Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

מודל טרום קליני להעריך את ההתאוששות המוח לאחר שבץ חריף בחולדות

Published: November 6, 2019 doi: 10.3791/60166
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 3, 1, 1, 1, 1
1Beijing Yinfeng Dingcheng Biological Engineering Technology Ltd., 2Hulunbuir People's Hospital, 3Shandong Qilu Stem Cell Engineering Co. Ltd.
* These authors contributed equally

Summary

מטרת מחקר זה היא להקים ולאמת מודל בעלי חיים עבור מחקר בשלבים שחזור והצלה של איסכמיה של המוח על ידי בדיקת אוטם המוח ואת הפונקציה sensorimotor לאחר חסימה באמצע עורק מוחין/reperfusion (MCAO/R) לאחר 1-90 ימים בחולדות

Abstract

מטרת מחקר זה היתה להקים ולאמת מודל איסכמיה של המוח בעלי חיים בשלבי ההחלמה והסקוולה. עורק המוח האמצעי סגר/reperfusion (MCAO/R) מודל בחולדות ממין זכר-דאולי נבחר. על ידי שינוי משקל העכברוש (260-330 גרם), את סוג הברק חוט (2636/2838/3040/3043) ואת המוח סיכונים זמן (2-3 h), הציון של Longa גבוה יותר, נפח סיכונים גדול יותר יחס הצלחה מודל גדול הוקרן באמצעות הציון של Longa ו TTC כתמים. מצב מודל אופטימלי (300 g, 3040 בורג חוט, 3 h סיכונים זמן המוח) נרכש והשתמשו בתקופת התצפית 1-90 יום לאחר reperfusion באמצעות הערכה של sensorimotor פונקציות ונפח סיכונים. בתנאים אלה, מבחן ה-סימטריה הדו היה הבדל משמעותי בין 1 ל 90 ימים, ואת מבחן רשת הליכה היה הבדל משמעותי בין 1 ל 60 ימים; שני ההבדלים יכולים להיות מבחן פונקציונלי sensorimotor מתאים. כך, המצב המתאים ביותר של מודל עכברוש הרומן בשלבי ההתאוששות ובשלבים של איסכמיה המוח נמצא: 300 g חולדות שעברו MCAO עם בורג 3040 המוח סיכונים ולאחר מכן מחדש. המבחנים הsensorimotor פונקציונליים המתאימים היו בדיקת סימטריה דו-צדדית ומבחן הליכה ברשת.

Introduction

איסכמיה של המוח מחולקת לשלושה שלבים עם מחווני שלאחר שבץ שונים: השלב האקוטי (בתוך שבוע), שלב ההחלמה (1 שבוע עד 6 חודשים), ובשלב הסקוויה (יותר מ -6 חודשים). כיום, רוב המחקרים מתמקדים בשלב אקוטי של איסכמיה של המוח בשל השפעתה המשמעותית ומודלים רב יחסיים מחקר1,2,3. עם זאת, לא ניתן להתעלם מההתאוששות ומשלבים הרצף של איסכמיה מוחית עקב סיבוך לטווח ארוך של מוגבלויות. לכן, מטרת מחקר זה היא לחקור מודל יציבה, אמין בעלי חיים פשוטה יחסית כדי לחקור את שלבי ההתאוששות והרצף של איסכמיה של המוח.

בין הדגמים הרבים של איסכמיה של המוח ניסיוני, אנו משתמשים בעורק מוחין באמצע הסגר (MCAO) באמצעות בורג פתיל החדרת לתוך עורק המוח האמצעי הימני (MCA). מודל זה דומה שבץ האדם, אשר יכול לייצר כרכים סיכונים גדולים, התוצאה של הפרעות התנהגותיות רבות הקשורות לקו, והוא יכול לאפשר reperfusion דם (R) על ידי הסרת הברק פתיל4,5,6. MCAO/R נחשב גם מודל החיים תקן זהב של איסכמיה של המוח7. יתר על כן, חומרת הפגיעה במוח תלוי בקוטר ואת אורך הכניסה של בורג פתיל, משך של איסכמיה המוח, ואת משקל בעלי חיים (חולדות גדול יותר יש מוח גדול יותר כלי מוחין עבה)8. לכן, על ידי שינוי סוג הברק פתיל, את הזמן הסיכונים, ואת משקל החולדה, מודל מתאים ניתן למצוא עבור שלבי ההתאוששות והרצף של איסכמיה של המוח בחולדות MCAO/R. כדי לאמת את המודל עכברוש, ביצעו יום אחד, 35 יום, 60 יום, ו 90-יום מחקר של מודל MCAO/R באמצעות כתמים TTC ו sensorimotor פונקציות ניסויים (בדיקת סימטריה דו צדדית, מבחן הליכה הרשת, מבחן rotarod ומבחן חבל הרמה).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הנוהל והשימוש בנושאי בעלי חיים אושרו על ידי המכון הלאומי לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. פרוטוקול זה מותאם במיוחד עבור המבחנים של סגר עורק המוח האמצעי/reperfusion (MCAO/R) ו sensorimotor פונקציה.

1. תכנון וקיבוץ ניסיוניים

  1. השתמש עכברוש MCAO/R מודל למסך המוח חולדה השיטה מודל שיטת עם פגיעה חמורה יותר במוח ויחס הצלחה מודל גדול יותר באמצעות הציון של Longa ו TTC כתמים.
    1. בצעו את הניסוי על עכברי הג-דאולי הזכרים במשקל 260-330 גרם שגילם הוא 7-9 שבועות. משקל עכברוש אמיתי הוא 275 ± 15 g עבור 275 g, 300 ± 10 g עבור 300 g, ו 320 ± 10 g עבור 320 g.
    2. השתמש בשבע הקבוצות הבאות (משקל, סוג בורג פתיל, סיכונים time): קבוצה 1 עם 15 חולדות (275 g, 2636, 2 h); קבוצה 2 עם 15 חולדות (275 g, 2636, 3 שעות); קבוצה 3 עם 15 חולדות (275 g, 2838, 2 h); קבוצה 4 עם 15 חולדות (275 g, 2838, 3 h); קבוצה 5 עם 13 חולדות (300 g, 3040, 3 h); קבוצה 6 עם 10 חולדות (320 g, 3040, 3 h); קבוצה 7 עם 13 חולדות (300 g, 3043, 3 h).
  2. ללמוד את המצב התאוששות מוחית על-ידי כתמים TTC, ולהשתמש בדיקות sensorimotor function מתאים כדי לציין את לטווח ארוך הפונקציונליות הפונקציונלית על ידי מבחן סימטריה דו-סימטרי, מבחן הליכה ברשת, rotarod בדיקה ומתיחת חבל לאחר 1, 35, 60, 90 ימים של MCAO/R.
    1. השתמש בחולדות הגברי-דאולי במשקל 300 ± 10 g כי הם 8 עד 9 שבועות של גיל.
    2. השתמש בחמש הקבוצות הבאות: שליטה (רגילה) קבוצה עם 20 חולדות; קבוצה של יום אחד עם 16 חולדות; קבוצה 35 של יום עם 16 חולדות; קבוצה 60 של יום עם 17 חולדות; וקבוצת 90 ליום עם 19 עכברושים.
  3. לאחר הציון של Longa בשלב 1.1 או sensorimotor בדיקות תפקודית בשלב 1.2, הרדים ולערוף את ראשו של כל חולדות עבור כתמים TTC.

2. הקמת מודל MCAO/R חד צדדי בחולדות9

הערה: במהלך המבצע, השתמש במיקרולקחיים בעדינות כדי למנוע שבירת כלי הדם. הימנע נזק לעצבים ולכלי דם אחרים בצוואר החולדה כאשר כלי הקיבול מבודד. טיפול יש לנקוט כדי להציג טכניקה מתאימה אספטי עבור כל ההליכים כירורגי הישרדות. הטכניקה מומחש מאוחר יותר בווידאו יש לתרגל במהלך ההליך כולו.

  1. במהלך הניתוח, לשמור על טמפרטורת הגוף של חולדות ב 37.0 ± 0.5 ° c בתרמוסטט בעלי חיים קטנים. הכינו 4 התפרים 5-0 ס מ.
  2. הגדר את קצב זרימת החמצן של מכונת הרדמה בעלי חיים קטנה (עם מכשיר לטיפול בפסולת גז) ב 0.4-ליטר/דקה והריכוז של isofלאנה להיות 5%. מניחים את החולדה. במכונת ההרדמה
  3. לאחר שהחיה התעלפה, הניחו את העכברוש על שולחן כירורגי. לחבר את הפה של החולדה למסכה של מכונת ההרדמה (שיעור זרימת החמצן נשאר ללא שינוי; להתאים את הריכוז של isofלאנה להיות 3%). ודא כי החיה נכנס הרדמה עמוקה על ידי התבוננות בחוסר מתח הגפיים, רפלקסים הקרנית, וכאב.
  4. תקן את איבריו לשכב על שולחן הניתוחים עם תחבושות נייר (או כלים אחרים).
  5. הסר את מעיל הצוואר עם מכונת גילוח חשמלית ועקר עם 75% אלכוהול (שפתי-העין הוא טוב יותר). . תקן את הפה של העכברוש עם קרס
  6. חותכים 2-3 ס מ לאורך צורת האורך המרכזי של הצוואר עם מספריים אופטלמולוגי.
  7. . הפרד את עורק העורק המשותף הפרד את השריר התת-עורי. עם מלקחיים אופטלמולוגיות השתמש במפסק תוצרת בית כדי לחשוף במלואו את שדה הראייה. לאחר הפרדת השריר הקדמי של קנה הנשימה עם מלקחיים אופטלמולוגי, נפרדים לאורך גיד הירך הימני העין עד העורק הראשי המשותף גלוי.
  8. לבודד את עורק הראש המשותף, עורק הראש החיצוני ועורק הראש הפנימי עם מלקחיים אופטלמולוגי. ליגייט העורק הראשי המשותף (הקשר הקשה), עורק הראש החיצוני רחוק מקצה הלב (הקשר הקשה), עורק הראש הפנימי (קשר רופף) עם 5-0 תפרים. קו עורק הראש החיצוני ליד סוף הלב עם 5-0 תפרים.
  9. הוסף בורג הליך משנה. חותכים פתח קטן בעורק הראש החיצוני באמצעות מספריים אופטלמולוגי ומכניסים בעדינות את הבורג. שהיה בקשר רופף. וחתך את עורק העורק החיצוני
    1. שחררו את הקשר הרופף של עורק הראש הפנימי והמשיכו להוסיף את הברק לתחילת עורק המוח האמצעי (תפר מסומן). ואז לחתוך את בורג החוט החשוף.
  10. אחרי הזמן האיסכמי הוא הגיע (2-3 h), לתקן את השבר של עורק הראש החיצוני עם מיקרומלקחיים אחד, ובעדינות לשלוף את הבריח פתיל עם מיקרומלקחיים אחרים. כאשר הקצה הקדמי של בורג החוט הוא נסוג לחלוטין מן העורק הראשי הפנימי, לקחת את העורק הראשי החיצוני שהיה מצופה עם 5-0 תפרים, ולאחר מכן לשלוף את הבורג פתיל לחלוטין.
  11. שחרר את עורק הראש המשותף, ואת מיור ~ 50,000 U של אבקת נתרן על פני השטח של הפצע כדי למנוע זיהום. תפר תת שרירי ועור עם 4 תפרים.
  12. תן ~ 0.2 mL של תמיסת מלח סטרילי לחולדה דרך הפה באמצעות מזרק 1 מ מ (SQ-עט הזרקת הוא טוב יותר) כדי למנוע מחסור במים הניתוח לאחר הצבת חולדה בחזרה לכלוב.
  13. בחר את בעלי החיים לאחר 24 שעות של reperfusion על פי הציון של Longa10. בחר בעלי חיים עם הציון של Longa של 1 עד 3 עבור כתמים TTC הבא בשלב 1.1, ובעלי חיים עם הציון של Longa של 2 על 3 ציון עבור 1, 35, 60, 90 ימים לימוד בשלב 1.2.
    הערה: הציון של Longa10: 0 ציון, אין גרעון נוירולוגי; 1 ציון, אי להרחיב את החוק לקידמה שמאל; 2 ציון, מסתובב שמאלה; 3 ציון, נפילה שמאלה; 4 ציון, לא יכול ללכת ספונטנית ויש לו תודעה מדוכאת.
  14. לנתח את הציון של Longa על ידי בדרך אחת ANOVA. ערכים המוצגים מייצגים את הממוצע ± ש גויטיין P < 0.05 מציינים הפרש.

3. TTC צביעת

הערה: התבנית והלהב ממוח החולדה חייבים להיות מקורר מראש במקרר של 20 ° c לפני השימוש כדי למנוע הדבקה הנגרמת על ידי הבדל טמפרטורה גדול. במהלך הצביעת, למנוע הדבקה בין פרוסות המוח לבין צלחת התרבות, אשר יכול לגרום להכתמים מספיק.

  1. הרליד החולדה על ידי הזרקה תוך הצפק של 400 מ"ג/ק"ג כלוראל לאחר הציון של Longa בשלב 1.1 או בדיקות תפקודית sensorimotor בשלב 1.2.
  2. הוא ערוף את ראשו של העכברוש עם מספריים כירורגיים להסיר את המוח עם מספריים כירורגיים מלקחיים הומוסטטי.
  3. שים את המוח במקרר ב -20 ° c במשך 30 דקות כדי להקל על החיתוך.
  4. להסיר את המוח מהמקרר ולמקם אותו בתבנית מקורר המוח החולדה פרוסת. חותכים את המוח לשישה חלקים רצופים בעובי של 2 מ"מ עם להב מקורר.
  5. הכתם את הסעיפים עם 2% 5-triphenyl-2H-טטרזוכלוריד (TTC) בצלחת התרבות 6-היטב.
  6. התרבות הסעיפים של 30 עד 60 דקות ב-37 מעלות צלזיוס במיטת טלטול. הפוך את הסעיפים כל 10 דקות עד אזור איסכמיה של המוח ואת האזור הרגיל הם בבירור לבן ואדום.
  7. לסדר את פרוסות המוח באופן אנכי מהגב לקדמת המוח. השתמש בסרגל כדי לוודא שהאורך הכולל של כל שורה זהה. צלם תמונות עם מצלמה דיגיטלית.
  8. נתח את אמצעי האחסון הסיכונים.
    1. טרום טיפול בתמונה עם תוכנת photoshop
      1. יבא את התמונה באמצעות photoshop CS6. 00:00-00:14
      2. לחץ על בחירה כדי לבחור את פרוסות המוח, לחץ על בחר | הופכי. 00:15-00:36
      3. לחץ על הקידמה כדי לבחור בשחורולחץ על אישור. 00:37-00:42
      4. הקש Alt + Delete כדי למלא את צבע הרקע, ו- CTRL + D כדי לבטל את הבחירה. 00:43-00:46
      5. לחץ על קובץ | שמור לשולחן העבודה. 00:47-01:08
    2. הטיפול מראש את התמונה עם תוכנת תדמית Pro Plus.
      1. פתח תמונה Pro פלוס 6.0 תוכנה ולייבא את התמונה. 01:09-01:24
      2. לשינוי פגם, התאימו את הבהירות בעזרת הכלי שיפור ניגודיות , כך שהרקע יהיה שחור. 01:25-01:37
      3. השתמש בכלי חציון במסנן כדי להסיר את הסימונים. 01:38-01:46
    3. לחשב את האזור השמאלי (נורמלי) המוח עם תוכנת Pro פלוס תוכנה
      1. בחרו צבע בעזרת פילוח והתאימו את הערך של H/S/I, כך שפרוסות המוח מופרדות מהרקע השחור. 01:47-02:12
      2. חזור לספירה | . בגודלהזה 02:13-02:16
      3. לחץ על הספירה | פצל אובייקטים בעריכה כדי להפריד את המוח מהקו האמצע. התוכנה להבדיל באופן אוטומטי את אזורי המוח השמאלי והימני. 02:17-02:49
    4. לחשב את אזור המוח סיכונים הנכון עם תוכנה Pro Plus התמונה
      1. יישום שלב 3.8.1-3.8.2. 02:50-03:14
      2. בחר ספירה | . בגודלהזה 03:15-03:21
      3. לחץ על צייר | כלי מיזוג אובייקטים בעריכה. בחר באופן ידני את אזור האיסכמי ולחץ על Count כדי לחשב את אזור האיסכמי. 03:16-05:31
    5. לחשב את האזור בריאות המוח עם תוכנת Pro פלוס תוכנה
      1. יישום שלב 3.8.1-3.8.2. 05:32-06:44
      2. בחר צבע באמצעות פילוח והתאם את הערך של H/S/I, כך שהחלק הרגיל של פרוסות המוח מופרד מהרקע השחור. 06:45-07:10
      3. חזור לספירה | גודל ולחץ על הספירה כדי לחשב את האזור. 07:11-07:21
      4. לחץ על לפצל אובייקטים בעריכה כדי להפריד את המוח מאמצע הקו. התוכנה להבדיל באופן אוטומטי את אזורי המוח השמאלי והימני. 07:22-08:08
  9. חישוב אמצעי האחסון הסיכונים (%) והסיכונים וכיווץ אמצעי אחסון (%)

    סיכונים נפח (%) = [אזור ימני סיכונים/(2 x אזור המוח השמאלי)] x 100.
    סיכונים וכיווץ נפח (%) = [(שמאל אזור המוח הימני באזור המוח)/(2 x באזור המוח השמאלי)] x 100.

    הערה: המוח הימני הוא החלק הנפגע. הנתונים נותחו על-ידי ANOVA בכיוון אחד. ערכים המוצגים מייצגים את הממוצע ± ש גויטיין P < 0.05 מציינים הפרש.

4. הערכה של פונקציה sensorimotor

הערה: חולדות (300 g, 3040 בורג החוט, 3 המוח סיכונים זמן) עם הציון של Longa של 2 לפני 3 נבחרו לבצע ניסויים sensorimotor פונקציה מתוך 1-90 ימים. שמרו על שקט ואל תפריע לבעלי החיים בתקופה זו של הלימודים. הנתונים נותחו על-ידי ANOVA בשתי כיוון. ערכים המוצגים מייצגים את הממוצע ± ש גויטיין P < 0.05 מציינים הפרש.

  1. מבחן א-סימטריה הדו11
    1. סרט נייר עטוף (5 ס מ אורך, 0.8 ס מ רחב) על החלק saphenous של כל חוק לעכל של חולדה שלוש פעמים עם לחץ שווה.
    2. עבור כל עכברוש, להקליט את מספר הפעמים כל החוק לקידמה הוא קשר והקלטת הוסר ב 5 דקות עם המצלמה, כולל כף מושפע וזמני מושפע.
    3. לאחר 30 דקות, חזור על שלבים 4.1.1 ו-4.1.2 שוב.
    4. חשב את הערך הממוצע של ההטיה הsensorimotor (%)
      Sensorimotor הטיה (%) = (מושפע מפעם לפעם כפה מושפעות)/(כפה מושפעים פעמים + כפה מושפעות) x 100
  2. מבחן רשת-הליכה
    1. מניחים את העכברוש במרכז פלטפורמת שטח מוגבה (שטח: 1 m2; גובה: 90 ס מ) עם פתחי הרשת של 2.5 ס מ2.
    2. דחף את הירכיים של העכברוש בקלילות כדי לעודד את העכברוש לחצות את משטח הרשת.
    3. הקלט את מספר תקלות הרגל שנעשו על ידי הגפיים מושפע (מימין) ו מושפע (משמאל) ואת מספר השלב הכולל ב 1 דקות עם מצלמה.
    4. חשב את זמני השגיאה:
      זמני שגיאה (%) = [לא מושפע (מימין) האיבר מושפע (שמאל) הגפה]/מספר השלב הכולל x 100.
      הערה: מספר הצעדים הכולל מתחת לנתוני 20-השלבים הוסרו.
  3. Rotarod test12,13
    1. הגדר את העכברוש מסתובבת העכבר מנגנון עייפות (קוטר 90 מ"מ) של חולדות באמצעות התוכנה התומכת מהירות של 13 סל ד על פני תקופה של 5 דקות במחשב.
    2. הפעל את תוכניות המחשב ומניחים את העכברוש על rotarod לבי באותו זמן.
    3. לסיים את המשפט אם העכברוש נופל מן השלב או ממשיך ללכת 5 דקות ולהקליט את הזמן מסתובבת.
    4. . החולדה תנוח בעוד 30 דקות
    5. חזור על הצעדים 4.3.2-4.3.4 פעמיים ובחר את הערך המירבי כך שיהיה הזמן האחרון לסיבוב.
  4. מבחן חבל הרמה14
    1. מניחים את הכלי חבל הרמה (70 ס מ גבוה; החבל הוא 0.2 ס"מ קוטר ו 40 ס מ ארוך) על השולחן.
    2. החולדה תחזיק את החבל עם. התחת שלו ותתלה את העכברוש
    3. תעד את זמן התלייה וחשב את התוצאות.
      הערה: ציון של 3:0-2 על החבל; ציון של 2:3-4 על החבל; ציון של 1:5-6 על החבל; ציון של 0: יותר מ 7 על החבל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באמצעות ההליך הנ ל מודל MCAO/R עם הציון של Longa וצביעת TTC, טיפולים שונים של משקל ממוצע (275/300/320 g), סוגי בריחים (2636/2838/3040/3043; שולחן 1) ושעות האיסכמי (2-3 h) ו 1 יום reperfusion שימשו למסך עבור המודל איסכמיה המוח אופטימלית בחולדות. מודל פרמטרים של 300 גרם משקל, 3040 בורג חוט, ו 3 h המוח סיכונים זמן היו המתאימים ביותר עבור אוטם מוחין הגדול ביותר, הציון של Longa הגבוהה ביותר ויחס הצלחה מודל הגדול ביותר. זה השתפר באופן משמעותי על הטיפול המקובל של 275 גרם משקל, 2636 בורג פתיל, ו 2 h המוח סיכונים זמן (איור 1).

יתר על כן, חולדות עם 300 g משקל, 3040 בורג חוט, 3 h המוח סיכונים זמן ו 2-3 לונגה של הציון עברו sensorimotor בדיקות הפונקציה (בדיקת סימטריה דו צדדית, מבחן הליכה ברשת, מבחן rotarod, ו מבחן חבל הרמה) ו TTC צביעת ללמוד את ההתאוששות מצב של איסכמיה של המוח מ 1-90 ימים. נפח סיכונים וכיווץ היו 23.4%, 19.6%, 16.1% (p < 0.01, לעומת היום הראשון) ו 15.7% (p < 0.01, לעומת היום הראשון) לאחר 1, 35, 60, ו 90 ימים Post mcao/R, בהתאמה (איור 2). ביום הראשון לאחר MCAO/R, נפח סיכונים היה הגדול ביותר. עם הזמן, עוצמת הקול הסיכונים הפכה לקטנה יותר וכמות הכיווץ הפכה לגדולה יותר. כמות הסיכונים והכיווץ לא השתנו עוד לאחר 60 ימים של MCAO/R.

Sensorimotor הטיה במבחן הדו של א-סימטריה, הזמן שגיאה הליכה הרשת במבחן הליכה ברשת ואת הציון החבל להרים במבחן חבל הרמה כל גדל באופן משמעותי, בעוד הזמן rotarod במבחן rotarod ירדו באופן משמעותי לאחר 1 יום של MCAO/R (איור 3), אשר ציין כי כל ארבעת המבחנים היו משמעותיים בשלב של איסכמיה של המוח חריפה. עם זאת, רק sensorimotor הטיה שמרה על הפרעות פונקציונליות גדולות עם באופן תלוי זמן לאחר 35, 60 ו 90 ימים של MCAO/R. היו הבדלים משמעותיים של זמני שגיאה הליכה ברשת במבחן רשת הליכה אחרי 35 ו 60 ימים של MCAO/R. תוצאות אלה הראו כי בדיקת ה-סימטריה הדו ואת מבחן הליכה הרשת יכול להיות מתאים sensorimotor בדיקות הפונקציה לשלב של התאוששות ונצנצים בחולדות.

Figure 1
איור 1:300 גרם משקל, 3040 בורג חוט, 3 h המוח סיכונים זמן עשוי להיות מצב אופטימלי של הפגיעה במוח הנזק הנגרמת על ידי MCAO/R. (א, ב) תמונות והקרטוגרם של הנפח הסיכונים של רקמת המוח (n = 9-12). (C) הציון של longa (n = 9-12). (ד) הסטטיסטיקות של מודל יחס הצלחה של חולדות (n = 10 עד 15). מודל יחס הצלחה = (מספר כולל של חולדות מוות עכברי אחרי MCAO/R-כישלון חולדות לאחר MCAO/R)/מספר כולל של חולדות. חולדות כישלון הם חולדות המודל שאין להם את הציון המתאים של Longa. קווי שגיאה מייצגים ש גויטיין, *p < 0.05, * *p < 0.01. דמות זו שונתה מ-ליו ואח '15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: אמצעי האחסון הסיכונים והכיווץ הצטמצמה בהדרגה מ-1 עד 90 ימים לאחר MCAO/R. (A) הצביעת ttc של רקמת מוח חולדה. (ב) הקרטוגרמה לסיכונים ולכיווץ של נפח (n = 16-19). קווי שגיאה מייצגים את ש גויטיין, * *P < 0.01 לעומת היום הראשון שאחרי mcao/R. דמות זו שונתה מ-ליו ואח '15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מבחן א-סימטריה הדו ומבחן הליכה הרשת היו מתאימים פונקציה sensorimotor בדיקות התאוששות בשלב הרצף של איסכמיה של המוח. (א) האיבר הנכון קורע את היכולת הטובה ביותר בניסוי מליטה. (ב) זמני שגיאת הליכה ברשת במבחן הליכה ברשת. (ג) משך הזמן במבחן rotarod. (ד) הציון במבחן חבל הרמה. קווי שגיאה מייצגים ש גויטיין, n = 15-19, *P < 0.05, * * *P < 0.001. דמות זו שונתה מ-ליו ואח '15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

סוג הקוטר של בורג הפתיל קוטרו של ראש הברגה משקל מומלץ של חולדה רמת
2636 0.26 ממ ' 0.36 ממ ' 250-280 גרם A4
2838 0.28 ממ ' 0.38 ממ ' 280-350 גרם A4
3040 0.30 ממ ' 0.40 ממ ' 360-400 גרם A4
3043 0.30 ממ ' 0.43 ממ ' > 400 גר' A4
הערה: הברגה ברמת A4 היא התקן שהקצה הראשי הוא הקצה, החזית מכוסה בפולי-ליזין, מסומנים, מעוקרים ומשתמשים בהם ללא כל טיפול (הטבלה הזאת שונתה מ-ליו ואח ', 2018).

טבלה 1: מידע כתמי הליכי משנה. הטבלה הזאת שונתה מ-ליו ואח '15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

דגמים רבים הקמת שיטות ואינדיקטורים התנהגותיים כי הם משמשים היטב איסכמיה מוחית חריפה לא יכול להיות שינויים משמעותיים בשלבים ההתאוששות והרצף של איסכמיה של המוח16,17. עם זאת, מספר המטופלים עם הסכמי המוח של שלבי ההתאוששות והרצף הוא הגדול ביותר. זה חיוני כדי לבחור מודל מתאים בעלי חיים עבור שלבי ההתאוששות והרצף של שבץ איסכמיה.

אנו משתמשים מודל MCAO/R בחולדות כדי למסך את המשקל המתאים של חולדות (260-330 g), סוג של בורג החוט (2636/2838/3040/3043), ואת הזמן של סיכונים המוח (2-3 h) עבור פציעה סיכונים חמורה ביותר, יחס הצלחה מודל גבוה, ומחוונים התנהגותיים גלויים , אשר יהיה מתאים ההתאוששות בשלבים הרצף של איסכמיה של המוח.

חולדות כי שוקל 300 g עם בורג החוט 3040 ו 3 h המוח סיכונים הזמן יש כרכים סיכונים גדולים יותר, פגמים התנהגותיים חמורים יותר, ואת יחס הצלחה מודל גדול (איור 1). יתר על כן, סיפקנו שיטות אימות של מודל עכברוש זה על ידי TTC כתמים ובדיקות sensorimotor function (בדיקת סימטריה דו-צדדית, מבחן הליכה ברשת, rotarod test והרמת מבחן חבל) 1-90 ימים לאחר reperfusion. מצאנו כי הבדיקה הדו סימטריה ומבחן הליכה הרשת יכול לשמש כדי לחקור את שלבי התאוששות ונצנצים של איסכמיה כי הבדלים משמעותיים של מחוונים אלה האחרון 90 ימים ו 60 ימים, בהתאמה. ככל שנפח הסיכונים והכיווץ גדול יותר, כך הsensorimotor גרקות, שניתן לראות באיור 2 ובאיור 3.

שיטה זו מתאימה בעיקר לאיסכמיה של המוח הנגרמת על ידי MCAO. עם זאת, למודל יש הבדלים באנטופני המוח בין בני אדם וחולדות, כגון כיתה של מחזור המחזור הנלווה. מגבלה נוספת היא כי השחזור חומר לבן לא ניתן לראות על ידי כתמים TTC. מחקרים נוספים של מחזור סביבתי ושחזור חומר לבן עם הדמיה MR או שיטות אחרות יכול לאשר את הערך החזוי של מודל זה.

החומר הקריטי ביותר הוא כי המיומנות של יצירת מודל MCAO/R בחולדות הוא לא קל ודורש אימון. לפני הניסוי, לאשר יחס קביל הצלחה מודל מקביל. כלים ושיטות נוספים נחוצים כדי לבדוק את הפונקציה sensorimotor בשלבי ההתאוששות והרצף של שבץ. אם משימה קשה יותר, כגון הגדלת המהירות בין 10 ל-30 סל ד, נעשה שימוש בתקופה ארוכה יותר של גרעון במבחן הrotarod. בדיקות התנהגותיות אחרות עשוי להיות מתאים גם עבור מודל זה, כגון זיהוי הילוך. שיטות זיהוי מדויקות יותר יש להשתמש עבור חולים בשלבי ההתאוששות והסקוויה של איסכמיה של המוח, אשר יכול לזהות את ההשפעה של תרופות או כלים טיפוליים אחרים.

כמודל חיה חדש לחקור איסכמיה המוח בשלבי ההתאוששות והסקוויה, השיטה המוצגת כאן היא משמעותית וראויה לפופולריות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (81603315, 81603316), מפתח R & D תוכנית של מחוז ג'יאנגשי בסין (20171ach80001), פרויקטים תעשייתיים ושיתוף פעולה אקדמי במכללות ואוניברסיטאות של מחוז פוג'יין ב סין (2018Y41010011).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anatomical Microscope Leica (Germany) S8 Microscopic operating instrument
Blade Gellette / Cutting brain sections
Constant Temperature Shaking Bed Taicang Experimental Equipment Factory THZ-C To keep the brain sections stained evenly and at a constant temperature
Digital Camera Canon 700D For taking pictures of TTC staining
Electric Shaver Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. 3000# Removal of hair from the neck of rats
Forceps Hamostatic Shanghai Medical device Co., Ltd. 14 cm Using for brain removing
Image Pro Plus Software Media Cybernetics Inc. 6.0 Analyze the infarct volume
Isoflurane RWD Life Science 217170702 Anesthetic gas
Microforceps Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. 10 cm Vascular micromanipulation
Microshear Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. 10 cm Vascular micromanipulation
Ophthalmic Forceps Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. 10 cm Auxiliary skin and muscle anatomy
Pphthalmic Scissors Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. 10 cm Using for cutting the skin of neck
Rat Brain Slice Mold Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. 400 g For standard, uniform cutting of brain tissue
Rat Rotating Bar Fatigue Apparatus Anhui Zhenghua Biological Instrument and Equipment Co., Ltd. ZH-300B To test the sensorimotor function
Small Animal Anaesthesia Machine Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. ABM3000 A gas anesthetic machine
Small Animal Thermostat Beijing Damida Technology Co., Ltd. DM.7-YLS-20A To maintain animal body temperature constant during operation
Surgical Scissors Shanghai Medical device Co., Ltd. 16 cm Using for decapitate and brain removing
Suture Shanghai Jinhuan Medical Devices Co., Ltd. 4-0 / 5-0 Using for skin and muscle sutures / Using for vascular ligations
Thread Bolt Beijing Cinontech Co. Ltd. 2636/2838/3040/3043-A4 Blockage of the middle cerebral artery in rats
5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride (TTC) Sigma LOT#BCBP3272V Brain section staining reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kong, L. L., et al. Neutralization of chemokine-like factor 1, a novel C-C chemokine, protects against focal cerebral ischemia by inhibiting neutrophil infiltration via MAPK pathways in rats. Journal of Neuroinflammation. 11, 112 (2014).
  2. Jiang, M., et al. Neuroprotective effects of bilobalide on cerebral ischemia and reperfusion injury are associated with inhibition of pro-inflammatory mediator production and down-regulation of JNK1/2 and p38 MAPK activation. Journal of Neuroinflammation. 11, 167 (2014).
  3. Thomas, A., Detilleux, J., Flecknell, P., Sandersen, C. Impact of Stroke Therapy Academic Industry Roundtable (STAIR) Guidelines on Peri-Anesthesia Care for Rat Models of Stroke: A Meta-Analysis Comparing the Years 2005 and 2015. PLoS One. 12, e0170243 (2017).
  4. Kumar, A., Aakriti,, Gupta, V. A review on animal models of stroke: An update. Brain Research Bulletin. 122, 35-44 (2016).
  5. Tong, F. C., et al. An enhanced model of middle cerebral artery occlusion in nonhuman primates using an endovascular trapping technique. AJNR Am. Journal of Neuroradiology. 36, 2354-2359 (2015).
  6. Li, F., Omae, T., Fisher, M. Spontaneous hyperthermia and its mechanism in the intraluminal suture middle cerebral artery occlusion model of rats. Stroke. 30, 2464-2470 (1999).
  7. Herson, P. S., Traystman, R. J. Animal models of stroke: translational potential at present and in 2050. Future Neurology. 9, 541-551 (2014).
  8. Abrahám, H., Somogyvári-Vigh, A., Maderdrut, J. L., Vigh, S., Arimura, A. Filament size influences temperature changes and brain damage following middle cerebral artery occlusion in rats. Exp. Brain Res. 142, 131-138 (2002).
  9. Sun, M. N., et al. Coumarin derivatives protect against ischemic brain injury in rats. European Journal of Medicinal Chemistry. 67, 39-53 (2013).
  10. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
  11. Smith, E. J., et al. Implantation site and lesion topology determine efficacy of a human neural stem cell line in a rat model of chronic stroke. Stem Cell. 30, 785-796 (2012).
  12. Zhang, S., et al. Protective effects of Forsythia suspense extract with antioxidant and anti-inflammatory properties in a model of rotenone induced neurotoxicity. Neurotoxicology. 52, 72-83 (2016).
  13. Milani, D., et al. Poly-arginine peptides reduce infarct volume in a permanent middle cerebral artery rat stroke model. BMC Neuroscience. 17, 19 (2016).
  14. DeGraba, T. J., Ostrow, P., Hanson, S., Grotta, J. C. Motor performance, histologic damage, and calcium influx in rats treated with NBQX after focal ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 14, 262-268 (1994).
  15. Liu, P., et al. Validation of a preclinical animal model to assess brain recovery after acute stroke. European Journal of Pharmacology. 835, 75-81 (2018).
  16. Zuo, W., et al. IMM-H004 prevents toxicity induced by delayed treatment of tPA in a rat model of focal cerebral ischemia involving PKA-and PI3K-dependent Akt activation. European Journal of Neuroscience. 39, 2107-2118 (2014).
  17. Yang, L., et al. L-3-n-butylphthalide Promotes Neurogenesis and Neuroplasticity in Cerebral Ischemic Rats. CNS Neuroscience & Therapeutics. 21, 733-741 (2015).

Tags

מדעי המוח סוגיה 153 איסכמיה של המוח התאוששות בשלב הרצף עורק מוחין האמצעי חסימה/reperfusion סיכונים volume כתמים TTC sensorimotor פונקציה
מודל טרום קליני להעריך את ההתאוששות המוח לאחר שבץ חריף בחולדות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, P., Song, X. C., Yang, X. S.,… More

Liu, P., Song, X. C., Yang, X. S., Cao, Q. L., Tang, Y. Y., Liu, X. D., Yang, M., An, W. Q., Dong, B. X., Song, X. Y. A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats. J. Vis. Exp. (153), e60166, doi:10.3791/60166 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter