Da verpflichtende anaerobe Organismen bei Sauerstoffexposition nicht wachsen können, ist der Einsatz anaerobe Kultivierungstechniken unerlässlich. Hier zeigen wir eine einfache und effektive Methode zur Kultivierung einer Mischkultur aus einer Biogasanlage von der Medienaufbereitung bis zur Gas- und Fettsäurequantifizierung.
Im Gegensatz zu aeroben Organismen erfordern streng anaerobe Mikroorganismen das Fehlen von Sauerstoff und in der Regel ein geringes Redoxpotenzial, um Wachstum zu initiieren. Da Sauerstoff in der Luft allgegenwärtigist, ist die Beibehaltung der O2-freien Bedingungen bei allen Kultivierungsschritten eine Herausforderung, aber eine Voraussetzung für die anaerobe Kultivierung. Das hier vorgestellte Protokoll zeigt den erfolgreichen Anbau einer anaeroben Mischkultur aus einer Biogasanlage mit einer einfachen und kostengünstigen Methode. Eine genaue Beschreibung des gesamten anoxischen Kultivierungsprozesses wird gegeben, einschließlich Der Medienvorbereitung, Deminfüllung von Kultivierungskolben, Supplementierung mit Redox-Indikator und Reduktionsmitteln, um niedrige Redoxpotentiale zu bieten sowie den Kopfraum auszutauschen, um sauerstofffrei. Darüber hinaus wird ein detaillierter Überblick über aseptisch impfende gasdichte Serumkolben (mit sterilen Spritzen und Nadeln) und geeignete Inkubationsbedingungen gegeben. Das vorliegende Protokoll befasst sich ferner mit Gas- und Flüssigkeitsproben für nachfolgende Analysen zur Gaszusammensetzung und flüchtigen Fettsäurekonzentrationen mittels Gaschromatographie (GC) bzw. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) bzw. Berechnung der Biogas- und Methanausbeute unter Berücksichtigung des idealen Gasgesetzes.
Auf der Erde ist molekularer Sauerstoff in bemerkenswerten Konzentrationen in Bereichen mit direktem Kontakt mit der Atmosphäre oder in Gegenwart von sauerstoffhaltigen Phototrophen verfügbar. Umgebungen, in denen Sauerstoff fehlt, werden anaerobe genannt. Die Energieumwandlung ist jedoch unter anaeroben Bedingungen über zwei verschiedeneStoffwechselprozesse, Fermentation und anaerobe Atmung 1, weiterhin möglich.
Während Organismen, die sich einer aeroben Atmung unterziehen, Sauerstoff als Terminalelektronenakzeptor verwenden, erfordert die anaerobe Atmung alternative Elektronenakzeptoren wie Nitrat oder Sulfat2. Im sogenannten “Elektronenturm” sind Redoxpaare nach ihrem Redoxpotential organisiert, wobei sich die negativsten an der Spitze (Elektronenspender) und die stärksten Oxidationsmittel mit positivem Redoxpotenzial am Boden (Elektronenakzeptoren) befinden. Der Elektronentransfer zwischen Spendern und Akzeptoren führt über die sogenannte Atemkette zur Energieeinsparung und Elektronen können von Elektronenakzeptoren – um im Bild zu bleiben – in verschiedenen Stockwerken des Turms eingefangen werden. Je höher der Fall der Elektronen durch den Elektronenturm, desto mehr Energie kann durch die jeweilige Reaktion konserviert werden. Daher ist die Atmung auch in anaeroben Lebensräumen möglich, z.B. mit Redoxpaaren wie NO3–/NO2–, Fumarsäure/Bernsteinsäure, SO32-/H2S, S°/H2S, Mn(IV)/Mn(II ), Fe(III)/Fe(II)2,3. Zunächst wird die resultierende Energie als Membranpotential konserviert, das anschließend durch Elektronentransportphosphorylierung zur Adenosin-Triphosphat-Synthese (ATP) durch membrangebundene ATP-Synthasen genutzt wird. Im Gegensatz zur aeroben Atmung kann die Energiemenge, die durch anaerobe Atmung konserviert werden kann, drastisch reduziert werden; jedoch ist die Energieleistung der meisten anaeroben Reapirationen noch höher als bei der Fermentation, einem anaeroben Energiesparpfad in Lebensräumen ohne Sauerstoff und anderen Terminalelektronenakzeptoren2.
Während der Fermentation werden energiereiche, organische Substrate zu verschiedenen Fermentationsprodukten abgebaut, die oft den Namen des Gesamtprozesses definieren, z. B. die alkoholische Fermentation. Im Gegensatz zu Atmungsprozessen beschränkt sich die ATP-Erzeugung während der Fermentation auf die Phosphorylierung auf Substratebene, bei der eine Phosphatgruppe von einem energiereichen phosphorylierten Substrat2auf Adenosin-Di-Phosphat (ADP) übertragen wird. Fermentierende Mikroorganismen spielen eine zentrale Rolle beim anaeroben Abbau organischer Stoffe, da sie Schlüsselfaktoren beim Substratabbau sind. Die primären Fermentationsprodukte, wie organischeSäuren, Alkohole, CO2 und H2, können anschließend von sekundären Fermentmikroorganismen zur Herstellung von Essigsäure, CO2 und H2 verwendet werden. Beispiele für Fermentationsprodukte sind Milchsäure, verschiedene flüchtige Fettsäuren (Formic-, Essig-, Propion-, Butyric-, Baldriansäure), n-Butanol, 2,3-Butandiol, Aceton und Ethanol.
Die Kultivierung von Mikroorganismen unter streng anaeroben Bedingungen erfordert völlig andere Methoden und Ausrüstungen als die Kultivierung von aeroben Organismen. Während sauerstofftolerante Organismen oft auf Agargerichten, sogenannten Oberflächenkulturen, kultiviert werden, ist dies – bis auf wenige Ausnahmen – für streng anaerobe Mikroorganismen kaum möglich. Daher werden Anreicherungskulturen streng anaeroben Mikroorganismen hauptsächlich in flüssigen Medien hergestellt, die Kulturgefäße auftragen, die mit gasdichten Septen versiegelt sind, die eine sauerstofffreieKopfraumatmosphäre4,6, 7.
Die aktuelle Protokollbeschreibung wird geeignete Anbaumethoden für Zielmikroorganismen einer gemischten Population aus einer anaeroben Biogasanlage enthalten. Die Isolation und Kultivierung reiner Kulturen ist noch schwieriger, aber nicht Teil dieser Arbeit.
Hier zeigen wir das Verfahren zur Kultivierung einer anaeroben mikrobiellen Gemeinschaft auf der Grundlage einer Studie über die Bildung von Phenylsäuren während der anaeroben Verdauung von proteinhaltigen Substraten8. Die mikrobielle Gemeinschaft bestand aus Mitgliedern aus allen vier Phasen der anaeroben Verdauung: Hydrolyse, Säuerung, Acetogenese und Methanogenese. Ein Mineralsalzmedium, ergänzt durch eine Kohlenstoffquelle, Redox-Indikator, Vitamin- und Spurenelementlösung, und Reduktionsmittel wurdeangewendet 9. Das Medium wurde mit den jeweiligen proteinhaltigen Phenylsäurevorläufersubstraten8geändert.
Der wichtigste und wichtigste Schritt bei der Kultivierung anaeroben Mikroorganismen ist die Gewährleistung sauerstofffreier Bedingungen in Kultivierungsmedien und im Kopfraum von Kolben. Ein Indikator wie Resazurin kann verwendet werden, um indirekt die korrekte anaerobe Füllung der Kolben zu überprüfen. Resazurin ist ein häufig verwendeter Redoxfarbstoff, da er kostengünstig, ungiftig und bereits in niedrigen Dosen und kurzen Inkubationszeiten 12wirksam ist. Bei Der Verwendung in die Medien erfährt das blau gefärbte Resazurin zunächst einen irreversiblen Reduktionsschritt zum Resorufin, das bei neutralen pH-Werten rosa ist. Diese erste Reaktion kann auftreten, wenn die Medien erhitzt werden 13. Anschließend wird Resorufin in einer reversiblen Sekundärreaktion auf farbloses Dihydroresorufin reduziert (Abbildung 7)12. Das Resorufin/Dihydroresorufin Redoxsystem wird bei einem Standard-Oxidationsreduktionspotential von etwa Eh = -110 mV völlig farblos und wird über einem Redoxpotential von -51 mV 13rosa.
Um beispielsweise das Redoxpotenzial weiter zu reduzieren, um das Wachstum methanogener Mikroorganismen zu erleichtern, die bekanntermaßen weniger als -200 mV14benötigen, kann eine Na2S-Lösung hinzugefügt werden. Alternativ werden häufig Cystein-HCl, Natriumthioglycolat oder Natriumdithionit verwendet. Welches Reduktionsmittel für den Einsatz geeignet ist, hängt jedoch vom jeweiligen Versuchsaufbau ab und kann besondere Aufmerksamkeit erfordern. Natriumthioglycolat benötigt beispielsweise eine Temperaturaktivierung (z. B. durch Autoklavieren).
Ein ausgewogenes mikrobielles Konsortium, bestehend aus verschiedenen Gattungen von Bakterien und Archaeen, und eine effizient funktionierende anaerobe Abbaukaskade können weiter bewertet werden, indem die Kopfraumgaszusammensetzung in den Kulturkolben über Gas bestimmt wird. Chromatographie. Beim Umgang mit Verbindungen wie Phenylsäuren aus verschiedenen Vorläufern ist die Beurteilung des Kopfraums eine schnelle Möglichkeit, den Methanogenese-Prozess zu überprüfen8. Eine Kopfraum-CH 4-Konzentration von ca. 50-60% in den Kontrollen am Ende der Inkubationszeit deutet auf eine erfolgreiche Nutzung der aufgetragenen Nährstoffe und damit auf eine Mineralisierung organischen Materials unter anaeroben Bedingungen hin. Die theoretische Methanproduktion und die zu erwartenden Methankonzentrationen während des Verdauungsprozesses können ex ante nach der Buswell-Boyle-Gleichung nach elementarer Analyse des Substrats oder durch Abschätzung des Kohlenhydrate, Proteine und Fette im Substrat. Laut VDI 4630 15können Kohlenhydrate zu einer theoretischen Biogasproduktion von 750 L kg-1 VSS (50% CH4 und 50% CO2), Proteinen bis 800 L kg-1 VSS (72% CH4 und 28 % CO2) und Fetten bis 1.390 L kg führen. -1 VSS (60% CH4 und 40% CO2).
Darüber hinaus wurden die Bildung und der mögliche nachfolgende Abbau von VFA und Phenylsäuren überwacht. Der Abbauprozess kann durch Analyse der VFA-Konzentrationen (z.B. Acetat, Propionat) zu verschiedenen Zeitpunkten ausgewertet werden. Die Anhäufung von kurzkettigen Fettsäuren wie Acetat und/oder Propionat kann auf Störungen in der methanogenen Gemeinschaftszusammensetzung und auf eine Gesamtüberlast des Reaktors hinweisen. Eine ausgewogene mikrobielle Abbaukaskade kann jedoch sogar mit sehr hohen VFA- und Acetatkonzentrationen9zurechtkommen. Außerdem könnte das Acetat/Propionat-Verhältnis weitere Informationen über den Gesamtreaktorzustand16liefern. Es gibt jedoch viele Parameter, die für die Prozessüberwachung geeignet sind und gemäß den vorgeschlagenen experimentellen Hypothesen ausgewählt werden müssen. Im vorliegenden Beispiel waren die Zielvariablen die Phenylsäurekonzentrationen (Abbildung 6).
The authors have nothing to disclose.
Diese Forschung wurde vom Wissenschaftsfonds (FWF) gefördert: die Projektnummern P 29360 und P 29143. Die Veröffentlichung wurde vom Publikationsfonds der Universität Innsbruck unterstützt. Wir würdigen die EIG sehr.
culture flasks (120 mL, N20) | Ochs, Germany | 102046 | |
buty rubber septa (N20) | Ochs, Germany | 102049 | |
aluminium caps (N20) | Ochs, Germany | 102050 | |
N2 gas | Messer, Austria | purity 5.0 | |
syringes + cannulae | various | ||
crimper | Ochs, Germany | 102051 | |
de-crimper | Ochs, Germany | 102052 | |
GC2010 | Shimadzu | ||
Shin-carbon GC column | Restek | chromatographic separation of H2, O2, CH4, and CO2 | |
HPLC Prominence | Shimadzu | ||
Fast Fruit HPLC Column | Phenomenex | chromatographic separation of VFAs, phenyl acids, etc. |