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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Diferenciación de células epiteliales de mama de ratón HC11 y EpH4

Published: February 27, 2020 doi: 10.3791/60147
Automatic Translation
*1,2, *1, *1,3, 1,4, 1, 1, 2, 1
1Department of Biomedical and Molecular Sciences and Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, Kingston, 2Department of Chemical and Physical Sciences, University of Toronto, Mississauga, 3Department of Laboratory Medicine, Brampton Civic Hospital Campus, William Osler Health System, 4Latner Thoracic Surgery Research Laboratories
* These authors contributed equally

Summary

Describimos técnicas para la inducción de diferenciación de dos líneas epiteliales mamarias, HC11 y EpH4. Mientras que ambos requieren suero de ternero fetal, insulina y prolactina para producir proteínas de la leche, las células EpH4 pueden diferenciarse completamente en mamesferas en cultivo tridimensional. Estos modelos complementarios son útiles para estudios de transducción de señales de diferenciación y neoplasia.

Abstract

Las cadherinas desempeñan un papel importante en la regulación de la diferenciación celular, así como la neoplasia. Aquí describimos los orígenes y métodos de la inducción de la diferenciación de dos líneas celulares epiteliales de mama de ratón, HC11 y EpH4, y su uso para estudiar etapas complementarias del desarrollo de la glándula mamaria y la transformación neoplásica.

La línea celular epitelial de la mama del ratón HC11 se originó a partir de la glándula mamaria de un ratón Balb/c embarazada. Se diferencia cuando se cultiva para confluencia unida a una superficie de plástico de la placa Petri en medio que contiene suero de ternero fetal y Hydrocortisona, Insulin y Prolactin (medio HIP). En estas condiciones, las células HC11 producen las proteínas lácteas-caseína y proteína ácida de suero de leche (WAP), similares a las células epiteliales mamarias lactantes lactantes, y forman estructuras rudimentarias similares a las glándulas mamarias llamadas "domes".

La línea celular EpH4 se deriva de células epeliales de la glándula mamaria de ratón inmortalizadas espontáneamente aisladas de un ratón Balb/c embarazada. A diferencia de HC11, las células EpH4 pueden diferenciarse completamente en esferoides (también llamadas mamesferas) cuando se cultivan en condiciones de crecimiento tridimensionales (3D) en medio HIP. Las células son trippsinizadas, suspendidas en una matriz del 20% que consiste en una mezcla de proteínas de matriz extracelular producidas por las células de sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), chapadas encima de una capa de matriz concentrada que recubre una placa de plástico Petri o placa multipocilíndor, y se cubren con una capa de 10% de medio HIP que contiene matriz. En estas condiciones, las células EpH4 forman esferoides huecos que exhiben polaridad apical-basal, un lumen hueco, y producen la caseína y el WAP.

Utilizando estas técnicas, nuestros resultados demostraron que la intensidad de la señal de la cadherina/Rac es fundamental para la diferenciación de las células HC11. Mientras que Rac1 es necesario para la diferenciación y bajos niveles de RacV12 activado aumentar la diferenciación, altos niveles de RacV12 bloquean la diferenciación mientras que induce neoplasia. Por el contrario, las células EpH4 representan una etapa anterior en la diferenciación epitelial mamaria, que se inhibe incluso por niveles bajos de RacV12.

Introduction

En los tejidos normales o tumores, las células tienen amplias oportunidades de adhesión a sus vecinos en una organización tridimensional, y esto es imitado en el cultivo por el crecimiento celular de alta densidad. La adhesión de célula a célula se media principalmente a través de receptores de cadherina, que definen la arquitectura celular y tisular. Curiosamente, recientemente se demostró que las cadherinas también desempeñan un papel poderoso en la transducción de señales, especialmente en la señalización de supervivencia1. Paradójicamente, algunas de estas señales de adhesión de célula a célula que emanan de las cadreínas se encontraron recientemente compartidas tanto por diferenciación como por neoplasia2. Aquí, describimos métodos de inducción y evaluación de la diferenciación en dos tipos representativos de líneas celulares epiteliales de mama de ratón, HC11 y EpH4.

La línea celular epitelial de la mama de ratón HC11 puede proporcionar un modelo útil para el estudio de la diferenciación de células epiteliales. Las células HC11 son una línea celular derivada de COMMA-1D, que se origina en la glándula mamaria de un ratón Balb/c de embarazo medio3. A diferencia de otros clones derivados de COMMA-1D, el clon HC11 no tiene ningún requisito para añadir exógenamente matriz extracelular o cocultivo con otros tipos de células para la inducción in vitro del gen endógeno de caseína por hormonas lactogénicas3. Esta línea celular se ha utilizado ampliamente en estudios de diferenciación porque ha conservado características importantes del epitelio mamario normal: las células HC11 pueden reconstituir parcialmente el epitelio ductal en una almohadilla de grasa mamaria clara4. Por otra parte, se pueden diferenciar en un cultivo bidimensional (2D) cuando se cultivan a la confluencia unida a una superficie de plástico de plato de Petri en presencia de un esteroide como Hydrocortisona o Dexametasona, además de Insulina y Prolactina (medio HIP) carente de factor de crecimiento epidérmico (EGF), un inhibidor de la diferenciación5,6,7. En estas condiciones, las células HC11 producen proteínas lácteas como la caseína y la WAP, que son detectables por la hincha occidental dentro de los 4 días siguientes a la inducción. Al mismo tiempo, una porción de células HC11 forma estructuras rudimentarias mamarias similares a las glándulas denominadas "domes" de una manera estocástica. Las cúpulas son visibles de 4 a 5 días después de la inducción y aumentan gradualmente de tamaño hasta el día 10, concomitantes con un aumento en la producción de caseína8. Curiosamente, las células HC11 poseen mutante p539, y por lo tanto representan un estado preneoplásico. Por esta razón, el modelo HC11 es ideal para estudiar redes de señalización de diferenciación en conjunto con neoplasia en el mismo sistema celular.

Las células EpH4, un derivado de las células IM-2, son una línea celular no tumorigénica originalmente derivada de células epeliales de la glándula mamaria de ratón inmortalizadas espontáneamente aisladas de un ratón Balb/c de embarazo medio10. Las células EpH4 forman monocapas epeliales continuas en el cultivo 2D, pero no se diferencian en estructuras glandulares10,11. Sin embargo, después del crecimiento 3D en un material que consiste en una mezcla de proteínas de matriz extracelular producidas por las células de sarcoma de ratón EHS12 (matriz EHS, matriz o Matrigel, ver Tabla de materiales),además de la estimulación con HIP, las células EpH4 pueden recapitular las etapas iniciales de diferenciación de la glándula mamaria. En estas condiciones, las células EpH4 forman esferoides (también llamados mamesferas) que exhiben polaridad apical-basal y un lumen hueco, y son capaces de producir las proteínas lácteas-caseína y WAP, similares a las células epiteliales mamarias lactantes lactantes lactantes lactantes. Contrariamente a las células HC11, que son indiferenciadas, y algunas expresan marcadores mesenquimales13, las células EpH4 exhiben una morfología puramente luminal14. Las células EpH4 también se han divulgado para producir proteínas de la leche en el cultivo 2D a través de la estimulación con dexametasona, insulina, y prolactina15. Sin embargo, este enfoque impide el estudio de los efectos reglamentarios que imitan el microambiente de la glándula mamaria en el cultivo 3D.

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Protocol

1. Placado de células HC11

  1. En una campana de flujo laminar utilizando técnicas estériles, prepare un frasco con 50 ml de medio celular HC11: RPMI-1640 con 10% de suero bovino fetal (FBS), insulina de 5 g/ml y EGF de 10 ng/ml (ver Tabla de materiales).
  2. Placa de aproximadamente 400.000 celdas por plato Petri de 3 cm: Pasar dos platos Petri de 10 cm, 50% confluentes en veinte platos de 3 cm en medio HC11. Las células deben estar bien esparcidas, pero se debe evitar el secado.
    1. Aspirar el medio en un matraz utilizando una bomba de vacío.
    2. Añadir 250 l de tripsina (ver Tabla de Materiales)por placa de 10 cm. Gire y golpee la placa desde los lados mientras la mantiene horizontal para extender la trippsina y desalojar las células unidas
    3. Observar bajo fase de la microscopía de contraste con un objetivo 4x para asegurarse de que las células han comenzado a separarse de los bordes antes de pipetear.
    4. Aspirar aproximadamente 1,5 ml de medio HC11 en una pipeta Pasteur estéril de 9 pulgadas y chorro verticalmente contra las células. Gire la placa Petri mientras se revuelve para desalojar todas las células. Debe trabajar rápido para evitar el secado de las células.
    5. Transfiera todas las células al frasco con el medio HC11 y gire.
    6. Pipeta 2 ml de suspensión celular en cada plato Petri de 3 cm. Mece los platos Petri transversalmente para esparcirse uniformemente. Coloque las células en una incubadora de CO2 de 37oC y 5%.
  3. Al día siguiente, o cuando las células son de 90-100% confluentes, aspirar el medio, y reemplazarlo con medio con FBS e insulina pero carente de EGF.

2. Inducción de diferenciación, monitoreo y cuantificación de células HC11

  1. Después de cultivar las células en medio carentes de EGF durante 24 h, añadir el medio de diferenciación (medio HIP) a diez placas de 3 cm: RPMI-1640 suplementada con 10% FBS, 1 g/ml Hydrocortisona (ver Tabla de Materiales),5 g/ml Insulina y 5 g/ml Prolactin (ver Tabla de Materiales)durante un máximo de 10 días.
  2. Mantenga las otras diez placas de 3 cm como controles: Cambie a un medio con un 10% de FBS y 5 g/ml de insulina que falten EGF y HIP.
  3. Cambie el medio cada 2-3 días a células y controles tratados con HIP. Pipetear el medio cuidadosamente para asegurarse de que las células no se separan.
  4. Para monitorear la diferenciación (es decir, la formación de "domes"), observar las células bajo microscopía de contraste de fase(Figura 1A,panel izquierdo). Si las células están expresando proteína de fluorescencia verde (GFP), observe bajo microscopía de fluorescencia (excitación 485/20; emisión a 530/25; aumento 240x; objetivo 20x)(Figura 1A, panel derecho).
  5. Para cuantificar el grado de diferenciación, extraiga las proteínas de una placa Petri cada una de las células y controles tratados con HIP, una vez al día durante un total de 10 días y sondee las manchas occidentales para la caseína (ver Tabla de Materiales)(Figura 1B).
    1. Raspa las células sobre hielo con una solución salina tamponada de fosfato helado de 1,5 ml (PBS) en un tubo centrífugo de plástico de 1,8 ml.
    2. Pellet las células a 350 x g,1 min, 4 oC.
    3. Lave rápidamente el pellet 2x con PBS helado. Escurra cualquier residuo.
    4. Hacer un tampón de lisis: 50 mM HEPES (pH a 7,4), 150 mM De NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Na4P2O7, 1% NP-40, 100 mM NaF, 2 mM Na3VO4, 0,5 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 10 g/ml de aprotina, 10 g/ml de leupeptina16. Añadir 100 l por plato de Petri de 3 cm.
    5. Aclarar el lisado por centrifugación a 10.000 x g durante 10 minutos en frío.
    6. Determinar la concentración de proteínas (ver Tabla de Materiales)y cargar de 10 a 20 g de proteína de cada muestra en un gel de poliacrilamida-SDS al 10%.
    7. Electroforesa durante 15 h a 45 V, o a 100 V durante 2–2,5 h.
    8. Transferencia a una membrana de nitrocelulosa o PVDF utilizando un aparato de transferencia electroblotante (ver Tabla de Materiales).
    9. Bloquear con albúmina sérica bovina (BSA) al 5% en solución salina con búfer de Tris con 0,1% de Tween-20 (TBST).
    10. Añadir el anticuerpo primario, cabra anti-caseína diluida 1:2,000 o ratón anti-a actina diluida 1:1,000 (ver Tabla de Materiales).
    11. Lavar 3 veces con TBST, 5 min cada vez.
    12. Añadir el anticuerpo secundario, el rábano picante peroxidasa (HRP) vinculado burro anti-cabra diluido 1:2,500, o HRP vinculado anticuerpo anti-ratón caballo diluido 1:10,000.
    13. Lavar 3 veces con TBST, 5 min cada vez.
    14. Añadir reactivos ECL a la membrana de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales).

3. Plating y crecimiento 3D de células EpH4 en EHS Matrix

NOTA: La matriz es líquida a temperaturas <10 oC y sólida a temperaturas superiores. Conservar a -80oC. Descongelar a 4oC la noche antes de su uso. Enfríe previamente las placas de cultivo de tejido y las puntas de las pipetas a -20 oC antes de manipular y mantenga las puntas de la matriz, las placas y las pipetas en el hielo para evitar que se solidifique.

  1. Cultivar células EpH4 en 2D en medio RPMI-1640 con 10% de FBS y 5 g/ml de insulina (no se requiere EGF).
  2. Preparar el medio de crecimiento EpH4 complementado con una matriz de 10% (v/v, 3.500 l) o 20% (v/v 2.000 l) en dos tubos cónicos de 50 ml. Mantener en hielo hasta que esté listo para usar.
  3. Recubrir 10 pocillos (1 cm2 cada uno) de una placa de 24 pocillos con 150 ml de matriz sin diluir. Extienda la matriz con una punta de pipeta. Evite crear burbujas. Toque suavemente los lados de la placa mientras la sostiene horizontalmente para asegurarse de que la matriz se distribuye uniformemente a través de la parte inferior del pozo.
  4. Incubar la placa de 24 pocillos a 37oC durante 1 h para permitir que la matriz se solidifique.
  5. Pruebe las células EpH4 como se describió anteriormente para las células HC11 y cuente con un hemocitómetro. Transfiera 5 x 104 células por pozo a un tubo centrífugo cónico estéril de 1,5 ml y gire a 250 x g durante 5 min.
  6. Aspirar cuidadosamente el medio y colocar el tubo sobre hielo.
  7. Resuspenda las células en un medio de crecimiento EpH4 de 350 oL complementado con una matriz del 20% utilizando una punta de pipeta de 1 ml mientras mantiene el tubo cónico sobre hielo. Evite las burbujas. Es importante asegurar una suspensión de una sola célula.
  8. Una vez que la matriz de la capa inferior se haya solidificado (la matriz debe aparecer translúcida y de color más claro en comparación con el recubrimiento inicial de los pozos), agregue los 350 s de suspensión celular a cada pocato recubierto y colóquelo en una incubadora de CO2 a 37 oC para el número 1 h para permitir que la capa de matriz del 20% se solidifique.
    1. Observe las células microscópicamente bajo contraste de fase con un objetivo 4x. Las celdas individuales deben ser visibles.
  9. Añadir 200 sl de medio EpH4 que contenga una matriz del 10% encima de los 350 s de células suspendidas en una matriz del 20%. Incubar a 37oC.

4. Inducción de diferenciación de células EpH4 cultivadas en 3D(Figura 2)

NOTA: Además de la diferenciación, las células EpH4 también pueden someterse a tubulogénesis cuando se estimulan con HGF (factor de crecimiento de hepatocitos) en el cultivo 3D. Los crecimientos tubulares se pueden ver después de 10 días de estimulación de HIP y HGF.

  1. Comenzar la inducción de diferenciación de las células EpH4 1 día después del enchapado en la matriz. Retire con cuidado 150 s l de medio superior que contenga una matriz del 10% de los pozos utilizando una punta de pipeta de plástico. Añadir 200 sL de medio EpH4 que contenga HIP y matriz del 10%.
  2. Reemplace el medio de matriz-HIP del 10% cada 2 días durante un máximo de 10 días. Cultivar células de control en el mismo medio de matriz 10% sin HIP.
  3. Supervisar la formación de mamesferas bajo contraste de fase(Figura 3A,panel inferior).

5. Inducción de tubulogénesis de células EpH4 cultivadas en 3D(Figura 3A y 3C)

  1. Prepare 24 placas de pozo y células EpH4 para el crecimiento en matriz como se detalla en los pasos 3.1–3.9. El día después de enchapar las células en la matriz, retire 150 ml de medio EpH4 que contenga una matriz del 10% de los pozos utilizando una punta de pipeta de plástico. Añadir 200 l de medio EpH4 que contenga una matriz del 10%, HIP y 20 ng/mL HGF (ver Tabla de Materiales).
  2. Reemplace el medio de matriz/HIP/HGF del 10% cada 2 días durante un máximo de 12-14 días.
  3. Supervise la formación de túbulos microscópicamente utilizando un objetivo de 20x o 40x(Figura 3A,panel derecho).

6. Cantidad de diferenciación: Western Blotting para la caseína

  1. Pipetear cuidadosamente el medio de matriz-HIP del 10% de los pozos. Enjuague la capa de matriz 20% 2x con 350 s de PBS helado. Los esferoides todavía deben estar presentes en la capa de matriz.
  2. Añadir entre 700 y 1.000 ml de PBS helado con ácido etilendiaminetetraacético de 1 mM (EDTA) directamente en los pozos. Separe suavemente la capa inferior de la matriz 100% del pozo con una punta de pipeta para recuperar los esferoides presentes en esa capa. Agitar suavemente durante 30 min a 4oC.
  3. Transfiera cuidadosamente la suspensión esferoide a un tubo cónico. Enjuague los pozos con 500 ol de PBS-EDTA para recuperar los esferoides restantes en los pozos y añadirlos al tubo cónico.
  4. Roca sobre hielo durante 30 minutos adicionales. Asegúrese de que la matriz se haya disuelto por completo. Si se ven grumos de matriz visibles, agregue más PBS-EDTA o agite más tiempo.
  5. Centrifugar la solución para peletizar los esferoides a 350 x g durante 5 min.
  6. Aspirar el sobrenadante, licre rofher los esferoides en tampón de lisis helada, y sonda para la caseína, la ciclina D1 y p120RasGAP por la hincha occidental como en el paso 2.5 por encima de16. Como anticuerpos primarios, utilizar la cabra anti-caseína diluido 1:2,000, conejo anticiclina D1 diluido 1:2,000, y ratón anti-p120 diluido 1:2,000. Para los anticuerpos secundarios, utilice anti-cabra de burro vinculado a HRP diluido 1:2,500, HRP vinculado burro anticonejo diluido 1:2,500, y HRP vinculado caballo anti-ratón diluido 1:10,000.

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Representative Results

Durante mucho tiempo se ha sabido que la diferenciación de células epiteliales y adipocitos requiere confluencia y compromiso de las cadherinas2. Nosotros y otros demostramos que la adhesión de célula a célula y el compromiso de E- o N-cadherin y cadherin-11, como ocurre con la confluencia de células cultivadas, desencadena un aumento dramático en la actividad de las pequeñas GTPases Rac y la proteína de control de división celular 42 (Cdc42), y este proceso conduce a la activación de las citoquinas de la familia interleucina-6 (IL6) y Stat3 (transductor de señal y activador de transcripción-316,17)1,18,19. Debido a que muchos componentes de la vía de la cadherina/Rac/IL6/Stat3 pueden participar tanto en la diferenciación como en la transformación neoplásica, proporcionan asas moleculares para el estudio de la interrelación de estos dos procesos diametralmente opuestos.

Utilizando las técnicas descritas anteriormente, demostramos una sorprendente dependencia de la diferenciación sobre la fuerza de la señal Rac en las células HC11: Mientras que el cRac1 endógeno es necesario para la diferenciación, y en niveles bajos racV12 activado mutacionmente causa un aumento distinto en la capacidad de diferenciación, los altos niveles de RacV12 desencadenan un bloque dramático de diferenciación mientras inducen neoplasia(Figura 1B). Por el contrario, incluso los niveles bajos de expresión RacV12 bloquearon la diferenciación en las células EpH42. Además, a pesar de que RacV12 activa Stat3 en muchos sistemas celulares, incluyendo HC1116, Stat3C activado mutacionalmente bloqueado diferenciación mientras induce la transformación neoplásica20.

Exploramos además las propiedades de diferenciación de las células EpH4 en un cultivo de matriz 3D. Mientras que la producción de caseína alcanzó un máximo de 8-10 días, la expresión de ciclina D-1 fue máxima a los 4-6 días después de la estimulación HIP(Figura 3B). Estos hallazgos apoyan una relación inversa entre la proliferación y la diferenciación en el modelo EpH4. Utilizando la tinción DAPI (nuclear) y la microscopía confocal para determinar el posicionamiento de las células epiteliales individuales, observamos la muerte de células internas y la formación de lúmenes huecos en mamesferas(Figura 3A,C). Además, mostramos que la adición de HGF (20 ng/mL) a 48 h al medio HIP dio lugar a la formación de estructuras tubulares(Figura 3A,C),consistente con estudios anteriores de microscopía electrónica21. Estos enfoques que utilizan el modelo EpH4 permiten la caracterización de características específicas de la diferenciación epitelial mamaria y su asociación con vías de transducción de señales distintas.

Figure 1
Figura 1: Evaluación y cuantificación de la diferenciación celular HC11. (A) Una cúpula formada en células HC11 que expresan bajos niveles de GFP-RacV12 a los 10 días siguientes a la inducción de la diferenciación. Izquierda: Fase-contraste; Derecha: Fluorescencia del mismo campo (fotos no publicadas antes). Barra de escala a 100 m; Ampliación 240x; Objetivo 20x. (B) Efecto de RacV12 sobre la diferenciación HC11: Se expresaron en células HC11 niveles bajos (carriles 19–24), intermedios (carriles 13–18) o altos (carriles 7–12) de una construcción de fusión RacV12-GFP. Tras el crecimiento en ausencia de EGF durante 24 horas, las células fueron inducidas a diferenciarse con la adición de HIP, o no, como se indica. Los extractos de detergente se prepararon en el número indicado de días más tarde y se sondearon para la caseína o la actina como control de carga. Tenga en cuenta el aumento dramático de la caseína en las células de expresión de RacV12-GFP (carriles 21–24 frente a 3–6), y la drástica reducción tras la expresión de la alta RacV12-GFP (carriles 9–12). NE - Cultivos de control, cultivados en ausencia de EGF, pero no inducidos a diferenciar (Niit et al.2, reproducidos con permiso). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Esquema del método de superposición para el crecimiento de celdas EpH4 en la referencia cultural de matriz 3D. (A) Los pocillos de una placa de 6 pocillos fueron recubiertos inicialmente con matriz 100% EHS que se permitió solidificar a 37 oC formando un lecho gelificado de membrana de sótano de aproximadamente 2-5 mm de espesor. Las células EpH4 fueron sembradas en este lecho como una suspensión de una sola célula en medio HIP con matriz del 20%. Esto fue superpuesto con una matriz del 10% en el medio HIP. El medio de matriz del 10% fue reemplazado cada dos días. Las células proliferaron y comenzaron a formar mamesferas después de 4-5 días en cultivo (ver sección Protocolos). (B) Las imágenes de contraste de fase de células EpH4 en cultivo sin 2D (monocapa) y 3D (mamesfera) se capturaron utilizando un microscopio equipado con una cámara digital (aumento de 300x). Se muestran imágenes representativas en cada etapa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Eventos en morfogénesis acinar 3D de EpH4 en la cultura 3D. (A) las células EpH4 se cultivaron en placas de pozos recubiertas con matriz y se mantuvieron en medio 3D completo como en la Figura 2. Durante las primeras etapas de la morfogénesis, las células proliferaron, formaron racimos y se organizaron en dos grupos: (1) una capa externa de células polarizadas y (2) un cúmulo interno de células desorganizadas que fueron sometidas a la muerte celular, correspondiente a la apoptosis como se muestra anteriormente12. Este último condujo a la formación de un lumen hueco, caracterizado por el oscurecimiento del centro de las mamesferas visto por la microscopía de contraste de fase. La adición de HGF (20 ng/mL) al medio dio lugar a la formación de estructuras tubulares. Más del 60% de los agregados inducidos por HGF mostraron tubulogénesis, en comparación con los agregados de control no tratados, lo cual no lo hizo. Una fotografía representativa del contraste de fase de las células en cada etapa fue capturada usando un microscopio equipado con una cámara digital (aumento de 300x; Barra de escala a 100 m). Los resultados son representativos de al menos tres experimentos. Schematic fue adaptada de Starova et al.22. (B) Las células EpH4 cultivadas en 3D se cosecharon en los días indicados. Las concentraciones de proteínas se normalizaron y las cantidades de proteínas iguales (20 g) se sometieron a SDS-PAGE, seguidas de la hincha occidental y el sondeo con los anticuerpos indicados. Se utilizó una glándula mamaria homogeneizada de un ratón lactante (MGT) como comparación in vivo. p120RasGAP se utilizó como un control de carga independiente. La expresión de la ciclina D1 aumentó transitoriamente coincidiendo con las células que proliferan durante los primeros 3-4 días. Por el contrario, la expresión de caseína alcanzó un máximo de 8-10 días, correspondiente a la formación de mamesferas maduras. Los resultados son representativos de dos experimentos. (C) La formación de lúmenes y la tubulogénesis de las mamesferas se confirmó utilizando la tinción DAPI de ADN nuclear (azul fluorescente) en agregados cultivados en cubiertas de vidrio recubiertas de matriz. Las células se fijaron en 3% de paraformaldehyde, permeabilizadas con 25 g/ml de digitalonina, y la unión inespecífica se bloqueó con 3% de BSA. Las células se teñían para ADN nuclear con DAPI (azul). Los cubreobjetos se montaron en portaobjetos de vidrio utilizando un medio de montaje. Se tomaron fotomicrografías del plano central del eje XY utilizando un microscopio confocal multifotón (barra de escala de 100 m). Las imágenes de los paneles B y C están adaptadas de Starova et al.22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Las células HC11 son ideales para el estudio de la diferenciación en combinación con la transformación neoplásica. Una ventaja añadida es que las células HC11 son fácilmente infectables con vectores retrovirales basados en Mo-MLV para expresar una variedad de genes. En nuestras manos, las células EpH4 eran más difíciles de infectar con los mismos vectores retrovirales que HC112.

El contacto entre células y el detención del crecimiento son requisitos previos clave para la diferenciación celular HC11. Por lo tanto, para lograr una diferenciación uniforme a través de la capa celular, es importante lograr una distribución uniforme de las células en la placa Petri en el momento de la sembración. Esto es especialmente importante si se desea la cuantificación de la diferenciación. La tripinización debe optimizarse para que se logre una suspensión de una sola célula y las células no pierdan viabilidad debido a las manipulaciones.

Las células que se están trippsiniando deben ser subconfluentes (50-70%), porque las células cultivadas a altas densidades tienden a adherirse fuertemente entre sí, y separarlas es difícil. Para evitar el secado de las células, aspirar con el plato Petri plano en el suelo de la campana de flujo laminar, a continuación, inclinar se para drenar rápidamente. Cubra el plato de Petri con la tapa. Si es necesario, puede acelerar la acción de la trippsina colocando la placa Petri en una incubadora de 37 oC.

Debido a que las células son muy confluentes durante los 10 días posteriores a la inducción, es importante reemplazar los nutrientes que se agotan. Cuando se cambia el medio, también se debe tener cuidado de evitar el desprendimiento de las células, que pueden no adherirse muy bien al plástico debido a la alta densidad celular. Aún así, en nuestra experiencia no es necesario utilizar platos Petri recubiertos con fibronectina, colágeno, o CellTak para obtener buenos resultados de diferenciación, a diferenciar los preadipocitos como 3T3L123 o Balb / c3T3 derivados.

La determinación precisa de proteínas para los experimentos de hincha es fundamental. Debido a que las proteínas séricas tienden a unirse al plástico de grado de cultivo de tejido, es importante raspar y lavar las células en un tubo de plástico de 1,5 ml que no atrae proteínas y añadir el tampón de lisis en el pellet celular en lugar de liscar las células directamente en la placa Petri24.

En cuanto a la extracción de proteínas, es muy importante mantener todas las soluciones de lavado y lisis heladas y los platos Petri o mamesferas EpH4 en hielo en todo el hielo. Esto se debe a que en ausencia de calcio en el lavado PBS las cadherinas no están comprometidas y como resultado Stat3-ptyr705 se desfosforilarápidamente 25.

El tamaño de los platos de Petri descritos para las células HC11 es suficiente para 3-4 manchas occidentales (es decir, la cantidad de proteína recuperada por plato de Petri es de aproximadamente 50 g por plato de 3 cm). Preferimos utilizar platos Petri de 3 cm para experimentos de diferenciación para facilitar la extracción de proteínas. Si se utiliza una bandeja de 6 pozos en su lugar, es difícil extraer proteínas de un pozo en el frío mientras mantiene el resto de los pozos estériles. Además, la concentración de CO2 es importante para la diferenciación y es difícil mantenerla para el resto de los pozos ya que las proteínas se extraen de un pozo en el banco.

En nuestra experiencia, a diferencia de la diferenciación de los preadipocitos23,varios lotes de suero de ternera fetal son capaces de apoyar el crecimiento, así como la diferenciación de las células HC11 o EpH4. Una gran cantidad de suero de ternero recién nacido probado no apoyó la diferenciación, aunque podría apoyar el crecimiento normal: las células parecían diferenciarse al principio, pero perdieron su capacidad de diferenciarse después de tres pasajes en el suero de la pantorrilla del recién nacido.

A diferencia de las células HC11, la diferenciación de las células EpH4 está estrechamente vinculada a la arquitectura de matriz 3D circundante. Describimos los pasos necesarios para la diferenciación de EpH4 en el cultivo 3D modificados a partir de estudios anteriores26,27,28 y posterior extracción de proteínas para el análisis de la producción de caseína. La matriz EHS es líquida a bajas temperaturas (<10 oC) y se solidifica a temperaturas más altas. Normalmente se almacena a -80 oC, pero las alícuotas de trabajo se pueden almacenar a -20 oC. Descongelar la matriz a 4oC la noche antes de su uso y las placas de cultivo de tejido pre-frío y las puntas de pipeta a -20 oC antes de manipularla. Para una evaluación precisa de la concentración de proteínas es importante eliminar la matriz completamente antes de la extracción con lavado de PBS en frío porque la matriz es rica en proteínas, que puede confundir los resultados de determinación de proteínas.

La dependencia de EpH4 de la matriz para la diferenciación se ha demostrado en múltiples modelos experimentales: Reichman et al.10 mostraron que las células EpH4 inducidas por hormonas lactogénicas producían la caseína dentro de áreas de deposición de laminina y expresión de citoqueratina intensificada. 11 demostraron que PI3-quinasa es necesaria para la formación de esferoides dependientes de la unión y la expresión del gen de la proteína de la leche diferenciadora. Además, Brinkmann y al.21 demostraron que la expresión del ADNC hGF transinfectado en células EpH4 inducía tubulogénesis ramificada de esferoides en un modelo de cultivo 3D, análogo a la formación de túbulos inducida por HGF observada aquí(Figura 3A,C). Estos hallazgos ilustran las ventajas del modelo de línea celular EpH4 para estudiar eventos de señalización que regulan la diferenciación de la glándula mamaria.

Las células EpH4 también pueden formar mamesferas cuando se chapan en concentraciones de suero de ternera fetal inferiores al 10% descrito. Curiosamente, pueden formar mamesferas a concentraciones más bajas, o incluso en ausencia de matriz del 20% o 10%, cuando se enchapan encima de una capa de matriz 100%22,27. En ausencia de matriz en la suspensión celular, se evita el enfriamiento de las células. Una ventaja añadida es que todas las celdas se encuentran en un solo plano, por lo que son más fáciles de fotografiar.

Importancia: La participación de la cadherina en células cultivadas, que se aproxima al estado fisiológico de una célula in vivo, puede activar la vía Rac/IL6/Stat3. Esto puede ser especialmente importante en la diferenciación de células epiteliales. Utilizando las técnicas descritas, nuestros resultados expusieron la intensidad de la señal que emana de esta vía como un determinante central en el equilibrio entre la proliferación celular frente a la diferenciación, dos procesos fundamentalmente opuestos2. La investigación en profundidad del eje E-cadherin/Rac/Stat3 puede descubrir nuevos componentes anfíboles de la vía dependiendo del nivel de expresión, que podrían ser explotados como dianas para la terapia oncológica. Para estos objetivos, la inhibición completa no sería necesaria para revertir el fenotipo neoplásico. La inhibición parcial sería incluso beneficiosa, porque las cantidades residuales pueden bloquear la transformación y promover la diferenciación. Esto puede variar con el objetivo, así como el tipo de tumor en cuestión, como se muestra en el comportamientodiferente de RacV12 vs.

Aplicaciones futuras: La vía de la cadherina/Rac/IL6/Stat3 puede desempeñar un papel similar en la diferenciación de otras células epiteliales, como la mama humana MCF10A o el riñón canino MDCK29 líneas celulares, así como otros tipos de diferenciación que dependen de la confluencia celular, como de preadipocitos y mioblastos30,que expresan diferentes tipos de cadherinas. Por último, esta técnica puede ser explotada para el examen del papel de Stat531 y otros componentes de las vías diferenciadoras.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos que revelar.

Acknowledgments

La línea celular HC11 fue proporcionada amablemente por el Dr. D. Medina (Houston, TX). Los autores están agradecidos al Dr. Andrew Craig de queen's University por muchos reactivos y valiosas sugerencias. Las células EpH4 fueron un regalo del Dr. C. Roskelley (UBC, Vancouver). Colleen Schick proporcionó una excelente asistencia técnica para estudios de cultivo 3D.

La asistencia financiera del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC), los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria (CIHR), la Fundación Canadiense contra el Cáncer de Mama (CBCF, Capítulo de Ontario), la Alianza Canadiense para la Investigación del Cáncer de Mama , se reconocen con gratitud los Centros de Excelencia de Ontario, el Kingston de Acción contra el Cáncer de Mama (BCAK) y el fondo de legado Clare Nelson a través de subvenciones a LR. BE recibió apoyo de CIHR, CBCF, BCAK y Cancer Research Society Inc. PTG cuenta con el apoyo de una Cátedra de Investigación de Canadá, la Fundación Canadiense para la Innovación, el CIHR, el NSERC y la Sociedad Canadiense del Cáncer. MN fue apoyado por una estudiante del Programa de Entrenamiento Terry Fox en Investigación Transdisciplinaria del Cáncer de NCIC, un Premio de Posgrado (QGA), y un Premio Dean de la Universidad de Queen. MG fue apoyada por becas postdoctorales del Programa de Cáncer de Mama del Ejército de los Estados Unidos, el Ministerio de Investigación e Innovación de la Provincia de Ontario y el Comité Asesor de Investigación de la Universidad de Queen. VH contó con el apoyo de una beca de doctorado CBCF y una beca postdoctoral del Programa de Capacitación de la Fundación Terry Fox en Investigación Transdisciplinaria del Cáncer en asociación con la CIHR. Hanad Adan fue el receptor de una beca de verano NSERC. La licenciatura fue apoyada por un premio de posgrado de la Universidad de la Reina.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30% Acrylamide/0.8% Bis Solution Bio Rad 1610154 Western Blotting
Anti-Cyclin D1 antibody rabbit, Santa Cruz sc-717 Western Blotting
Anti-p120 antibody mouse, Santa Cruz sc-373751 Western Blotting
Anti-β actin antibody mouse, Cell Signalling technology 3700 Western Blotting
Anti-β casein antibody goat, Santa Cruz Biotechnology sc-17971 Western Blotting
Aprotinin Bio Shop APR600 Lysis Buffer
Bicinchoninic Acid Solution Sigma B9643-1L-KC Protein Determination
Bovine serum albumin Bio Shop ALB007.500 Protein Determination
Clarity Western ECL Substrate Bio Rad 170-5061 Western Blotting
Copper(II) sulphate Sigma C2284-25ML Protein Determination
DAPI Thermofisher Scientific D1306 Staining
Digitonin Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd 14952-500 Staining
EDTA Bio Shop EDT001.500
Epidermal Growth Factor Sigma E9644 Medium for HC11 Cells
Fetal calf serum PAA A15-751 Cell Culture Medium
Goat- Anti Rabbit-HRP Santa Cruz SC-2004 Western Blotting
Hepatocyte Growth Factor recombinant Gibco PHG0321
Hepes Sigma 7365-45-9 Cell Culture
Horse Anti-Mouse HRP Cell Signalling Technology 7076 Western Blotting
Hydrocortisone Sigma H0888 HIP Medium
insulin Sigma I6634 HIP Medium
Laminar-flow hood BioGard Hood Cell Culture
Leupeptin Bio Shop LEU001.10 Lysis Buffer
Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel) Corning CACB 354230
Mouse Anti-Goat HRP Santa Cruz sc-8360 Western Blotting
Mowiol 4-88 Reagent Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd 475904-100GM Staining
Multi-photon confocal microscope Leica TCS SP2
Na3VO4 Bio Shop SOV850 Lysis Buffer
Na4P207 Sigma 125F-0262 Lysis Buffer
NaCl Bio Shop SOD001.1 Western Blotting
NaF Fisher Scientific 7681-49-4 Lysis Buffer
Nikon digital Camera Coolpix 995
Nitrocellulose Bio Rad 1620112 Western Blotting
NP-40 Sigma 9016-45-9
Paraformaldehyde Fisher Scientific 30525-89-4 Staining
Phase Contrast Microscope Olympus IX70 Cell Culture
Phenylmethylsuphonyl fluoride Sigma 329-98-6 Lysis Buffer
pMX GFP Rac G12V Addgene 14567
Prolactin Sigma L6520 HIP Medium
RPMI-1640 Sigma R8758 Cell Culture Medium
Tissue Culture Dish 35 Sarstedt 83.3900. Cell Culture
Tissue Culture Plate-24 well Sarstedt 83.1836.300 Cell Culture
Transfer Apparatus CBS Scientific Co EBU-302 Western Blotting
Tris Acetate Bio Shop TRA222.500 Western Blotting
Trypsin Sigma 9002-07-7. Cell Culture
Tween-20 Bio Shop TWN510.500 Western Blotting
Veritical Gel Electrophoresis System CBS Scientific Co MGV-202-33 Western Blotting

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References

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Cancer Research Número 156 diferenciación celular células epiteliales mamarias prolactina matriz EHS
Diferenciación de células epiteliales de mama de ratón HC11 y EpH4
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Geletu, M., Hoskin, V., Starova, B., Niit, M., Adan, H., Elliott, B., Gunning, P., Raptis, L. Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells. J. Vis. Exp. (156), e60147, doi:10.3791/60147 (2020).

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