Summary
Vi beskriver teknikker for differensiering induksjon av to bryst epitellinjer, HC11 og EpH4. Mens begge krever fosterkalvserum, insulin og prolaktin for å produsere melkeproteiner, kan EpH4-celler fullt ut skille seg inn i mammosfærer i tredimensjonal kultur. Disse komplementære modellene er nyttige for signaltransduksjonsstudier av differensiering og neoplasi.
Abstract
Kadheriner spiller en viktig rolle i reguleringen av celledifferensiering samt neoplasi. Her beskriver vi opprinnelsen og metodene for induksjon av differensiering av to musbrystepitelcellelinjer, HC11 og EpH4, og deres bruk for å studere komplementære stadier av brystkjertelutvikling og neoplastisk transformasjon.
HC11 mus bryst epitelcellelinjen stammer fra brystkjertelen til en gravid Balb / c mus. Det skiller når den dyrkes til samløpet festet til en plast Petri parabolen overflate i medium som inneholder fosterkalv serum og Hydrocortisone, jegnsulin og Prolactin (HIP medium). Under disse forholdene produserer HC11-celler melkeproteinene β-kasein og mysesurt protein (WAP), som ligner på ammende brystepitelceller, og danner rudimentære brystkjertellignende strukturer kalt "kupler".
EpH4 cellelinjen ble avledet fra spontant udødeliggjort mus brystkjertel epitelceller isolert fra en gravid Balb / c mus. I motsetning til HC11 kan EpH4-celler fullt ut differensiere til sfæroider (også kalt mammosfærer) når de dyrkes under tredimensjonale (3D) vekstforhold i HIP-medium. Celler er trypsinized, suspendert i en 20% matrise bestående av en blanding av ekstracellulære matriseproteiner produsert av Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mussarkomceller, belagt på toppen av et lag med konsentrert matrisebelegg en plast Petri-tallerken eller multiwell plate, og dekket med et lag på 10% matriseholdige HIP medium. Under disse forholdene danner EpH4-celler hule sfæroider som viser apical-basal polaritet, en hul lumen, og produserer β-kasein og WAP.
Ved hjelp av disse teknikkene viste våre resultater at intensiteten av kadherin / Rac-signalet er avgjørende for differensiering av HC11-celler. Mens Rac1 er nødvendig for differensiering og lave nivåer av aktivert RacV12 øke differensiering, høye RacV12 nivåer blokkere differensiering mens indusere neoplasi. I motsetning representerer EpH4-celler et tidligere stadium i mammary epiteldifferensiering, som hemmes av selv lave nivåer av RacV12.
Introduction
I normale vev eller svulster har celler omfattende muligheter for vedheft til sine naboer i en tredimensjonal organisasjon, og dette etterlignes i kultur ved høy tetthet cellevekst. Celle-til-celle adhesjon er mediert hovedsakelig gjennom kadherin reseptorer, som definerer celle og vev arkitektur. Interessant, det ble nylig vist at kadheriner også spille en kraftig rolle i signaltransduksjon, spesielt i overlevelse signaliserer1. Paradoksalt nok ble noen av disse celle-til-celle-adhesjonssignalene som kommer fra kadheriner nylig funnet å bli delt av både differensiering og neoplasi2. Her beskriver vi metoder for induksjon og vurdering av differensiering i to representative typer musbrystepitelcellelinjer, HC11 og EpH4.
HC11 mus bryst epitelcellelinjen kan gi en nyttig modell for studiet av epitelcelledifferensiering. HC11 celler er en COMMA-1D-avledet cellelinje, stammer fra brystkjertelen av en mid-gravid Balb / c mus3. I motsetning til andre COMMA-1D derivatkloner har HC11-klonen ikke noe krav til eksogene ekstracellulære matrise eller codyrking med andre celletyper for in vitro induksjon av endogene β-kaseingen ved laktogene hormoner3. Denne cellelinjen har blitt brukt mye i differensieringsstudier fordi den har beholdt viktige egenskaper ved det normale brystepitelet: HC11-celler kan delvis rekonstituere det kanalepitelet i en ryddet brystfettpute4. Videre kan de skille seg i en todimensjonal (2D) kultur når de dyrkes til samløpet festet til en plast Petri parabolen overflaten i nærvær av et steroid som Hydrocortisone eller Deksametason, i tillegg til jegnsulin og Prolactin (HIP medium) mangler epidermal vekstfaktor (EGF), en hemmer av differensiering5,6,7. Under disse forholdene produserer HC11-celler melkeproteiner som β-kasein og WAP, som kan påvises ved vestlig flekking innen 4 dager etter induksjon. Samtidig danner en del av HC11-celler rudimentære brystkjertellignende strukturer kalt "kupler" på en stokastisk måte. Dopler er synlige 4–5 dager etter induksjon og gradvis økning i størrelse opp til dag 10, samtidig med en økning i β-kaseinproduksjon8. Interessant, HC11 celler har mutert p539, og representerer derfor en preneoplastisk tilstand. Av denne grunn er HC11-modellen ideelt egnet til å studere signalnettverk av differensiering i forbindelse med neoplasi i samme cellesystem.
EpH4 celler, et derivat av IM-2 celler, er en ikke-tumorigen cellelinje opprinnelig avledet fra spontant udødeliggjort mus brystkjertel epitelceller isolert fra en mid-gravid Balb / c mus10. EpH4-celler danner kontinuerlige epitelmonolayers i 2D-kultur, men skiller ikke mellom i kjertellignende strukturer10,11. Men etter 3D-vekst i et materiale som består av en blanding av ekstracellulære matriseproteiner produsert av EHS musesarkomceller12 (EHS matrise, matrise eller Matrigel, se Tabell over materialer), i tillegg til stimulering med HIP, kan EpH4-celler rekapitulere de første stadiene av brystkjerteldifferensiering. Under disse forholdene danner EpH4-celler sfæroider (også kalt mammosfærer) som viser apical-basal polaritet og en hul lumen, og er i stand til å produsere melkeproteinene β-kasein og WAP, som ligner på ammende brystepitelceller. I motsetning til HC11 celler, som er udifferensiert, og noen uttrykker mesenchymal markører13,EpH4 celler viser en rent luminal morfologi14. EpH4-celler har også blitt rapportert å produsere melkeproteiner i 2D-kultur gjennom stimulering med deksametason, insulin og prolaktin15. Denne tilnærmingen utelukker imidlertid studiet av regulatoriske effekter som etterligner mikromiljøet i brystkjertelen i 3D-kulturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plating HC11 Celler
- I en laminar strømningshette ved hjelp av sterile teknikker forberede en flaske med 50 ml HC11 cellemedium: RPMI-1640 med 10% føtal storfe serum (FBS), 5 μg/ml insulin, og 10 ng/ml EGF (se Tabell over materialer).
- Plate ca 400.000 celler per 3 cm Petri skål: Pass to 10 cm, 50% confluent Petri retter i tjue 3 cm retter i HC11 medium. Cellene må være godt spredt ut, men tørking må unngås.
- Aspirer mediet inn i en kolbe ved hjelp av en vakuumpumpe.
- Tilsett 250 μL trypsin (se Materialtabell) per 10 cm plate. Virvle og traff platen fra sidene mens du holder den horisontal for å spre trypsin og å løsne de vedlagte cellene
- Vær oppmerksom på under fasekontrastmikroskopi med et 4x-mål for å sikre at cellene har begynt å løsne fra kantene før pipettering.
- Aspirer ca. 1,5 ml HC11 medium i en steril, 9 tommers Pasteur pipette og sprute den vertikalt mot cellene. Roter Petri-fatet mens du spruter for å løsne alle celler. Du må jobbe raskt for å unngå tørking av cellene.
- Overfør alle celler til flasken med HC11-mediet og virvler.
- Pipette 2 ml celleoppheng i hver 3 cm Petriskål. Rock Petri retter på tvers for å spre seg jevnt. Plasser cellene i en 37 °C, 5 % CO 2-inkubator.
- Neste dag, eller når cellene er ~ 90-100% confluent, aspirere mediet, og erstatte det med medium med FBS og insulin, men mangler EGF.
2. Differensiering Induksjon, overvåking og kvantasjon av HC11 celler
- Etter å ha dyrket cellene i medium mangler EGF for 24 timer, legge differensiering medium (HIP medium) til ti 3 cm plater: RPMI-1640 supplert med 10% FBS, 1 μg/ml Hydrocortisone (se Tabell over materialer),5 μg/ml Jegnsulin og 5 μg/ml Prolactin (se Tabell av materialer)i opptil 10 dager.
- Hold de andre ti 3 cm platene som kontroller: Bytt til et medium med 10% FBS og 5 μg/ml insulin som mangler EGF og HIP.
- Endre mediet hver 2-3 dager til både HIP-behandlede celler og kontroller. Pipett mediet nøye for å forsikre deg om at cellene ikke løsner.
- For å overvåke differensiering (dvs. dannelsen av "kupler"), observere cellene under fase kontrast mikroskopi (Figur 1A, venstre panel). Hvis cellene uttrykker grønt fluorescensprotein (GFP), observeres under fluorescensmikroskopi (eksitasjon = 485/20; utslipp = 530/25; forstørrelse 240x; 20x objektiv) (Figur 1A, høyre panel).
- For å kvantitet graden av differensiering, trekk ut proteiner fra en Petriskål hver av HIP-behandlede celler og kontroller, en gang om dagen i totalt 10 dager og sonde vestlige blots for β-kasein (se Tabell av materialer) ( Figur1B).
- Skrap cellene på is med 1,5 ml iskald fosfatbufret saltvann (PBS) inn i et 1,8 ml plastsentrifugerør.
- Pellet cellene ved 350 x g, 1 min, 4 °C.
- Vask pellet en rask 2x raskt med iskald PBS. Tøm eventuelle rester.
- Lag en lysisbuffer: 50 mM HEPES (pH = 7,4), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Na4P2O7, 1% NP-40, 100 mM NaF, 2 mM Na3VO4, 0,5 mM fenylmethylsulyl fluorid (PMSF), 10 μg/ml aprotinin, 10 μg/ml leupeptin16. Tilsett 100 μL per 3 cm Petriskål.
- Avklare lysate ved sentrifugering på 10.000 x g i 10 min i kulden.
- Bestem proteinkonsentrasjon (se Materialtabell) og last 10–20 μg protein fra hver prøve til en 10 % polyakrylamid-SDS gel.
- Elektroforese i 15 timer ved 45 V, eller ved 100 V for ~ 2-2,5 h.
- Overfør til nitrocellulose eller PVDF membran ved hjelp av et elektroblottingoverføringsapparat (se Materialtabell).
- Blokk med 5% storfe serum albumin (BSA) i Tris-bufret saltvann med 0,1% Tween-20 (TBST).
- Tilsett det primære antistoffet, geitanti-β-kasein fortynnet 1:2000 eller mus anti-β actin fortynnet 1:1000 (se Tabell av materialer).
- Vask 3x med TBST, 5 min hver gang.
- Tilsett det sekundære antistoffet, pepperrotperoksidase (HRP) knyttet esel antigeit fortynnet 1:2500, eller HRP koblet hest anti-mus antistoff fortynnet 1:10.000.
- Vask 3x med TBST, 5 min hver gang.
- Legg til ECL-reagenser i membranen i henhold til produsentens instruksjoner (se Materialtabell).
3. Plating og 3D vekst av EpH4 celler i EHS Matrix
MERK: Matrisen er flytende ved temperaturer <10 °C og fast ved temperaturer over. Oppbevares ved -80 °C. Tin ved 4 °C natten før bruk. Forkjøl vevskulturplatene og pipettespissene ved -20 °C før håndtering og hold matrisen, platene og pipettespissene på is for å hindre at den stivner.
- Vokse EpH4 celler i 2D i RPMI-1640 medium med 10% FBS og 5 μg/ml insulin (EGF er ikke nødvendig).
- Forbered EpH4 vekstmedium supplert med 10% (v / v, 3500 μL) eller 20% (v / v 2000 μL) matrise i to 50 ml konisk rør. Hold på is til du er klar til bruk.
- Coat 10 brønner (1 cm2 hver) av en 24 brønnplate med 150 μL ufortynnet matrise. Spre matrisen med en pipettespiss. Unngå å lage bobler. Trykk forsiktig på sidene av platen mens du holder den horisontalt for å sikre at matrisen er jevnt fordelt over bunnen av brønnen.
- Inkuber 24 brønnplaten ved 37 °C i 1 time slik at matrisen kan stivne.
- Trypsinize EpH4 celler som beskrevet ovenfor for HC11 celler og telle dem med et hemocytometer. Overfør 5 x 104 celler per brønn til et 1,5 ml sterilt konisk sentrifugerør og spinn ved 250 x g i 5 min.
- Forsiktig aspirer mediet og plasser røret på is.
- Resuspendceller i 350 μL epH4 vekstmedium supplert med 20% matrise ved hjelp av en 1 ml pipettetips mens du holder det koniske røret på is. Unngå bobler. Det er viktig å sikre en enkelt celle suspensjon.
- Når den nederste lagmatrisen har størknet (matrisen skal vises gjennomsiktig og lettere i farge sammenlignet med det første belegget av brønnene), legg til 350 μL cellesuspensjon til hver belagt brønn og legg i en CO2 inkubator ved 37 °C i ~ 1 t for å tillate 20% matriselag å stivne.
- Vær oppmerksom på cellene mikroskopisk under fasekontrast med et 4x-mål. Enkeltceller skal være synlige.
- Tilsett 200 μL EpH4 medium som inneholder 10% matrise på toppen av 350 μL celler suspendert i 20% matrise. Inkuber ved 37 °C.
4. Differensiering Induksjon av EpH4 celler dyrket i 3D (Figur 2)
MERK: I tillegg til differensiering, EpH4 celler kan også gjennomgå tubulogenese når stimulert med HGF (hepatocytt vekstfaktor) i 3D kultur. Rørformede utvekster kan sees etter 10 dager med HIP og HGF stimulering.
- Begynn differensieringinduksjon av EpH4-celler 1 dag etter plating i matrisen. Fjern forsiktig 150 μL toppmedium som inneholder 10 % matrise fra brønnene ved hjelp av en plastpipettespiss. Tilsett 200 μL EpH4 medium som inneholder HIP og 10% matrise.
- Bytt ut 10% matrix-HIP medium annenhver dag i opptil 10 dager. Vokse kontrollceller i samme 10% matrise medium uten HIP.
- Overvåk mammosfæredannelse under fasekontrast (Figur 3A,nedre panel).
5. Tubulogenese Induksjon av EpH4 celler dyrket i 3D (Figur 3A og 3C)
- Forbered 24 brønnplater og EpH4-celler for vekst i matrisen som beskrevet i trinn 3.1–3.9. Dagen etter plating cellene i matrisen, fjern 150 μL EpH4 medium som inneholder 10% matrise fra brønnene ved hjelp av en plast pipettespiss. Tilsett 200 μL EpH4 medium som inneholder 10% matrise, HIP og 20 ng / ml HGF (se Tabell over materialer).
- Bytt ut 10 % matrise/HIP/HGF-mediet annenhver dag i opptil 12–14 dager.
- Overvåk tubuldannelse mikroskopisk ved hjelp av et 20x- eller 40x-mål (figur 3A, høyre panel).
6. Mengde differensiering: Western Blotting for β-casein
- Pipette forsiktig av 10% matrix-HIP medium fra brønnene. Skyll 20% matriselag 2x med 350 μL iskald PBS. Sfæroider bør fortsatt være til stede i matriselaget.
- Tilsett 700–1000 μL iskald PBS med 1 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) direkte inn i brønnene. Løsne forsiktig det nederste laget av 100% matrisen fra brønnen med en pipettespiss for å gjenopprette sfæroider tilstede i det laget. Rist forsiktig i 30 min ved 4 °C.
- Overfør forsiktig sfæroidsuspensjonen til et konisk rør. Skyll brønnene med ~ 500 μL PBS-EDTA for å gjenopprette eventuelle gjenværende sfæroider i brønnene og legg til det koniske røret.
- Stein på is i ytterligere 30 min. Pass på at matrisen er fullstendig oppløst. Hvis synlige matriseklumper vises, legger du til flere PBS-EDTA eller rister lenger.
- Sentrifuge løsningen for å pellet sfæroider på 350 x g i 5 min.
- Aspirer supernatanten, lyse sfæroider i iskald lysebuffer, og sonde for β-kasein, cyklin D1, og p120RasGAP ved vestlig blotting som i trinn 2,5 over16. Som primære antistoffer, bruk geit anti-β-kasein fortynnet 1:2000, kanin anti-cyklin D1 fortynnet 1:2000, og mus anti-p120 fortynnet 1:2000. For sekundære antistoffer, bruk HRP-koblet esel antigeit fortynnet 1:2500, HRP koblet esel anti-kanin fortynnet 1:2500, og HRP koblet hest anti-mus fortynnet 1:10.000.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det har lenge vært kjent at differensiering av epitelceller og adipocytter krever samløpet og engasjement av kadheriner2. Vi og andre viste at celle-til-celle adhesjon og engasjement av E- eller N-kadherin og kadherin-11, som oppstår med samløpet av kultiverte celler, utløser en dramatisk økning i aktiviteten til de små GTPases Rac og celledeling kontroll protein 42 (Cdc42), og denne prosessen fører til aktivering av interleukin-6 (IL6) familie cytokiner og Stat3 (signal transduser og aktivator av transkripsjon-316,17)1,18,19. Fordi mange komponenter i cadherin / Rac / IL6 / Stat3 banen kan delta i både differensiering og neoplastisk transformasjon, gir de molekylære håndtak for studiet av sammenhengen mellom disse to diametralt motsatte prosesser.
Ved hjelp av teknikkene som er beskrevet ovenfor, demonstrerte vi en slående avhengighet av differensiering på styrken av Rac-signalet i HC11-celler: Mens endogene cRac1 er nødvendig for differensiering, og ved lave nivåer mutasjonsaktivert RacV12 forårsaker en tydelig økning i differensieringskapasitet, utløser høye RacV12-nivåer en dramatisk blokkering av differensiering mens du induserer neoplasi (figur 1B). I motsetning, selv lave nivåer av RacV12 uttrykk blokkert differensiering i EpH4 celler2. Videre, selv om RacV12 aktiverer Stat3 i mange cellesystemer, inkludert HC1116,mutasjonsaktivert Stat3C blokkert differensiering mens indusere neoplastisk transformasjon20.
Vi utforsket ytterligere differensieringsegenskapene til EpH4-celler i en 3D-matrisekultur. Mens β-kasein produksjonen nådde 8-10 dager, cyklin D-1 uttrykk var maksimal på 4-6 dager etter HIP stimulering (Figur 3B). Disse funnene støtter et omvendt forhold mellom spredning og differensiering i EpH4-modellen. Ved hjelp av DAPI (kjernefysisk) farging og konfokal mikroskopi for å bestemme plasseringen av individuelle epitelceller, observerte vi indre celledød og dannelsen av hule lumen i mammosfærer (Figur 3A,C). Vi viste videre at tillegg av HGF (20 ng / ml) ved 48 timer til HIP-mediet resulterte i dannelsen av rørformede strukturer (Figur 3A,C), i samsvar med tidligere elektronmikroskopistudier21. Disse tilnærmingene ved hjelp av EpH4-modellen tillater karakterisering av spesifikke trekk ved mammary epiteldifferensial differensiering og deres tilknytning til distinkte signaltransduksjonsveier.
Figur 1: Vurdering og kvantitasjon av HC11 celledifferensiering. (A) En kuppel dannet i HC11 celler som uttrykker lave nivåer av GFP-RacV12 på 10 dager etter induksjon av differensiering. Venstre: Fasekontrast; Høyre: Fluorescens av samme felt (bilder som ikke er publisert før). Skala bar = 100 μm; Forstørrelse = 240x; 20x mål. (B)Effekten av RacV12 ved HC11 differensiering: Lav (baner 19–24), mellomliggende (baner 13–18), eller høye (baner 7–12) nivåer av en RacV12-GFP fusjonskonstruksjon ble uttrykt i HC11 celler. Etter vekst i fravær av EGF i 24 timer, celler ble indusert til å skille med HIP tillegg, eller ikke, som angitt. Vaskemiddelekstrakter ble utarbeidet ved angitt antall dager senere og undersøkt for β-kasein eller β-actin som en lastekontroll. Legg merke til den dramatiske økningen i β-kasein i lav RacV12-GFP som uttrykker celler (baner 21–24 vs. 3–6), og den dramatiske reduksjonen ved uttrykk for høy RacV12-GFP (baner 9–12). NE = Kontrollkulturer, dyrket i fravær av EGF, men ikke indusert til å skille (Niit et al.2, gjengitt med tillatelse). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Skjematisk overleggsmetode for voksende EpH4-celler i 3D-matrisekulturen. (A) Brønnene til en 6 brønnplate ble opprinnelig belagt med 100% EHS matrise som fikk lov til å stivne ved 37 °C danner en gelled seng av kjellermembran som måler ca 2-5 mm i tykkelse. EpH4 celler ble seeded på denne sengen som en enkelt celle suspensjon i HIP medium med 20% matrise. Dette ble overlagt med 10% matrise i HIP medium. 10% matrisemedium ble erstattet annenhver dag. Celler spredtog begynte å danne mammosfærer etter 4-5 dager i kultur (se Protokoller seksjon). (B) Fase kontrastbilder av EpH4-celler i 2D (monolayer) og 3D (mammosphere) kultur ble tatt ved hjelp av et mikroskop utstyrt med et digitalt kamera (300x forstørrelse). Representative bilder på hvert trinn vises. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Hendelser i 3D acinar morfoenese av EpH4 i 3D-kultur. (A) EpH4 celler ble dyrket i matrisebelagte 6 brønnplater og vedlikeholdt i fullstendig 3D medium som i figur 2. I de tidlige stadiene av morfobese sprer celler seg, dannet klynger og organisert i to grupper: (1) et ytre lag av polariserte celler og (2) en indre klynge av uorganiserte celler som gjennomgikk celledød, tilsvarende apoptose som vist tidligere12. Sistnevnte førte til dannelsen av en hul lumen, preget av mørkere sentrum av mammosfærene sett av fasekontrastmikroskopi. Tillegg av HGF (20 ng /ml) til mediet resulterte i dannelsen av rørformede strukturer. Mer enn 60% av HGF-indusertaggregater viste tubulogenese, sammenlignet med ubehandlet kontrollaggregater, som ikke gjorde det. Et representativt fasekontrastfotografi av celler på hvert trinn ble tatt ved hjelp av et mikroskop utstyrt med et digitalt kamera (300x forstørrelse; Skalabar = 100 μm). Resultatene er representative for minst tre eksperimenter. Schematic ble tilpasset fra Starova et al.22. (B) EpH4 celler dyrket i 3D ble høstet på de angitte dagene. Proteinkonsentrasjoner ble normalisert og like proteinmengder (20 μg) ble utsatt for SDS-PAGE, etterfulgt av vestlig flekking og sondering med de angitte antistoffene. En homogenisert brystkjertel fra en ammende mus (MGT) ble brukt som en in vivo sammenligning. p120RasGAP ble brukt som en uavhengig lastekontroll. Cyclin D1-uttrykket økte forbigående sammenfallende med å spre celler i løpet av de første 3-4 dagene. I motsetning toppet β-kasiin uttrykket på 8-10 dager, tilsvarende dannelsen av modne mammosfærer. Resultatene er representative for to eksperimenter. (C) Lumen dannelse og tubulogenese av mammospheres ble bekreftet ved hjelp av DAPI farging av kjernefysisk DNA (fluorescerende blå) i aggregater dyrket på matrisebelagte glass coverslips. Celler ble løst i 3% paraformaldehyd, permeabilisert med 25 μg / ml digitonin, og uspesifikk binding ble blokkert med 3% BSA. Cellene ble deretter farget for kjernefysisk DNA med DAPI (blå). Dekkslips ble montert på glasssklier ved hjelp av et monteringsmedium. Fotomikrografer ble tatt av det sentrale XY-akseplanet ved hjelp av et multifoton konfokalmikroskop (Skalabar = 100μm). Bilder i panel B og C er tilpasset fra Starova et al.22. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HC11 celler er ideelt egnet for studiet av differensiering i forbindelse med neoplastisk transformasjon. En ekstra fordel er at HC11-celler lett kan infiseres med Mo-MLV-baserte retrovirale vektorer for å uttrykke en rekke gener. I våre hender var EpH4-celler vanskeligere å infisere med de samme retrovirale vektorene enn HC112.
Celle-til-celle-kontakt og vekstarrest er viktige forutsetninger for HC11-celledifferensiering. Dermed, for å oppnå ensartet differensiering over cellelaget, er det viktig å oppnå en jevn fordeling av celler i Petri-parabolen på tidspunktet for seeding. Dette er spesielt viktig hvis differensiering er ønsket. Trypsinisering må optimaliseres slik at en enkelt cellesuspensjon oppnås og celler ikke mister levedyktighet på grunn av manipulasjonene.
Celler som blir trypsinisert må være underkonfluent (50-70%), fordi celler vokst til høye tettheter har en tendens til å sterkt holde seg til hverandre, og skille dem er vanskelig. For å unngå tørking av cellene, aspirer med Petri parabolen flatt på gulvet i laminar flow hette, deretter vippe for å drenere raskt. Dekk Petri-fatet med lokket. Om nødvendig kan du akselerere virkningen av trypsin ved å plassere Petri-fatet i en 37 °C inkubator.
Fordi cellene er svært konfluent i løpet av de 10 dagene etter induksjon, er det viktig å erstatte næringsstoffene som er utarmet. Når mediet endres, bør det også utvises forsiktighet for å unngå løsrivelse av cellene, som kanskje ikke holder seg veldig bra til plasten på grunn av høy celletetthet. Likevel, i vår erfaring er det ikke nødvendig å bruke Petri retter belagt med fibronectin, kollagen, eller CellTak for å oppnå gode differensiering resultater, i motsetning til differensiering preadipocytes som 3T3L123 eller Balb / c3T3 derivater.
Nøyaktig proteinbestemmelse for de flekkende eksperimentene er kritisk. Fordi serumproteiner har en tendens til å feste seg til vevskulturgraden plast, er det viktig å skrape og vaske cellene i et 1,5 ml plastrør som ikke tiltrekker seg proteiner og å legge til lysisbufferen på cellepelleti stedet for å lysing cellene direkte på Petriparabolen 24.
Når det gjelder proteinutvinning, er det svært viktig å holde alle vaske- og lyseløsninger iskalde og Petri-retter eller EpH4 mammosfærer på is hele. Dette skyldes at i fravær av kalsium i PBS vaske kadheriner er ikke engasjert og som et resultat Stat3-ptyr705 er raskt defosforylert25.
Størrelsen på Petri-rettene som er beskrevet for HC11-celler, er tilstrekkelig for 3–4 vestlige blots (dvs. mengden protein som gjenvinnes per Petri-fat er ca. 50 μg per 3 cm fat). Vi foretrekker å bruke 3 cm Petri retter for differensiering eksperimenter for å lette protein utvinning. Hvis en 6 brønnbrett brukes i stedet, er det vanskelig å trekke ut proteiner fra en brønn i kulden samtidig som resten av brønnene er sterile. Dessuten er CO 2-konsentrasjonen viktig for differensiering, og det er vanskelig å opprettholde den for resten av brønnene som proteiner blir ekstrahert fra en brønn på benken.
I vår erfaring, i motsetning til differensiering av preadipocytes23,flere masse føtal kalv serum er i stand til å støtte veksten samt differensiering av HC11 eller EpH4 celler. En masse nyfødt kalv serum testet ikke støtte differensiering, selv om det kunne støtte normal vekst: cellene syntes å skille i begynnelsen, men mistet sin evne til å skille etter tre passasjer i nyfødte kalv serum.
I motsetning til HC11 celler, differensiering av EpH4 celler er tett knyttet til den omkringliggende 3D matrise arkitektur. Vi beskriver trinnene som kreves for EpH4 differensiering i 3D-kultur modifisert fra tidligere studier26,27,28 og påfølgende proteinutvinning for analyse av β-casein produksjon. EHS-matrisen er flytende ved lave temperaturer (<10 °C) og stivner ved høyere temperaturer. Det lagres normalt ved -80 °C, men fungerende aliquots kan lagres ved -20 °C. Tin matrisen ved 4 °C natten før bruk og pre-chill vev kulturplater og pipette tips ved -20 °C før håndtering. For en nøyaktig vurdering av proteinkonsentrasjon er det viktig å eliminere matrisen helt før ekstraksjon med kald PBS-vask fordi matrisen er rik på protein, noe som kan forvirre proteinbestemmelsesresultatene.
EpH4 avhengighet en matrise for differensiering har blitt demonstrert i flere eksperimentelle modeller: Reichman et al.10 viste at EpH4 celler indusert av laktogene hormoner produsert β-casein innenfor områder av laminin deponering og intensivert cytokeratin uttrykk. Somasiri et al.11 viste at PI3-kinase er nødvendig for å følge koblingsavhengig sfæroiddannelse og differensierende melkeproteingenuttrykk. Videre viste Brinkmann et al.21 at uttrykk for transfected HGF cDNA i EpH4-celler indusert forgrening tubulogenese av sfæroider i en 3D kulturmodell, analogt med den observerte HGF-indusert tubuldannelse sett her (Figur 3A,C). Disse funnene illustrerer fordelene med EpH4 cellelinjemodellen for å studere signalhendelser som regulerer brystkjerteldifferensiering.
EpH4-celler kan også danne mammosfærer når de er belagt ved konsentrasjoner av fosterkalvserum lavere enn de 10% beskrevet. Interessant, de kan danne mammospheres ved lavere konsentrasjoner, eller til og med i fravær av 20% eller 10% matrise, når belagt på toppen av et lag på 100% matrise22,27. I fravær av matrise i cellesuspensjonen unngås kjøling av cellene. En ekstra fordel er at alle celler finnes i et enkelt plan, slik at de er lettere å fotografere.
Betydning: Cadherin engasjement i kultiverte celler, som tilnærmer den fysiologiske tilstanden til en celle in vivo, kan aktivere Rac / IL6 / Stat3 banen. Dette kan være spesielt viktig i epitelcelledifferensiering. Ved hjelp av teknikkene som er beskrevet, avslørte våre resultater intensiteten av signalet som kommer fra denne veien som en sentral determinant i balansen mellom cellespredning vs. differensiering, to fundamentalt motsatte prosesser2. Den grundige undersøkelsen av E-kadherin /Rac/Stat3-aksen kan avdekke nye amfiboløse komponenter av veien avhengig av uttrykksnivået, som kan utnyttes som mål for kreftbehandling. For slike mål ville fullstendig hemming ikke være nødvendig for å reversere neoplastisk fenotype. Delvis hemming ville til og med være gunstig, fordi de gjenværende beløpene faktisk kan blokkere transformasjon og fremme differensiering. Dette kan variere med målet samt den type svulst i spørsmålet, som vist fra den forskjellige oppførselen til RacV12 vs Stat3C, i HC11 vs EpH4 celler2,20.
Fremtidige applikasjoner: Cadherin/Rac/IL6/Stat3-banen kan spille en lignende rolle i differensieringen av andre epitelceller, for eksempel humant bryst MCF10A eller hundens nyre MDCK29 cellelinjer, samt andre typer differensiering som avhenger av cellesamfluens, for eksempel preadipocytes og myoblaster30, som uttrykker ulike typer kadheriner. Til slutt kan denne teknikken utnyttes for undersøkelse av rollen til Stat531 og andre komponenter av differensierende veier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter å avsløre.
Acknowledgments
HC11 cellelinjen ble vennlig levert av Dr. D. Medina (Houston, TX). Forfatterne er takknemlige til Dr. Andrew Craig fra Queen's University for mange reagenser og verdifulle forslag. EpH4 celler var en gave fra Dr. C. Roskelley (UBC, Vancouver). Colleen Schick ga utmerket teknisk assistanse for 3D kulturstudier.
Den økonomiske hjelpen fra Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario Chapter), Canadian Breast Cancer Research Alliance , Ontario Centres of Excellence, Breast Cancer Action Kingston (BCAK) og Clare Nelson bequest fondet gjennom tilskudd til LR er takknemlig anerkjent. BE fikk støtte fra CIHR, CBCF, BCAK og Cancer Research Society Inc. PTG støttes av en Canada Research Chair, Canadian Foundation for Innovation, CIHR, NSERC og Canadian Cancer Society. MN ble støttet av et studentskip fra Terry Fox Training Program i transdisciplinary Cancer Research fra NCIC, en Graduate award (QGA), og en Dean's Award fra Queen's University. MG ble støttet av postdoktorstipend fra US Army Breast Cancer Program, Ministry of Research and Innovation i provinsen Ontario og Advisory Research Committee of Queen's University. VH ble støttet av et CBCF doktorgradsstipend og et postdoktorstipend fra Terry Fox Foundation Training Program i Transdisciplinary Cancer Research i samarbeid med CIHR. Hanad Adan var mottaker av en NSERC sommer studentskap. BS ble støttet av en Queen's University graduate award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Acrylamide/0.8% Bis Solution | Bio Rad | 1610154 | Western Blotting |
| Anti-Cyclin D1 antibody | rabbit, Santa Cruz | sc-717 | Western Blotting |
| Anti-p120 antibody | mouse, Santa Cruz | sc-373751 | Western Blotting |
| Anti-β actin antibody | mouse, Cell Signalling technology | 3700 | Western Blotting |
| Anti-β casein antibody | goat, Santa Cruz Biotechnology | sc-17971 | Western Blotting |
| Aprotinin | Bio Shop | APR600 | Lysis Buffer |
| Bicinchoninic Acid Solution | Sigma | B9643-1L-KC | Protein Determination |
| Bovine serum albumin | Bio Shop | ALB007.500 | Protein Determination |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad | 170-5061 | Western Blotting |
| Copper(II) sulphate | Sigma | C2284-25ML | Protein Determination |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | Staining |
| Digitonin | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 14952-500 | Staining |
| EDTA | Bio Shop | EDT001.500 | |
| Epidermal Growth Factor | Sigma | E9644 | Medium for HC11 Cells |
| Fetal calf serum | PAA | A15-751 | Cell Culture Medium |
| Goat- Anti Rabbit-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | Western Blotting |
| Hepatocyte Growth Factor recombinant | Gibco | PHG0321 | |
| Hepes | Sigma | 7365-45-9 | Cell Culture |
| Horse Anti-Mouse HRP | Cell Signalling Technology | 7076 | Western Blotting |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | HIP Medium |
| insulin | Sigma | I6634 | HIP Medium |
| Laminar-flow hood | BioGard Hood | Cell Culture | |
| Leupeptin | Bio Shop | LEU001.10 | Lysis Buffer |
| Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel) | Corning | CACB 354230 | |
| Mouse Anti-Goat HRP | Santa Cruz | sc-8360 | Western Blotting |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 475904-100GM | Staining |
| Multi-photon confocal microscope | Leica TCS SP2 | ||
| Na3VO4 | Bio Shop | SOV850 | Lysis Buffer |
| Na4P207 | Sigma | 125F-0262 | Lysis Buffer |
| NaCl | Bio Shop | SOD001.1 | Western Blotting |
| NaF | Fisher Scientific | 7681-49-4 | Lysis Buffer |
| Nikon digital Camera | Coolpix 995 | ||
| Nitrocellulose | Bio Rad | 1620112 | Western Blotting |
| NP-40 | Sigma | 9016-45-9 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | Staining |
| Phase Contrast Microscope | Olympus IX70 | Cell Culture | |
| Phenylmethylsuphonyl fluoride | Sigma | 329-98-6 | Lysis Buffer |
| pMX GFP Rac G12V | Addgene | 14567 | |
| Prolactin | Sigma | L6520 | HIP Medium |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | Cell Culture Medium |
| Tissue Culture Dish 35 | Sarstedt | 83.3900. | Cell Culture |
| Tissue Culture Plate-24 well | Sarstedt | 83.1836.300 | Cell Culture |
| Transfer Apparatus | CBS Scientific Co | EBU-302 | Western Blotting |
| Tris Acetate | Bio Shop | TRA222.500 | Western Blotting |
| Trypsin | Sigma | 9002-07-7. | Cell Culture |
| Tween-20 | Bio Shop | TWN510.500 | Western Blotting |
| Veritical Gel Electrophoresis System | CBS Scientific Co | MGV-202-33 | Western Blotting |
References
- Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation. Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).
- Niit, M., et al. Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis. Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).
- Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line. The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).
- Humphreys, R. C., Rosen, J. M. Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function. Cell growth & differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).
- Merlo, G. R., et al. differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors. European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).
- Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation. Journal of Cell Science. 108, Pt 6 2445-2456 (1995).
- Arbeithuber, B., et al. Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation. BioMed Research International. 2015, 460598 (2015).
- Morrison, B., Cutler, M. L. Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation. Journal of Visualized Experiments. (32), e1265 (2009).
- Merlo, G. R., et al. Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53. Oncogene. 9, 443-453 (1994).
- Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally. Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).
- Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation. Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).
- Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).
- Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression. Breast Cancer Research. 11 (3), 26 (2009).
- Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 34 (6), 468-477 (1998).
- Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands. PLoS One. 8 (6), 65127 (2013).
- Arulanandam, R., et al. Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3. Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).
- Geletu, M., et al. Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis. BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).
- Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases. Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).
- Raptis, L., et al. Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement. Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).
- Niit, M., et al. Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3. Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).
- Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells. Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).
- Starova, B. Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis. , Queen's University. M.Sc. Thesis (2008).
- Raptis, L., et al. Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner. Cell Growth & Differentiation. 8, 11-21 (1997).
- Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells. Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).
- Vultur, A., et al. Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells. Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Hoskin, V. C. A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis. , Queen's University. Ph.D. Thesis (2015).
- Su, H. W., et al. Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression. Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).
- Ostrovidov, S., et al. Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).
- Cass, J. Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation. , Queen's University. Ph.D. thesis (2013).
