Summary
Biz iki meme epitel hatları, HC11 ve EpH4 farklılaşma indüksiyon teknikleri açıklayın. Her ikisi de süt proteinleri üretmek için fetal buzağı serumu, insülin ve prolaktin gerektirirken, EpH4 hücreleri üç boyutlu kültürde mammospheres içine tam olarak ayırt edebilirsiniz. Bu tamamlayıcı modeller farklılaşma ve neoplazi sinyal iletimi çalışmaları için yararlıdır.
Abstract
Kadherinler hücre farklılaşmasının düzenlenmesinde ve neoplazide önemli rol oynarlar. Burada iki fare meme epitel hücre hatları, HC11 ve EpH4 farklılaşma indüksiyon uyupasyon ve meme bezi gelişimi ve neoplastik dönüşüm tamamlayıcı aşamaları çalışma da bunların kullanımı açıklar.
HC11 fare meme epitel hücre hattı hamile bir Balb / c fare meme bezi kökenli. Fetal baldır serumu ve Hydrokortizon, Insulin ve Prolactin (HIP medium) içeren orta derecede plastik Petri kabı yüzeyine bağlı olarak biraraya geldiğinde farklılaşır. Bu koşullar altında, HC11 hücreleri süt proteinleri β-kazein ve peynir altı suyu asidik protein (WAP), emziren meme epitel hücrelerine benzer üretmek ve "kubbe" olarak adlandırılır ilkel meme bezi benzeri yapılar oluştururlar.
EpH4 hücre hattı, hamile bir Balb/c fareden izole edilmiş kendiliğinden ölümsüzleştirilmiş fare meme bezi epitel hücrelerinden türetilmiştir. HC11'in aksine, EpH4 hücreleri HIP ortamda üç boyutlu (3D) büyüme koşulları altında kültürlendiğinde küresel (mammospheres olarak da adlandırılır) tam olarak ayırt edilebilirler. Hücreler, Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) fare sarkom hücreleri tarafından üretilen ekstrasellüler matriks proteinlerinin karışımından oluşan %20'lik bir matris içinde, plastik petri kabını veya çok kuyulu plakayı kaplayan konsantre matris tabakasının üzerine kaplanmış ve %10 matris içeren HIP ortamı tabakası ile kaplanır. Bu koşullar altında, EpH4 hücreleri apical-bazal polarite, içi boş bir lümen sergileyen ve β-kazein ve WAP üreten içi boş küreseller oluştururlar.
Bu teknikleri kullanarak, sonuçlarımız cadherin/Rac sinyalinin yoğunluğunun HC11 hücrelerinin farklılaşması için kritik öneme sahip olduğunu göstermiştir. Rac1 farklılaşma ve aktive RacV12 artış farklılaşma düşük seviyelerde için gerekli iken, yüksek RacV12 düzeyleri neoplazi indüklerken farklılaşmayı engeller. Buna karşılık, EpH4 hücreleri meme epitelyal diferansiyasyon daha önceki bir aşamayı temsil, Hangi RacV12bile düşük seviyelerde inhibe edilir .
Introduction
Normal dokularda veya tümörlerde, hücreler üç boyutlu bir organizasyonda komşularına yapışma için geniş fırsatlara sahiptir ve bu da kültürde yüksek yoğunluklu hücre büyümesi ile taklit edilir. Hücre-hücre adezyonu esas olarak hücre ve doku mimarisini tanımlayan kadherin reseptörleri aracılığıyla aracılık edilir. İlginçtir, son zamanlarda kadherinler de sinyal iletimi güçlü bir rol oynadığı gösterilmiştir, özellikle hayatta kalma sinyalizasyon1. Paradoksal olarak, kadherinlerden yayılan bu hücreden hücreye yapışma sinyallerinin bir kısmının yakın zamanda hem farklılaşma hem de neoplazi2ile paylaşıldığı bulunmuştur. Burada fare meme epitel hücre hatları, HC11 ve EpH4 iki temsili tip tedisiyasyon indüksiyon ve değerlendirme yöntemleri açıklanmıştır.
HC11 fare meme epitel hücre hattı epitel hücre farklılaşması çalışma için yararlı bir model sağlayabilir. HC11 hücreleri, orta gebe balb/c fare3'ünmeme bezinden kaynaklanan, VIRGÜL-1D türetilmiş bir hücre hattıdır. Diğer VIRMAN-1D türevi klonların aksine, HC11 klonu ekselolarak ekselansları ekstrasellüler matriks veya laktojenik hormonlar tarafından endojen β-kazein geninin in vitro indüksiyonu için diğer hücre tipleri ile birlikte eklenme gereksinimi yoktur3. Bu hücre hattı, normal meme epitelinin önemli özelliklerini koruduğu için ayırım çalışmalarında yaygın olarak kullanılmıştır: HC11 hücreleri kısmen temizlenmiş bir meme yağ yastığında duktal epiteli yeniden oluşturabilir4. Ayrıca, h ydrokortizon veya Deksametazon gibi bir steroid varlığında plastik petri çanak yüzeyine bağlı biraraya yetiştirilen bir iki boyutlu (2D) kültür ayırt edebilirsiniz, Insulin ve Prolactin ek olarak (HIP orta) epidermal büyüme faktörü yoksun (EGF), farklılaşma bir inhibitörü5,6,7. Bu koşullar altında, HC11 hücreleri β-kazin ve WAP gibi süt proteinleri üretirler ve indüksiyondan sonraki 4 gün içinde Batı lekeleme ile saptanabilir. Aynı zamanda, HC11 hücrelerinin bir kısmı stochastic bir şekilde "kubbeler" olarak adlandırdığı temel meme bezi benzeri yapılar oluşturur. Kubbeler indüksiyondan 4-5 gün sonra görülebilir ve 10. İlginçtir, HC11 hücreleri mutant p539sahip , ve bu nedenle bir preneoplastik devlet temsil eder. Bu nedenle, HC11 modeli ideal aynı hücre sisteminde neoplazi ile birlikte farklılaşma sinyal ağları çalışmak için uygundur.
EPH4 hücreleri, IM-2 hücrelerinin bir türevi, bir nontumorigenic hücre hattı aslında bir orta hamile Balb / c fare izole spontan ölümsüzleştirilmiş fare meme bezi epitel hücreleri türetilmiştir10. EpH4 hücreleri 2D kültürde sürekli epitel monolayers formu, ancak glandüler benzeri yapılar10,11ayırt yok. Ancak, EHS fare sarkomu hücreleri tarafından üretilen ekstrasellüler matriks proteinlerinin bir karışımından oluşan bir malzemede 3D büyüme sonrasında12 (EHS matris, matris veya Matrigel, Bkz. Malzeme Tablosu),HIP ile uyarılmaya ek olarak, EpH4 hücreleri meme bezi farklılaşmasının ilk aşamalarını özetleyebilir. Bu koşullar altında, EpH4 hücreleri apical-bazal polarite ve içi boş bir lümen sergileyen küresel (mammospheres olarak da adlandırılır) oluştururlar ve süt proteinleri β-kazin ve WAP üretme yeteneğine sahiptirler, emziren meme epitel hücrelerine benzer. Farklılaşmamış HC11 hücrelerinin aksine, ve bazı ekspres mezenkimal belirteçler13, EpH4 hücreleri tamamen luminal morfolojisi sergiler14. EpH4 hücrelerinin de deksametazon, insülin ve prolaktin15ile stimülasyon yoluyla 2D kültürde süt proteinleri üretmek için bildirilmiştir. Ancak bu yaklaşım, 3D kültürde meme bezi mikroçevresini taklit eden düzenleyici etkilerin araştırılmasını engellemektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. KAPLAMA HC11 Hücreleri
- Steril teknikler kullanarak bir laminar akış kaputunda 50 mL HC11 hücreli ortama sahip bir şişe hazırlayın: RPMI-1640 %10 fetal sığır serumu (FBS), 5 g/mL insülin ve 10 ng/mL EGF (Bkz. Malzeme Tablosu).
- 3 cm Petri kabı başına yaklaşık 400.000 hücre: İki 10 cm, %50 confluent Petri tabaklarını HC11 orta sında yirmi 3 cm'lik tabaklara geçirin. Hücreler iyi dağılmış olmalı ama kurutma kaçınılmalıdır.
- Bir vakum pompası kullanarak bir şişe içine orta aspire.
- 10 cm'lik tabla 250 μL tripsin ekleyin (Bkz. Malzeme Tablosu). Girdap ve trippsin yaymak ve bağlı hücreleri yerinden etmek için yatay tutarken yanlardan plaka vurmak
- Hücrelerin pipetlemeden önce kenarlardan kopmaya başladığından emin olmak için faz kontrast mikroskopisi altında 4 x objektif olarak gözlemleyin.
- Steril bir şekilde yaklaşık 1,5 mL HC11 ortamı, 9 inç Pasteur pipet ve hücrelere dikey olarak fışkırtın. Tüm hücreleri yerinden çıkarmak için fışkırtma sırasında Petri kabını döndürün. Hücrelerin kurumasını önlemek için hızlı çalışmanız gerekir.
- HC11 orta ve girdap ile şişe tüm hücreleri aktarın.
- Her 3 cm Petri kabında pipet 2 mL hücre süspansiyonu. Eşit olarak yaymak için Petri tabakları çapraz sal. Hücreleri 37 °C, %5 CO2 kuluçka makinesine yerleştirin.
- Ertesi gün, ya da hücreler ~ 90-100% confluent olduğunda, orta aspire, ve FBS ve insülin ile orta ile değiştirin ama EGF eksik.
2. HC11 Hücrelerinin Farklılaşma İndüksiyonu, İzlenmesi ve Nicelliği
- 24 saat boyunca EGF eksik orta hücreleri büyüttükten sonra, on 3 cm plakalar için diferansiyasyon orta (HIP orta) ekleyin: RPMI-1640% 10 FBS ile takviye, 1 μg/mL Hydrokortizon (Malzemeler Tablosubakınız), 5 μg/mL Insulin ve 5 μg/mL Prolactin (Malzemeler Tablosunabakın) kadar 10 gün.
- Diğer on 3 cm plakayı kontrol olarak saklayın: EGF ve HIP'den yoksun %10 FBS ve 5 g/mL insülin içeren bir ortama geçiş.
- Her 2-3 günde bir ortamı hem KALÇA ile tedavi edilen hücrelere hem de kontrollere değiştirin. Pipet, hücrelerin kopmadığından emin olmak için ortamı dikkatlice kullanın.
- Farklılaşmayı (yani kubbelerin oluşumunu) izlemek için faz kontrastmikroskobu altındaki hücreleri gözlemleyin(Şekil 1A, sol panel). Hücreler yeşil floresan proteini (GFP) ifade ediyorsanız, floresan mikroskopisi altında gözlemleyin (uyarma = 485/20; emisyon = 530/25; büyütme 240x; 20x objective)(Şekil 1A, sağ panel).
- Farklılaşma derecesini hesaplamak için, kalça ile tedavi edilen hücrelerin ve kontrollerin her birinden proteinleri çıkarmak, günde bir kez toplam 10 gün boyunca ve β-kazein için Batı lekelerini araştırmak (Bkz. Malzeme Tablosu)(Şekil 1B).
- 1,5 mL buz gibi fosfat tamponlu salin (PBS) ile buz üzerindeki hücreleri 1,8 ml plastik santrifüj tüpüne kazıyın.
- 350 x g,1 dk, 4 °C'de bulunan hücrelerpelet.
- Pelet2x'i buz gibi PBS ile hızlıca yıkayın. Herhangi bir kalıntı drenaj.
- Bir lysis tampon olun: 50 mM HEPES (pH = 7.4), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Na4P2O7,%1 NP-40, 100 mM NaF, 2 mM Na3VO4,0.5 mM fenilmetilsülsfonil florür (PMSF), 10 μg/mL aprotinin, 10 μg/mL leupeptin16. 3 cm Petri kabına 100°L ekleyin.
- 10 dk soğukta 10.000 x g santrifüj ile lysate netleştirin.
- Protein konsantrasyonu belirleyin (bkz. Malzemeler Tablosu)ve her örnekten 10-20 μg proteini %10 poliakrilamid-SDS jeline yükleyin.
- 45 V'da 15 saat veya ~2-2,5 saat için 100 V'de elektrofor.
- Elektroblot transfer cihazı kullanarak nitroselüloz veya PVDF membranüzerine transfer (Bkz. Malzeme Tablosu).
- Tris-tamponlu serum da %5 büyükbaş serum albumin (BSA) ile %0.1 Tween-20 (TBST) ile blok.
- Birincil antikor, keçi anti-β-kazein seyreltilmiş 1:2.000 veya fare anti-β aktin seyreltilmiş 1:1.000 (Malzeme Tablosubakınız).
- TBST ile 3x yıkayın, 5 dk her zaman.
- İkincil antikor ekleyin, horseradish peroksidaz (HRP) bağlı eşek anti-keçi seyreltilmiş 1:2,500, veya HRP bağlantılı at anti-fare antikor seyreltilmiş 1:10,000.
- TBST ile 3x yıkayın, 5 dk her zaman.
- Üreticinin talimatlarına göre membrana ECL reaktifleri ekleyin (bkz. Malzemeler Tablosu).
3. EHS Matrisinde EpH4 Hücrelerinin Kaplama ve 3D Büyümesi
NOT: Matris sıcaklıklarda sıvıdır <10 °C ve yukarıdaki sıcaklıklarda katıdır. -80 °C'de saklayın. Kullanımdan önceki gece 4 °C'de çözülün. İşleme den önce -20 °C'de doku kültürü plakalarını ve pipet uçlarını önceden soğutun ve katılaşmasını önlemek için matris, plaka ve pipet uçlarını buz üzerinde tutun.
- RPMI-1640 orta 2D EpH4 hücreleri büyümek 10% FBS ve 5 μg/mL insülin (EGF gerekli değildir).
- İki 50 mL konik tüpte %10 (v/v, 3,500 μL) veya %20 (v/v 2.000 μL) matris ile desteklenen EpH4 büyüme ortamını hazırlayın. Kullanıma hazır olana kadar buzda tutun.
- 150 μL'lik seyreltilmemiş matrisiçeren 24 kuyuluk bir tablanın 10 kuyusunu (her biri 1 cm2) kaplayın. Bir pipet ucu kullanarak matris yayıldı. Kabarcıklar oluşturmaktan kaçının. Matrisin kuyunun dibine eşit olarak dağıldığından emin olmak için plakayı yatay olarak tutarken yavaşça dokunun.
- Matrisin katılaması için 24 kuyu plakasını 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
- Yukarıda HC11 hücreleri için açıklandığı gibi EpH4 hücrelerini trypsinize ve hemositometre ile sayar. Kuyu başına 5 x 104 hücreyi 1,5 mL steril konik santrifüj tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 250 x g'de döndürün.
- Dikkatle orta aspire ve buz üzerinde tüp yerleştirin.
- EpH4 büyüme ortamının 350 μL'lik halindeki hücreleri 1 mL pipet ucu kullanılarak %20 matris ile tamamlanırken konik tüpü buzda tutar. Kabarcıklar kaçının. Tek bir hücre süspansiyonu sağlamak önemlidir.
- Alt tabaka matrisi katılaştırıldıktan sonra (matris kuyuların ilk kaplamasına göre yarı saydam ve açık renkte görünmelidir), kaplanmış her bir iyiye 350 μL hücre süspansiyonu ekleyin ve 37 °C'de ~1 saat için ~1 saat bir CO2 kuluçka makinesine yerleştirilerek %20 matris tabakasının katılaşmasını bekleyin.
- 4x hedefi ile faz kontrastı altında hücreleri mikroskobik olarak gözlemleyin. Tek hücreler görünür olmalıdır.
- %20 matris içinde asılı olan 350 μL'lik hücrelerin üzerine %10 matris içeren 200 μL EpH4 ortamı ekleyin. 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
4. EpH4 Hücrelerinin 3B'de Yetiştirilen Farklılaşma İndüksiyonu (Şekil 2)
NOT: Farklılaşmanın yanı sıra, EpH4 hücreleri 3D kültürde HGF (hepatosit büyüme faktörü) ile uyarıldığında tübülogenene de uğrayabilirler. 10 günlük KALÇA ve HGF stimülasyonundan sonra tübüler çıkıntılar görülebilir.
- EpH4 hücrelerinin matris kaplama 1 gün sonra farklılaşma indüksiyonbaşlar. Plastik pipet ucu kullanarak kuyulardan %10 matris içeren 150 μL'lik üst ortamı dikkatlice çıkarın. 200 μL EPH4 orta hip ve% 10 matris içeren ekleyin.
- 10 güne kadar her 2 günde bir %10 matris-HIP ortamını değiştirin. HIP olmadan aynı% 10 matris ortamda kontrol hücreleri büyümek.
- Faz kontrastı altında mammosfer oluşumunu izleyin(Şekil 3A, alt panel).
5. 3Boyutlu Olarak Yetiştirilen EpH4 Hücrelerinin Tübülogenez İndüksiyonu (Şekil 3A ve 3C)
- 3.1-3.9 adımlarında ayrıntılı olarak belirtildiği gibi matris büyüme için 24 kuyu plakaları ve EpH4 hücreleri hazırlayın. Matristeki hücreleri kaplamasından bir gün sonra, plastik pipet ucu kullanarak kuyulardan %10 matris içeren 150 μL EpH4 ortamını çıkarın. %10 matris, HIP ve 20 ng/mL HGF içeren 200 μL EpH4 ortamı ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
- %10 matris/HIP/HGF ortamını 12-14 güne kadar her 2 günde bir değiştirin.
- 20x veya 40x hedefi(Şekil 3A, sağ panel) kullanarak tübül oluşumunu mikroskobik olarak izleyin.
6. Farklılaşmanın Nicelliği: Β-kazin için Batı Lekeleme
- Kuyulardan %10 matris-HIP ortamını dikkatlice incelikle kapatın. %20 matris tabakasını 350 μL buz gibi PBS ile durulayın. Küreseller hala matris tabakasında bulunmalıdır.
- 1 mM ethylenediaminetetraasetik asit (EDTA) ile 700-1.000 μL buz gibi PBS doğrudan kuyulara ekleyin. %100 matrisin alt tabakasını bir pipet ucuyla kuyudan yavaşça ayırarak o tabakada bulunan küresel leri kurtarın. 4 °C'de 30 dk hafifçe çalkalayın.
- Spheroid süspansiyonu konik bir tüpe dikkatlice aktarın. Kuyularda kalan küresel leri kurtarmak ve konik tüpe eklemek için kuyuları ~500 μL PBS-EDTA ile durulayın.
- Ek bir 30 dakika buz üzerinde Kaya 30 dakika. Matris tamamen erimiş olduğundan emin olun. Görünür matris kümeleri görülürse, daha fazla PBS-EDTA ekleyin veya daha uzun süre sallayın.
- 5 dk için 350 x g de spheroids pelet için çözelti santrifüj.
- Supernatant aspire, buz-soğuk lysis tampon küresel lyse, ve β-kazein için prob, siklin D1, ve p120RasGAP Batı blotting tarafından adım 2.5 yukarıda16. Birincil antikorlar olarak, 1:2.000 seyreltilmiş keçi anti-β-kazein, tavşan anti-siklin D1 1:2.000 seyreltilmiş ve fare anti-p120 seyreltilmiş 1:2.000 kullanın. İkincil antikorlar için, HRP bağlantılı eşek anti-keçi 1:2.500 seyreltilmiş, HRP bağlantılı eşek anti-tavşan seyreltilmiş 1:2.500 ve HRP bağlantılı at anti-fare seyreltilmiş 1:10.000 kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uzun epitel hücreleri ve adipositlerin farklılaşması biraraya ve kadherinler2nişan gerektirir bilinmektedir . Biz ve diğerleri, E- veya N-kadherin ve kadherin-11 hücre-hücre adezyon ve nişan gösterdi kültürlü hücrelerin birleşimi ile oluşur, küçük GTPases Rac ve hücre bölünmesi kontrol protein 42 (Cdc42) aktivitesinde dramatik bir artış tetikler ve bu süreç interlökin aktivasyonu yol açar-6 (IL6) aile sitokinler ve Stat3 (sinyal transdüser ve transkripsiyon aktivatör-316,17)1,18,19. Kadherin/Rac/IL6/Stat3 yolunun birçok bileşeni hem farklılaşma hem de neoplastik dönüşüme katılabildiği için, bu iki taban tabana zıt sürecin birbiriyle ilişkililiğinin incelenmesi için moleküler kulplar sağlarlar.
Yukarıda açıklanan teknikleri kullanarak, HC11 hücrelerinde Rac sinyalinin gücü üzerine çarpıcı bir farklılaşma bağımlılığı gösterdi: endojen cRac1 farklılaşma için gerekli iken, ve düşük seviyelerde mutasyona neden olan RacV12 farklılaşma kapasitesinde belirgin bir artışa neden olurken, yüksek RacV12 düzeyleri neoplazi yi tetiklerken dramatik bir farklılaşma bloğunu tetikler (Şekil 1B). Buna karşılık, RacV12 ekspresyonu bile düşük seviyelerde EpH4 hücrelerinde farklılaşma engelledi2. Ayrıca, RacV12 HC1116dahil olmak üzere birçok hücre sistemlerinde Stat3 aktive olsa da, mutasyona neden olan Stat3C neoplastik dönüşüm20indüklerken farklılaşmayı engelledi .
EpH4 hücrelerinin 3Boyutlu matris kültüründeki farklılaşma özelliklerini daha da inceledik. Β-kazin üretimi 8-10 gün olarak zirve ederken, siklin D-1 ekspresyonu KALÇA stimülasyonundan 4-6 gün sonra maksimal di(Şekil 3B). Bu bulgular EpH4 modelinde proliferasyon ve farklılaşma arasında ters bir ilişkiyi desteklemez. Tek tek epitel hücrelerinin konumlandırılmasını belirlemek için DAPI (nükleer) boyama ve konfokal mikroskopi kullanarak, iç hücre ölümünü ve mamografiferlerde içi boş lümen oluşumunu gözlemledik(Şekil 3A,C). Ayrıca, HGF (20 ng/mL) 48 h'de KALÇA ortamına eklenmesinin daha önceki elektron mikroskobu çalışmaları ile tutarlı olarak tübüler yapıların(Şekil 3A,C)oluşumuna yol açtığını gösterdik. EpH4 modelini kullanan bu yaklaşımlar, meme epitelyal diferansiyasyonunun belirli özelliklerinin karakterizasyonuna ve bunların farklı sinyal iletim yolları ile ilişkilendirilmesine olanak sağlar.
Şekil 1: HC11 hücre farklılaşmasının değerlendirilmesi ve nicelliği. (A) HC11 hücrelerinde oluşan ve farklılaşmanın indüksiyonundan sonraki 10 gün içinde GFP-RacV12 seviyelerinin düşük olduğunu ifade eden bir kubbe. Sol: Faz-kontrast; Sağ: Aynı alanın floresan (fotoğraflar daha önce yayınlanmadı). Ölçek çubuğu = 100 μm; Büyütme = 240x; 20x objektif. (B) RacV12'nin HC11 farklılaşması üzerine etkisi: Düşük (şerit 19-24), orta (şerit 13-18) veya yüksek (şerit 7-12) bir RacV12-GFP füzyon yapısı nın seviyeleri HC11 hücrelerinde ifade edildi. 24 saat eGF yokluğunda büyüme sonrasında, hücreler HIP eklenmesi ile ayırt etmek için indüklenen, ya da değil, belirtildiği gibi. Deterjan ekstreleri belirtilen sayıda gün sonra hazırlandı ve yükleme kontrolü olarak β-kazein veya β-aktin için incelendi. Düşük RacV12-GFP ifade hücreleri (şeritler 21-24 vs 3-6) β-kazin dramatik artış ve yüksek RacV12-GFP (şeritler 9-12) ifadesi üzerine dramatik azalma unutmayın. NE = Kontrol kültürleri, EGF yokluğunda yetiştirilen, ancak ayırt etmek için indüklenen değil (Niit ve ark.2, izin ile çoğaltılır). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: 3D matris kültüründe EpH4 hücrelerinin büyümesi için bindirme yöntemi şeması. (A) 6 kuyu plakasının kuyuları başlangıçta 37 °C'de katılamasına izin verilen %100 EHS matrisi ile kaplanmış ve yaklaşık 2-5 mm kalınlığında olan bir jelleştirilmiş bodrum zarı yatağı oluşturmuştur. EpH4 hücreleri% 20 matris ile HIP orta tek hücreli süspansiyon olarak bu yatağa tohumlu edildi. Bu HIP orta% 10 matris ile bindirmeli oldu. %10 matris ortamı iki günde bir değiştirildi. Hücreler çoğaldı ve kültürde 4-5 gün sonra mammospheres oluşturmaya başladı (Protokoller bölümüne bakınız). (B) EpH4 hücrelerinin 2D (monolayer) ve 3D (mammosphere) kültüründeki faz kontrast görüntüleri dijital kamera (300x büyütme) ile donatılmış bir mikroskop kullanılarak çekildi. Her aşamada temsili görüntüler gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: EpH4'ün 3D acinar morfogenezinde 3D kültürdeki olaylar. (A) EpH4 hücreleri matris kaplı 6 kuyu plakası ile yetiştirildi ve Şekil 2'deolduğu gibi tam 3D ortamda muhafaza edildi. Morfogenezin erken evrelerinde hücreler çoğalır, kümeler oluşturur ve iki gruba ayrılır: (1) polarize hücrelerin dış tabakası ve (2) hücre ölümü yapılan düzensiz hücrelerin iç kümesi, daha önce gösterildiği gibi apoptosis karşılık gelen12. İkincisi, faz kontrastlı mikroskopiile görüldüğü gibi mamosferlerin merkezinin kararması ile karakterize içi boş bir lümenin oluşmasına yol açtı. HGF'nin (20 ng/mL) ortama eklenmesi tübüler yapıların oluşmasına neden oldu. HGF'ye bağlı agregaların %60'ından fazlası tübulogenez gösterdi, tedavi edilmeyen kontrol agregalarına kıyasla, ki bu da yoktu. Her aşamada hücrelerin temsili faz kontrast fotoğrafı dijital kamera ile donatılmış bir mikroskop kullanılarak çekildi (300x büyütme; Ölçek çubuğu = 100 μm). Sonuçlar en az üç deneyi temsil eder. Şematik Starova ve ark.22uyarlanmıştır. (B) 3Boyutlu olarak yetiştirilen EpH4 hücreleri belirtilen günlerde hasat edildi. Protein konsantrasyonları normalleştirildi ve eşit protein miktarları (20 g) SDS-PAGE'e tabi tutuldu, ardından Batı lekelenmesi ve belirtilen antikorlarla sonprobing yapıldı. Bir emzirme farebir homojenize meme bezi (MGT) in vivo karşılaştırma olarak kullanılmıştır. p120RasGAP bağımsız yükleme kontrolü olarak kullanılmıştır. Siklin D1 ekspresyonu ilk 3-4 gün boyunca çoğalan hücrelerle çakışan geçici olarak arttı. Buna karşılık β-kazin ekspresyonu 8-10 gün olarak doruğa ulaşabilmekte ve olgun mammospheres oluşumuna karşılık geliyordu. Sonuçlar iki deneyi temsil eder. (C) Mammoferlerin lümen oluşumu ve tübülogenezi, matris kaplı cam kapaklarda yetişen agregalarda nükleer DNA'nın (floresan mavi) DAPI boyanması kullanılarak doğrulandı. Hücreler %3 paraformaldehit, permeabilize 25 g/mL digitonin, nonspesifik bağlanma %3 BSA ile bloke edildi. Hücreler daha sonra DAPI (mavi) ile nükleer DNA için lekeli edildi. Kapaklar bir montaj ortamı kullanılarak cam kaydırakları üzerine monte edilmiştir. Fotomikrograflar orta XY eksenli düzlemde multifoton konfokal mikroskop (Ölçek çubuğu = 100μm) kullanılarak çekilmiştir. B ve C panellerinde yer alan görüntüler Starova ve ark.22'denuyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HC11 hücreleri neoplastik transformasyon ile birlikte farklılaşma çalışmaları için idealdir. Ek bir avantajı HC11 hücreleri kolayca Mo-MLV tabanlı retroviral vektörler ile genlerin çeşitli ifade etmek için enfekte olmasıdır. Elimizde, EpH4 hücreleri HC112daha aynı retroviral vektörleri ile enfekte daha zordu.
Hücreden hücreye temas ve büyüme durması HC11 hücre farklılaşmasıiçin önemli ön koşullardır. Bu nedenle, hücre tabakası arasında tek tip farklılaşma elde etmek için, tohumlama sırasında Petri kabında hücrelerin tek tip dağılımı elde etmek önemlidir. Farklılaşmanın nicelliği isteniyorsa bu özellikle önemlidir. Tripsinizasyon, tek bir hücre süspansiyonu elde edilecek ve hücreler manipülasyonlar nedeniyle canlılığını kaybetmemek için optimize edilmelidir.
Yüksek yoğunlukta yetişen hücreler birbirine güçlü bir şekilde yapışma eğiliminde olduğundan ve onları ayırmak zor olduğundan, deneyen hücreler subenfluent (%50-70) olmalıdır. Hücreleri kurutmaönlemek için, laminar akış kaputunun zeminüzerinde Petri çanak düz aspire, sonra hızlı bir şekilde drenaj için eğmek. Petri kabını kapakla kapatın. Gerekirse, Petri kabını 37 °C'lik bir kuluçka makinesine yerleştirerek tripsinin eylemini hızlandırabilirsiniz.
Hücreler indüksiyonu takip eden 10 gün boyunca çok fazla olduğu için, tükenen besinlerin değiştirilmesi önemlidir. Ortam değiştiğinde, yüksek hücre yoğunluğu nedeniyle plastiğe çok iyi yapışmayan hücrelerin kopmasını önlemek için de dikkatli olunmalıdır. Yine de, deneyimlerimize göre 3T3L123 veya Balb/c3T3 türevleri gibi preadipocytes farklılaştırıcı aksine, iyi bir diferansiye sonuçları elde etmek için fibronektin, kollajen veya CellTak ile kaplı Petri yemekleri kullanmak gerekli değildir.
Lekeleme deneyleri için doğru protein tayini çok önemlidir. Serum proteinleri doku kültürü sınıfı plastik eklemek eğilimindedir çünkü, kazımak ve proteinleri çekmek değil 1.5 mL plastik tüp içinde hücreleri yıkamak ve hücre pelet üzerinde lysis tampon eklemek yerine doğrudan Petri çanak 24 hücreleri lysing önemlidir24.
Protein ekstraksiyonu ile ilgili olarak, tüm yıkama ve lysis çözeltilerini buz gibi tutmak ve Petri kapları veya EpH4 mammospheres boyunca buz üzerinde tutmak çok önemlidir. PBS yıkama kalsiyum yokluğunda kadherinler meşgul değildir ve sonuç olarak Stat3-ptyr705 hızla25defosforile olmasıdır.
HC11 hücreleri için tanımlanan Petri kaplarının büyüklüğü 3-4 Batı lekeleri için yeterlidir (örneğin, Petri kabı başına elde edilen protein miktarı 3 cm çanak başına yaklaşık 50 μg'dir). Protein ekstraksiyonunu kolaylaştırmak için farklılaşma deneyleri için 3 cm Petri çanak kullanmayı tercih ediyoruz. Bunun yerine 6 kuyulu tepsi kullanılırsa, kuyuların geri kalanını steril tutarken soğukta bir kuyudan protein çıkarmak zordur. Ayrıca, CO2 konsantrasyonu farklılaşma için önemlidir ve proteinler tezgah üzerinde bir kuyudan ayıklanır gibi kuyuların geri kalanı için korumak zordur.
Bizim deneyim, preadipocytes farklılaşma aksine23, fetal buzağı serum birkaç çok büyüme yanı sıra HC11 veya EpH4 hücrelerinin farklılaşmasını desteklemek edebiliyoruz. Test edilen bir çok yenidoğan buzağı serumu farklılaşmayı desteklemedi, ancak normal büyümeyi destekleyebilir: hücreler ilk başta farklılaşmaya neden oldu, ancak yenidoğan buzağı serumundaki üç pasajdan sonra ayırt etme yeteneklerini kaybettiler.
HC11 hücrelerinin aksine, EpH4 hücrelerinin farklılaşması çevreleyen 3D matris mimarisine sıkıca bağlıdır. Daha önceki çalışmalardan26,27,28 ve müteakip protein ekstraksiyonu ndan β-kazein üretiminin analizi için 3D kültürde EpH4 farklılaşması için gerekli adımları açıklıyoruz. EHS matrisi düşük sıcaklıklarda (<10 °C) sıvıdır ve daha yüksek sıcaklıklarda katılatır. Normalde -80 °C'de saklanır, ancak çalışan aliquotlar -20 °C'de depolanabilir. Matrisi kullanımdan bir gece önce 4 °C'de, soğutma öncesi doku kültür plakalarını ve pipet uçlarını işlemeden önce -20 °C'de eritin. Protein konsantrasyonunun doğru bir şekilde değerlendirilmesi için, matris protein tayini sonuçlarını şaşırtabilecek protein açısından zengin olduğundan, soğuk PBS yıkama ile ekstraksiyondan önce matrisi tamamen ortadan kaldırmak önemlidir.
Farklılaşma için matris üzerine EpH4 bağımlılığı birden fazla deneysel modelde gösterilmiştir: Reichman ve ark.10, laktojenik hormonlar tarafından indüklenen EpH4 hücrelerinin lamina birikimi ve yoğun sitokeratin ekspresyonu alanlarında β-kazein ürettiğini göstermiştir. Somasiri ve ark.11, yapışıklıklara bağlı küresel formasyon ve ayırıcı süt protein gen ekspresyonu için PI3-kigaz gerekli olduğunu göstermiştir. Ayrıca, Brinkmann ve ark.21, eph4 hücrelerinde transfected HGF cDNA ekspresyonunun 3Boyutlu kültür modelinde spheroidlerin dallanma tübülgenezine bağlı olarak, burada görülen hgf kaynaklı tübül oluşumuna benzer olduğunu göstermiştir (Şekil 3A,C). Bu bulgular meme bezi farklılaşmasını düzenleyen sinyal olayları incelemek için EpH4 hücre hattı modelinin avantajlarını göstermektedir.
EpH4 hücreleri, fetal baldır serumunun %10'dan daha düşük konsantrasyonlarda kaplandığında mamografi de oluşturabilirler. İlginçtir, onlar düşük konsantrasyonlarda mammospheres oluşturabilirsiniz, hatta yokluğunda 20% veya 10% matris, zaman% 100 matris22birtabaka üstüne plakalı ,27. Hücre süspansiyonunda matris yokluğunda, hücrelerin soğutulması önlenir. Ek bir avantaj, tüm hücrelerin tek bir düzlemde bulunmasıdır, böylece fotoğraflamak daha kolaydır.
Önemi: In vivo bir hücrenin fizyolojik durumuna yakın kültürlü hücrelerde Kadherin nişan, Rac / IL6/Stat3 yolu etkinleştirebilirsiniz. Bu epitel hücre farklılaşmasında özellikle önemli olabilir. Açıklanan teknikleri kullanarak, sonuçlarımız hücre çoğalması ve farklılaşma arasındaki dengede merkezi bir belirleyici olarak bu yollardan yayılan sinyalin yoğunluğunu ortaya çıkardı, iki temelde karşıt süreçler2. E-kadherin/Rac/Stat3 ekseninin derinlemesine araştırılması, kanser tedavisi için hedef olarak yararlanılabilecek ifade seviyesine bağlı olarak yolun yeni amfibol bileşenlerini ortaya çıkarabilebilir. Bu tür hedefler için, tam inhibisyon neoplastik fenotip tersine çevirmek için gerekli olmaz. Kısmi inhibisyon bile yararlı olacaktır, kalıntı miktarlar aslında dönüşümü engellemek ve farklılaşmateşvik çünkü. Bu hedef yanı sıra söz konusu tümörün türüne göre değişebilir, RacV12 vs Stat3C farklı davranış gösterildiği gibi, HC11 vs EpH4 hücreleri2,20.
Gelecekteki uygulamalar: Kadherin/Rac/IL6/Stat3 yolu, insan meme mcf10A veya köpek böbrek MDCK29 hücre hatları gibi diğer epitel hücrelerinin farklılaşmasında benzer bir rol oynayabilir, yanı sıra hücre birleşmesi bağlıdır diferansiyasyon diğer türleri, preadipocytes ve myoblastlar gibi30, hangi cadherins farklı ifade. Son olarak, bu teknik Stat531 ve farklıyolların diğer bileşenlerinin rolünün incelenmesi için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir çakışmaları yok.
Acknowledgments
HC11 hücre hattı dr. D. Medina (Houston, TX) tarafından sağlanmıştır. Yazarlar Dr Andrew Craig Queen's Üniversitesi birçok reaktifler ve değerli öneriler için müteşekkiriz. EpH4 hücreleri Dr. C. Roskelley (UBC, Vancouver) tarafından hediye edildi. Colleen Schick 3D kültür çalışmaları için mükemmel teknik yardım sağladı.
Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC), Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri (CIHR), Kanada Meme Kanseri Vakfı (CBCF, Ontario Bölüm), Kanada Meme Kanseri Araştırma İttifakı mali yardım , Ontario Mükemmellik Merkezleri, Meme Kanseri Eylem Kingston (BCAK) ve LR hibe yoluyla Clare Nelson miras fonu minnetle kabul edilmektedir. BE CIHR, CBCF, BCAK ve Kanser Araştırma Derneği A.Ş. PTG bir Kanada Araştırma Başkanı, Kanada Yenilik Vakfı, CIHR, NSERC ve Kanada Kanser Derneği tarafından desteklenir hibe desteği aldı. MN NCIC'den Disiplinlerarası Kanser Araştırmaları Terry Fox Eğitim Programı'ndan bir öğrencilik, Bir Lisansüstü ödülü (QGA) ve Queen's University'den Dekan Ödülü ile desteklenmiştir. MG, ABD Ordusu Meme Kanseri Programı, Ontario Eyaleti Araştırma ve Yenilik Bakanlığı ve Queen's University Danışma Araştırma Komitesi'nden doktora sonrası burslar tarafından desteklendi. VH, CIHR ile işbirliği içinde Terry Fox Vakfı Eğitim Programı'ndan Bir CBCF doktora bursu ve doktora sonrası burs ile desteklenmiştir. Hanad Adan Bir NSERC yaz öğrencilik alıcı oldu. BS, Queen's University lisansüstü ödülü ile desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Acrylamide/0.8% Bis Solution | Bio Rad | 1610154 | Western Blotting |
| Anti-Cyclin D1 antibody | rabbit, Santa Cruz | sc-717 | Western Blotting |
| Anti-p120 antibody | mouse, Santa Cruz | sc-373751 | Western Blotting |
| Anti-β actin antibody | mouse, Cell Signalling technology | 3700 | Western Blotting |
| Anti-β casein antibody | goat, Santa Cruz Biotechnology | sc-17971 | Western Blotting |
| Aprotinin | Bio Shop | APR600 | Lysis Buffer |
| Bicinchoninic Acid Solution | Sigma | B9643-1L-KC | Protein Determination |
| Bovine serum albumin | Bio Shop | ALB007.500 | Protein Determination |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad | 170-5061 | Western Blotting |
| Copper(II) sulphate | Sigma | C2284-25ML | Protein Determination |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | Staining |
| Digitonin | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 14952-500 | Staining |
| EDTA | Bio Shop | EDT001.500 | |
| Epidermal Growth Factor | Sigma | E9644 | Medium for HC11 Cells |
| Fetal calf serum | PAA | A15-751 | Cell Culture Medium |
| Goat- Anti Rabbit-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | Western Blotting |
| Hepatocyte Growth Factor recombinant | Gibco | PHG0321 | |
| Hepes | Sigma | 7365-45-9 | Cell Culture |
| Horse Anti-Mouse HRP | Cell Signalling Technology | 7076 | Western Blotting |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | HIP Medium |
| insulin | Sigma | I6634 | HIP Medium |
| Laminar-flow hood | BioGard Hood | Cell Culture | |
| Leupeptin | Bio Shop | LEU001.10 | Lysis Buffer |
| Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel) | Corning | CACB 354230 | |
| Mouse Anti-Goat HRP | Santa Cruz | sc-8360 | Western Blotting |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 475904-100GM | Staining |
| Multi-photon confocal microscope | Leica TCS SP2 | ||
| Na3VO4 | Bio Shop | SOV850 | Lysis Buffer |
| Na4P207 | Sigma | 125F-0262 | Lysis Buffer |
| NaCl | Bio Shop | SOD001.1 | Western Blotting |
| NaF | Fisher Scientific | 7681-49-4 | Lysis Buffer |
| Nikon digital Camera | Coolpix 995 | ||
| Nitrocellulose | Bio Rad | 1620112 | Western Blotting |
| NP-40 | Sigma | 9016-45-9 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | Staining |
| Phase Contrast Microscope | Olympus IX70 | Cell Culture | |
| Phenylmethylsuphonyl fluoride | Sigma | 329-98-6 | Lysis Buffer |
| pMX GFP Rac G12V | Addgene | 14567 | |
| Prolactin | Sigma | L6520 | HIP Medium |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | Cell Culture Medium |
| Tissue Culture Dish 35 | Sarstedt | 83.3900. | Cell Culture |
| Tissue Culture Plate-24 well | Sarstedt | 83.1836.300 | Cell Culture |
| Transfer Apparatus | CBS Scientific Co | EBU-302 | Western Blotting |
| Tris Acetate | Bio Shop | TRA222.500 | Western Blotting |
| Trypsin | Sigma | 9002-07-7. | Cell Culture |
| Tween-20 | Bio Shop | TWN510.500 | Western Blotting |
| Veritical Gel Electrophoresis System | CBS Scientific Co | MGV-202-33 | Western Blotting |
References
- Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation. Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).
- Niit, M., et al. Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis. Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).
- Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line. The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).
- Humphreys, R. C., Rosen, J. M. Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function. Cell growth & differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).
- Merlo, G. R., et al. differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors. European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).
- Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation. Journal of Cell Science. 108, Pt 6 2445-2456 (1995).
- Arbeithuber, B., et al. Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation. BioMed Research International. 2015, 460598 (2015).
- Morrison, B., Cutler, M. L. Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation. Journal of Visualized Experiments. (32), e1265 (2009).
- Merlo, G. R., et al. Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53. Oncogene. 9, 443-453 (1994).
- Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally. Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).
- Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation. Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).
- Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).
- Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression. Breast Cancer Research. 11 (3), 26 (2009).
- Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 34 (6), 468-477 (1998).
- Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands. PLoS One. 8 (6), 65127 (2013).
- Arulanandam, R., et al. Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3. Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).
- Geletu, M., et al. Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis. BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).
- Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases. Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).
- Raptis, L., et al. Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement. Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).
- Niit, M., et al. Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3. Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).
- Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells. Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).
- Starova, B. Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis. , Queen's University. M.Sc. Thesis (2008).
- Raptis, L., et al. Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner. Cell Growth & Differentiation. 8, 11-21 (1997).
- Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells. Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).
- Vultur, A., et al. Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells. Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Hoskin, V. C. A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis. , Queen's University. Ph.D. Thesis (2015).
- Su, H. W., et al. Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression. Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).
- Ostrovidov, S., et al. Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).
- Cass, J. Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation. , Queen's University. Ph.D. thesis (2013).
