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Biochemistry

厳密嫌気性/無酸素条件下での微生物の培養のための培地製剤

doi: 10.3791/60155 Published: August 15, 2019
* These authors contributed equally

Summary

酸素曝露時に嫌気性生物が成長できないため、嫌気性培養技術の利用が不可欠です。ここでは、培養製剤からガス、揮発性脂肪酸定量にバイオガスプラント由来の混合培養物を培養する簡単かつ効果的な方法を示す。

Abstract

好気性生物とは対照的に、厳密に嫌気性微生物は酸素の不在を必要とし、通常は成長を開始する低い酸化還元電位を必要とします。酸素は空気中でユビキタスであるので、栽培のすべてのステップの間にO2-フリー条件を保持することは困難ですが、嫌気性培養のための前提条件です。ここで提示されるプロトコルは、簡便で安価な方法を用いてバイオガスプラントに由来する嫌気性混合培養物の栽培の成功を示す。メディア調製、栽培フラスコの充填、酸化還元指標の補充、低酸化還元電位を提供する還元剤の削減、ヘッドスペースの交換など、無電酸培養プロセス全体の正確な説明が与えられています。酸素のないメディア。さらに、無菌接種ガスタイトな血清フラスコ(無菌注射器および針を用いて)および適切なインキュベーション条件の詳細な概要が提供される。本プロトコルは、ガスクロマトグラフィー(GC)及高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)および高性能液クロマトグラフィー(HPLC)を用したガス組成および揮発性脂肪酸濃度に関するその後の分析に関するガス及び液体サンプリングに関する更に、かつ、理想的なガス法を考慮したバイオガスとメタン収量の計算。

Introduction

顕著な濃度の地球上の分子酸素は、大気と直接接触する領域または酸素フォトトロフの存在下で利用可能である。酸素が存在しない環境を嫌気性と呼びます。しかし、エネルギー変換は、2つの異なる代謝プロセス、発酵および嫌気性呼吸1を介して嫌気性条件下で依然として可能である。

好気性呼吸を受けている生物は末端電子受入器として酸素を使用していますが、嫌気性呼吸には硝酸塩や硫酸塩2のような代替電子受入器が必要です。いわゆる「電子タワー」では、レドックスカップルは、最も負の値が最も上に位置し(電子ドナー)、最も強い酸化剤が底部に正の酸化還元電位を有する(電子受入器)、その酸化物の電位に応じて組織されています。ドナーと受容者の間の電子移動は、いわゆる呼吸鎖を介して省エネにつながり、電子は電子受容器によって捕捉され、写真の中にとどまることができます。これにより、電子塔を通る電子の落下が高いほど、それぞれの反応によってより多くのエネルギーを節約することができます。したがって、嫌気性の生息地では呼吸も可能で、例えば、NO3-/NO2-、フマル酸/コハク酸、SO32-/H2S、S°/H2S、Mn(IV)/Mn(II)を含む酸化還元対を含む。)、Fe(III)/Fe(II)2,3.第1に、得られたエネルギーは膜電位として保存され、その後、膜結合ATP合成によるアデノシン三リン酸(ATP)合成のための電子輸送リン酸化によって使用される。好気性呼吸とは対照的に、嫌気性呼吸によって保存できるエネルギーの量は劇的に減少することができる。しかしながら、ほとんどの嫌気性呼吸のエネルギー出力は、発酵に比べて依然として高く、酸素および他の末端電子受入器2を欠いている生息地における嫌気性省エネセプターパスである。

発酵中、エネルギーが豊富な有機基質は、アルコール発酵など、全体的なプロセスの名前を定義することが多い様々な発酵産物に分解されます。呼吸プロセスとは対照的に、発酵中のATP生成は、リン酸基がエネルギー豊富なリン酸化基質2からアデノシン-二リン酸(ADP)に移される間の基質レベルのリン酸化に限定される。発酵微生物は、基質分解のキープレーヤーである有機物の嫌気性分解において中心的な役割を果たします。一次発酵産物は、有機酸、アルコール、CO2、およびH2のような、その後、酢酸、CO2、およびH2を産生する二次発酵微生物によって使用することができる。発酵産物の例としては、乳酸、各種揮発性脂肪酸(フォーミック、酢酸、プロピオン酸、ブチリック、バレリン酸)、n-ブタノール、2,3-ブタンジオール、アセトン、エタノールが挙げられる。

厳密に嫌気性条件下での微生物の栽培は、好気性生物の栽培と比較して全く異なる方法と設備を必要とします。酸素耐性生物は寒天料理、いわゆる表面培養物で栽培されることが多いが、これはいくつかの例外を除いて、厳密に嫌気性微生物にはほとんど不可能である。したがって、厳密に嫌気性微生物の濃縮培養は、主に酸素のないヘッドスペース雰囲気4、6を確保する気密性の高いセプタで密封された培養容器を適用する液体媒体で確立されています。7.

現在のプロトコルの説明は、嫌気性バイオガスプラントに由来する混合集団の標的微生物に対して適切な栽培方法を提供する。純粋な文化の孤立と育成はさらに困難ですが、この仕事の一部ではありません。

ここでは、タンパク質属基質の嫌気性消化中のフェニル酸の形成に関する研究に基づいて嫌気性微生物コミュニティを培養する手順を示す8.微生物コミュニティは、嫌気性消化のすべての4つの段階からのメンバーで構成されていました:加水分解、酸性化、アセトジェネシス、およびメタノジェネシス。炭素源、酸化還元指標、ビタミン及び微量元素溶液を補充したミネラル塩培地、及び還元剤を塗布した9.培地をそれぞれのタンパク質性フェニル酸前駆体基質8で改定した。

Protocol

1. 培地の調製

  1. レドックス指標ストック溶液(レサズリン/100mL水溶液の0.1g)を調調します。
  2. ビタミン溶液を調ます(表1)。
  3. トレース要素ソリューションを準備します (2)。
    注: 追加の順序は重要です。表 2および各プロトコルを参照してください。
  4. 還元剤ストック溶液(60gNa2S/L水溶液)を調記する。
  5. 中成分(ミネラル塩培地、表3)を適切なフラスコ(例えば、1Lスクリューキャップラボフラスコ)で計量する。
    注:実験の組み立てによっては、別の炭素源を追加する必要がある場合があります。
  6. 蒸留水(表3)の半分の量を追加し、材料を溶解します。
  7. 表 3に従って、1 mL のレドックスインジケーター ソリューションを追加します。
  8. 表 3に従ってビタミンおよび微量元素溶液を追加します。
  9. 表 3の中/生物の要件に従って pH を調整します。
    注:レドックス指標の色はpH依存であり、調整に時間がかかる場合があります。
  10. 蒸留水で1Lの最終容積に持って来なさい。
    注:ビタミンおよび微量元素溶液は、フィルター殺菌アリコート(希釈液、フィルター細孔サイズ<0.2 μm)を以前に閉じたオートクレーブ処理された血清フラスコに無菌的に添加することによっても追加できます。しかし、このアプローチは汚染のリスクが高い。

2. 栽培フラスコの充填

  1. 十分にきれいで、乾燥した120 mLの血清フラスコ。
    注:血清フラスコは異なった容積容量(例えば、20、60、120、250 mL)で利用できる。
  2. 徹底的にきれいなと乾燥ブチルゴムセプタ。
  3. 栽培フラスコ中の追加の培地成分(例えば、フェニル酸前駆体基質)を計量する。
    注: 追加のコンポーネントは、実験の設定と仮説によって異なります。
  4. 血清フラスコに50mLの培地を充填します。

3. 液体相における酸素の還元/除去

  1. ~100°Cの水風呂を準備します。
  2. 水浴中に充填された血清フラスコをセットし、液相中のO2の溶解度を低減するために約20〜30分間インキュベートする。
  3. N2ガスでヘッドスペースを直ちにフラッシュするか、N2/CO2のような他のガスまたはガス混合物でフラッシュします。
    注意:適切な部屋の換気の世話をします。
  4. ブチルゴムセプタでフラスコを閉じ、アルミキャップで固定します。
    注:ゴムセプタは、多くの場合、それを掘削しながら、水/媒体の滴を追加することにより、フラスコの首にフィットする可能性があります。
  5. 還元剤(ストック溶液)を各フラスコに0.1mL添加し、50mLの培地で満たされた各フラスコに酸化還元電位(培地の50mL当たり還元剤の0.1mL)をさらに低減する。
  6. 121 °Cで20分のオートクレーブ。
    注意:閉鎖された容器の殺菌のために証明されるオートクレーブは使用されなければならない。そうしないと、温度上昇に起因する過圧によって血清フラスコが爆発する可能性があります。

4. 培地の接種

  1. 嫌気性消化器から接種を準備します。
    1. 400mLの蒸留水をフラスコに入れ、沸騰させます。
    2. N2でヘッドスペースを恒久的にフラッシュしながら、それを冷却します (< 30 °C)
    3. 嫌気性消化器由来の汚泥を約100g加えます。
      注:酸素とスラッジの過度の接触を避けてください。
    4. 希釈の正確な決定のために追加されたスラッジの正確な質量を記録します。
    5. フラスコのヘッドスペースをN2と交換し、ブチルゴム中隔で閉じます。
    6. フラスコを120rpmで30分間振ります。
  2. 注射器+カニューレを使用して5mLの接種を取り除き、ステップ1-3に記載されているように調製血清フラスコに注入する。

5. インキュベーション、サンプリング、解析

  1. 接種された血清フラスコを、それぞれの実験に適した温度でインキュベートする。
    注:インキュベーション温度は、実験セットアップと使用される接種に依存します。
    1. 注射器+カニューレを用いて温度上昇に起因するドレイン過圧は、血清フラスコ中の液体がインキュベーション温度(インキュベーション温度に応じて約15~30分)に平衡化した場合に及ぶ。
      注意:適用された基板に応じて、その濃度、温度、インキュベーション時間、接種タイプおよび濃度、フラスコ内の過圧は>2棒圧力まで上昇し、血清の剥離が爆発する可能性があります。したがって、圧力計を使用して過圧を監視し、その後カニューレで過圧を排出することは必須です。
  2. インキュベーション時間中にバイオガスの生産と組成を評価します。
    注:インキュベーション期間は数日から数週間に及ぶことができます。
    1. 現在の大気圧を記録します。
    2. マノメーターを準備し、微生物活性に由来するフラスコ内の圧力を評価します。
    3. フラスコを振ります。
    4. 注射器+カニューレを使用してヘッドスペースガスの1 mLを除去し、ガスクロマトグラフィーを介してH2、O2、CH4、および/またはCO2濃度を測定します。
      注:H2、O2、CH4、およびCO2の認定および定量のために、ガスクロマトグラフを使用して、160°C(カラムオーブン)、100°C(インジェクタ)、および180°C(熱伝導性検出器、TCD)の動作温度を適用しました。).N2はキャリアガスとして用いられた。詳細については、以前の研究10を参照してください。
  3. 揮発性脂肪酸(VFA)およびフェニル酸の濃度を監視します。VFAおよびフェニル酸分析では、移動相として5mM H2 SO4で実行されるUV検出器(220nm)を搭載したHPLCシステムを使用します。メソッドの詳細とサンプルストレージに関する追加情報については、以前の研究11を参照してください。
    注:VFAの分析は、他の多くの物理化学分析や顕微鏡評価の例示です。また、実験のある時点における微生物の特定の微生物および/または組成物の豊富さを標的とする分子生物学的方法は、記載された手順を用いて適用することができる。
    1. 注射器+カニューレで1mLの液体を取り除きます。
      注:サンプルは、撤退直後に凍結(-20°C)し、実験11の終了時に分析することができる。
    2. 15,000~20,000 x gの遠心分離機を使用し、0.2 μm RC(再生セルロース)フィルタを通過します。
    3. HPLCシステムに5-20 μLを注入し、VFA組成物とフェニル酸の濃度を分析します。
  4. カニューレを使ってフラスコの過圧を排水する。
    注:圧力とガス組成を決定し、必要なサンプルを採取した後、栽培フラスコをそれぞれの温度に戻し、液体がインキュベーション温度を達成する前に過圧を排出しないでください。
  5. 方程式1-3を使用して理想的なガス法則を考慮して、バイオガスおよびメタン産生VCH4Nを計算する。表4も参照してください。
    方程式 1:Equation 1
    という
    方程式 2:Equation 2
    そして
    方程式 3:Equation 3
    注:バイオガスの総生産量の計算では、式2および3のCH4%およびCH4%Xの量を100に設定する必要があります。NmL:標準化された条件下での正規化ガス容積(0°C、1 atm)、その下でモルガス容積は22.414 NmL/mmolである。

Representative Results

栽培フラスコは、上述のプロトコルに従って嫌気性条件下で培地を充填し、適切な色(図1)を確認し、嫌気性消化を行うミニチュアバッチバイオリアクターとして使用した。これらは、フェニル酸形成を引き起こす可能性のある基板で修正し、嫌気性消化器スラッジを接種剤としてインキュベートした(図2)。トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、ならびに複雑なタンパク質前駆体肉エキスおよびカゼインをそれぞれ2および3つの異なる濃度で適用した。コントロールは、追加の基質補充なしで調製した。過負荷の異なる段階のシミュレーションを目的とした異なる基板濃度。フラスコを37°C(中聞酸)で4週間インキュベートした。

バイオガスの製造および組成物(H2、CH4、CO2)は、ガスクロマトグラフィー(GC TCD)10およびヘッドスペース圧力の評価を介して定期的にモニタリングした。図3は、嫌気性インキュベーションの4週間の間に様々な濃度で適用された基質の消化に由来する累積メタン産生の違いを示す。また、メタノゲンは、メタノジェネシスにおける電子キャリアであるコエンザイムF420を照射して可視化し、最大420nmの吸収を有する青緑色蛍光を示した(図4)。

ガス分析と並行して、HPLC11を介したVFAおよびフェニル酸濃度測定用のサンプルを撤回し、さらなる処理まで凍結保存した。図5は、アセテートに例示的に描写された高度に過負荷されたサンプルの蓄積によって反映される過負荷の異なる段階の効果を示す。図6は、インキュベーション期間中の酢酸フェニル濃度のダイナミクスを示す。

Figure 1
図1:レドックス指標。栽培フラスコにおける正しい酸化還元電位は、酸化還元指標を添加することによって制御することができる。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:ミニチュアバッチバイオリアクター。嫌気性消化実験用の120mL栽培フラスコで調製したミニチュアバッチバイオリアクター。フラスコを培地で充填し、希釈消化器スラッジで接種した。原子炉は、ブチルゴムストッパーとアルミニウムキャップでガスを密閉した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:メタン生産。異なる過負荷条件(低、中、高)を反映する反応器からの中親和性インキュベーションの28日間の累積メタン産生。コント:コントロール。トリプ: トリプトファン;Tyr: チロシン;フェヘ: フェニルアラニン;ME: 肉エキス;Cas:カゼイン。これは、以前の研究8に由来する修正された図です。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:蛍石化メタノーゲン。メタノゲンは、紫外線で励起されると青みがかった光を放つ。ここで、メタノゲンは植物粒子(薄緑色)に付着している。サンプルをバッチ反応器から採取し、顕微鏡検査のために希釈し、直ちに分析した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:アセテート濃度。異なる過負荷条件(低、中、高)を反映する反応器中の中腹インキュベーションの28日間の酢酸濃度。コント:コントロール。トリプ: トリプトファン;Tyr: チロシン;フェヘ: フェニルアラニン;ME: 肉エキス;Cas:カゼイン。これは、以前の研究8に由来する修正された図です。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:フェニルラセテート濃度。異なる過負荷条件(低、中、高)を反映する反応器中の中球状インキュベーションの28日間のフェニルラセテート濃度。コント:コントロール。トリプ: トリプトファン;Tyr: チロシン;フェヘ: フェニルアラニン;ME: 肉エキス;Cas:カゼイン。これは、以前の研究8に由来する修正された図です。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 7
図7:レサズリン反応。青色のレサズリンは、Resorufin(ピンク)に不可逆的な減少を受け、ウザルスキら12によると無色ジヒドロレソルフィンに対する更なる可逆的な減少を受ける。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

シアノコバラミン 0.050グラム
4-アミノ安息香酸 0.050グラム
D-ビオチン 0.010グラム
ニコチン酸 0.100グラム
ピリドキシン 0.250グラム
Dパントテイン酸 0.025グラム
塩化チアミニウムHCl 0.18グラム
蒸留水 1000 mL

表1:ビタミン溶液。

25% (w/v) HCl 10.0メートル
FeCl2 x 4 H2O 1.50グラム
ZnCl2 0.070グラム
MnCl2 x 4 H2O 0.100グラム
H3BO3 0.006グラム
コクル2 x 6 H2O 0.190グラム
CuCl2 x 2 H2O 0.002グラム
ニクル2 x 6 H2O 0.024グラム
Na2MoO4 x 2 H2O 0.036グラム
蒸留水 990.0メートルのメートル
準備の推奨事項 HClを追加し、FeCl2を溶解し、100 mLの蒸留水を追加し、他の成分を溶解し、1000 mLまで作ります。

表 2: トレース要素ソリューション。

塩化 ナトリウム 1.0グラム
MgCl2 x 6 H2O 0.4グラム
KH2PO4 0.2グラム
Kcl 0.5グラム
CaCl2 x 2 H2O 0.15グラム
L-システイン 0.5グラム
酵母エキス 1.0グラム
レサズリン溶液 1 mL
ビタミン溶液 1 mL
トレース要素ソリューション 1 mL
蒸留水 1000 mL
博士 7.2

表3:塩分を最小限に抑える。

変数 ユニット 説明
tY [d] 測定の時間
tX [d] 前の測定のタイムポイント
pM [mbar] tYでの過圧の測定
pA [mbar] tYの周囲圧力
pAX [mbar] tXの周囲圧力
pS [mbar] 標準圧力、 1013,25 mbar acc. DIN 1343
TI [K] インキュベーション温度
TS [K] 標準温度、 273,15 K (0° C に相当) acc. DIN 1343
VH [ml] tYのヘッドスペースボリューム
VHX [ml] tXのヘッドスペース・ボリューム
CH4% [vol%] tYでのGC測定によるメタン濃度
CH4%X [vol%] tXのGC測定によるメタン濃度
VCH4T [Nml] tYの血清ボトル中の総メタン量
VCH4R [Nml] tXのヘッドスペース内の残留メタン量
VCH4N [Nml] 新たに生成されたメタンをtXからtY

表 4: 式 1 - 3 の変数の説明。

Discussion

嫌気性微生物を培養する上で最も重要かつ重要なステップは、栽培培地およびフラスコのヘッドスペースにおける無酸素状態を確保することです。レサズリンのような指標は、フラスコの正しい嫌気性充填を間接的にチェックするために使用することができます。レサズリンは、安価で非毒性であり、低用量および短いインキュベーション時間12で既に有効であるとして一般的に使用される酸化物色素である。メディアに組み込まれると、青色のレサズリンは、まず、中性pH値でピンク色であるレソルフィンに不可逆的な還元ステップを受けます。この最初の反応は、メディアが加熱されたときに発生する可能性があります 13.続いて、レソルフィンは、可逆二次反応において無色ジヒドロ反応に還元される(図7)12。レソルフィン/ジヒドロレソルフィンレドックスシステムは、E=-110 mV程度の標準的な酸化還元電位で完全に無色になり、-51 mV 13の酸化電位の上にピンク色に変わります。

酸化還元電位をさらに低下させるために、例えば、-200mV14未満を必要とすることが知られているメタノール系微生物の増殖を容易にするために、Na2S溶液を添加することができる。あるいは、システイン-HCl、チオグリコレートナトリウム、またはジチオニ酸ナトリウムが一般的に使用される。ただし、どの還元剤を使用するのが適切であるかは、それぞれの実験設定によって異なり、特別な注意が必要な場合があります。例えば、チオグリコレートナトリウムは温度活性化を必要とします(例えば、オートクレーブによって)。

バクテリアとアルケイアの様々な属からなるバランスのとれた微生物コンソーシアムと、効率的に働く嫌気性分解カスケードは、ガスを介した培養フラスコ中のヘッドスペースガス組成を決定することによってさらに評価することができる。クロマトグラフィー。異なる前駆体に由来するフェニル酸のような化合物を取り扱う場合、ヘッドスペースの評価は、メタノジェネシスプロセス8を迅速にチェックする方法である。インキュベーション期間の終わりにコントロールで約50〜60%のヘッドスペースCH4濃度は、適用された栄養素の使用に成功し、したがって嫌気性条件下で有機材料の鉱物化を示します。消化過程における理論的なメタン産生および期待可能なメタン濃度は、基板の素数分析後、またはその含有量を推定することによって、バスウェル・ボイル方程式に従ってex anteを決定することができる。基質中の炭水化物、タンパク質、および脂肪。VDI 4630 15によると、炭水化物は750 L kg-1 VSS(50%CH4および50%CO2)、タンパク質から800 Lkg-1 VSS(72%CH4および28%CO2)、および脂肪を1,390L kgに理論的にバイオガス産生させる可能性があります。-1VSS (60% CH4および 40% CO2)

さらに、VFAおよびフェニル酸の形成および可能なその後の分解を監視した。分解プロセスは、異なる時点でVFA濃度(例えば、酢酸塩、プロピオン酸)を分析することによって評価することができる。酢酸塩やプロピオン酸のような短鎖脂肪酸の蓄積は、メタン生成コミュニティ組成の乱れを指し、全体的な反応器の過負荷を指し起こす可能性があります。しかし、バランスのとれた微生物分解カスケードは、非常に高いVFAおよび酢酸濃度9に対処することもできる。また、酢酸塩/プロピオン酸比は、さらに全体的な反応器状態16に関する情報を提供しうる。しかし、提案された実験仮説に従って選択しなければならないプロセスモニタリングに適した多くのパラメータがあります。本実施例では、標的変数はフェニル酸濃度であった(図6)。

Disclosures

著者は何も開示していない。

Acknowledgments

この研究は、オーストリア科学基金(FWF):プロジェクト番号P 29360とP 29143によって資金提供されました。出版物は、Publikationsfonds derユニバーシテットインスブルックによってサポートされました。我々はEIGを大いに認めます。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
culture flasks (120 mL, N20) Ochs, Germany 102046
buty rubber septa (N20) Ochs, Germany 102049
aluminium caps (N20) Ochs, Germany 102050
N2 gas Messer, Austria purity 5.0
syringes + cannulae various
crimper Ochs, Germany 102051
de-crimper Ochs, Germany 102052
GC2010 Shimadzu
Shin-carbon GC column Restek chromatographic separation of H2, O2, CH4, and CO2
HPLC Prominence Shimadzu
Fast Fruit HPLC Column Phenomenex chromatographic separation of VFAs, phenyl acids, etc.

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References

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Wagner, A. O., Markt, R., Mutschlechner, M., Lackner, N., Prem, E. M., Praeg, N., Illmer, P. Medium Preparation for the Cultivation of Microorganisms under Strictly Anaerobic/Anoxic Conditions. J. Vis. Exp. (150), e60155, doi:10.3791/60155 (2019).More

Wagner, A. O., Markt, R., Mutschlechner, M., Lackner, N., Prem, E. M., Praeg, N., Illmer, P. Medium Preparation for the Cultivation of Microorganisms under Strictly Anaerobic/Anoxic Conditions. J. Vis. Exp. (150), e60155, doi:10.3791/60155 (2019).

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