GFP (الممرات 21-24 مقابل 3-6) ، والانخفاض الكبير عند التعبير عن ارتفاع RacV12-GFP (الممرات 9-12). NE = السيطرة على الثقافات، نمت في غياب EGF، ولكن لم يتم حث للتمييز (Niitوآخرون. 2،مستنسخة بإذن). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التخطيطي لطريقة تراكب لزراعة خلايا EpH4 في ثقافة مصفوفة ثلاثية الأبعاد. (أ)كانت آبار صفيحة بئر 6 مغلفة في البداية بمصفوفة EHS بنسبة 100٪ التي سمح لها بترسيخ 37 درجة مئوية مما يشكل سريرًا هلاميًا من غشاء الطابق السفلي يبلغ سمكه حوالي 2-5 مم. تم بذر خلايا EpH4 على هذا السرير كتعليق خلية واحدة في وسط HIP مع مصفوفة 20٪. وقد تراكب هذا مع مصفوفة 10٪ في وسط HIP. تم استبدال متوسط مصفوفة 10٪ كل يومين. انتشرت الخلايا وبدأت في تشكيل الغلاف الشعاعي للثدي بعد 4-5 أيام في الثقافة (انظر قسم البروتوكولات). (ب)تم التقاط صور تباين المرحلة لخلايا EpH4 في الثقافة ثنائية الأبعاد (أحادية الطبقة) وثلاثية الأبعاد (المامووسفير) باستخدام مجهر مجهز بكاميرا رقمية (تكبير 300x). يتم عرض الصور التمثيلية في كل مرحلة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الأحداث في 3D acinar morphogenesis من EpH4 في ثقافة 3D. (أ)نمت خلايا EpH4 في مصفوفة المغلفة 6 لوحات بئر وصيانة في وسط 3D كاملة كما هو الحال في الشكل 2. خلال المراحل المبكرة من تكوين المورفوجينية ، انتشرت الخلايا ، وشكلت مجموعات ، ونظمت في مجموعتين: (1) طبقة خارجية من الخلايا المستقطبة و (2) مجموعة داخلية من الخلايا غير المنظمة التي خضعت لموت الخلايا ، المقابلة لموت الخلايا المبرمج كما هو موضح سابقًا12. أدى هذا الأخير إلى تشكيل تجويف أجوف ، يتميز بسواد مركز الغلاف الشعاعي للثدي كما يراها المجهر على النقيض من المرحلة. أدت إضافة HGF (20 نانوغرام/مل) إلى الوسط إلى تشكيل هياكل أنبوبية. أكثر من 60٪ من المجاميع الناجمة عن HGF أظهرت تولد الأنابيب، مقارنة مع المجاميع السيطرة غير المعالجة، والتي لم تفعل ذلك. تم التقاط صورة تمثيلية للخلايا في كل مرحلة باستخدام مجهر مجهز بكاميرا رقمية (تكبير 300x؛ مقياس شريط = 100 ميكرون). والنتائج تمثل ثلاث تجارب على الأقل. تم تكييف التخطيطية من ستاروفا وآخرون22. (ب)تم حصاد خلايا EpH4 التي تزرع في 3D في الأيام المشار لها. تم تطبيع تركيزات البروتين وتعرضت كميات البروتين المتساوية (20 ميكروغرام) لـ SDS-PAGE، يليها النشاف الغربي والتحقيق مع الأجسام المضادة المشار إليها. تم استخدام الغدة الثديية المتجانسة من فأر الرضاعة (MGT) كمقارنة في الجسم الحي. تم استخدام p120RasGAP كتحكم تحميل مستقل. زاد تعبير Cyclin D1 بشكل عابر بالتزامن مع الخلايا المنتشرة خلال الأيام 3-4 الأولى. وعلى النقيض من ذلك، بلغ التعبير الكيسين ذروته في 8-10 أيام، وهو ما يقابل تكوين الغلاف الشعاعي للثدي الناضج. النتائج تمثل تجربتين. (ج)تم تأكيد تكوين اللومن وتولد الخلايا الشعاعية للثدي باستخدام تلطيخ DAPI من الحمض النووي (الأزرق الفلوري) في مجاميع نمت على القسائم الزجاجية المغلفة بالمصفوفة. تم تثبيت الخلايا في 3٪ paraformaldehyde، permeabilized مع 25 ميكروغرام / مل digitonin، وتم حظر الربط غير محدد مع 3٪ BSA. ثم تم تلطيخ الخلايا للحمض النووي مع DAPI (الأزرق). تم تركيب قسائم التغطي على الشرائح الزجاجية باستخدام وسط متصاعد. تم التقاط الصور الضوئية للمستوى المركزي XY المحور باستخدام المجهر متعدد الصور البؤرية (مقياس الشريط = 100μm). الصور في الألواح B و C مقتبسة من Starova et al.22. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
خلايا HC11 مناسبة بشكل مثالي لدراسة التمايز بالتزامن مع التحول النيوبلاستيك. وتتمثل الميزة المضافة في أن خلايا HC11 يمكن أن تصيب بسهولة بناقلات الفيروسات الرجعية المستندة إلى Mo-MLV للتعبير عن مجموعة متنوعة من الجينات. في أيدينا، كانت خلايا EpH4 أكثر صعوبة لتصيب بنفس ناقلات الفيروسات الرجعية من HC112.
الاتصال من خلية إلى خلية واعتقال النمو هي الشروط الأساسية للتمايز الخلية HC11. وبالتالي ، لتحقيق التمايز الموحد عبر طبقة الخلية ، من المهم تحقيق توزيع موحد للخلايا في طبق بيتري في وقت البذر. وهذا أمر مهم بشكل خاص إذا كان المطلوب كمية التمايز. يجب تحسين التربسينة بحيث يتم تحقيق تعليق خلية واحدة والخلايا لا تفقد القدرة على البقاء بسبب التلاعب.
يجب أن تكون الخلايا التي يتم مثقبتها subconfluent (50-70٪)، لأن الخلايا نمت إلى كثافات عالية تميل إلى الالتزام بقوة مع بعضها البعض، وفصلها أمر صعب. لتجنب تجفيف الخلايا، يستنشق مع طبق بيتري شقة على أرضية غطاء محرك السيارة تدفق لامينار، ثم الميل لاستنزاف بسرعة. غطي طبق بيتري بالغطاء. إذا لزم الأمر، يمكنك تسريع عمل التربسين عن طريق وضع طبق بيتري في حاضنة 37 درجة مئوية.
لأن الخلايا هي متشنجة جدا خلال الأيام ال 10 التالية التعريفي، من المهم أن تحل محل المواد الغذائية التي استنفدت. عندما يتم تغيير الوسط ، يجب أيضًا توخي الحذر لتجنب انفصال الخلايا ، والتي قد لا تلتزم جيدًا بالبلاستيك بسبب كثافة الخلايا العالية. ومع ذلك ، في تجربتنا ليس من الضروري استخدام أطباق بيتري المغلفة مع ليفينكتين ، الكولاجين ، أو CellTak للحصول على نتائج تمايز جيدة ، على عكس التمييز preadipocytes مثل مشتقات 3T3L123 أو Balb/c3T3.
تحديد دقيق للبروتين لتجارب النشاف أمر بالغ الأهمية. لأن بروتينات المصل تميل إلى إرفاق لنسيج الأنسجة الصف البلاستيك، فمن المهم كشط وغسل الخلايا في 1.5 مل أنبوب بلاستيكي لا يجذب البروتينات وإضافة المخزن المؤقت الانضاج على بيليه الخلية بدلا من تحليل الخلايا مباشرة على طبق بيتري24.
فيما يتعلق باستخراج البروتين ، من المهم جدًا الحفاظ على جميع حلول الغسيل والانحلال الجليدي البارد وأطباق بيتري أو وحدات التصوير الشعاعي للدم من EpH4 على الجليد في جميع أنحاء. وذلك لأنه في غياب الكالسيوم في برنامج تلفزيوني غسل الكاديرين لا تشارك ونتيجة لذلك Stat3-ptyr705 هو سريع الفسفور25.
حجم أطباق بيتري الموصوفة لخلايا HC11 يكفي ل3-4 بقع الغربية (أي كمية البروتين المستردة لكل طبق بيتري حوالي 50 ميكروغرام لكل طبق 3 سم). نحن نفضل استخدام 3 سم بيتري الأطباق لتجارب التمايز لتسهيل استخراج البروتين. إذا تم استخدام علبة بئر 6 بدلاً من ذلك ، فمن الصعب استخراج البروتينات من بئر واحد في البرد مع الحفاظ على بقية الآبار معقمة. إلى جانب ذلك ، فإن تركيز CO2 مهم للتمايز ومن الصعب الحفاظ عليه لبقية الآبار حيث يتم استخراج البروتينات من بئر واحد على مقاعد البدلاء.
في تجربتنا، على عكس التمايز من preadipocytes23،عدة الكثير من مصل ربلة الساق الجنين قادرة على دعم النمو، فضلا عن التمايز من خلايا HC11 أو EpH4. لم تدعم مجموعة كبيرة من مصل العجل حديث الولادة الذي تم اختباره التمايز ، على الرغم من أنه يمكن أن يدعم النمو الطبيعي: يبدو أن الخلايا تمايز في البداية ولكنها فقدت قدرتها على التفريق بعد ثلاثة ممرات في مصل العجل حديث الولادة.
وعلى النقيض من خلايا HC11، يرتبط تمايز خلايا EpH4 ارتباطًا وثيقًا ببنية المصفوفة ثلاثية الأبعاد المحيطة. نحن نصف الخطوات المطلوبة للتمايز EpH4 في ثقافة 3D المعدلة من الدراسات السابقة26،27،28 واستخراج البروتين اللاحقة لتحليل إنتاج الكيسين. مصفوفة EHS سائلة في درجات حرارة منخفضة (<10 درجة مئوية) وتوطدت في درجات حرارة أعلى. يتم تخزينها عادة في -80 درجة مئوية، ولكن يمكن تخزين aliquots العمل في -20 درجة مئوية. إذابالمصفوفة عند 4 درجات مئوية في الليلة السابقة للاستخدام ولوحات زراعة الأنسجة قبل التبريد ونصائح ماصة عند -20 درجة مئوية قبل المناولة. لتقييم دقيق لتركيز البروتين من المهم القضاء على المصفوفة تماما قبل استخراج مع الباردة PBS الغسيل لأن المصفوفة غنية بالبروتين، والتي قد تُربك نتائج تحديد البروتين.
وقد ثبت اعتماد EpH4 على مصفوفة التمايز في نماذج تجريبية متعددة: رايكمان وآخرون10 أظهرت أن خلايا EpH4 الناجمة عن الهرمونات اللاكتوبجينية أنتجت α-casein داخل مناطق ترسب اللامين ومكثفة التعبير السيتوكراتين. Somasiri وآخرون11 أظهرت أن PI3-كيناز مطلوب للالتزامات تشكيل كروي ة تعتمد على تقاطع والتعبير الجيني بروتين الحليب متميزة. وعلاوة على ذلك، أظهرت Brinkmann وآخرون21 أن التعبير عن cDNA HGF عبر المصابين في خلايا EpH4 تسبب tubulogenesis المتفرعة من spheroids في نموذج ثقافة 3D، مماثلة لتشكيل الأنابيب HGF المستحثة لوحظ ينظر هنا(الشكل 3A،C). توضح هذه النتائج مزايا نموذج خط الخلية EpH4 لدراسة أحداث الإشارات التي تنظم تمايز الغدة الثديية.
يمكن لخلايا EpH4 أيضًا أن تشكل الغلاف الشعاعي للثدي عند مطليها بتركيزات مصل ربلة الساق الجنينية أقل من 10٪ الموصوفة. ومن المثير للاهتمام، فإنها يمكن أن تشكل الماموسفيرات بتركيزات أقل، أو حتى في حالة عدم وجود مصفوفة 20٪ أو 10٪، عندما مطلي فوق طبقة من مصفوفة 100٪22،27. في حالة عدم وجود مصفوفة في تعليق الخلية ، يتم تجنب تبريد الخلايا. ميزة إضافية هي أن يتم العثور على جميع الخلايا في مستوى واحد، لذلك فهي أسهل لتصوير.
الأهمية: مشاركة الكادهيرين في الخلايا المستزرعة، والتي تقترب من الحالة الفسيولوجية للخلية في الجسم الحي، يمكن أن تنشط مسار Rac/IL6/Stat3. قد يكون هذا مهمًا بشكل خاص في تمايز الخلايا الظهارية. باستخدام التقنيات الموصوفة ، كشفت نتائجنا شدة الإشارة المنبثقة من هذا المسار كمحدد مركزي في التوازن بين انتشار الخلايا مقابل التمايز ، وهما عمليتان متعارضتان بشكل أساسي2. التحقيق المتعمق للمحور E-cadherin/Rac/Stat3 قد يكشف عن مكونات amphibolous جديدة من المسار اعتمادا على مستوى التعبير, التي يمكن استغلالها كأهداف لعلاج السرطان. وبالنسبة لهذه الأهداف، لن يكون من الضروري تثبيط كامل لعكس النمط الظاهري النيوبلاستيك. بل إن التثبيط الجزئي سيكون مفيدا، لأن المبالغ المتبقية قد تمنع في الواقع التحول وتعزز التمايز. قد يختلف هذا مع الهدف وكذلك نوع الورم المعني ، كما هو موضح من السلوك المختلف لـ RacV12 مقابل Stat3C ، في HC11 مقابل خلايا EpH42،20.
الطلبات المستقبلية: قد يلعب مسار cadherin/Rac/IL6/Stat3 دورًا مماثلًا في تمايز الخلايا الظهارية الأخرى ، مثل الثدي البشري MCF10A أو خطوط الخلايا MDCK29 للكلى الكلاب ، بالإضافة إلى أنواع أخرى من التمايز التي تعتمد على التقاء الخلايا ، مثل preadipocytes و myoblasts30، والتي تعبر عن أنواع مختلفة من الكاديرين. وأخيرا، يمكن استغلال هذه التقنية لدراسة دور Stat531 وغيرها من مكونات المسارات المتمايزة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يوجد أي تضارب بين أصحاب البلاغ للكشف عنه.
Acknowledgments
وتكرم د. د. مدينا (هيوستن، تكساس) بتوفير خط الخلايا HC11. المؤلفون ممتنون للدكتور أندرو كريغ من جامعة كوينز للعديد من الكواشف والاقتراحات القيمة. كانت خلايا EpH4 هدية من الدكتور سي روسكيلي (UBC ، فانكوفر). قدمت كولين شيك مساعدة تقنية ممتازة لدراسات الثقافة ثلاثية الأبعاد.
المساعدة المالية من مجلس البحوث الطبيعية والهندسية في كندا ( NSERC ) ، المعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR) ، المؤسسة الكندية لسرطان الثدي (CBCF ، أونتاريو ) ، التحالف الكندي لأبحاث سرطان الثدي ، ومراكز أونتاريو للتميز، وسرطان الثدي العمل كينغستون (BCAK) وصندوق كلير نيلسون الوصية من خلال المنح إلى LR هو موضع تقدير بامتنان. كن تتلقى منحة الدعم من CIHR، CBCF، BCAK وجمعية أبحاث السرطان شركة PTG بدعم من رئيس البحوث الكندية، والمؤسسة الكندية للابتكار، CIHR، NSERC وجمعية السرطان الكندية. تم دعم MN من قبل الطلاب من برنامج تدريب تيري فوكس في أبحاث السرطان عبر التخصصات من NCIC، وجائزة الدراسات العليا (QGA)، وجائزة عميد من جامعة كوينز. تم دعم MG من خلال زمالات ما بعد الدكتوراه من برنامج الجيش الأمريكي لسرطان الثدي، ووزارة البحث والابتكار في مقاطعة أونتاريو ولجنة البحوث الاستشارية في جامعة كوينز. تم دعم VH من خلال زمالة الدكتوراه CBCF وزمالة ما بعد الدكتوراه من برنامج تدريب مؤسسة تيري فوكس في أبحاث السرطان عبر التخصصات بالشراكة مع CIHR. كان هاناد دان متلقياً لطالب صيفي من NSERC. تم دعم البكالوريس من قبل جائزة الدراسات العليا في جامعة كوينز.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Acrylamide/0.8% Bis Solution | Bio Rad | 1610154 | Western Blotting |
| Anti-Cyclin D1 antibody | rabbit, Santa Cruz | sc-717 | Western Blotting |
| Anti-p120 antibody | mouse, Santa Cruz | sc-373751 | Western Blotting |
| Anti-β actin antibody | mouse, Cell Signalling technology | 3700 | Western Blotting |
| Anti-β casein antibody | goat, Santa Cruz Biotechnology | sc-17971 | Western Blotting |
| Aprotinin | Bio Shop | APR600 | Lysis Buffer |
| Bicinchoninic Acid Solution | Sigma | B9643-1L-KC | Protein Determination |
| Bovine serum albumin | Bio Shop | ALB007.500 | Protein Determination |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad | 170-5061 | Western Blotting |
| Copper(II) sulphate | Sigma | C2284-25ML | Protein Determination |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | Staining |
| Digitonin | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 14952-500 | Staining |
| EDTA | Bio Shop | EDT001.500 | |
| Epidermal Growth Factor | Sigma | E9644 | Medium for HC11 Cells |
| Fetal calf serum | PAA | A15-751 | Cell Culture Medium |
| Goat- Anti Rabbit-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | Western Blotting |
| Hepatocyte Growth Factor recombinant | Gibco | PHG0321 | |
| Hepes | Sigma | 7365-45-9 | Cell Culture |
| Horse Anti-Mouse HRP | Cell Signalling Technology | 7076 | Western Blotting |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | HIP Medium |
| insulin | Sigma | I6634 | HIP Medium |
| Laminar-flow hood | BioGard Hood | Cell Culture | |
| Leupeptin | Bio Shop | LEU001.10 | Lysis Buffer |
| Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel) | Corning | CACB 354230 | |
| Mouse Anti-Goat HRP | Santa Cruz | sc-8360 | Western Blotting |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 475904-100GM | Staining |
| Multi-photon confocal microscope | Leica TCS SP2 | ||
| Na3VO4 | Bio Shop | SOV850 | Lysis Buffer |
| Na4P207 | Sigma | 125F-0262 | Lysis Buffer |
| NaCl | Bio Shop | SOD001.1 | Western Blotting |
| NaF | Fisher Scientific | 7681-49-4 | Lysis Buffer |
| Nikon digital Camera | Coolpix 995 | ||
| Nitrocellulose | Bio Rad | 1620112 | Western Blotting |
| NP-40 | Sigma | 9016-45-9 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | Staining |
| Phase Contrast Microscope | Olympus IX70 | Cell Culture | |
| Phenylmethylsuphonyl fluoride | Sigma | 329-98-6 | Lysis Buffer |
| pMX GFP Rac G12V | Addgene | 14567 | |
| Prolactin | Sigma | L6520 | HIP Medium |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | Cell Culture Medium |
| Tissue Culture Dish 35 | Sarstedt | 83.3900. | Cell Culture |
| Tissue Culture Plate-24 well | Sarstedt | 83.1836.300 | Cell Culture |
| Transfer Apparatus | CBS Scientific Co | EBU-302 | Western Blotting |
| Tris Acetate | Bio Shop | TRA222.500 | Western Blotting |
| Trypsin | Sigma | 9002-07-7. | Cell Culture |
| Tween-20 | Bio Shop | TWN510.500 | Western Blotting |
| Veritical Gel Electrophoresis System | CBS Scientific Co | MGV-202-33 | Western Blotting |
References
- Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation. Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).
- Niit, M., et al. Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis. Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).
- Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line. The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).
- Humphreys, R. C., Rosen, J. M. Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function. Cell growth & differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).
- Merlo, G. R., et al. differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors. European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).
- Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation. Journal of Cell Science. 108, Pt 6 2445-2456 (1995).
- Arbeithuber, B., et al. Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation. BioMed Research International. 2015, 460598 (2015).
- Morrison, B., Cutler, M. L. Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation. Journal of Visualized Experiments. (32), e1265 (2009).
- Merlo, G. R., et al. Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53. Oncogene. 9, 443-453 (1994).
- Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally. Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).
- Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation. Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).
- Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).
- Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression. Breast Cancer Research. 11 (3), 26 (2009).
- Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 34 (6), 468-477 (1998).
- Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands. PLoS One. 8 (6), 65127 (2013).
- Arulanandam, R., et al. Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3. Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).
- Geletu, M., et al. Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis. BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).
- Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases. Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).
- Raptis, L., et al. Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement. Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).
- Niit, M., et al. Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3. Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).
- Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells. Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).
- Starova, B. Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis. , Queen's University. M.Sc. Thesis (2008).
- Raptis, L., et al. Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner. Cell Growth & Differentiation. 8, 11-21 (1997).
- Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells. Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).
- Vultur, A., et al. Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells. Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Hoskin, V. C. A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis. , Queen's University. Ph.D. Thesis (2015).
- Su, H. W., et al. Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression. Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).
- Ostrovidov, S., et al. Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).
- Cass, J. Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation. , Queen's University. Ph.D. thesis (2013).
