Summary
Hier wird ein Protokoll zur Verwendung von Alginat als Polymer bei der Mikroverkapselung von verewigten Zellen zur langfristigen Lieferung von Biologika an Nagetieraugen vorgestellt.
Abstract
Viele aktuelle Therapeutika in Der Entwicklung für Erkrankungen der hinteren Pol des Auges sind Biologika. Diese Medikamente müssen häufig verabreicht werden, in der Regel über intravitreale Injektionen. Verkapselte Zellen, die das Biologische der Wahl exzessiver exzessiver exzessierend sind, werden zu einem Werkzeug für die lokale Proteinproduktion und -freisetzung (z. B. durch langfristige Medikamentenabgabe). Darüber hinaus verwenden Verkapselungssysteme durchlässige Materialien, die die Diffusion von Nährstoffen, Abfällen und therapeutischen Faktoren in und aus Zellen ermöglichen. Dies geschieht, während die Zellen aus dem Wirt Immunantwort maskiert, Vermeidung der Notwendigkeit der Unterdrückung des Wirts-Immunsystem. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Alginat als Polymer in der Mikroverkapselung gekoppelt mit dem Elektrospray-Verfahren als Mikroverkapselungstechnik. ARPE-19-Zellen, eine spontan entstehende humane RPE-Zelllinie, wurde aufgrund ihrer Lebensdauer in Langzeit-Zelltherapieexperimenten eingesetzt und wird hier zur Verkapselung und Abgabe der Kapseln an Mausaugen eingesetzt. Das Manuskript fasst die Schritte zur Zellmikroverkapselung, Qualitätskontrolle und Augenzustellung zusammen.
Introduction
Zellbasierte Therapien stellen revolutionäre biologische Techniken dar, die in der Medizin weit verbreitet sind. Kürzlich wurden sie erfolgreich bei der Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, Augenerkrankungen und Krebs angewendet. Zelltherapien decken ein breites Spektrum von Bereichen ab, vom Zellersatz bis zur Medikamentenabgabe, und dieses Protokoll konzentriert sich auf Letzteres. Biologisch abbaubare Alginat-Mikrokapseln (MC) haben Wirksamkeit als Abgabesystem gezeigt, und sie werden immer weit verbreitet im biomedizinischen Bereich verwendet. Alginat wurde in der Mikroverkapselung aufgrund seines einfachen Gelierprozesses, der biologischen Abbaubarkeit, der ausgezeichneten Biokompatibilität und der Stabilität unter in vivo Bedingungen1,2,3,4verwendet.
Das Elektrospray-Verfahren wurde als Mikroverkapselungstechnik erfolgreich eingesetzt, um Peptide und Proteine mit Alginat (Basispolymer) und Poly-l-Ornithin (Sekundärbeschichtungspolymer) zu verkapseln. Beide Polymere sind natürlich erweise wiedergefunden und für ihre Biokompatibilitätverwendet 5,6,7. Die Hauptherausforderung bei zellbasierten Therapien ist jedoch die Unterdrückung des Wirtsimmunsystems, um Nebenwirkungen zu vermeiden, die durch immunsuppressive Medikamente verursacht werden. Die Durchlässigkeit von Alginat-Mikrokapseln gilt als geeignete Eigenschaft für die Zellverkapselung, die die Diffusion von Nährstoffen, Abfällen und therapeutischen Faktoren in und aus Zellen ermöglicht, während sie vom Wirt Immunantwort8,9,10maskiert werden.
Im Auge wurden verkapselte Zellen in klinischen Studien zur konstanten Abgabe von Biologika (d. h. Wachstumsfaktoren11,12 und Wachstumsfaktor-Antagonisten13) zur Behandlung von Retinitis pigmentosa oder altersbedingter Makuladegeneration eingesetzt. Andere Ziele wie Komplementhemmer14 werden derzeit ebenfalls in präklinischen Umgebungen untersucht.
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Protocol
Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der ARVO-Erklärung für den Einsatz von Tieren in der Augenheil- und Sehforschung durchgeführt und vom Medical University of South Carolina Animal Care and Use Committee unter der Protokoll-ID 00399 genehmigt.
1. Zellkultur
- Generieren Sie menschliche retinale Pigmentepithelzellen (ARPE-19) Zelllinie stabil das Gen der Wahl nach veröffentlichtenProtokollen 14,15.
- Pflegen Sie Zellen in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt durch 10% fetales Rinderserum (FBS).
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5%CO2.
- Ersetzen Sie das Medium alle 2 bis 3 Tage.
- Durchfluss der Zellen nach Erreichen 70%–80% Zusammenfluss mit Standard-Gewebekultur Verfahren.
2. Zellverkapselung
- Natriumalginat mit deionisiertem (DI) Wasser für eine Endkonzentration von 2% w/v mischen und durch Filtration mit einem 0,2 m sterilen Spritzenfilter reinigen.
- Bereiten Sie die Zellen, die mit der Alginatlösung gemischt werden sollen, durch Trypsinisieren, Zentrifugieren und Waschen mit 10 mM HEPES gepufferter Salinelösung (pH = 7,4) vor. Mit einem Hämozytometer die Zellen zählen und die endgültige Zellkonzentration in Alginatlösung auf 1 x 106 einstellen.
HINWEIS: Der Verkapselungsprozess sollte in einer sterilisierten Haube ausgeführt werden. - In eine 3 ml Spritze mit Alginat und Zellen gemisch mit 3 ml 300 L L eintragen und an einer Spritzenpumpe befestigen. Die Lösung wird durch eine 30 G stumpfe Spitzennadel in ein steriles Gelierbad gepumpt, das in einem sterilen 50 ml Becher unter der Spritzenspitze bei 7 mm für eine Nadel zum Bad Sprühabstand gelegt wird.
- Das Gelierbad enthält ein Volumen von 40 ml 10 mM HEPES gepufferter Saline mit 100 mM Calciumchlorid (CaCl2) und 0,5% w/v Poly-L-Ornithin (PLO). Die PLO ist eine sekundäre Polymerbeschichtung, die je nach Denkanschutz ausgelassen oder verändert werden kann.
- Stellen Sie die Spannung und die Durchflussrate ein und halten Sie beide konstant während des Verkapselungsprozesses bei 60 mm/h Durchflussrate und 6,0 kV Anfangsspannung, um Mikrokapseln mit einer Größe von 150 m zu erzeugen.
- Schließen Sie den Clip des Anodendrahtes (rot) einer Hochspannungsgenerator-Nadelspitze an die Nadel an die Nadel an und schließen Sie den Erdungsclip (schwarz) an den Kupferdraht an, der auf halbem Weg in das Gelierbad getaucht ist. Eine Charge des Alginat+ Zellgemischs (1 ml) benötigt ca. 30 min, um die gekapselten Zellen (ca. 25.000 Mikrokapseln) vorzubereiten.
- Waschen Sie die gebildeten Mikrokapseln, die Zellen enthalten, zweimal mit Waschlösung (10 mM HEPES gepufferte Saline mit 1,5 mM CaCl2, pH = 7,4). Verwenden Sie PBS nicht zum Waschen.
- Inkubieren Sie die gekapselten Zellen mit 10% FBS-ergänzten DMEM-Medien in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5%CO2.
HINWEIS: Verkapselungsprozessinstrumente sind in Abbildung 1dargestellt.
3. Bestätigung, dass die Kapselung die Zelllebensfähigkeit nicht beeinträchtigt
- Nach der Inkubation der gekapselten Zellen für 24 h in den Medien, bereiten Sie eine kleine Probe von 500 l (30 Mikrokapseln) für die Färbung.
- Waschen Sie die Mikrokapseln 2x mit Waschlösung (10 mM HEPES gepufferte Saline mit 1,5 mM CaCl2) und färben Sie sie für die Lebensfähigkeit mit einem Lebend/Toten-Assay-Kit.
- Bereiten Sie eine Färbemischung aus Calcein AM (Acetoxymethyl) und Ethidium homodimer-1 bei Endkonzentrationen von 2 m bzw. 4 m vor.
- 2 ml der Färbemischung in die gekapselten Zellen geben und 30–45 min im Dunkeln bei Raumtemperatur (RT) brüten.
- Mit sorgfältiger Aspiration die Färbelösung ansaugen und die Mikrokapseln 2x mit der Waschlösung waschen. Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskopsystem, um die gekapselten Zellen zu beobachten und abzubilden.
HINWEIS: Die Dokumentation der Verkapselung ist in Abbildung 2dargestellt.
4. Bestätigung, dass Kapseln die geeignete Größe für die Lieferung und Lieferung der biologischen
- Intravitreale Injektionen in einem Mausauge werden in der Regel mit einer 27 G stumpfen Spitzennadel (Innendurchmesser von 210 m) durchgeführt, die an einer 2,5-L-Hamilton-Spritze befestigt ist.
- Generieren Sie Kapseln im Bereich von 100 bis 200 m, verdünnen Sie sie in serumfreien Medien und ziehen Sie sie vorsichtig in die Hamilton-Spritze. PBS ist kein geeignetes Fahrzeug, da sich Alginatkapseln in PBS auflösen.
- Ausstoßen Sie langsam 1 L Tropfen mit Kapseln auf ein Mikroskopschlitten und bestimmen ihre Integrität mit einem aufrechten Hellfeldmikroskop.
- Passen Sie die Kapselgröße (siehe Schritt 2.3) an, indem Sie Spannung und Durchfluss entsprechend anpassen. Kleinere Mikrokapseln werden nichtlinear hergestellt, indem die Spannung erhöht und die Durchflussrate leicht abnimmt8. In unseren Händen erwiesen sich Kapseln mit einem Durchmesser von 150 m als am besten geeignet. Die Anpassung der Kapselgröße hängt auch davon ab, die Alginatkonzentration konstant zu halten und gleichzeitig die anderen Parameter zu ändern.
- Bewahren Sie einen separaten Satz von Zellen in Kapseln der entsprechenden Größe in serumfreiem Medium auf, um die Sekretionsmenge des gewünschten Biologikums zu bestimmen. Verwenden Sie empfindliche ELISAs oder Western Blotting, um die Konzentration der Biologika im Überstand zu bestimmen.
- Bestimmen Sie die erforderliche Menge an Kapseln, die auf der Grundlage der bekannten PK/PD (Pharmakokinetik/Pharmakodynamik) des Therapeuten injiziert werden müssen. In unseren Händen erwiesen sich 10 Kapseln pro Mausauge als am wirksamsten.
5. Kapsellieferung in Mouse Vitreous
- Führen Sie intravitreale Injektionen mit einem Sezierendes Mikroskop durch. Siehe Abbildung 3 für chirurgische Einrichtung und Materialien, die während des Eingriffs verwendet werden. Ein detailliertes Protokoll für intravitreöse Injektionen kann an anderer Stelle gefunden werden16.
- Anästhesisieren Sie Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Xylazin und Ketamin (20 mg/kg und 80 mg/kg) oder anderen bevorzugten Anästhetika, die vom Tierpflege- und Verwendungsausschuss der jeweiligen Institution zugelassen wurden. Stellen Sie die entsprechende Tiefe der Anästhesie mit einer Zehenzange17sicher.
- Delatetiere die Maus-Pupillen mit Phenylephrin-HCL (2,5%) und Atropinsulfat (1%) um eine gute Sichtbarkeit der Glaskammer zu ermöglichen und ein Schmierauge Augengel auf die Augen aufzutragen, um sie während des Eingriffs hydratisiert zu halten.
- Punktieren Sie die Sklera am Limbus mit einer 26 G Nadel als Führungsloch, stellen Sie sicher, dass sich die Nadel in einem 45°-Winkel mit Dem Auge und Tisch befindet und 2) die abgeschrägte Spitze nach oben zeigt, um eine Punktion der Linse zu vermeiden.
- Injizieren Sie die Kapseln vorsichtig mit einer 27 G stumpfen Spitzennadel, die bei sichtweiser Inspektion an einer Hamilton-Spritze in einem 45°-Winkel befestigt ist, und vermeiden Sie es, die Linse mit der Nadel zu berühren. Eine Verletzung der Linse führt zur Kataraktbildung. Die Kapseln sollten im Glaskörper mit dem Sezieren des Mikroskops sichtbar sein (Abbildung 4A).
- Nach dem Zurückziehen der Nadel, behandeln Sie die Injektionsstelle mit antibiotischen Salben Neomycin und Polymyxin B Sulfate zusätzlich zu Dexamethason ophthalmologische Antibiotika Salbe.
- Anwendung goniotaire hypromellose demulcent ophthalmologische Lösung (2.5%) beiden Augen, um zu verhindern, dass die Hornhäuten während der Erholungsphase austrocknen.
- Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen bei 37°C gehalten und überwachen, bis vollständig wach.
- Eine erfolgreiche Injektion von gekapselten ARPE-19-Zellen sollte das Vorhandensein intakter Kapseln in der Glaskörperkammer der Maus mit nur geringen Mengen an Schmutz bei der Abbildung des Auges durch optische Kohärenztomographie oder andere Methoden offenbaren (Abbildung 4B).
- Das injizierte Mausauge ist nach einigen Tagen der Genesung aufgrund der Operation nun bereit für das experimentelle Paradigma.
HINWEIS: Die chirurgische Einrichtung und Dokumentation von Kapseln im Auge sind in Abbildung 3 bzw. Abbildung 4dargestellt.
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Representative Results
ARPE-19-Zellen sind eine spontan verewigte menschliche RPE-Zelllinie, die nachweislich bei der Implantation von Kapseln in das Auge verkapselt und langfristig überleben kann. Die Werkzeuge für die Alginatverkapselung sind in Abbildung 1dargestellt. In dieser Studie wurde gezeigt, dass bei der Verkapselung in Alginat die Zellen in Alginatkapseln durch Hellfeld-Bildgebung bestätigt wurden (Abbildung 2A). An den Zellen in den Kapseln wurden livetote Tests durchgeführt, die eine 90%ige Lebensfähigkeit nach der Verkapselung zeigten (Abbildung 2B). Um die langfristige Lebensfähigkeit der Zellen in Kapseln zu gewährleisten, wurden Kapseln in Natriumcitrat gelöst und die Zellen dann neu plattiert (Abbildung 2C). Nach der Bestätigung in unabhängigen Experimenten, dass die stabilen transfizierten ARPE-19-Zellen das gewünschte Biologikum14exprimierten und sezernierten, und nach der Festlegung der Parameter für die sichere Verkapselung von Zellen, wurden Kapseln für die intraokulare Injektion hergestellt.
Intravitreale Injektionen in das Mausauge erfordern die Verwendung einer 27 G Stumpfspitzennadel (Innendurchmesser 210 m) und eines genauen Abgabesystems, um das erforderliche kleine Volumen von 1 l konsequent zu injizieren. Die Größe der Kapseln, die beim Auswurf durch die 27 G Nadel nicht beschädigt wurden, wurde durch Mikroskopie bestätigt (Abbildung 2A). Es wurde eine optimale Größe von 150 m ermittelt. Die intravitreale Injektion wurde im Rahmen einer visuellen Inspektion durchgeführt, die die Visualisierung von Kapseln im Glaskörper ermöglichte (Abbildung 4A). Ebenso wurde eine OCT-Bildgebung durchgeführt, die bestätigte, dass die Mehrheit der Kapseln in der Glaskammer der Maus mit relativ geringen Mengen an Schmutz intakt war (Abbildung 4B). In den nachfolgenden veröffentlichten Experimenten wurde bestätigt, dass das gewünschte Biologikum im Auge in therapeutisch relevanten Dosen vorhanden war, was den untersuchten Krankheitsprozess hemmte14. Diese Ergebnisse bestätigten, dass gekapselte Zellen sicher in Mausaugen für die langfristige Lieferung von Biologika injiziert werden können.
Abbildung 1: Kapselungsprozessinstrumente. Die Einrichtung umfasst (A) eine 3 ml Spritze, (B) 0,2 m Filter, (C) eine 30 G, 1/2 Zoll stumpfe Spitze Nadel, (D) einen elektronischen Spritzentreiber, (E) einen Hochspannungsgenerator, (F) den Systemaufbau und (G) einen 7 mm festen Abstand zwischen der Nadelspitze und der Gelierlösungsoberfläche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Zellkapselung. (A) Mikrokapseln gefüllt mit ARPE 19 Zellen. (B) Live/dead assay: [a] rote fluoreszierende Farbe zeigt abgestorbene Zellen an, und [b] grüne fluoreszierende Farbe zeigt lebende Zellen an. (C) Kultivierte Zellen nach der Erholung von Mikrokapseln beginnend mit einem kleinen Cluster, der bis zur Konfluenz wächst. Skalenbalken = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Chirurgische Einrichtung. Zur Visualisierung des Verfahrens wird ein Sezierenvonmikroskop (1) mit einer Videokamera (2) verwendet. Die Maus wird gewogen (3), um die entsprechende Menge an Anästhetikum zu verabreichen und auf einer kleinen Plattform (4) platziert, um die Handhabung und Injektion zu erleichtern. Die Augen werden mit Myriatics Atropin und Phenylepinephrin (5) erweitert und mit Schmiermittel (6) hydratisiert gehalten. Ein Führungsloch wird mit einer 26 G Nadel (7) direkt außerhalb des Limbus durchbohrt. Die Glasspritze (8), beladen mit entsprechend verdünnten Kapseln (9), wird in einem 45°-Winkel zum Mausauge platziert und mit einem Mikromanipulator (10) durch das Führungsloch vorgeschoben. Die Nadelspur sowie die freigesetzten Kapseln können visualisiert werden [(11); siehe Abbildung 4]. Beim Zurückziehen der Nadel wird die Hornhaut mit Hypromellose (12) und Antibiotikumsalbe (13) auf die Injektionsstelle aufgetragen, um eine Infektion zu vermeiden. Anschließend wird die Maus auf ein 37 °C Heizkissen gelegt und bis zum Erwachen überwacht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Verkapselte Zelltechnologie, um ARPE-19 ins Auge zu bringen. (A) Injektionen werden mit einer stumpfen 27 G Nadel durchgeführt, die an einer Hamilton-Spritze befestigt ist. Die Nadelspur kann verfolgt werden, wenn die Spitze der Nadel in das Auge eindringt, wodurch die Linse vermieden wird und die Kapseln (Pfeilspitze) visualisiert, vergrößert durch das optische System des Mausauges. Es sollte beachtet werden, dass die kreisförmige Reflexion der Lichtquelle. (B) Kapseln (Pfeilspitze) können im Glaskörper mittels optischer Kohärenztomographie abgebildet werden. Maßstabsbalken = 200 m. Panel B wurde mit Genehmigung von Annamalai et al.14nachgedruckt.Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Diese Zellverkapselungstechnik ist relativ schnell und einfach durchzuführen. bestimmte Punkte müssen jedoch im Auge behalten werden, um genaue nachgelagerte Ergebnisse zu erhalten. Zellen sollten in kulturin einer Petrischale vor der Verkapselung gehalten und bei richtiger Konfluenz gehalten werden. Die Verkapselung sollte, wenn möglich, in einer richtigen Lüftungshaube mit geregeltem Luftstrom erfolgen. Zu stark von einem Luftstrom kann die Kapselbildung beeinflussen, vor allem in Langzeitexperimenten. Sterile Utensilien und Lösungen sind entscheidend für die langfristige Wartung von Zellen innerhalb der Kapsel.
Derzeit wird die lebend tote Färbung als Bestätigungswerkzeug verwendet, um die Lebensfähigkeit von Zellen in den Kapseln zu bestimmen. Die Anzahl der Zellen pro Kapsel und unter dem aktuellen Zustand (d.h. normalerweise 12–20 Zellen pro Kapsel) wird ebenfalls visuell bestimmt. Die Lebensfähigkeit jeder Charge gekapselter Zellchargen wird mit dieser Methode überwacht. Um die Lebensfähigkeit der Zellen weiter zu bestimmen, werden gekapselte Zellen aufgelöst und neu kultiviert. Dies zeigt die Lebensfähigkeit und Integrität der Zellen innerhalb der Kapseln, was eine erfolgreiche zelluläre Verkapselung validiert.
Die für die Zellkapselung verwendeten Parameter wurden für diesen bestimmten Zelltyp festgelegt. Die oben genannten Parameter sind diejenigen, die für die Verkapselung von ARPE 19 Zellen für diese Experimente verwendet werden. Durchflussrate, Alginatkonzentration, spannung und sekundäre Beschichtung der Kapseln sind alle Variablen, die für die angemessene Verwendung der Kapseln angepasst werden können. Ebenso muss die Menge der Kapseln, die für ein bestimmtes Experiment benötigt werden, entweder empirisch oder auf der Grundlage der bekannten PK/PD der Biologika bestimmt werden. Es ist wichtig, immer geeignete Kontrollexperimente durchzuführen, indem leere Kapseln hinzugefügt werden, um das Vorhandensein der Kapseln und Kapseln zu kontrollieren, die mit untransfizierten ARPE-19-Zellen beladen sind, um das Vorhandensein von sezernierten Faktoren zu kontrollieren. ARPE-19-Zellen können auch stabil mit einem Kontrollplasmid transfiziert werden, da das Vorhandensein selbst einer kleinen Anzahl von Kapseln im kleinen Glaskörper der Maus (<10 l) die normale Physiologie des Auges zu verändern scheint. In diesem Zusammenhang ist es wichtig, das Sekrenom von APRE-19-Zellen unter Verkapselungsbedingungen (sowie in Gegenwart von Glaskörpern in einer bestimmten Krankheit) zu kennen, da die sezernierten Proteine die Wirksamkeit des untersuchten Biologikums beeinträchtigen können.
Schließlich wurde diese Technik eingeführt, um den Nachweis des Prinzips für die langfristige Abgabe von Komplementhemmern zur Behandlung von AMD zu bieten und die aktuelle Methode der intravitrealen Injektionen zu verbessern14. Im aktuellen Entwicklungsstadium werden Komplementinhibitoren in den Glaskörper injiziert, in der Regel mit monatlichen Injektionen. Dazu gehört die Injektion des Komplementfaktors D, der den Antikörper Lampalizumab18blockiert, der in einer klinischen Phase-III-Studie zur Verringerung des Fortschreitens der geographischen Atrophie fehlgeschlagen ist, oder des Komplementfaktors 3-Hemmers APL-219, der sich derzeit in einer klinischen Phase-III-Studie befindet.
Die intravitreale Injektion wird durch Nebenwirkungen der Injektion selbst behindert (d. h. Risiko einer Netzhautablösung, Anstieg des Augeninnendrucks, Endophthalmitis usw.). Darüber hinaus werden die Arzneimittelspiegel im Laufe des Monats bei monatlichen intravitrealen Injektionen erheblich variieren, und Rückprallreaktionen können erwartet werden. Als Alternative werden Gentherapiestrategien entwickelt, wie der lösliche CD59-Ergänzungshemmer20, der sich derzeit in einer klinischen Phase-I-Studie befindet. Verkapselte Zellen ermöglichen auch die kontinuierliche Produktion eines Biologikums über einen längeren Zeitraum und können bei Bedarf beendet werden (d. h. Explantation der Kapsel).
Bis heute haben wir nur für die Herstellung eines Biologikums im Laufe von 6 Wochengetestet 14. Es sei darauf hingewiesen, dass die hier beschriebene Methode nur zum Proof-of-Prinzip bei Tiermodellen und nicht zur Anwendung bei Patienten verwendet werden sollte, da die Alginatkapseln nicht stabil genug sind, um das Zerkleinern während der Injektion vollständig zu verhindern, und nicht länger als einige Wochen dauern dürften. Im Gegensatz dazu kann ein festes Gerät wie das von Neurotech entwickelte jahrelang21 Jahre halten, um die erforderlichen Faktoren zu liefern22,23,24. Darüber hinaus kann diese neue Technik auch mit gekapselter Medikamentenabgabe kombiniert werden. Insgesamt wird erwartet, dass sich dieses aufstrebende Feld rasch als alternative Strategie für wiederholte Injektionen von Therapeutika der Gentherapie entwickeln wird.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Die Studie wurde teilweise durch Stipendien unterstützt, die B. R. von den National Institutes of Health (R01EY019320), dem Department of Veterans Affairs (RX000444 und BX003050) und dem South Carolina SmartState Endowment gewährt wurden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mL Syringe | BD | 309656 | |
| 30 G 1" Blunt needle | SAI Infusion technology | B30-100 | |
| Alginic acid sodium salt, from brown algae | Sigma | A0682 | |
| Atropine Sulfate Ophthalmolic solution (1%) | Akorn | NDC 17478-215-15 | for pupil dilation |
| BD 1 mL Syringe 26 G x 3/8 (0.45 mm x 10 mm) | Becton, Dickinson and Company | DG518105 500029609 REF 309625 | to generate the guide hole |
| Calcium chloride, Anhydrous, granular | Sigma | C1016 | |
| GenTeal Tears | Alcon | NDC 0078-0429-47 | to lubricate the eyes during anesthesia |
| Goniotaire: Hypromellose (2.5%) Ophthalmolic Demulcent Solution (Sterile) | Altaire Pharmaceuticals Inc. | NDC 59390-182-13 | to lubricate the eyes during anesthesia |
| Hamilton Needle/syringe Tip: 27 G, Small Hub RN NDL, custum length (12 mm), point style 3, 6/PK | Hamilton | 7803-01 | for intravitreal delivery of capsules |
| Hamilton Syringe: 2.5 µL, Model 62 RN SYR, NDL Sold Separately | Hamilton | 7632-01 | for intravitreal delivery of capsules |
| HEPES buffer, 1 M | Fisher Bioreagents | BP299100 | |
| High voltage generator | ESD EMC Technology | ES813-D20 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher Scientific | L3224 | |
| L-Ornithine hydrochloride, 99% | Alfa Aesar | A12111 | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone Ophthalmolic Ointment | SANDOZ | NDC 61314-631-36 | antibiotic to prevent infection after intravitreal injection |
| Phenolephrine Hydrochloride Ophthalmolic Solution (2.5%) | Akorn | NDC 17478-201-15 | for pupil dilation |
| Sodium Chloride | Sigma | S-5886 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 μm | VWR | 28143-312 | |
| Syringe pump | GRASEBY | MS16A |
References
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