Summary
이 연구의 목적은 1-90 후 중뇌 동맥 폐색 / 재관류 (MCAO / R) 후 뇌 경색 및 감각 운동 기능을 테스트하여 뇌 허혈의 회복 및 후유부단계에서 연구를위한 동물 모델을 확립하고 검증하는 것입니다. 쥐에서 일.
Abstract
이 연구의 목적은 회복 및 후유증 단계에서 동물 뇌 허혈 모델을 확립하고 검증하는 것이었습니다. 남성 스프라그-다울리 쥐의 중간 대뇌 동맥 폐색/재관류(MCAO/R) 모델이 선택되었습니다. 쥐의 무게 (260-330 g), 스레드 볼트 유형 (2636/2838/3040/3043) 및 뇌 경색 시간 (2-3 h), 높은 롱가의 점수, 더 큰 경색 볼륨 및 더 큰 모델 성공 비율을 Longa의 점수와 TTC 염색을 사용하여 스크리닝하였다. 최적의 모델 상태(300 g, 3040 스레드 볼트, 3시간 뇌 경색 시간)를 획득하여 감각 운동 기능 및 경색 부피의 평가를 통해 재관류 후 1-90일 관찰 기간에 사용하였다. 이러한 조건에서, 양측 비대칭 시험은 1 일에서 90 일까지 유의한 차이를 가졌고, 그리드 보행 시험은 1 에서 60 일까지 유의한 차이를 가졌다; 두 가지 차이점은 적절한 감각 운동 기능 테스트가 될 수 있습니다. 따라서, 뇌 허혈의 회복 및 후유증 단계에서 새로운 쥐 모델의 가장 적절한 조건이 발견되었다: 300 g 쥐는 3040 브레인 볼트와 MCAO를 겪은 다음 뇌 경색을 위해 다음 reperfused. 적절한 감각 운동 기능 테스트는 양측 비대칭 테스트와 그리드 보행 테스트였습니다.
Introduction
뇌 허혈은 급성 단계 (1 주 이내), 회복 단계 (1 주 ~ 6 개월), 후유증 단계 (6 개월 이상)와 다른 뇌졸중 후 지표가있는 세 단계로 나뉩니다. 현재, 대부분의 연구는 뇌 허혈의 급성 단계에 초점을 맞추고 있기 때문에 중요한 효과와 다중 상대 연구 모델1,2,3. 그러나, 뇌 허혈의 회복과 후유증 단계는 장애의 장기 합병증으로 인해 무시 될 수 없습니다. 따라서, 본 연구의 목적은 뇌 허혈의 회복 및 후유증 단계를 연구하기 위해 안정적이고 안정적이며 비교적 간단한 동물 모델을 탐구하는 것이다.
많은 실험적인 뇌 허혈 모델 중, 우리는 오른쪽 중간 대뇌 동맥에 스레드 볼트 삽입을 통해 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO)를 사용합니다 (MCA). 이 모델은 더 큰 경색 볼륨을 생성할 수 있는 인간 뇌졸중과 유사하며, 뇌졸중과 관련된 많은 행동 장애를 초래하며, 스레드 볼트4,5,6을제거하여 혈액 재관류(R)를 허용할 수 있다. MCAO/R은 또한 뇌 허혈7의 금표준 동물 모델로 간주됩니다. 더욱이, 뇌 손상의 중증도는 나사 볼트의 직경 및 삽입 길이, 뇌 허혈의 지속 시간 및 동물 체중(큰 쥐는 더 큰 두뇌와 두꺼운 대뇌 혈관을 가지고 있음)에 따라 달라집니다8. 따라서, 나사 볼트 유형, 경색 시간 및 랫트 무게를 변경함으로써, MCAO/R 랫트에서 뇌 허혈의 회복 및 후유증 단계에 적합한 모델을 찾을 수 있다. 쥐 모델의 유효성을 검사하기 위해 TTC 염색 및 감각 운동 기능 실험(양측 비대칭 테스트, 그리드 보행 테스트, 회전 테스트 및 리프팅 로프 테스트)을 사용하여 MCAO/R 모델에 대한 1일, 35일, 60일 및 90일 간의 연구를 수행했습니다.
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Protocol
동물 과목의 절차 와 사용은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 건강의 국립 연구소에 의해 승인되었습니다. 이 프로토콜은 특히 중간 대뇌 동맥 폐색 / 재관류 (MCAO / R) 및 감각 운동 기능의 테스트를 위해 조정됩니다.
1. 실험적인 디자인 과 그룹화
- 쥐 MCAO/R 모델을 사용하여 Longa의 점수 및 TTC 염색을 사용하여 더 심한 뇌 손상 및 더 큰 모델 성공률을 가진 쥐 뇌 허혈 모델 방법을 스크리닝합니다.
- 7-9주된 260-330 g의 수컷 스프라그-다울리 쥐에 대한 실험을 수행한다. 실제 랫트 무게는 275 g의 경우 275±15 g, 300 g에는 300±10 g, 320 g의 경우 320±10 g이다.
- 다음 7개의 그룹(중량, 나사 볼트 유형, 경색 시간):15마리(275 g, 2636, 2h)가 있는 그룹 1을 사용한다. 그룹 2 와 함께 15 쥐 (275 g, 2636, 3 h); 15 마리의 쥐 (275 g, 2838, 2 h)와 그룹 3; 그룹 4 와 함께 15 쥐 (275 g, 2838, 3 h); 그룹 5 와 함께 13 쥐 (300 g, 3040, 3 h); 10 마리의 쥐 (320 g, 3040, 3 h)와 그룹 6; 13 마리의 쥐 (300g, 3043, 3 시간)로 그룹 7.
- TTC 염색에 의한 뇌 회복 상태를 연구하고, MCAO/R의 1, 35, 60, 90일 후 양측 비대칭 테스트, 그리드 보행 테스트, 로타로드 테스트 및 리프팅 로프 테스트에 의한 장기적인 기능 적 적자를 나타내기 위해 적합한 감각 운동 기능 테스트를 사용합니다.
- 나이의 8-9 주 인 300 ± 10 g의 수컷 스프라그 -Dawley 쥐를 사용하십시오.
- 다음 5개의 그룹: 대조군(정상) 20마리의 쥐를 가진 그룹; 16 마리의 쥐와 함께 1 일 그룹; 16 마리의 쥐와 함께 35 일 그룹; 17 마리의 쥐와 함께 60 일 그룹; 그리고 19 마리의 쥐와 함께 90 일 그룹.
- 1.1 단계에서 Longa의 점수 또는 1.2 단계에서 감각 운동 기능 테스트 후, TTC 염색을 위해 모든 쥐를 마취하고 참수합니다.
2. 쥐9에 일방적 MCAO/R 모델 구축
참고: 수술 중에는 미세포스를 부드럽게 사용하여 혈관이 파손되는 것을 방지하십시오. 혈관이 분리 될 때 쥐의 목에 있는 신경 그리고 그밖 혈관에 손상을 피하십시오. 모든 생존 수술 절차에 적합한 무균 기술을 제시하기 위해 주의를 기울여야합니다. 비디오의 후반부에서 설명된 기술은 전체 절차를 통해 실행되어야 합니다.
- 수술 전반에 걸쳐, 작은 동물 온도 조절기에서 37.0±0.5°C에서 쥐의 체온을 유지한다. 6cm 5-0 봉합사 4개를 준비합니다.
- 작은 동물 마취 기계 (폐 가스 처리 장치)의 산소 유량을 0.4-0.6 L / min으로 설정하고 이소플루란의 농도를 5 %로 설정합니다. 마취 기계에 쥐를 놓습니다.
- 동물이 기절한 후, 쥐를 수술용 고정 테이블에 놓습니다. 쥐의 입을 마취 기계의 마스크에 연결하십시오 (산소 유량은 변하지 않고 이소플루란의 농도를 3 %로 조정하십시오). 동물이 사지 긴장, 각막 반사 및 통증의 부족을 관찰하여 깊은 마취에 들어갔는 것을 확인하십시오.
- 팔다리를 종이 붕대(또는 기타 도구)로 수술대에 놓도록 고정합니다.
- 전기 면도기로 목 털을 제거하고 75 %의 알코올로 살균하십시오 (요오드 도피르가 더 좋습니다). 쥐의 입을 갈고리로 고정하십시오.
- 안과 가위로 목의 중앙 세로 모양을 따라 2-3cm를 자른다.
- 일반적인 경동맥을 분리합니다. 피하 근육을 안과 집게로 분리하십시오. 홈메이드 리트랙터를 사용하여 시야를 완전히 노출시하십시오. 기관의 전방 근육을 안과 포셉으로 분리한 후, 일반적인 경동맥이 보일 때까지 오른쪽 흉골레미노마스토이드 힘줄을 따라 분리합니다.
- 일반적인 경동맥, 외부 경동맥 및 내부 경동맥을 안과 집게로 분리합니다. 일반적인 경동맥 (하드 매듭), 심장 끝에서 멀리 떨어진 외부 경동맥 (하드 매듭), 내부 경동맥 (느슨한 매듭)을 5-0 봉합사로 분리하십시오. 5-0 봉합사로 심장 끝 근처의 외부 경동맥을 라인.
- 스레드 볼트를 삽입합니다. 안과 가위를 사용하여 외부 경동맥의 작은 구멍을 자르고 스레드 볼트를 부드럽게 삽입하십시오. 느슨한 매듭에 있던 외부 경동맥의 봉합을 해제하고 외부 경동맥을 잘라냅니다.
- 내부 경동맥의 느슨한 매듭을 풀고 중간 대뇌 동맥의 시작 부분에 스레드 볼트를 계속 삽입하십시오 (봉합사 표시). 그런 다음 노출 된 스레드 볼트를 잘라냅니다.
- 허혈적 인 시간 (2-3 h)에 도달 한 후, 하나의 마이크로 포스로 외부 경동맥의 골절을 수정하고 다른 마이크로 포스로 스레드 볼트를 부드럽게 꺼냅니다. 스레드 볼트의 프론트 엔드가 내부 경동맥에서 완전히 제거되면 5-0 봉합사가 줄 지어있던 외부 경동맥을 분리 한 다음 스레드 볼트를 완전히 꺼냅니다.
- 일반적인 경동맥을 풀어내고, 감염을 방지하기 위해 상처 표면에 페니실린 나트륨 분말의 daub ~50,000 U를 풀어. 봉합사 피하 근육과 피부 4 봉합사.
- 1 mL 주사기를 사용하여 경구적으로 쥐에 멸균 식염수의 ~ 0.2 mL을 주고 (SQ-PEN 주사가 더 낫다) 케이지에 다시 쥐를 배치 한 후 수술 후 물 부족을 방지하기 위해.
- 롱가의 점수10에따라 재관류 24 시간 후 동물을 선택하십시오. 1.1단계에서 다음 TTC 염색에 대해 롱가의 점수가 1-3인 동물을 선택하고, 1단계, 35, 60, 90일 연구에 대해 롱가의 점수가 2-3점인 동물을 1.2단계에서 연구한다.
참고 : 롱가의 점수10: 0 점수, 신경 적자 없음; 1 점수, 왼쪽 발톱을 연장하지 못함; 2 점수, 왼쪽으로 순환; 3 점수, 왼쪽으로 떨어지는; 4 점수, 자발적으로 걸을 수 없으며 우울한 의식을 가지고 있습니다. - 단방향 ANOVA로 롱가의 점수를 분석합니다. 표시된 값은 평균 ±S.D. P < 0.05차이를 나타낸다.
3. TTC 염색
참고: 쥐 뇌 슬라이스 몰드와 블레이드는 큰 온도 차이로 인한 접착을 방지하기 위해 사용하기 전에 -20 °C 냉장고에서 미리 냉각되어야 합니다. 염색 하는 동안, 뇌 조각과 배양 플레이트 사이의 접착을 방지, 불충분 한 얼룩이 발생할 수 있습니다.
- 1.1단계에서 Longa의 점수 또는 1.2단계에서 감각운동 기능 시험 후 400 mg/kg의 클로랄 수화물을 경강내 주사하여 쥐를 마취시다.
- 외과 용 가위 또는 쥐 참수 장치로 쥐를 참수하십시오. 외과 용 가위와 지혈 집게로 뇌를 제거하십시오.
- 슬라이스를 용이하게하기 위해 30 분 동안 -20 °C에서 냉장고에 뇌를 넣습니다.
- 냉장고에서 뇌를 제거하고 미리 냉각 된 쥐 뇌 슬라이스 금형에 배치합니다. 미리 냉각 된 블레이드로 6 개의 2mm 두께의 연속 섹션으로 뇌를 잘라냅니다.
- 6 웰 배양 플레이트에 2 % 5 % 5 -트리페닐 -2H -테트라 졸륨 염화물 (TTC)로 섹션을 염색하십시오.
- 37°C에서 30-60분 동안 절편을 흔들어 서 배양한다. 뇌 허혈 영역과 정상 영역이 명확하게 흰색과 빨간색이 될 때까지 10 분마다 섹션을 뒤집습니다.
- 뒤에서 뇌의 앞쪽으로 수직으로 뇌 슬라이스를 정렬합니다. 눈금자를 사용하여 각 줄의 총 길이가 동일한지 확인합니다. 디지털 카메라로 사진을 찍습니다.
- 경색 체적을 분석합니다.
- 포토샵 소프트웨어로 사진을 전처리
- 포토샵 CS6를 사용하여 사진을 가져옵니다. 00:00-00:14
- 뇌 조각을 선택하려면 선택을 클릭하고 | 선택을 클릭합니다. 역. 00:15-00:36
- 전경을 클릭하여 검은색을 선택하고 확인을클릭합니다. 00:37-00:42
- Alt +Delete를 눌러 배경색을 채우고 CTRL +D를 선택 해제합니다. 00:43-00:46
- 파일 | 클릭 바탕 화면에 저장합니다. 00:47-01:08
- 이미지 프로 플러스 소프트웨어로 사진을 전처리합니다.
- 이미지 프로 플러스 6.0 소프트웨어를 열고 사진을 가져옵니다. 01:09-01:24
- 결함 수정의 경우 대비 향상 도구를 사용하여 밝기를 조정하여 배경이 검은색이 되도록 합니다. 01:25-01:37
- 필터의 중앙분리대 도구를 사용하여 밝은 영역을 제거합니다. 01:38-01:46
- 이미지 프로 플러스 소프트웨어로 왼쪽 (정상) 뇌 영역을 계산
- 분할을 사용하여 색상을 선택하고 뇌 조각이 검은색 배경에서 분리되도록 H/S/I의 값을 조정합니다. 01:47-02:12
- 카운트로 돌아가기 | 크기. 02:13-02:16
- 카운트 | 클릭 편집에서 오브젝트를 분할하여 뇌를 중간선에서 분리합니다. 이 소프트웨어는 자동으로 왼쪽과 오른쪽 뇌 영역을 구별합니다. 02:17-02:49
- 이미지 프로 플러스 소프트웨어와 오른쪽 경색 뇌 영역을 계산
- 단계 3.8.1-3.8.2를 구현합니다. 02:50-03:14
- 카운트 선택 | 크기. 03:15-03:21
- 그리기 | 클릭 편집에서 객체 병합 도구. 허혈성 영역을 수동으로 선택하고 개혈성 영역을 계산하려면 카운트를 클릭합니다. 03:16-05:31
- 이미지 프로 플러스 소프트웨어로 건강 뇌 영역 계산
- 단계 3.8.1-3.8.2를 구현합니다. 05:32-06:44
- 분할을 사용하여 색상을 선택하고 뇌 조각의 일반 부분이 검은색 배경에서 분리되도록 H/S/I의 값을 조정합니다. 06:45-07:10
- 카운트로 돌아가기 | 크기와 이 영역을 계산하려면 카운트를 클릭합니다. 07:11-07:21
- 편집에서 오브젝트 분할을 클릭하여 뇌를 중간선에서 분리합니다. 이 소프트웨어는 자동으로 왼쪽과 오른쪽 뇌 영역을 구별합니다. 07:22-08:08
- 포토샵 소프트웨어로 사진을 전처리
- 경색 체적 계산(%) 및 경색 및 수축 볼륨 (%):
경색 볼륨 (%) = [오른쪽 경색 영역/(2 x 왼쪽 뇌 영역)] x 100.
경색 및 수축 볼륨 (%) = [(왼쪽 뇌 영역 - 오른쪽 건강 뇌 영역) / (2 x 왼쪽 뇌 영역)] x 100.
참고: 오른쪽 뇌는 부상당한 부분입니다. 데이터는 단방향 ANOVA에 의해 분석되었다. 표시된 값은 평균 ±S.D. P < 0.05차이를 나타낸다.
4. 감각운동 기능 평가
참고: 롱가의 점수를 2-3으로 한 쥐(300 g, 3040 스레드 볼트, 3시간 뇌 경색 시간)는 1-90일에서 감각 운동 기능 실험을 수행하기 위해 선택되었다. 이 연구 기간 동안 조용히 동물을 방해하지 마십시오. 데이터는 양방향 ANOVA에 의해 분석되었다. 표시된 값은 평균 ±S.D. P < 0.05차이를 나타낸다.
- 양측 비대칭 시험11
- 종이 테이프(길이 5cm, 너비 0.8cm)를 쥐의 각 전조의 사페누스 부분에 3번 동일한 압력으로 감쌉니다.
- 각 쥐에 대해, 각 앞발톱에 접촉하고 테이프를 5 분 안에 카메라로 제거한 횟수를 기록하십시오(영향을 받지 않는 발 시간 및 영향을 받는 발 시간 포함).
- 30분 후, 4.1.1 단계와 4.1.2단계를 다시 반복합니다.
- 감각 운동 바이어스(%)의 평균 값을 계산합니다.
감각 운동 바이어스 (%) = (영향을받지 않은 발 시간 - 영향을받는 발 시간)//(영향을받지 않은 발 시간 + 영향을받는 발 시간) x 100
- 그리드 걷기 테스트
- 2.5 cm2의격자 개구부와 높은 그리드 표면 플랫폼 (면적 : 1m2; 높이 : 90cm)의 중심에 쥐를 놓습니다.
- 쥐의 엉덩이를 가볍게 밀어 쥐가 그리드 표면을 통과하도록 장려합니다.
- 영향을 받지 않는(오른쪽) 및 영향을 받는(왼쪽) 팔다리에 의한 발 결함 수와 카메라로 총 걸음 수를 1분 으로 기록합니다.
- 오류 시간 계산:
오류 시간(%) = [영향을 받지 않는(오른쪽) 사지 - 영향을 받는(왼쪽) 사지]/총 단계 번호 x 100.
참고: 20단계 데이터 미만의 총 단계 수가 제거되었습니다.
- 로타로드 테스트12,13
- 컴퓨터 상에서 5분 동안 13 rpm의 속도로 지지 소프트웨어를 사용하여 쥐의 래트 회전 바 피로 장치(직경 90 mm)를 설정한다.
- 컴퓨터 프로그램을 시작하고 동시에 회전 횡선에 쥐를 배치합니다.
- 쥐가 렁에서 떨어지거나 5 분 동안 계속 걷고 회전 시간을 기록하면 재판을 종료하십시오.
- 쥐를 30분 동안 쉬게 합니다.
- 4.3.2-4.3.4 단계를 두 번 더 반복하고 마지막 회전 시간으로 최대 값을 선택합니다.
- 리프팅 로프 테스트14
- 리프팅 로프 악기(높이 70cm, 로프는 직경 0.2cm, 길이 40cm)를 책상 위에 놓습니다.
- 쥐가 앞다리로 밧줄을 잡고 쥐를 매달게 한다.
- 매달려의 시간을 기록하고 점수를 계산합니다.
참고 : 로프에 3 : 0 -2의 점수; 2의 점수 : 밧줄에 3-4 s; 1의 점수 : 로프에 5-6 s; 0의 점수 : 밧줄에 7 s 이상.
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Representative Results
Longa의 점수 및 TTC 염색이 있는 MCAO/R 모델에 대해 위에서 언급한 절차를 사용하여, 평균 중량의 다른 처리(275/300/320 g), 볼트 유형(2636/2838/3040/3043; 표 1) 및 허혈성 시간(2-3 시간) 및 1일 재관류를 사용하여 랫트에서 최적의 뇌 허혈 모델을 스크리밍하였다. 300g 무게, 3040 나사 볼트 및 3 h 뇌 경색 시간의 모델 매개 변수는 가장 큰 뇌 경색, 가장 높은 Longa의 점수 및 가장 큰 모델 성공률에 가장 적합했습니다. 이는 275 g 중량, 2636 나사 볼트 및 2시간 뇌 경색 시간의 종래의 처리에서 현저히 개선되었다(도1).
또한, 300g 무게, 3040 스레드 볼트, 3 시간 뇌 경색 시간 및 2-3 Longa의 점수가 있는 쥐는 감각 운동 기능 테스트 (양측 비대칭 테스트, 그리드 보행 테스트, 회전 테스트 및 리프팅 로프 테스트)와 TTC 염색을 통해 회복을 연구했습니다. 1-90 일에서 뇌 허혈의 상태. 경색 및 수축 부피는 각각 1, 35, 60 및 90일 후 MCAO/R 후 23.4%, 19.6%, 16.1%(P&0.01, 첫날 대비) 및 15.7%(P< 0.01, 첫날 대비)였다(그림 2). MCAO/R 이후 첫날, 경색 볼륨이 가장 큰 것으로 나타날 수 있습니다. 시간이 지남에 따라 경색 볼륨이 작아지고 수축 볼륨이 커졌습니다. MCAO/R의 60일 후에 경색 및 수축 볼륨이 더 이상 변경되지 않습니다.
양측 비대칭 시험에서 감각 운동 편향, 그리드 보행 테스트에서 그리드 보행 오차 시간 및 리프팅 로프 테스트에서 리프팅 로프 점수가 모두 크게 증가한 반면 로타로드 테스트의 회전 시간은 1 이후 크게 감소했습니다. MCAO/R의 날(그림 3),이는 모든 네 가지 시험이 급성 뇌 허혈의 단계에서 의미가 있음을 나타냈다. 그러나, 단지 감각 운동 편향은 MCAO/R의 35, 60 및 90 일 후에 시간 의존적인 방식으로 큰 기능성 무질서를 유지했습니다. MCAO/R의 35일과 60일 후에 그리드 보행 테스트에서 그리드 보행 오류 시간의 상당한 차이가 있었습니다. 이러한 결과는 양측 비대칭 테스트와 그리드 보행 테스트가 쥐의 회복 및 후유아 단계에 적합한 감각 운동 기능 테스트가 될 수 있음을 나타냈다.
도 1: 300 g 무게, 3040 스레드 볼트, 3 h 뇌 경색 시간은 MCAO/R에 의해 유도된 뇌 허혈성 손상의 최적 상태일 수 있다. (A, B) 뇌 조직의 경색 부피의 사진 및 카토그램 (n = 9−12). (C)롱가의 점수 (n = 9−12). (D)쥐의 모델 성공률(n =10−15)의 통계. 모델 성공률 = (MCAO/R 후 의 사망 쥐 - MCAO/R 후 의 총 쥐 수)/총 쥐 수. 실패 랫트는 적당한 Longa의 점수를 갖지 않는 모델 래트입니다. 오류 막대는 S.D., *P < 0.05, **P < 0.01을 나타냅니다. 이 수치는 리우 외15에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 양측 비대칭 시험 및 그리드 보행 시험은 뇌 허혈의 회복 및 후유술 단계에서 적합한 감각운동 기능 시험이었다. (A)오른쪽 사지가 디본드 실험에서 호의를 베푸는 다. (B)그리드 걷기 테스트에서 그리드 보행 오류 시간입니다. (C)회전 테스트의 시간 길이입니다. (D)리프팅 로프 테스트의 점수. 오류 막대는 S.D., n = 15−19, *P < 0.05, ***P < 0.001을 나타냅니다. 이 수치는 리우 외15에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 형식 | 나사 볼트의 직경 | 나사 볼트 헤드의 직경 | 쥐의 권장 체중 | 수준 |
| 2636 | 0.26 mm | 0.36 mm | 250~280 g | A4 |
| 2838 | 0.28 mm | 0.38 mm | 280~350 g | A4 |
| 3040 | 0.30 mm | 0.40 mm | 360~400 g | A4 |
| 3043 | 0.30 mm | 0.43 mm | >400 g | A4 |
| 참고 : A4 레벨 스레드 볼트는 헤드 엔드가 반구형이며, 프론트 엔드는 폴리 리신, 표시, 살균 및 치료없이 구매 - 온 - 사용으로 덮여 표준입니다 (이 표는 Liu 등에서 수정되었습니다., 2018). | ||||
표 1: 스레드 블롯 정보. 이 표는 Liu 등15에서수정되었습니다.
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Discussion
급성 뇌허혈에 잘 사용되는 방법 및 행동 지표를 확립하는 많은 모델은 뇌 허혈의 회복 및 후유증 단계에 큰 변화가 없을 수 있습니다16,17. 그러나 회복 및 후유증 단계에서 뇌 허혈환자의 수가 가장 많다. 허혈성 뇌졸중의 회복 및 후유증 단계에 적합한 동물 모델을 선택하는 것이 필수적입니다.
쥐의 적당한 무게(260-330 g), 스레드 볼트 유형(2636/2838/3040/3043), 가장 심한 경색 상해, 높은 모델 성공률 및 가시적인 행동 지표에 대한 뇌 경색 시간(2-3시간)을 선별하기 위해 쥐의 MCAO/R 모델을 사용합니다. 뇌 허혈의 회복 및 후유증 단계에 적합합니다.
3040 스레드 볼트와 3 h 뇌 경색 시간으로 300g의 무게를 가진 쥐는 더 큰 경색 부피, 더 가혹한 행동 결함 및 더 중대한 모형 성공비율을 가지고 있습니다(그림 1). 또한, 재관류 후 1-90일 후에 TTC 염색 및 감각 운동 기능 테스트(양측 비대칭 테스트, 그리드 보행 테스트, 회전 테스트 및 리프팅 로프 테스트)를 통해 이 쥐 모델의 유효성 검사 방법을 제공했습니다. 우리는 양측 비대칭 시험 및 격자 보행 시험이 이 표시기의 중요한 다름이 각각 90 일 및 60 일 지속하기 때문에 허혈의 복구 그리고 후유증 단계를 연구하기 위하여 이용될 수 있었다는 것을 것을을 발견했습니다. 경색 및 수축 부피가 클수록, 더 심한 감각 운동 적자이며, 이는 도 2 및 도 3에서볼 수 있다.
이 방법은 MCAO에 기인한 두뇌 허혈에 주로 적당합니다. 그러나, 모델은 인간과 쥐 사이 두뇌 해부학에 있는 다름이, 부수적인 순환의 급료와 같은. 또 다른 제한은 백색 물질 복구 TTC 염색에 의해 볼 수 없다는 것입니다. MR 화상 진찰 또는 그밖 방법을 가진 부수적인 순환 및 백색 물질 복구의 추가 연구 결과는 이 모형의 예측 값을 확인할 수 있습니다.
가장 중요한 문제는 쥐에서 MCAO / R 모델을 만드는 기술이 쉽지 않고 연습이 필요하다는 것입니다. 실험 전에 허용 가능한 병렬 모델 성공률을 확인합니다. 뇌졸중의 회복 및 후유부 단계에서 감각 운동 기능을 테스트하기 위해 더 많은 계측기와 방법이 필요합니다. 속도를 10rpm에서 30 rpm으로 증가시키기와 같은 더 어려운 작업이 사용된 경우, 로타로드 시험에서 더 긴 기간의 적자가 나타날 수 있습니다. 다른 행동 테스트는 걸음걸이 감지와 같은 이 모델에도 적합할 수 있습니다. 보다 정확한 검출 방법은 약물 이나 다른 치료 도구의 효과를 식별 할 수있는 뇌 허혈의 회복 및 후유증 단계에서 환자를 위해 사용되어야합니다.
회복과 후유증 단계에서 뇌 허혈을 연구하는 새로운 동물 모델로서 여기에 제시된 방법은 의미 있고 대중화할 자격이 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (81603315, 81603316), 중국 장시성의 주요 R & D 계획 (20171ACH80001), 푸젠 성 대학의 산업 및 학술 협력 프로젝트에 의해 지원되었다 중국 (2018Y4101011).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anatomical Microscope | Leica (Germany) | S8 | Microscopic operating instrument |
| Blade | Gellette | / | Cutting brain sections |
| Constant Temperature Shaking Bed | Taicang Experimental Equipment Factory | THZ-C | To keep the brain sections stained evenly and at a constant temperature |
| Digital Camera | Canon | 700D | For taking pictures of TTC staining |
| Electric Shaver | Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. | 3000# | Removal of hair from the neck of rats |
| Forceps Hamostatic | Shanghai Medical device Co., Ltd. | 14 cm | Using for brain removing |
| Image Pro Plus Software | Media Cybernetics Inc. | 6.0 | Analyze the infarct volume |
| Isoflurane | RWD Life Science | 217170702 | Anesthetic gas |
| Microforceps | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Vascular micromanipulation |
| Microshear | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Vascular micromanipulation |
| Ophthalmic Forceps | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Auxiliary skin and muscle anatomy |
| Pphthalmic Scissors | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Using for cutting the skin of neck |
| Rat Brain Slice Mold | Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. | 400 g | For standard, uniform cutting of brain tissue |
| Rat Rotating Bar Fatigue Apparatus | Anhui Zhenghua Biological Instrument and Equipment Co., Ltd. | ZH-300B | To test the sensorimotor function |
| Small Animal Anaesthesia Machine | Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. | ABM3000 | A gas anesthetic machine |
| Small Animal Thermostat | Beijing Damida Technology Co., Ltd. | DM.7-YLS-20A | To maintain animal body temperature constant during operation |
| Surgical Scissors | Shanghai Medical device Co., Ltd. | 16 cm | Using for decapitate and brain removing |
| Suture | Shanghai Jinhuan Medical Devices Co., Ltd. | 4-0 / 5-0 | Using for skin and muscle sutures / Using for vascular ligations |
| Thread Bolt | Beijing Cinontech Co. Ltd. | 2636/2838/3040/3043-A4 | Blockage of the middle cerebral artery in rats |
| 5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride (TTC) | Sigma | LOT#BCBP3272V | Brain section staining reagent |
References
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