Summary
Wir beschreiben Techniken zur Differenzierungsinduktion von zwei Brustepithellinien, HC11 und EpH4. Während beide fetales Kalbsserum, Insulin und Prolaktin benötigen, um Milchproteine zu produzieren, können sich EpH4-Zellen in der dreidimensionalen Kultur vollständig in Mammosphären differenzieren. Diese komplementären Modelle sind nützlich für Signaltransduktionsstudien der Differenzierung und Neoplasie.
Abstract
Cadherine spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Zelldifferenzierung sowie der Neoplasie. Hier beschreiben wir die Ursprünge und Methoden der Induktion der Differenzierung von zwei Mausbrustepithelzelllinien, HC11 und EpH4, und ihre Verwendung zur Untersuchung komplementärer Stadien der Brustdrüsenentwicklung und neoplastischen Transformation.
Die HC11 Maus Brust epitheliale Zelllinie stammt aus der Brustdrüse einer schwangeren Balb/c Maus. Es unterscheidet sich, wenn es zu Zusammenfluss an einer Kunststoff-Petrischale Oberfläche in Medium mit fetalem Kalbsserum und HYdrocortison, Insulin und PRolactin (HIP-Medium) befestigt angebaut wird. Unter diesen Bedingungen produzieren HC11-Zellen die Milchproteine -Casein und Molkenssäureprotein (WAP), ähnlich wie laktierende Brustepithelzellen, und bilden rudimentäre Brustdrüsenstrukturen, die als "Dome" bezeichnet werden.
Die EpH4-Zelllinie wurde von spontan verewigten Maus-Mamma-Drüsen-Epithelzellen abgeleitet, die von einer schwangeren Balb/c-Maus isoliert wurden. Im Gegensatz zu HC11 können sich EpH4-Zellen vollständig in Sphäroide (auch Mammosphären genannt) unterscheiden, wenn sie unter dreidimensionalen (3D) Wachstumsbedingungen im HIP-Medium kultiviert werden. Die Zellen werden trypsinisiert, in einer 20%igen Matrix suspendiert, bestehend aus einer Mischung aus extrazellulären Matrixproteinen, die von Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Maussarkomzellen hergestellt werden, auf einer Schicht konzentrierter Matrixbeschichtung einer Kunststoff-Petrischale oder Multiwell-Platte plattiert und mit einer Schicht von 10% Matrix-haltigem HIP-Medium bedeckt. Unter diesen Bedingungen bilden EpH4-Zellen hohle Sphäroide, die eine apikal-basale Polarität aufweisen, ein hohles Lumen, und produzieren '-Casein und WAP.
Mit diesen Techniken zeigten unsere Ergebnisse, dass die Intensität des Cadherin/Rac-Signals für die Differenzierung von HC11-Zellen entscheidend ist. Während Rac1 für die Differenzierung und niedrige Konzentrationen der aktivierten RacV12-Erhöhung der Differenzierung notwendig ist, blockieren hohe RacV12-Spiegel die Differenzierung und induzieren Neoplasie. Im Gegensatz dazu stellen EpH4-Zellen ein früheres Stadium der Brustepitheldifferenzierung dar, das durch selbst niedrige RacV12-Spiegelgehemmt wird.
Introduction
In normalen Geweben oder Tumoren haben Zellen umfangreiche Möglichkeiten, sich in einer dreidimensionalen Organisation an ihre Nachbarn zu halten, und dies wird in der Kultur durch das Wachstum von Zellen mit hoher Dichte nachgeahmt. Die Zell-zu-Zell-Adhäsion wird hauptsächlich über Cadherinrezeptoren vermittelt, die die Zell- und Gewebearchitektur definieren. Interessanterweise wurde vor kurzem gezeigt, dass Cadherine auch eine mächtige Rolle bei der Signaltransduktion spielen, insbesondere bei der Überlebenssignalisierung1. Paradoxerweise wurden einige dieser Zell-zu-Zell-Adhäsionssignale, die von Cadherinen ausgingen, vor kurzem sowohl von der Differenzierung als auch von der Neoplasie geteilt2. Hier beschreiben wir Methoden der Induktion und Bewertung der Differenzierung in zwei repräsentativen Arten von Mausbrustepithelzelllinien, HC11 und EpH4.
Die HC11 Maus Brust epitheliale Zelllinie kann ein nützliches Modell für die Untersuchung der Epithelzelldifferenzierung bieten. HC11-Zellen sind eine VON COMMA-1D abgeleitete Zelllinie, die aus der Brustdrüse einer mittelschwangeren Balb/c-Maus3stammt. Im Gegensatz zu anderen COMMA-1D-Derivateklonen hat der HC11-Klon keine Anforderung an exogen zugesetzte extrazelluläre Matrix oder Kokultivierung mit anderen Zelltypen zur In-vitro-Induktion des endogenen -casein-Gens durch lactogene Hormone3. Diese Zelllinie wurde in Differenzierungsstudien ausgiebig verwendet, da sie wichtige Eigenschaften des normalen Brustepithels beibehalten hat: HC11-Zellen können dasduktale Epithel teilweise in einem gereinigten Brustfettpad 4 rekonstituieren. Darüber hinaus können sie in einer zweidimensionalen (2D) Kultur unterscheiden, wenn sie zu Zusammenfluss an einer Kunststoff Petri schale Oberfläche in Gegenwart eines Steroids wie HYdrocortison oder Dexamethason, zusätzlich zu Insulin und PRolactin (HIP Medium) ohne epidermale Wachstumsfaktor (EGF), ein Inhibitor der Differenzierung5,6,7. Unter diesen Bedingungen produzieren HC11-Zellen Milchproteine wie z.B. '-Casein und WAP, die durch Western Blotting innerhalb von 4 Tagen nach der Induktion nachweisbar sind. Gleichzeitig bildet ein Teil der HC11-Zellen rudimentäre Brustdrüsenstrukturen, die auf stochastische Weise als "Dome" bezeichnet werden. Kuppeln sind 4–5 Tage nach der Induktion sichtbar und nehmen bis zum Tag 10 allmählich zu, zusammen mit einer Erhöhung der Produktion von '-Casein8. Interessanterweise besitzen HC11-Zellen mutierte p539und stellen daher einen präneoplastischen Zustand dar. Aus diesem Grund eignet sich das HC11-Modell ideal, um Signalnetze der Differenzierung in Verbindung mit Neoplasie im selben Zellsystem zu untersuchen.
EpH4-Zellen, ein Derivat von IM-2-Zellen, sind eine nichttumorogene Zelllinie, die ursprünglich aus spontan verewigten Maus-Mamma-Erüsen-Epithelzellen abgeleitet wurde, die aus einer mittelschwangeren Balb/c-Maus10isoliert wurden. EpH4-Zellen bilden kontinuierliche epitheliale Monolayer in der 2D-Kultur, differenzieren sich aber nicht in drüsenähnliche Strukturen10,11. Nach dem 3D-Wachstum in einem Material, das aus einer Mischung von extrazellulären Matrixproteinen besteht, die von EHS-Maussarkomzellen12 (EHS-Matrix, Matrix oder Matrigel, siehe Tabelle der Materialien)produziert werden, können EpH4-Zellen jedoch zusätzlich zur Stimulation mit HIP die Anfangsstadien der Brustdrüsendifferenzierung rekapitulieren. Unter diesen Bedingungen bilden EpH4-Zellen Sphäroide (auch Mammosphären genannt), die eine apikal-basale Polarität und ein hohles Lumen aufweisen und in der Lage sind, die Milchproteine -Casein und WAP zu produzieren, ähnlich wie lakierende Brustepithelzellen. Im Gegensatz zu HC11-Zellen, die undifferenziert sind, und einige exprimieren mesenchymale Marker13, EpH4-Zellen zeigen eine rein luminale Morphologie14. EpH4-Zellen wurden auch berichtet, Milchproteine in 2D-Kultur durch Stimulation mit Dexamethason, Insulin und Prolaktin15zu produzieren. Dieser Ansatz schließt jedoch die Untersuchung von regulatorischen Effekten aus, die die Mikroumgebung der Brustdrüse in der 3D-Kultur imitieren.
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Protocol
1. Beschichtung HC11 Zellen
- In einer laminaren Durchflusshaube mit sterilen Techniken bereiten Sie eine Flasche mit 50 ml HC11 Zellmedium: RPMI-1640 mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 5 g/ml Insulin und 10 ng/ml EGF (siehe Tabelle der Materialien).
- Platte ca. 400.000 Zellen pro 3 cm Petrischale: Zwei 10 cm, 50% konfluente Petrischalen in 23 cm Schalen in HC11 medium geben. Die Zellen müssen gut verteilt sein, aber das Trocknen muss vermieden werden.
- Mit einer Vakuumpumpe das Medium in einen Kolben aussaugen.
- Fügen Sie 250 l Trypsin (siehe Materialtabelle)pro 10 cm Platte hinzu. Wirbeln und schlagen Sie die Platte von den Seiten, während Sie es horizontal halten, um das Trypsin zu verbreiten und die angeschlossenen Zellen zu lösen
- Beobachten Sie unter Phasenkontrastmikroskopie mit einem 4x Objektiv, um sicherzustellen, dass sich die Zellen vor dem Pipetieren von den Rändern zu lösen begonnen haben.
- Aspirieren Sie ca. 1,5 ml HC11 Medium in einer sterilen, 9 Zoll Pasteur Pipette und spritzen Sie es vertikal gegen die Zellen. Drehen Sie die Petrischale beim Spritzen, um alle Zellen zu lösen. Sie müssen schnell arbeiten, um das Trocknen der Zellen zu vermeiden.
- Übertragen Sie alle Zellen auf die Flasche mit dem HC11 Medium und wirbeln.
- Pipette 2 ml Zellsuspension in je 3 cm Petrischale. Die Petri-Gerichte quer schaukeln, um sich gleichmäßig zu verteilen. Legen Sie die Zellen in einen 37 °C, 5% CO2-Inkubator.
- Am nächsten Tag, oder wenn Die Zellen sind 90-100% konfluent, aspirieren das Medium, und ersetzen Sie es mit Medium mit FBS und Insulin, aber ohne EGF.
2. Differenzierungsinduktion, Überwachung und Quantifizierung von HC11-Zellen
- Nach dem Anbau der Zellen in mittelfehlendem EGF für 24 h, fügen Sie das Differenzierungsmedium (HIP-Medium) auf zehn 3 cm Platten: RPMI-1640 ergänzt mit 10% FBS, 1 g/mL HYdrocortison (siehe Tabelle der Materialien), 5 g/mL Insulin und 5 g/mL PRolactin (siehe Tabelle der Materialien) für bis zu 10 Tage.
- Bewahren Sie die anderen zehn 3 cm Platten als Steuerung auf: Wechseln Sie auf ein Medium mit 10% FBS und 5 g/ml Insulin ohne EGF und HIP.
- Ändern Sie das Medium alle 2–3 Tage in HIP-behandelte Zellen und Steuerelemente. Pipette das Medium sorgfältig, um sicherzustellen, dass Zellen nicht lösen.
- Zur Überwachung der Differenzierung (d. h. der Bildung von "Kuppeln") beobachten Sie die Zellen unter Phasenkontrastmikroskopie(Abbildung 1A, linkes Panel). Wenn die Zellen grünes Fluoreszenzprotein (GFP) exezieren, beobachten Sie unter Fluoreszenzmikroskopie (Erregung = 485/20; Emission = 530/25; Vergrößerung 240x; 20x Objektiv) (Abbildung 1A, rechtes Panel).
- Um den Grad der Differenzierung zu quantitieren, extrahieren Sie Proteine aus einer Petrischale jeder VON HIP-behandelten Zellen und Kontrollen, einmal täglich für insgesamt 10 Tage und untersuchen Western-Blots für .-Casein (siehe Tabelle der Materialien) ( Abbildung1B).
- Die Zellen auf Eis mit 1,5 ml eiskalter Phosphat-gepufferter Saline (PBS) in ein 1,8 ml Kunststoffzentrifugenrohr zerkleinern.
- Pellet die Zellen bei 350 x g, 1 min, 4 °C.
- Waschen Sie das Pellet 2x schnell mit eiskaltem PBS. Entleeren Sie rückstände.
- Einen Lysepuffer bilden: 50 mM HEPES (pH = 7,4), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Na4P2O7, 1% NP-40, 100 mM NaF, 2 mM Na3VO4, 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 10 g/ml Aprotinin, 10 g/ml Leupeptin16. Fügen Sie 100 l pro 3 cm Petrischale hinzu.
- Klären Sie das Lysat durch Zentrifugation bei 10.000 x g für 10 min in der Kälte.
- Bestimmen Sie die Proteinkonzentration (siehe Materialtabelle) und laden Sie 10–20 g Protein aus jeder Probe auf ein 10% Polyacrylamid-SDS-Gel.
- Elektrophorese für 15 h bei 45 V oder bei 100 V für 2–2,5 h.
- Übertragung auf eine Nitrocellulose- oder PVDF-Membran mit einem Elektroblotting-Transfergerät (siehe Materialtabelle).
- Block mit 5% Rinderserumalbumin (BSA) in Tris-gepufferter Kochsaline mit 0,1% Tween-20 (TBST).
- Fügen Sie den primären Antikörper, Ziege Anti---Casein verdünnt 1:2.000 oder Maus Anti--Actin verdünnt 1:1.000 (siehe Tabelle der Materialien).
- Waschen Sie 3x mit TBST, 5 min jedes Mal.
- Fügen Sie den sekundären Antikörper, Meerrettichperoxidase (HRP) verknüpft Esel Anti-Ziete verdünnt 1:2.500, oder HRP verknüpft Pferd Anti-Maus-Antikörper verdünnt 1:10,000.
- Waschen Sie 3x mit TBST, 5 min jedes Mal.
- Fügen Sie der Membran eCL-Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzu (siehe Materialtabelle).
3. Beschichtung und 3D-Wachstum von EpH4-Zellen in EHS-Matrix
HINWEIS: Die Matrix ist bei Temperaturen von <10 °C flüssig und bei Temperaturen über 10 °C fest. Bei -80 °C lagern. In der Nacht vor Gebrauch bei 4 °C auftauen. Die Gewebekulturplatten und Pipettenspitzen vor der Handhabung bei -20 °C vorkühlen und die Matrix-, Platten- und Pipettenspitzen auf Eis halten, um eine Erstarrung zu verhindern.
- Wachsen Sie EpH4-Zellen in 2D in RPMI-1640 Medium mit 10% FBS und 5 g/ml Insulin (EGF ist nicht erforderlich).
- Bereiten Sie EpH4-Wachstumsmedium, ergänzt durch 10% (v/v, 3.500 l) oder 20% (v/v 2.000 l) Matrix in zwei 50 ml konischen Röhren. Auf Eis bleiben, bis es einsatzbereit ist.
- 10 Bohrungen (je 1 cm2) einer 24-Well-Platte mit 150 l unverdünnter Matrix beschichten. Verteilen Sie die Matrix mit einer Pipettenspitze. Vermeiden Sie blasen. Tippen Sie vorsichtig auf die Seiten der Platte, während Sie sie horizontal halten, um sicherzustellen, dass die Matrix gleichmäßig über den Boden des Brunnens verteilt ist.
- Inkubieren Sie die 24 Wellplatte bei 37 °C für 1 h, damit die Matrix erstarrt.
- Trypsinize EpH4-Zellen wie oben für HC11-Zellen beschrieben und zählen sie mit einem Hämozytometer. 5 x 104 Zellen pro Brunnen auf ein 1,5 ml steriles konisches Zentrifugenrohr übertragen und bei 250 x g 5 min drehen.
- Das Medium vorsichtig ansaugen und die Röhre auf Eis legen.
- Resuspend-Zellen in 350 l EpH4 Wachstumsmedium ergänzt mit 20% Matrix mit einer 1 ml Pipettenspitze, während die konische Röhre auf Eis zu halten. Vermeiden Sie Blasen. Es ist wichtig, eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten.
- Sobald sich die Matrix der unteren Schicht verfestigt hat (die Matrix sollte im Vergleich zur ursprünglichen Beschichtung der Brunnen transluzent und heller erscheinen), fügen Sie die 350 l Zellsuspension zu jedem beschichteten Brunnen hinzu und legen Sie sie in einenCO2-Inkubator bei 37 °C für 1 h, damit sich die 20%ige Matrixschicht verfestigen kann.
- Beobachten Sie die Zellen mikroskopisch unter Phasenkontrast mit einem 4x Objektiv. Einzelne Zellen sollten sichtbar sein.
- Fügen Sie 200 L EpH4-Medium mit 10% Matrix auf die 350 L Zellen, die in 20% Matrix suspendiert sind, hinzuzufügen. Bei 37 °C inkubieren.
4. Differenzierungsinduktion von EpH4-Zellen, die in 3D angebaut werden (Abbildung 2)
HINWEIS: Neben der Differenzierung können EpH4-Zellen auch Tubulogenese erleiden, wenn sie mit HGF (Hepatozyten-Wachstumsfaktor) in der 3D-Kultur stimuliert werden. TubularE Auswüchse können nach 10 Tagen HIP- und HGF-Stimulation gesehen werden.
- Beginnen Sie die Differenzierungsinduktion von EpH4-Zellen 1 Tag nach der Beschichtung in der Matrix. Entfernen Sie vorsichtig 150 l des oberen Mediums, das 10% Matrix enthält, mit einer Kunststoff-Pipettespitze aus den Brunnen. Fügen Sie 200 L EpH4-Medium mit HIP und 10% Matrix hinzu.
- Ersetzen Sie das 10% Matrix-HIP Medium alle 2 Tage für bis zu 10 Tage. Wachsen Sie Kontrollzellen im gleichen 10% Matrixmedium ohne HIP.
- Überwachen Sie die Mammosphärenbildung unter Phasenkontrast(Abbildung 3A, unteres Panel).
5. Tubulogenese Induktion von EpH4-Zellen in 3D angebaut (Abbildung 3A und 3C)
- Bereiten Sie 24 Well-Platten und EpH4-Zellen für das Wachstum in der Matrix vor, wie in den Schritten 3.1–3.9 beschrieben. Entfernen Sie am Tag nach der Beschichtung der Zellen in der Matrix 150 L EpH4-Medium mit 10% Matrix aus den Brunnen mit einer Kunststoff-Pipettenspitze. Fügen Sie 200 L EpH4-Medium mit 10% Matrix, HIP und 20 ng/ml HGF hinzu (siehe Materialtabelle).
- Ersetzen Sie das 10%-Matrix-/HIP/HGF-Medium alle 2 Tage für bis zu 12–14 Tage.
- Überwachen Sie die Tubulibildung mikroskopisch mit einem 20x- oder 40x-Objektiv(Abbildung 3A, rechtes Panel).
6. Quantifizierung der Differenzierung: Western Blotting für '-Casein
- Sorgfältig Pipetten aus dem 10% Matrix-HIP Medium aus den Brunnen. Spülen Sie die 20% Matrixschicht 2x mit 350 l eiskaltem PBS. Die Sphäroide sollten weiterhin in der Matrixschicht vorhanden sein.
- 700–1.000 l eiskaltes PBS mit 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) direkt in die Brunnen geben. Lösen Sie die untere Schicht der 100%-Matrix vorsichtig mit einer Pipettenspitze vom Brunnen, um sphäroide in dieser Schicht vorhandene Sphäroide wiederherzustellen. 30 min bei 4 °C vorsichtig schütteln.
- Übertragen Sie die Sphäroidsuspension vorsichtig in ein konisches Rohr. Spülen Sie die Brunnen mit einem PBS-EDTA-Wert von 500 ,,,um alle verbleibenden Sphäroide in den Brunnen wiederherzustellen und in das konische Rohr hinzuzufügen.
- Rock auf Eis für weitere 30 min. Stellen Sie sicher, dass sich die Matrix vollständig aufgelöst hat. Wenn sichtbare Matrixklumpen gesehen werden, fügen Sie weitere PBS-EDTA hinzu oder schütteln Sie länger.
- Zentrifugieren Sie die Lösung, um die Sphäroide bei 350 x g für 5 min zu pellet.
- Aspirieren Sie den Überstand, lysieren Sie die Sphäroide im eiskalten Lysepuffer und sonden Sie nach sondieren für s-Casein, Cyclin D1 und p120RasGAP durch Western Blotting wie in Schritt 2.5 über16. Als primäre Antikörper verwenden Sie Ziegen-Anti--Casein verdünnt 1:2.000, Kaninchen Anti-Cyclin D1 verdünnt 1:2.000, und Maus Anti-p120 verdünnt 1:2.000. Für sekundäre Antikörper verwenden HRP-verknüpfte Esel Anti-Ziete verdünnt 1:2.500, HRP verknüpft Esel Anti-Kaninchen verdünnt 1:2.500, und HRP verknüpft Pferd Anti-Maus verdünnt 1:10,000.
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Representative Results
Es ist seit langem bekannt, dass die Differenzierung von Epithelzellen und Adipozyten den Zusammenfluss und das Eingreifen von Kaderinen2erfordert. Wir und andere zeigten, dass Die Zell-zu-Zell-Haftung und -Interaktion von E- oder N-Cadherin und Cadherin-11, wie beim Zusammenfluss von kultivierten Zellen auftritt, löst eine dramatische Zunahme der Aktivität des kleinen GTPases Rac und des Zellteilungskontrollproteins 42 (Cdc42) aus, und dieser Prozess führt zur Aktivierung von Interleukin-6 (IL6) Gewächse und Stat3 (Signalwandler und Aktivator der Transkription-316,17)1,18,19. Da viele Komponenten des Cadherin/Rac/IL6/Stat3-Signalwegs sowohl an der Differenzierung als auch an der neoplastischen Transformation beteiligt sein können, bieten sie molekulare Griffe für die Untersuchung der Vernetzung dieser beiden diametral entgegengesetzten Prozesse.
Mit den oben beschriebenen Techniken zeigten wir eine auffallende Abhängigkeit der Differenzierung von der Stärke des Rac-Signals in HC11-Zellen: Während endogene cRac1 für die Differenzierung erforderlich ist und bei niedrigen Konzentrationen mutationsaktiviertes RacV12 eine deutliche Erhöhung der Differenzierungskapazität bewirkt, lösen hohe RacV12-Spiegel einen dramatischen Differenzierungsblock aus, während neoplasiedin induzieren (Abbildung 1B). Im Gegensatz dazu blockierten selbst niedrige Konzentrationen der RacV12-Expression die Differenzierung in EpH4-Zellen2. Obwohl RacV12 Stat3 in vielen Zellsystemen aktiviert, einschließlich HC1116, blockierte mutationell aktivierte Stat3C die Differenzierung und induzieren die neoplastische Transformation20.
Wir untersuchten die Differenzierungseigenschaften von EpH4-Zellen in einer 3D-Matrixkultur. Während die Produktion von '-Casein mit 8–10 Tagen seinen Höhepunkt erreichte, war die Cyclin-D-1-Expression maximal bei 4–6 Tagen nach der HIP-Stimulation(Abbildung 3B). Diese Ergebnisse unterstützen eine umgekehrte Beziehung zwischen Proliferation und Differenzierung im EpH4-Modell. Mit Hilfe von DAPI (nukleare) Färbung und konfokale Mikroskopie, um die Positionierung einzelner Epithelzellen zu bestimmen, beobachteten wir den inneren Zelltod und die Bildung von hohlen Lumen in Mammosphären (Abbildung 3A,C). Wir zeigten weiter, dass die Zugabe von HGF (20 ng/mL) bei 48 h zum HIP-Medium zur Bildung von röhrenförmigen Strukturen führte (Abbildung 3A,C), die mit früheren Elektronenmikroskopiestudienübereinstimmten 21. Diese Ansätze mit dem EpH4-Modell ermöglichen die Charakterisierung spezifischer Merkmale der Brustepitheldifferenzierung und deren Assoziation mit unterschiedlichen Signaltransduktionswegen.
Abbildung 1: Bewertung und Quantifizierung der HC11-Zelldifferenzierung. (A) Eine Kuppel, die in HC11-Zellen gebildet wurde und 10 Tage nach der Induktion der Differenzierung niedrige GFP-RacV12-Spiegel ausdrückt. Links: Phasenkontrast; Rechts: Fluoreszenz des gleichen Feldes (Fotos, die noch nicht veröffentlicht wurden). Skala bar = 100 m; Vergrößerung = 240x; 20x Ziel. (B) Wirkung von RacV12 auf DIE HC11-Differenzierung: Niedrige (Bahnen 19–24), Mittlere (Bahnen 13–18) oder hohe (Bahnen 7–12) Pegel eines Rac V12-GFP-Fusionskonstrukts wurden in HC11-Zellen exprimiert. Nach dem Wachstum in Abwesenheit von EGF für 24 h, Zellen wurden induziert, mit HIP-Zugabe zu differenzieren, oder nicht, wie angegeben. Waschmittelextrakte wurden in der angegebenen Anzahl von Tagen später hergestellt und als Ladekontrolle auf die Ladekontrolle von '-Casein oder '-Actin untersucht. Beachten Sie die dramatische Zunahme von '-Casein in niedrigen RacV12-GFP-exemitten Zellen (Bahnen 21–24 vs. 3-6) und die dramatische Reduktion bei Expression von hohem RacV12-GFP (Lanes 9–12). NE = Kontrollkulturen, die ohne EGF angebaut, aber nicht zur Differenzierung veranlasst wurden (Niit et al.2, mit Genehmigung reproduziert). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Schematische Überlagerungsmethode zum Wachstum von EpH4-Zellen in der 3D-Matrixkultur. (A) Die Brunnen einer 6-Well-Platte wurden zunächst mit einer 100% EHS-Matrix beschichtet, die bei 37 °C erstarren konnte und ein gegeltes Bett mit einer Kellermembran von einer Dicke von etwa 2–5 mm bildete. EpH4-Zellen wurden als Einzelzellsuspension in HIP-Medium mit 20% Matrix auf dieses Bett gesät. Dies wurde mit 10% Matrix in HIP-Medium überlagert. Das 10% Matrixmedium wurde jeden zweiten Tag ausgetauscht. Die Zellen vermehrten sich und begannen nach 4–5 Tagen in der Kultur Mammosphären zu bilden (siehe Abschnitt Protokolle). (B) Phasenkontrastbilder von EpH4-Zellen in 2D- (Monolayer) und 3D-Kultur (Mammosphäre) wurden mit einem Mikroskop mit digitaler Kamera (300x Vergrößerung) aufgenommen. Repräsentative Bilder in jeder Phase werden gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Ereignisse in der 3D-Acinarmorphogenese von EpH4 in der 3D-Kultur. (A) EpH4-Zellen wurden in matrixbeschichteten 6 Brunnenplatten angebaut und in einem kompletten 3D-Medium wie in Abbildung 2gehalten. In den frühen Stadien der Morphogenese vermehrten sich die Zellen, bildeten Cluster und wurden in zwei Gruppen gegliedert: (1) eine äußere Schicht polarisierter Zellen und (2) ein innerer Cluster unorganisierter Zellen, die dem Zelltod unterzogen wurden, entsprechend der Apoptose, wie zuvorgezeigt 12. Letzteres führte zur Bildung eines hohlen Lumens, das durch die Verdunkelung des Zentrums der Mammosphären gekennzeichnet ist, wie es die Phasenkontrastmikroskopie sieht. Die Zugabe von HGF (20 ng/ml) zum Medium führte zur Bildung von röhrenförmigen Strukturen. Mehr als 60% der HGF-induzierten Aggregate zeigten Tubulogenese, verglichen mit unbehandelten Kontrollaggregaten, die dies nicht taten. Ein repräsentatives Phasenkontrastfoto von Zellen in jeder Phase wurde mit einem Mikroskop mit einer Digitalkamera (300-fache Vergrößerung; Skala bar = 100 'm). Die Ergebnisse sind repräsentativ für mindestens drei Experimente. Schematic wurde von Starova et al.22adaptiert. (B) EpH4-Zellen, die in 3D angebaut wurden, wurden an den angegebenen Tagen geerntet. Die Proteinkonzentrationen wurden normalisiert und die gleichen Proteinmengen (20 g) wurden SDS-PAGE unterzogen, gefolgt von Western Blotting und Sondierung mit den angegebenen Antikörpern. Als In-vivo-Vergleich wurde eine homogenisierte Brustdrüse von einer laktierenden Maus (MGT) verwendet. p120RasGAP wurde als unabhängige Ladesteuerung eingesetzt. Die Cyclin-D1-Expression erhöhte sich in den ersten 3–4 Tagen vorübergehend mit sich vermehrten Zellen. Im Gegensatz dazu erreichte der Ausdruck von '-Casein seinen Höhepunkt bei 8–10 Tagen, was der Bildung reifer Mammosphären entspricht. Die Ergebnisse sind repräsentativ für zwei Experimente. (C) Lumenbildung und Tubulogenese von Mammosphären wurde durch DAPI-Färbung von Kern-DNA (fluoreszierendes Blau) in Aggregaten bestätigt, die auf Matrix-beschichteten Glasabdeckungen angebaut wurden. Die Zellen wurden in 3% Paraformaldehyd fixiert, mit 25 g/ml Digitonin permeabilisiert, und die unspezifische Bindung wurde mit 3% BSA blockiert. Zellen wurden dann für Kern-DNA mit DAPI (blau) gefärbt. Coverlips wurden mit einem Montagemedium auf Glasschlitten montiert. Die Photomikroskope wurden von der zentralen XY-Achsenebene mit einem multiphotonenkonfokalen Mikroskop (Scale bar = 100 m) aufgenommen. Bilder in den Panels B und C sind von Starova et al.22adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
HC11-Zellen eignen sich ideal für die Untersuchung der Differenzierung in Verbindung mit neoplastischer Transformation. Ein zusätzlicher Vorteil ist, dass HC11-Zellen leicht mit Mo-MLV-basierten retroviralen Vektoren infizieren können, um eine Vielzahl von Genen auszudrücken. In unseren Händen waren EpH4-Zellen schwieriger mit den gleichen retroviralen Vektoren zu infizieren als HC112.
Zell-zu-Zell-Kontakt und Wachstumsstillstand sind wichtige Voraussetzungen für die HC11-Zelldifferenzierung. Um eine gleichmäßige Differenzierung über die Zellschicht hinweg zu erreichen, ist es daher wichtig, zum Zeitpunkt der Aussaat eine gleichmäßige Zellverteilung in der Petrischale zu erreichen. Dies ist besonders wichtig, wenn eine Quantifizierung der Differenzierung gewünscht wird. Die Trypsinisierung muss so optimiert werden, dass eine Einzelzellsuspension erreicht wird und Zellen aufgrund der Manipulationen nicht an Lebensfähigkeit verlieren.
Zellen, die versucht werden, müssen subkonfluent sein (50–70%), da Zellen, die zu hohen Dichten herangewachsen sind, dazu neigen, stark aneinander zu haften, und ihre Trennung ist schwierig. Um das Trocknen der Zellen zu vermeiden, aspirieren Sie mit der Petrischale flach auf dem Boden der laminaren Strömungshaube, dann kippen, um schnell abzutropfen. Bedecken Sie die Petrischale mit dem Deckel. Bei Bedarf können Sie die Wirkung des Trypsins beschleunigen, indem Sie die Petrischale in einen 37 °C-Inkubator legen.
Da die Zellen während der 10 Tage nach der Induktion sehr konfluent sind, ist es wichtig, die Nährstoffe zu ersetzen, die erschöpft sind. Wenn das Medium gewechselt wird, sollte auch darauf geachtet werden, eine Ablösung der Zellen zu vermeiden, die aufgrund der hohen Zelldichte nicht sehr gut am Kunststoff haften kann. Dennoch ist es unserer Erfahrung nach nicht notwendig, Petrischalen zu verwenden, die mit Fibronectin, Kollagen oder CellTak beschichtet sind, um gute Differenzierungsergebnisse zu erzielen, im Gegensatz zu Unterscheidungs-Präipozyten wie 3T3L123 oder Balb/c3T3-Derivaten.
Eine genaue Proteinbestimmung für die Blotting-Experimente ist entscheidend. Da Serumproteine dazu neigen, sich an den Kunststoff der Gewebekultur anzuheften, ist es wichtig, die Zellen in einem 1,5 ml Kunststoffrohr zu kratzen und zu waschen, das keine Proteine anzieht, und den Lysepuffer auf dem Zellpellet hinzuzufügen, anstatt die Zellen direkt auf die Petrischale24zu lysieren.
In Bezug auf die Proteinextraktion ist es sehr wichtig, alle Wasch- und Lyselösungen eiskalt und die Petrischalen oder EpH4-Mammosphären durchgängig auf Eis zu halten. Dies liegt daran, dass in Ermangelung von Kalzium in der PBS-Waschanlage die Cadherine nicht eingebunden sind und als Ergebnis Stat3-ptyr705 schnell dephosphoryliert25ist.
Die Größe der für HC11-Zellen beschriebenen Petrischalen ist ausreichend für 3–4 Western-Blots (d.h. die Menge an Protein, die pro Petrischale zurückgewonnen wird, beträgt ca. 50 g pro 3 cm Schale). Wir bevorzugen 3 cm Petrischalen für Differenzierungsexperimente, um die Proteinextraktion zu erleichtern. Wenn stattdessen ein 6-Well-Tablett verwendet wird, ist es schwierig, Proteine aus einem Brunnen in der Kälte zu extrahieren, während der Rest der Brunnen steril bleibt. Außerdem ist dieCO2-Konzentration wichtig für die Differenzierung und es ist schwierig, sie für den Rest der Brunnen zu erhalten, da Proteine aus einem Brunnen auf der Bank extrahiert werden.
Nach unserer Erfahrung sind im Gegensatz zur Differenzierung von Präreadipozyten23mehrere Lose fetales Kalbsserum in der Lage, das Wachstum sowie die Differenzierung von HC11- oder EpH4-Zellen zu unterstützen. Eine Menge des getesteten neugeborenen Kalbsserums unterstützte keine Differenzierung, obwohl es das normale Wachstum unterstützen konnte: Die Zellen schienen sich zunächst zu differenzieren, verloren aber nach drei Passagen im neugeborenen Kalbserum ihre Fähigkeit zu differenzieren.
Im Gegensatz zu HC11-Zellen ist die Differenzierung von EpH4-Zellen eng mit der umgebenden 3D-Matrixarchitektur verbunden. Wir beschreiben die Schritte, die für die EpH4-Differenzierung in 3D-Kultur erforderlich sind, modifiziert aus früheren Studien26,27,28 und die anschließende Proteinextraktion zur Analyse der Produktion von '-Casein. Die EHS-Matrix ist bei niedrigen Temperaturen (<10 °C) flüssig und erstarrt bei höheren Temperaturen. Es wird normalerweise bei -80 °C gelagert, aber arbeitsfreie Aliquots können bei -20 °C gelagert werden. Die Matrix in der Nacht vor dem Gebrauch bei 4 °C auftauen und vor der Handhabung Gewebekulturplatten und Pipettenspitzen bei -20 °C vorkühlen. Für eine genaue Beurteilung der Proteinkonzentration ist es wichtig, die Matrix vor der Extraktion mit kaltem PBS-Waschen vollständig zu eliminieren, da die Matrix reich an Proteinen ist, was die Proteinbestimmungsergebnisse verwirren kann.
Die EpH4-Abhängigkeit von der Matrix zur Differenzierung wurde in mehreren experimentellen Modellen nachgewiesen: Reichman et al.10 zeigten, dass EpH4-Zellen, die durch lactogene Hormone induziert wurden, in Bereichen der Lamininabscheidung und der intensivierten Cytokeratin-Expression .-Casein produzierten. Somasiri et al.11 zeigten, dass PI3-Kinase für die verbindungsabhängige Sphäroidbildung und differenziative Milchprotein-Genexpression erforderlich ist. Darüber hinaus zeigten Brinkmann et al.21, dass die Expression transfizierter HGF-cDNA in EpH4-Zellen eine verzweigte Tubulogenese von Sphäroiden in einem 3D-Kulturmodell induzierte, analog zur beobachteten HGF-induzierten Tubulenbildung, die hier zu sehen ist (Abbildung 3A,C). Diese Ergebnisse veranschaulichen die Vorteile des EpH4-Zelllinienmodells für die Untersuchung von Signalereignissen, die die Brustdrüsendifferenzierung regulieren.
EpH4-Zellen können auch Mammosphären bilden, wenn sie in Konzentrationen von fetalem Kalbsserum unter den beschriebenen 10% plattiert werden. Interessanterweise können sie Mammosphären in niedrigeren Konzentrationen bilden, oder sogar in Abwesenheit von 20% oder 10% Matrix, wenn sie auf einer Schicht von 100% Matrix22,27plattiert werden. In Ermangelung einer Matrix in der Zellsuspension wird eine Abkühlung der Zellen vermieden. Ein zusätzlicher Vorteil ist, dass alle Zellen in einer einzigen Ebene gefunden werden, so dass sie leichter zu fotografieren sind.
Bedeutung: Cadherin-Engagement in kultivierten Zellen, das den physiologischen Zustand einer Zelle in vivo annähert, kann den Rac/IL6/Stat3-Signalweg aktivieren. Dies kann besonders wichtig bei der Epithelzelldifferenzierung sein. Mit den beschriebenen Techniken zeigten unsere Ergebnisse die Intensität des Signals, das von diesem Signal ausgeht, als zentraler Determinant im Gleichgewicht zwischen Zellproliferation und Differenzierung, zwei grundsätzlich entgegengesetzten Prozessen2. Die eingehende Untersuchung der E-Cadherin/Rac/Stat3-Achse kann je nach Expressionsgrad neuartige amphibolöse Komponenten des Weges aufdecken, die als Ziele für die Krebstherapie genutzt werden könnten. Für solche Ziele wäre eine vollständige Hemmung nicht notwendig, um den neoplastischen Phänotyp umzukehren. Eine partielle Hemmung wäre sogar von Vorteil, da die Restmengen tatsächlich die Transformation blockieren und die Differenzierung fördern können. Dies kann mit dem Ziel sowie der Art des tumoren, wie aus dem unterschiedlichen Verhalten von RacV12 vs. Stat3C, in HC11 vs. EpH4 Zellen2,20gezeigt.
Zukünftige Anwendungen: Der Cadherin/Rac/IL6/Stat3-Signalweg kann eine ähnliche Rolle bei der Differenzierung anderer Epithelzellen spielen, wie z. B. der menschlichen Brust MCF10A oder der Canine Kidney MDCK29 Zelllinien, sowie anderen Arten der Differenzierung, die vom Zellzusammenfluss abhängen, wie z. B. Von Prägoipozyten und Myoblasten30, die verschiedene Arten von Cadherinen ausdrücken. Schließlich kann diese Technik für die Untersuchung der Rolle von Stat531 und anderen Komponenten von differenzierungsbildenden Bahnen genutzt werden.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Konflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Die HC11-Zelllinie wurde freundlicherweise von Dr. D. Medina (Houston, TX) zur Verfügung gestellt. Die Autoren sind Dr. Andrew Craig von der Queen es University für viele Reagenzien und wertvolle Vorschläge dankbar. EpH4-Zellen waren ein Geschenk von Dr. C. Roskelley (UBC, Vancouver). Colleen Schick leistete hervorragende technische Unterstützung für 3D-Kulturstudien.
Finanzielle Unterstützung des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), der Canadian Institutes of Health Research (CIHR), der Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario Chapter), der Canadian Breast Cancer Research Alliance , die Ontario Centres of Excellence, die Breast Cancer Action Kingston (BCAK) und der Clare Nelson Vermächtnisfonds durch Zuschüsse an LR werden dankbar anerkannt. BE erhielt Stipendien von CIHR, CBCF, BCAK und Cancer Research Society Inc. PTG wird von einem Canada Research Chair, der Canadian Foundation for Innovation, CIHR, NSERC und der Canadian Cancer Society unterstützt. MN wurde von einem Studentenwerk des Terry Fox Training Program in Transdisciplinary Cancer Research von NCIC, einem Graduate Award (QGA) und einem Dean es Award der Queen es University unterstützt. MG wurde durch Postdoktorandenstipendien des US Army Breast Cancer Program, des Ministry of Research and Innovation der Provinz Ontario und des Advisory Research Committee der Queen es University unterstützt. VH wurde durch ein CBCF-Doktorandenstipendium und ein Postdoktorandenstipendium des Terry Fox Foundation Training Program in Transdisciplinary Cancer Research in Partnerschaft mit CIHR unterstützt. Hanad Adan erhielt ein NSERC-Sommerstudium. BS wurde von einem Queen es University Graduate Award unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Acrylamide/0.8% Bis Solution | Bio Rad | 1610154 | Western Blotting |
| Anti-Cyclin D1 antibody | rabbit, Santa Cruz | sc-717 | Western Blotting |
| Anti-p120 antibody | mouse, Santa Cruz | sc-373751 | Western Blotting |
| Anti-β actin antibody | mouse, Cell Signalling technology | 3700 | Western Blotting |
| Anti-β casein antibody | goat, Santa Cruz Biotechnology | sc-17971 | Western Blotting |
| Aprotinin | Bio Shop | APR600 | Lysis Buffer |
| Bicinchoninic Acid Solution | Sigma | B9643-1L-KC | Protein Determination |
| Bovine serum albumin | Bio Shop | ALB007.500 | Protein Determination |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad | 170-5061 | Western Blotting |
| Copper(II) sulphate | Sigma | C2284-25ML | Protein Determination |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | Staining |
| Digitonin | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 14952-500 | Staining |
| EDTA | Bio Shop | EDT001.500 | |
| Epidermal Growth Factor | Sigma | E9644 | Medium for HC11 Cells |
| Fetal calf serum | PAA | A15-751 | Cell Culture Medium |
| Goat- Anti Rabbit-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | Western Blotting |
| Hepatocyte Growth Factor recombinant | Gibco | PHG0321 | |
| Hepes | Sigma | 7365-45-9 | Cell Culture |
| Horse Anti-Mouse HRP | Cell Signalling Technology | 7076 | Western Blotting |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | HIP Medium |
| insulin | Sigma | I6634 | HIP Medium |
| Laminar-flow hood | BioGard Hood | Cell Culture | |
| Leupeptin | Bio Shop | LEU001.10 | Lysis Buffer |
| Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel) | Corning | CACB 354230 | |
| Mouse Anti-Goat HRP | Santa Cruz | sc-8360 | Western Blotting |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 475904-100GM | Staining |
| Multi-photon confocal microscope | Leica TCS SP2 | ||
| Na3VO4 | Bio Shop | SOV850 | Lysis Buffer |
| Na4P207 | Sigma | 125F-0262 | Lysis Buffer |
| NaCl | Bio Shop | SOD001.1 | Western Blotting |
| NaF | Fisher Scientific | 7681-49-4 | Lysis Buffer |
| Nikon digital Camera | Coolpix 995 | ||
| Nitrocellulose | Bio Rad | 1620112 | Western Blotting |
| NP-40 | Sigma | 9016-45-9 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | Staining |
| Phase Contrast Microscope | Olympus IX70 | Cell Culture | |
| Phenylmethylsuphonyl fluoride | Sigma | 329-98-6 | Lysis Buffer |
| pMX GFP Rac G12V | Addgene | 14567 | |
| Prolactin | Sigma | L6520 | HIP Medium |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | Cell Culture Medium |
| Tissue Culture Dish 35 | Sarstedt | 83.3900. | Cell Culture |
| Tissue Culture Plate-24 well | Sarstedt | 83.1836.300 | Cell Culture |
| Transfer Apparatus | CBS Scientific Co | EBU-302 | Western Blotting |
| Tris Acetate | Bio Shop | TRA222.500 | Western Blotting |
| Trypsin | Sigma | 9002-07-7. | Cell Culture |
| Tween-20 | Bio Shop | TWN510.500 | Western Blotting |
| Veritical Gel Electrophoresis System | CBS Scientific Co | MGV-202-33 | Western Blotting |
References
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