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Neuroscience

चूहों में तीव्र स्ट्रोक के बाद मस्तिष्क वसूली का आकलन करने के लिए एक प्रीक्लिनिकल मॉडल

Published: November 6, 2019 doi: 10.3791/60166
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 3, 1, 1, 1, 1
1Beijing Yinfeng Dingcheng Biological Engineering Technology Ltd., 2Hulunbuir People's Hospital, 3Shandong Qilu Stem Cell Engineering Co. Ltd.
* These authors contributed equally

Summary

इस अध्ययन का उद्देश्य 1-90 के बाद मध्य मस्तिष्क धमनी occlusion/reperfusion (MCAO/R) के बाद मस्तिष्क इंफेक्शन और संवेदी कार्य का परीक्षण करके मस्तिष्क इस्केमिया की वसूली और अगली कड़ी चरणों में अनुसंधान के लिए एक पशु मॉडल की स्थापना और पुष्टि करना है चूहों में दिन।

Abstract

इस अध्ययन का उद्देश्य वसूली और अगली कड़ी चरणों में एक पशु मस्तिष्क इस्केमिया मॉडल की स्थापना और मान्य करना था। नर स्प्राग-डावले चूहों में एक मध्य मस्तिष्क धमनी ऑक्सीलेशन/रिपरफ्यूजन (MCAO/R) मॉडल चुना गया था । चूहे के वजन (260−330 ग्राम) को बदलकर, थ्रेड बोल्ट प्रकार (2636/2838/3040/3043) और मस्तिष्क infarct समय (2-3 घंटे), एक उच्च लोंगा स्कोर, एक बड़ा infarct मात्रा और एक बड़ा मॉडल सफलता अनुपात लोंगा के स्कोर और टीटीसी धुंधला का उपयोग कर के जांच की गई । इष्टतम मॉडल स्थिति (300 ग्राम, 3040 थ्रेड बोल्ट, 3 एच मस्तिष्क इंफ्लेट समय) का अधिग्रहण किया गया था और संवेदी मोटर कार्यों और infarct मात्रा के मूल्यांकन के माध्यम से रिपरफ्यूजन के बाद 1-90 दिन अवलोकन अवधि में उपयोग किया गया था। इन स्थितियों में, द्विपक्षीय विषमता परीक्षण में 1 से 90 दिनों तक एक महत्वपूर्ण अंतर था, और ग्रिड-वॉकिंग परीक्षण में 1 से 60 दिनों तक एक महत्वपूर्ण अंतर था; दोनों मतभेद एक उपयुक्त संवेदी मोटर कार्यात्मक परीक्षण हो सकता है। इस प्रकार, मस्तिष्क इस्केमिया की वसूली और अगली कड़ी चरणों में एक उपन्यास चूहा मॉडल की सबसे उपयुक्त स्थिति पाई गई: 300 ग्राम चूहे जो 3 एच मस्तिष्क infarct के लिए 3040 थ्रेड बोल्ट के साथ MCAO से गुजरे और फिर रिपरफ्यूज किए गए। उपयुक्त संवेदी विज्ञान कार्यात्मक परीक्षण एक द्विपक्षीय विषमता परीक्षण और ग्रिड-वॉकिंग परीक्षण थे।

Introduction

मस्तिष्क इस्केमिया को विभिन्न पोस्ट-स्ट्रोक संकेतकों के साथ तीन चरणों में विभाजित किया गया है: तीव्र चरण (1 सप्ताह के भीतर), वसूली चरण (1 सप्ताह से 6 महीने), और अगली कड़ी चरण (6 महीने से अधिक) । वर्तमान में, अधिकांश अध्ययन अपने महत्वपूर्ण प्रभाव और बहु-सापेक्ष अनुसंधान मॉडल1,2,3के कारण मस्तिष्क इस्केमिया के तीव्र चरण पर ध्यान केंद्रित करते हैं। हालांकि, मस्तिष्क इस्केमिया की वसूली और अगली कड़ी चरणों को विकलांग की दीर्घकालिक जटिलता के कारण नजरअंदाज नहीं किया जा सकता है। इसलिए, इस अध्ययन का उद्देश्य मस्तिष्क इस्केमिया की वसूली और अगली कड़ी चरणों पर शोध करने के लिए एक स्थिर, विश्वसनीय और अपेक्षाकृत सरल पशु मॉडल का पता लगाना है।

कई प्रयोगात्मक मस्तिष्क इस्केमिया मॉडल में, हम सही मध्य मस्तिष्क धमनी (एमसीए) में थ्रेड बोल्ट प्रविष्टि के माध्यम से मध्य मस्तिष्क धमनी ऑक्सीलेशन (MCAO) का उपयोग करते हैं। यह मॉडल मानव स्ट्रोक के समान है, जो बड़े अनाप-शनाप मात्रा का उत्पादन कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप स्ट्रोक से संबंधित कई व्यवहार विकार होते हैं, और थ्रेड बोल्ट4,5,6को हटाकर रक्त रिपरफ्यूजन (आर) की अनुमति दे सकते हैं। MCAO/R भी मस्तिष्क इस्केमिया7के सोने के मानक पशु मॉडल माना जाता है । इसके अलावा, मस्तिष्क की चोट की गंभीरता व्यास और धागे बोल्ट की प्रविष्टि लंबाई, मस्तिष्क इस्केमिया की अवधि, और पशु वजन (बड़े चूहों बड़ा दिमाग और मोटा मस्तिष्क वाहिकाओं है)8पर निर्भर करता है । इसलिए, थ्रेड बोल्ट प्रकार, इंफर्ट टाइम और चूहे के वजन को बदलकर, MCAO/R चूहों में मस्तिष्क इस्केमिया की वसूली और अगली कड़ी चरणों के लिए एक उपयुक्त मॉडल पाया जा सकता है। चूहे के मॉडल को मान्य करने के लिए, हमने टीटीसी धुंधला और संवेदी कार्य प्रयोगों (एक द्विपक्षीय विषमता परीक्षण, ग्रिड-वॉकिंग टेस्ट, रोटारोड टेस्ट और एक लिफ्टिंग रस्सी परीक्षण) का उपयोग करके MCAO/R मॉडल के 1 दिन, ३५-दिन, ६०-दिवस और ९० दिन के अध्ययन का प्रदर्शन किया ।

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Protocol

प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान द्वारा पशु विषयों की प्रक्रिया और उपयोग को मंजूरी दी गई है । इस प्रोटोकॉल को विशेष रूप से मध्य मस्तिष्क धमनी ऑक्सीकरण/रिपरफ्यूजन (MCAO/R) और संवेदी मोटर समारोह के परीक्षणों के लिए समायोजित किया जाता है ।

1. प्रायोगिक डिजाइन और समूह

  1. एक चूहा MCAO/आर मॉडल का उपयोग करें और अधिक गंभीर मस्तिष्क की चोट और अधिक से अधिक मॉडल सफलता अनुपात के साथ एक चूहा मस्तिष्क इस्कीमिक मॉडल विधि स्क्रीन करने के लिए है Longa स्कोर और टीटीसी धुंधला का उपयोग कर ।
    1. पुरुष स्प्राग-डाबले चूहों पर प्रयोग करें जिसका वजन 260−330 ग्राम है जो 7−9 सप्ताह की उम्र के हैं। असली चूहे का वजन 275 ग्राम के लिए 275 ± 15 ग्राम, 300 ग्राम के लिए 300 ± 10 ग्राम और 320 ग्राम के लिए 320 ± 10 ग्राम है।
    2. निम्नलिखित सात समूहों (वजन, धागा बोल्ट प्रकार, infarct समय): 15 चूहों के साथ समूह 1 (275 ग्राम, 2636, 2 एच) का उपयोग करें; 15 चूहों के साथ समूह 2 (275 ग्राम, 2636, 3 घंटे); 15 चूहों के साथ समूह 3 (275 ग्राम, 2838, 2 घंटे); 15 चूहों के साथ समूह 4 (275 ग्राम, 2838, 3 घंटे); 13 चूहों (300 ग्राम, 3040, 3 एच) के साथ समूह 5; 10 चूहों के साथ समूह 6 (320 ग्राम, 3040, 3 घंटे); समूह 7 13 चूहों के साथ (300 ग्राम, 3043, 3 घंटे)।
  2. टीटीसी धुंधला द्वारा मस्तिष्क वसूली की स्थिति का अध्ययन करें, और द्विपक्षीय विषमता परीक्षण, ग्रिड-वॉकिंग टेस्ट, रोटारोड परीक्षण और MCAO/R के 90 दिनों के बाद रस्सी परीक्षण उठाने के द्वारा दीर्घकालिक कार्यात्मक घाटे को इंगित करने के लिए उपयुक्त सेंसरीमोटर फ़ंक्शन परीक्षणों का उपयोग करें।
    1. पुरुष स्प्राग-डाबले चूहों का उपयोग करें जिनका वजन 300 ± 10 ग्राम है जो 8−9 सप्ताह की उम्र के हैं।
    2. निम्नलिखित पांच समूहों का उपयोग करें: 20 चूहों के साथ एक नियंत्रण (सामान्य) समूह; 16 चूहों के साथ एक दिन का समूह; 16 चूहों के साथ एक 35 दिन का समूह; 17 चूहों के साथ एक 60 दिन का समूह; और 19 चूहों के साथ एक 90 दिन का समूह।
  3. चरण 1.1 में लोंगा के स्कोर या चरण 1.2 में संवेदी मोटर कार्यात्मक परीक्षणों के बाद, टीटीसी धुंधला करने के लिए सभी चूहों को एनेस्थेट करें और काटना।

2. चूहों में एकतरफा MCAO/R मॉडल की स्थापना9

नोट: ऑपरेशन के दौरान, रक्त वाहिका के टूटने को रोकने के लिए माइक्रोफोर्सकाधीरे का उपयोग करें। जब बर्तन अलग हो जाता है तो चूहे की गर्दन में नसों और अन्य रक्त वाहिकाओं को नुकसान से बचें। देखभाल के लिए सभी अस्तित्व शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के लिए उपयुक्त aseptic तकनीक पेश करने के लिए लिया जाना चाहिए। वीडियो में बाद में सचित्र तकनीक पूरी प्रक्रिया के माध्यम से अभ्यास किया जाना चाहिए।

  1. सर्जरी के दौरान, चूहों के शरीर के तापमान को एक छोटे जानवर थर्मोस्टेट में 37.0 ± 0.5 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें। चार 6 सेमी 5-0 टांके तैयार करें।
  2. एक छोटे पशु संज्ञाहरण मशीन (एक अपशिष्ट गैस उपचार उपकरण के साथ) की ऑक्सीजन प्रवाह दर 0.4−0.6 एल/मिन और isoflurane की एकाग्रता 5% पर सेट करें। चूहे को एनेस्थीसिया मशीन में रखें।
  3. जानवर के बेहोश होने के बाद चूहे को सर्जिकल फिक्सिंग टेबल पर रखें। चूहे के मुंह को संज्ञाहरण मशीन के मुखौटे से जोड़ें (ऑक्सीजन प्रवाह दर अपरिवर्तित रहती है; आइसोफ्लोरीन की एकाग्रता को 3% तक समायोजित करें। इस बात की पुष्टि करें कि जानवर चरम तनाव, कॉर्नियल सजगता और दर्द की कमी को देखकर गहरे संज्ञाहरण में प्रवेश कर गया है।
  4. कागज पट्टियों (या अन्य उपकरण) के साथ ऑपरेटिंग टेबल पर झूठ बोलने के लिए अपने अंगों को ठीक करें।
  5. एक इलेक्ट्रिक शेवर के साथ गर्दन कोट निकालें और 75% शराब के साथ बंध्याकरण (iodophor बेहतर है)। चूहे के मुंह को हुक से ठीक करें।
  6. नेत्र कैंची के साथ गर्दन के केंद्रीय देशीयंधात्मक आकार के साथ 2−3 सेमी काटें।
  7. आम कैरोटिड धमनी को अलग कर दें। नेत्र संदंश के साथ चमड़े के नीचे की मांसपेशी को अलग कर लें। दृष्टि के क्षेत्र को पूरी तरह से बेनकाब करने के लिए घर का बना रिट्रैक्टर का उपयोग करें। नेत्र संदंश के साथ श्वासनली की पूर्वकाल मांसपेशी को अलग करने के बाद, सामान्य कैरोटिड धमनी दिखाई देने तक सही स्टरनोसेडोमामासुइड टेंडन के साथ अलग-अलग।
  8. आम कैरोटिड धमनी, बाहरी कैरोटिड धमनी और नेत्र संदंश के साथ आंतरिक कैरोटिड धमनी को अलग कर दें। दिल के अंत (हार्ड गाँठ), और आंतरिक कैरोटिड धमनी (ढीली गाँठ) से दूर आम कैरोटिड धमनी (हार्ड गाँठ), 5-0 टांके के साथ लिगेट करें। दिल के पास बाहरी कैरोटिड धमनी को 5-0 टांके के साथ समाप्त करें।
  9. एक धागा बोल्ट डालें। नेत्र कैंची का उपयोग कर बाहरी कैरोटिड धमनी में एक छोटे से खोलने में कटौती और धीरे से एक धागा बोल्ट डालें। बाहरी कैरोटिड धमनी के सीवन को लिगेट करें जो ढीले गाँठ में रहा है और बाहरी कैरोटिड धमनी को काट दिया है।
    1. आंतरिक कैरोटिड धमनी की ढीली गाँठ को ढीला करें और मध्य मस्तिष्क धमनी (सीवन चिह्नित) की शुरुआत में थ्रेड बोल्ट को सम्मिलित करना जारी रखें। इसके बाद उजागर धागे के बोल्ट को काट लें।
  10. इस्कीमिक समय (2-3 घंटे) तक पहुंचने के बाद, बाहरी कैरोटिड धमनी के फ्रैक्चर को एक माइक्रोफोर्सप्स के साथ ठीक करें, और धीरे-धीरे एक और माइक्रोफोर्सप्स के साथ थ्रेड बोल्ट को खींचें। जब थ्रेड बोल्ट के सामने के छोर को आंतरिक कैरोटिड धमनी से पूरी तरह से वापस ले लिया जाता है, तो बाहरी कैरोटिड धमनी को लिगेट करें जो 5-0 टांके के साथ लाइन में खड़ा था, और फिर थ्रेड बोल्ट को पूरी तरह से बाहर निकाल ें।
  11. आम कैरोटिड धमनी को ढीला करें, और संक्रमण को रोकने के लिए घाव की सतह पर पेनिसिलिन सोडियम पाउडर के ~ 50,000 यू लीपापोती करें। 4 टांके के साथ टांके चमड़े की मांसपेशियों और त्वचा।
  12. चूहे को वापस पिंजरे में रखने के बाद पश्चात पानी की कमी को रोकने के लिए 1 मिलील सिरिंज (वर्ग-पेन इंजेक्शन बेहतर है) का उपयोग करके चूहे को बाँझ खारा के ~ 0.2 mL दें।
  13. लोंगा के स्कोर10के अनुसार 24 घंटे के रिपरफ्यूजन के बाद जानवरों को चुनें । कदम 1.1 में अगले टीटीसी धुंधला के लिए 1−3 के लोंगा के स्कोर वाले जानवरों का चयन करें, और 1, 35, 60, 90 दिनों के अध्ययन के लिए 1, 35, 60, 90 दिनों के अध्ययन के लिए 2−3 स्कोर वाले लौंगा के स्कोर वाले जानवर1.2 चरण में।
    नोट: लोंगा का स्कोर10:0 स्कोर, कोई न्यूरोलॉजिकल घाटा; 1 स्कोर, बाएं फोरक्लॉ का विस्तार करने में विफलता; 2 स्कोर, बाईं ओर चक्कर; 3 स्कोर, बाईं ओर गिरने; 4 स्कोर, अनायास नहीं चल सकता और एक उदास चेतना है।
  14. एक तरह से ANOVA द्वारा लोंगा के स्कोर का विश्लेषण करें । दिखाए गए मूल्यों का मतलब ± एसडी पी एंड एलटी; ०.०५ अंतर का संकेत देते हैं ।

3. टीटीसी धुंधला

नोट: चूहा मस्तिष्क टुकड़ा मोल्ड और ब्लेड एक बड़े तापमान अंतर की वजह से आसंजन को रोकने के लिए उपयोग करने से पहले एक -20 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में पूर्व ठंडा किया जाना चाहिए। धुंधला करने के दौरान, मस्तिष्क स्लाइस और संस्कृति प्लेट के बीच आसंजन को रोकें, जिसके परिणामस्वरूप अपर्याप्त धुंधला हो सकता है।

  1. कदम १.१ या १.२ में संवेदी मोटर कार्यात्मक परीक्षणों में लोंगा के स्कोर के बाद ४०० मिलीग्राम/किलो क्लोरल हाइड्रेट के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा चूहे को एनेस्थेटाइज करें ।
  2. सर्जिकल कैंची के साथ या चूहे के डेपुटेशन उपकरण के साथ चूहे को काटना। सर्जिकल कैंची और हीमोस्टैटिक संदंश के साथ मस्तिष्क को हटा दें।
  3. टुकड़ा करने की क्रिया की सुविधा के लिए मस्तिष्क को 30 डिग्री सेल्सियस के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में रखें।
  4. फ्रिज से मस्तिष्क निकालें और इसे पूर्व-ठंडा चूहा मस्तिष्क स्लाइस मोल्ड में रखें। मस्तिष्क को पूर्व-कूल्ड ब्लेड के साथ लगातार छह 2-मिमी मोटी लगातार धाराओं में काट ें।
  5. 6-अच्छी संस्कृति प्लेट में 2% 5-ट्रिप्हेल-2एच-टेट्राजोलियम क्लोराइड (टीटीसी) के साथ वर्गों को दाग दें।
  6. एक मिलाते हुए बिस्तर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30−60 0 0 00 00 के लिए वर्गों संस्कृति। मस्तिष्क इस्केमिया क्षेत्र और सामान्य क्षेत्र स्पष्ट रूप से सफेद और लाल होने तक हर 10 मीटर के खंडों को फ्लिप करें।
  7. रेखा मस्तिष्क के पीछे से मस्तिष्क के सामने क्रम में खड़ी स्लाइस। यह सुनिश्चित करने के लिए एक शासक का उपयोग करें कि प्रत्येक पंक्ति की कुल लंबाई समान है। डिजिटल कैमरे के साथ तस्वीरें ले लो।
  8. इंफर्ट वॉल्यूम का विश्लेषण करें।
    1. प्री-ट्रीटमेंट फोटोशॉप सॉफ्टवेयर के साथ फोटो
      1. फोटोशॉप CS6 का उपयोग करके फोटो आयात करना। 00:00-00:14
      2. क्लिक करें मस्तिष्क स्लाइस का चयन करने के लिए चुनें, चुनें क्लिक करें . उलटा। 00:15-00:36
      3. काले रंग का चयन करने के लिए अग्रभूमि पर क्लिक करें और OKक्लिक करें । 00:37-00:42
      4. पृष्ठभूमि रंग को भरने के लिए ऑल्ट +डिलीट करें, और सीटीआरएल +डी को डिसेलेक्ट करने के लिए। 00:43-00:46
      5. क्लिक करें फाइल . डेस्कटॉप पर सेव करें। 00:47-01:08
    2. इमेज प्रो प्लस सॉफ्टवेयर के साथ फोटो को प्री-ट्रीटमेंट करें।
      1. ओपन इमेज प्रो प्लस 6.0 सॉफ्टवेयर और फोटो आयात करें। 01:09-01:24
      2. दोष संशोधन के लिए, कंट्रास्ट एन्हांसमेंट टूल के साथ चमक को समायोजित करें, ताकि पृष्ठभूमि काली हो। 01:25-01:37
      3. हाइलाइट्स को हटाने के लिए फ़िल्टर में मीडियन टूल का उपयोग करें। 01:38-01:46
    3. इमेज प्रो प्लस सॉफ्टवेयर के साथ बाएं (सामान्य) मस्तिष्क क्षेत्र की गणना करें
      1. विभाजन का उपयोग कर रंग का चयन करें और एच/एस/Iके मूल्य को समायोजित करें, ताकि मस्तिष्क स्लाइस काले रंग की पृष्ठभूमि से अलग हो जाएं। 01:47-02:12
      2. गिनती पर लौटें । आकार। 02:13-02:16
      3. क्लिक करें काउंट पर क्लिक करें । मस्तिष्क को मिडलाइन से अलग करने के लिए एडिट में ऑब्जेक्ट्स को विभाजित करें। सॉफ्टवेयर अपने आप बाएं और दाएं मस्तिष्क क्षेत्रों में भेद करेगा। 02:17-02:49
    4. इमेज प्रो प्लस सॉफ्टवेयर के साथ सही इंफर्ट मस्तिष्क क्षेत्र की गणना करें
      1. चरण 3.8.1-3.8.2 लागू करें। 02:50-03:14
      2. चुनें गिनती । आकार। 03:15-03:21
      3. ड्रॉ पर क्लिक करें । एडिटमें ऑब्जेक्ट्स टूल को मर्ज करें। इस्कीमिक क्षेत्र का मैन्युअल रूप से चयन करें और इस्कीमिक क्षेत्र की गणना करने के लिए काउंट पर क्लिक करें। 03:16-05:31
    5. इमेज प्रो प्लस सॉफ्टवेयर के साथ स्वास्थ्य मस्तिष्क क्षेत्र की गणना करें
      1. चरण 3.8.1-3.8.2 लागू करें। 05:32-06:44
      2. विभाजन का उपयोग कर रंग का चयन करें और एच/एस/Iके मूल्य को समायोजित करें, ताकि मस्तिष्क स्लाइस का सामान्य हिस्सा काली पृष्ठभूमि से अलग हो सके। 06:45-07:10
      3. गिनती पर लौटें । आकार और इस क्षेत्र की गणना करने के लिए गिनती पर क्लिक करें। 07:11-07:21
      4. मिडलाइन से मस्तिष्क को अलग करने के लिए एडिट में स्प्लिट ऑब्जेक्ट्स पर क्लिक करें। सॉफ्टवेयर अपने आप बाएं और दाएं मस्तिष्क क्षेत्रों में भेद करेगा। 07:22-08:08
  9. इंफर्ट वॉल्यूम (%) और infarct और सिकुड़मात्रा (%):

    Infarct मात्रा (%) = [दाएं infarct क्षेत्र/(2 x बाएं मस्तिष्क क्षेत्र)] x १०० ।
    Infarct और हटना मात्रा (%) = [बाएं मस्तिष्क क्षेत्र-सही स्वास्थ्य मस्तिष्क क्षेत्र)/(2 एक्स बाएं मस्तिष्क क्षेत्र)] x १०० ।

    नोट: सही मस्तिष्क घायल हिस्सा है। आंकड़ों का विश्लेषण एक तरह से ANOVA द्वारा किया गया । दिखाए गए मूल्यों का मतलब ± एसडी पी एंड एलटी; ०.०५ अंतर का संकेत देते हैं ।

4. संवेदी मोटर समारोह का आकलन

नोट: चूहों (300 ग्राम, 3040 धागा बोल्ट, 3 एच मस्तिष्क infarct समय) 2−3 के एक लोंगा स्कोर के साथ 1-90 दिनों से संवेदी समारोह प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए चुना गया था। चुप रहें पढ़ाई के इस दौर में जानवरों को परेशान न करें। आंकड़ों का विश्लेषण दो तरह से ANOVA द्वारा किया गया । दिखाए गए मूल्यों का मतलब ± एसडी पी एंड एलटी; ०.०५ अंतर का संकेत देते हैं ।

  1. द्विपक्षीय विषमता परीक्षण11
    1. समान दबाव के साथ तीन बार चूहे के प्रत्येक फोरक्लॉ के सैफेनॉस हिस्से पर पेपर टेप (5 सेमी लंबा, 0.8 सेमी चौड़ा) लपेटें।
    2. प्रत्येक चूहे के लिए, रिकॉर्ड समय की संख्या प्रत्येक फोरक्लॉ से संपर्क किया जाता है और टेप कैमरे के साथ 5 मिन में हटा दिया जाता है, जिसमें अप्रभावित पंजा समय और प्रभावित पंजा बार शामिल हैं।
    3. 30 मिन के बाद, फिर से चरण 4.1.1 और 4.1.2 दोहराएं।
    4. सेंसरीमोटर पूर्वाग्रह (%): के औसत मूल्य की गणना करें:
      सेंसरीमोटर पूर्वाग्रह (%) = (अप्रभावित पंजा बार - प्रभावित पंजा बार) / (अप्रभावित पंजा बार + प्रभावित पंजा बार+ प्रभावित पंजा बार) x 100
  2. ग्रिड-वॉकिंग टेस्ट
    1. चूहे को एक ऊंचा ग्रिड सतह मंच (क्षेत्र: 1 मीटर2;ऊंचाई: 90 सेमी) के केंद्र में 2.5 सेमी2के ग्रिड उद्घाटन के साथ रखें।
    2. चूहे के कूल्हों को हल्के से पुश करें ताकि चूहे को ग्रिड की सतह को पार करने के लिए प्रोत्साहित किया जा सके।
    3. अप्रभावित (दाएं) और प्रभावित (बाएं) अंगों द्वारा किए गए पैर दोषों की संख्या और कैमरे के साथ 1 मिन में कुल चरण संख्या रिकॉर्ड करें।
    4. त्रुटि के समय की गणना करें:
      त्रुटि समय (%) = [अप्रभावित (दाएं) अंग - प्रभावित (बाएं) अंग]/कुल चरण संख्या x 100।
      नोट: 20-चरण डेटा से नीचे के चरणों की कुल संख्या हटा दी गई थी।
  3. रोटारोद टेस्ट12,13
    1. कंप्यूटर पर 5 मिन अवधि में 13 आरपीएम की गति के लिए सहायक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर चूहों के चूहे घूर्णन बार थकान तंत्र (व्यास 90 मिमी) की स्थापना करें।
    2. कंप्यूटर प्रोग्राम शुरू करें और चूहे को एक ही समय में रोटारोड छड़ों पर रखें।
    3. यदि चूहा पायदान से गिर जाता है या 5 मिन के लिए घूमता रहता है और घूर्णन समय रिकॉर्ड करता है तो एक परीक्षण समाप्त करें।
    4. 30 मिन के लिए चूहा आराम है।
    5. दो बार और अधिक चरण 4.3.2−4.3.4 दोहराएं और अंतिम घूर्णन समय होने के लिए अधिकतम मूल्य चुनें।
  4. लिफ्टिंग रोप टेस्ट14
    1. उठाने वाली रस्सी उपकरण (70 सेमी ऊंचा; रस्सी व्यास में 0.2 सेमी और 40 सेमी लंबी) को डेस्क पर रखें।
    2. चूहे को अपने अग्रअंगों से रस्सी पकड़ लें और चूहे को लटका एं।
    3. फांसी के समय को रिकॉर्ड करें और स्कोर की गणना करें।
      नोट: रस्सी पर 3: 0−2 एस का स्कोर; 2 का स्कोर: रस्सी पर 3−4 एस; 1 का स्कोर: रस्सी पर 5−6 एस; 0 का स्कोर: रस्सी पर 7 से अधिक एस।

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Representative Results

एक लोंगा के स्कोर और टीटीसी धुंधला के साथ एक MCAO/आर मॉडल के लिए ऊपर उल्लिखित प्रक्रिया का उपयोग करना, औसत वजन के विभिन्न उपचार (275/300/320 ग्राम), बोल्ट प्रकार (2636/2838/3040/3043; तालिका 1) और इस्कीमिक बार (2-3 एच) और 1 दिन के रिपरफ्यूजन का उपयोग चूहों में इष्टतम मस्तिष्क इस्केमिया मॉडल के लिए स्क्रीन करने के लिए किया गया था। 300 ग्राम वजन, 3040 थ्रेड बोल्ट, और 3 एच मस्तिष्क infarct समय के मॉडल मापदंडों सबसे बड़ा सेरेब्रल इंफार्क्शन, उच्चतम लोंगा स्कोर और सबसे बड़ा मॉडल सफलता अनुपात के लिए सबसे उपयुक्त थे। यह 275 ग्राम वजन, 2636 थ्रेड बोल्ट, और 2 एच मस्तिष्क इंफ्लेट समय(चित्रा 1)के पारंपरिक उपचार पर काफी सुधार हुआ था।

इसके अलावा, ३०० ग्राम वजन वाले चूहों, ३०४० धागा बोल्ट, 3 एच मस्तिष्क infarct समय और एक 2−3 Longa स्कोर संवेदी मोटर समारोह परीक्षण (एक द्विपक्षीय विषमता परीक्षण, एक ग्रिड चलने परीक्षण, एक रोटारोद परीक्षण, और एक उठाने रस्सी परीक्षण) और टीटीसी वसूली का अध्ययन करने के लिए दाग से गुजरना पड़ा 1-90 दिनों से मस्तिष्क इस्केमिया की स्थिति। पहले दिन की तुलना में 1,35, 60 और 90 दिनों के बाद एमसीएओ/आर के बाद क्रमशः(चित्रा 2)के बाद 15.7%(पी एंड एलटी; 0.01) और 15.7% (पी एंड एलटी; 0.01) और 15.7%(पी एंड एलटी; 0.01) थे। MCAO/R के बाद पहले दिन, infarct मात्रा सबसे बड़ी थी । कुछ समय बाद, अनास्ताक मात्रा छोटी हो गई और सिकुड़ने की मात्रा बड़ी हो गई। Infarct और हटना मात्रा अब MCAO के ६० दिनों के बाद बदल/

द्विपक्षीय विषमता परीक्षण में संवेदी पूर्वाग्रह, ग्रिड चलने परीक्षण में ग्रिड चलने त्रुटि समय और उठाने रस्सी परीक्षण में उठाने रस्सी स्कोर सभी काफी वृद्धि हुई है, जबकि रोटारोद परीक्षण में रोटारोद समय काफी 1 के बाद कमी आई MCAO/R(चित्रा 3)का दिन, जिसने संकेत दिया कि तीव्र मस्तिष्क इस्केमिया के चरण में सभी चार परीक्षण सार्थक थे । हालांकि, केवल संवेदी पूर्वाग्रह ने MCAO/R के ३५, ६० और ९० दिनों के बाद समय पर निर्भर तरीके से बड़े कार्यात्मक विकारों को बनाए रखा । MCAO/R के ३५ और ६० दिनों के बाद ग्रिड चलने परीक्षण में ग्रिड चलने त्रुटि समय के महत्वपूर्ण मतभेद थे । इन परिणामों से संकेत मिलता है कि द्विपक्षीय विषमता परीक्षण और ग्रिड-वॉकिंग परीक्षण चूहों में वसूली और सीक्वेला के चरण के लिए उपयुक्त संवेदी कार्य परीक्षण हो सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: ३०० ग्राम वजन, ३०४० धागा बोल्ट, 3 एच मस्तिष्क infarct समय मस्तिष्क इस्कीमिक चोट की इष्टतम स्थिति MCAO द्वारा प्रेरित हो सकता है/ (ए, बी) मस्तिष्क के ऊतकों की इंफर्ट वॉल्यूम के चित्र और कार्टोग्राम (एन = 9−12)। (C)लोंगा का स्कोर (n= 9−12)। (D)चूहों के मॉडल सफलता अनुपात के आंकड़े (n = 10−15)। मॉडल सफलता अनुपात = (चूहों की कुल संख्या-MCAO के बाद मौत चूहों/R-MCAO के बाद विफलता चूहों/चूहों की कुल संख्या । विफलता चूहों मॉडल चूहों कि एक उपयुक्त लोंगा स्कोर नहीं है। त्रुटि सलाखों के एसडी, *पी एंड लेफ्टिनेंट; ०.०५, **पी एंड लेफ्टिनेंट; ०.०१ का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस आंकड़े को लियू एट अल15से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: infarct और हटना मात्रा धीरे से MCAO के बाद 1 से ९० दिनों के लिए कम हो गया/ (क)चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों का टीटीसी धुंधला। (ख)इंफर्ट और सिकोड़ने की मात्रा (एन = 16−19) का कार्टोग्राम। त्रुटि सलाखों के एसडी, **पी एंड लेफ्टिनेंट; ०.०१ बनाम MCAO/R के बाद पहले दिन का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस आंकड़े को लियू एट अल15से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: द्विपक्षीय विषमता परीक्षण और ग्रिड-वॉकिंग परीक्षण मस्तिष्क इस्केमिया की वसूली और अगली कड़ी चरण में उपयुक्त संवेदी कार्य परीक्षण थे। (क)सही अंग को डिबॉन्डिंग प्रयोग में अनुकूलता फाड़ रहा है । (ख)ग्रिड चलने के परीक्षण में ग्रिड चलने त्रुटि समय । }रोटारोड टेस्ट में समय की लंबाई। (घ)रोप टेस्ट उठाने में स्कोर । त्रुटि सलाखों के एसडी, एन = 15−19, *पी एंड एलटी; 0.05, ***पी एंड एलटी; 0.001 का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस आंकड़े को लियू एट अल15से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्रकार धागा बोल्ट का व्यास धागा बोल्ट सिर का व्यास चूहे का अनुशंसित वजन स्तर
2636 0.26 मिमी 0.36 मिमी 250-280 ग्राम A4
2838 0.28 मिमी 0.38 मिमी 280-350 ग्राम A4
3040 0.30 मिमी 0.40 मिमी 360-400 ग्राम A4
3043 0.30 मिमी 0.43 मिमी 400 ग्राम A4
नोट: A4 स्तर धागा बोल्ट मानक है कि सिर अंत गोलार्द्ध है, सामने अंत पाली-lysine, चिह्नित, निष्फल, और खरीद पर उपयोग के बिना किसी भी उपचार के साथ कवर किया जाता है (इस मेज लियू एट अल से संशोधित किया गया है., २०१८) ।

तालिका 1: थ्रेड ब्लॉट जानकारी। इस तालिका को लियू एट अल15से संशोधित किया गया है ।

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Discussion

एक्यूट सेरेब्रल इस्केमिया में अच्छी तरह से उपयोग किए जाने वाले विधियों और व्यवहार संकेतकों की स्थापना करने वाले कई मॉडलों में मस्तिष्क इस्केमिया16,17की वसूली और अगली कड़ी चरणों में महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं हो सकते हैं । हालांकि, वसूली और अगली कड़ी चरणों में मस्तिष्क इस्कीमिक के साथ रोगियों की संख्या सबसे बड़ी है। इस्केमिया स्ट्रोक की वसूली और अगली कड़ी चरणों के लिए एक उपयुक्त पशु मॉडल का चयन करना आवश्यक है।

हम चूहों के उपयुक्त वजन (260−330 ग्राम), धागे बोल्ट के प्रकार (2636/2838/3040/3043) और सबसे गंभीर infarct चोट के लिए मस्तिष्क infarct (2-3 घंटे) के समय, एक उच्च मॉडल सफलता अनुपात, और दिखाई व्यवहार संकेतक स्क्रीन करने के लिए चूहों में MCAO/R मॉडल का उपयोग करें , जो मस्तिष्क इस्केमिया की वसूली और अगली कड़ी चरणों के लिए उपयुक्त होगा।

चूहों कि एक 3040 धागा बोल्ट और 3 एच मस्तिष्क infarct समय के साथ 300 ग्राम वजन बड़ा infarct संस्करणों, अधिक गंभीर व्यवहार दोषहै, और एक बड़ा मॉडल सफलता अनुपात(चित्रा 1)। इसके अलावा, हमने रीपरफ्यूजन के 1-90 दिनों बाद टीटीसी धुंधला और संवेदी कार्य परीक्षण (द्विपक्षीय विषमता परीक्षण, ग्रिड-वॉकिंग टेस्ट, रोटारोड परीक्षण और रस्सी परीक्षण उठाने) द्वारा इस चूहे मॉडल के सत्यापन विधियां प्रदान की हैं। हमने पाया कि द्विपक्षीय विषमता परीक्षण और ग्रिड-वॉकिंग परीक्षण का उपयोग इस्केमिया की वसूली और अगली कड़ी चरणों पर शोध करने के लिए किया जा सकता है क्योंकि इन संकेतकों के महत्वपूर्ण अंतर क्रमशः ९० दिन और ६० दिन हैं । अfarct और हटना मात्रा जितना बड़ा है, संवेदी घाटे जितना गंभीर होगा, जिसे चित्रा 2 और चित्रा 3में देखा जा सकता है।

यह विधि मुख्य रूप से MCAO के कारण मस्तिष्क इस्केमिया के लिए उपयुक्त है। हालांकि, मॉडल में मनुष्यों और चूहों के बीच मस्तिष्क शरीर रचना विज्ञान में अंतर है, जैसे कि संपाश्र्वक परिसंचरण का ग्रेड। एक और सीमा यह है कि सफेद पदार्थ वसूली टीटीसी धुंधला द्वारा नहीं देखा जा सकता है । श्री इमेजिंग या अन्य तरीकों के साथ जमानत परिसंचरण और सफेद पदार्थ वसूली के आगे के अध्ययन इस मॉडल के भविष्य कहनेवाला मूल्य की पुष्टि कर सकते हैं ।

सबसे महत्वपूर्ण मामला यह है कि चूहों में MCAO/R मॉडल बनाने का कौशल आसान नहीं है और अभ्यास की आवश्यकता है । प्रयोग से पहले, एक स्वीकार्य और समानांतर मॉडल सफलता अनुपात की पुष्टि करें। स्ट्रोक की वसूली और अगली कड़ी चरणों में संवेदी कार्य का परीक्षण करने के लिए अधिक उपकरणों और तरीकों की आवश्यकता होती है। अगर ज्यादा मुश्किल काम जैसे स्पीड को 10 से बढ़ाकर 30 आरपीएम किया गया तो रोटारोड टेस्ट में डेफिसिट की लंबी अवधि दिखाई दे सकती है। अन्य व्यवहार परीक्षण भी इस मॉडल के लिए उपयुक्त हो सकते हैं, जैसे चाल का पता लगाना। मस्तिष्क इस्केमिया की वसूली और अगली कड़ी चरणों में रोगियों के लिए अधिक सटीक पहचान विधियों का उपयोग किया जाना चाहिए, जो दवा या अन्य चिकित्सीय उपकरणों के प्रभाव की पहचान कर सकते हैं।

वसूली और अगली कड़ी चरणों में मस्तिष्क इस्केमिया का अध्ययन करने के लिए एक नए पशु मॉडल के रूप में, यहां प्रस्तुत विधि सार्थक है और लोकप्रिय होने की हकदार है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (८१६०३३१५, ८१६०३३१६), चीन में जियांग्शी प्रांत की प्रमुख अनुसंधान और डी योजना (20171ACH80001), फुजियान प्रांत के कॉलेजों और विश्वविद्यालयों में औद्योगिक और अकादमिक सहयोग परियोजनाओं द्वारा समर्थित किया गया था चीन (2018Y41010011) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anatomical Microscope Leica (Germany) S8 Microscopic operating instrument
Blade Gellette / Cutting brain sections
Constant Temperature Shaking Bed Taicang Experimental Equipment Factory THZ-C To keep the brain sections stained evenly and at a constant temperature
Digital Camera Canon 700D For taking pictures of TTC staining
Electric Shaver Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. 3000# Removal of hair from the neck of rats
Forceps Hamostatic Shanghai Medical device Co., Ltd. 14 cm Using for brain removing
Image Pro Plus Software Media Cybernetics Inc. 6.0 Analyze the infarct volume
Isoflurane RWD Life Science 217170702 Anesthetic gas
Microforceps Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. 10 cm Vascular micromanipulation
Microshear Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. 10 cm Vascular micromanipulation
Ophthalmic Forceps Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. 10 cm Auxiliary skin and muscle anatomy
Pphthalmic Scissors Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. 10 cm Using for cutting the skin of neck
Rat Brain Slice Mold Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. 400 g For standard, uniform cutting of brain tissue
Rat Rotating Bar Fatigue Apparatus Anhui Zhenghua Biological Instrument and Equipment Co., Ltd. ZH-300B To test the sensorimotor function
Small Animal Anaesthesia Machine Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. ABM3000 A gas anesthetic machine
Small Animal Thermostat Beijing Damida Technology Co., Ltd. DM.7-YLS-20A To maintain animal body temperature constant during operation
Surgical Scissors Shanghai Medical device Co., Ltd. 16 cm Using for decapitate and brain removing
Suture Shanghai Jinhuan Medical Devices Co., Ltd. 4-0 / 5-0 Using for skin and muscle sutures / Using for vascular ligations
Thread Bolt Beijing Cinontech Co. Ltd. 2636/2838/3040/3043-A4 Blockage of the middle cerebral artery in rats
5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride (TTC) Sigma LOT#BCBP3272V Brain section staining reagent

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References

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न्यूरोसाइंस इश्यू १५३ ब्रेन इस्केमिया रिकवरी और सीक्वेल स्टेज मिडिल सेरेब्रल धमनी ऑक्क्लेन/रिपरफ्यूजन इनफेक्ट वॉल्यूम टीटीसी धुंधला सेंसरीमोटर फंक्शन
चूहों में तीव्र स्ट्रोक के बाद मस्तिष्क वसूली का आकलन करने के लिए एक प्रीक्लिनिकल मॉडल
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Liu, P., Song, X. C., Yang, X. S.,… More

Liu, P., Song, X. C., Yang, X. S., Cao, Q. L., Tang, Y. Y., Liu, X. D., Yang, M., An, W. Q., Dong, B. X., Song, X. Y. A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats. J. Vis. Exp. (153), e60166, doi:10.3791/60166 (2019).

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