Summary
Formålet med denne studien er å etablere og validere en dyr modell for forskning i utvinningen og sequela stadier av hjernen iskemi ved å teste hjerneinfarkt og Sensorimotor funksjon etter midten cerebral arterien okklusjon/reperfusion (MCAO/R) etter 1-90 dager hos rotter.
Abstract
Hensikten med denne studien var å etablere og validere et dyr hjernen iskemi modell i utvinningen og sequela stadier. En middel hjerne arterien okklusjon/reperfusion (MCAO/R) modell i mannlig Sprague-Dawley rotter ble valgt. Ved å endre rotte vekten (260 − 330 g), ble tråd bolt typen (2636/2838/3040/3043) og hjerneinfarkt tid (2-3 h), en høyere Longa-poengsum, et større infarkt volum og et større suksess forhold i modellen vist ved hjelp av Longa poengsum og TTC-farging. Den optimale modellen tilstand (300 g, 3040 tråd bolt, 3 h Brain infarkt tid) ble kjøpt og brukt i en 1-90 dagers observasjons periode etter reperfusion via vurdering av Sensorimotor funksjoner og infarkt volum. Ved disse forholdene, den bilaterale asymmetri test hadde en betydelig forskjell fra 1 til 90 dager, og Grid-walking test hadde en betydelig forskjell fra 1 til 60 dager; begge forskjellene kan være en passende Sensorimotor funksjonstest. Således, de fleste passende forfatning av en romersk rotten modell inne gjennervervelsen og sequela scener av hjerne iskemi var grunnlegge: 300 g rotter det gjennomgikk MCAO med en 3040 tråden bolt for en 3 h hjerneinfarkt og så reperfused. De riktige Sensorimotor funksjons testene var en bilateral asymmetri test og et rutenett-walking test.
Introduction
Brain iskemi er delt inn i tre stadier med ulike post-takts indikatorer: den akutte scenen (innen 1 uke), utvinning scenen (1 uke til 6 måneder), og sekvele scenen (mer enn 6 måneder). I dag, de fleste studier fokus på den akutte fasen av hjernen iskemi på grunn av sin betydelige effekt og multi-relative forskning modeller1,2,3. Men, utvinning og sekvele stadier av hjernen iskemi kan ikke ignoreres på grunn av deres langsiktige komplikasjoner av funksjonshemminger. Derfor er hensikten med denne studien er å utforske en stabil, pålitelig og relativt enkel dyremodell til forskning utvinning og sequela stadier av hjernen iskemi.
Blant de mange eksperimentelle hjernen iskemi modeller, bruker vi middels cerebral arterien okklusjon (MCAO) via tråden bolt innsetting i høyre midten cerebral arterien (MCA). Denne modellen er lik menneskets hjerneslag, som kan produsere større infarkt volumer, resultere i mange atferdsforstyrrelser knyttet til hjerneslag, og kan tillate blod reperfusion (R) ved å fjerne tråden bolt4,5,6. MCAO/R er også betraktet gullstandarden dyret modell av hjernen iskemi7. Videre avhenger alvorlighetsgraden av hjerne skaden på diameteren og innsetting lengden av tråden bolten, varigheten av hjernen iskemi, og dyret vekt (større rotter har større hjerner og tykkere cerebral fartøy)8. Derfor, av skiftende tråden bolt type, infarkt tid, og rotta vekt, en passende modell kan grunnlegge for gjennervervelsen og sequela scener av hjerne iskemi inne MCAO/R rotter. For å validere rotte modellen, utførte vi en 1-dag, 35-dagers, 60-dag, og 90-dagers studie av MCAO/R-modellen ved hjelp av TTC farging og Sensorimotor funksjon eksperimenter (en bilateral asymmetri test, et rutenett-walking test, en rotarod test og en løfting tau test).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prosedyren og bruk av dyre har blitt godkjent av National Institute of Health for omsorg og bruk av forsøksdyr. Denne protokollen er spesielt tilpasset for tester av middels cerebral arterien okklusjon/reperfusion (MCAO/R) og Sensorimotor funksjon.
1. eksperimentell design og gruppering
- Bruk en rotte MCAO/R modellen til skjermen en rotte hjerne iskemiske modell metoden med mer alvorlig hjerneskade og større modell suksess ratio bruker Longa score og TTC farging.
- Utfør eksperimentet på hann Sprague-Dawley rotter som veier 260 − 330 g som er 7 − 9 ukers alder. Den virkelige rotte vekten er 275 ± 15 g for 275 g, 300 ± 10 g for 300 g, og 320 ± 10 g for 320 g.
- Bruk følgende sju grupperinger (vekt, tråd bolt type, infarkt tid): gruppe 1 med 15 rotter (275 g, 2636, 2 h); gruppe 2 med 15 rotter (275 g, 2636, 3 h); gruppe 3 med 15 rotter (275 g, 2838, 2 h); gruppe 4 med 15 rotter (275 g, 2838, 3 h); gruppe 5 med 13 rotter (300 g, 3040, 3 h); gruppe 6 med 10 rotter (320 g, 3040, 3 h); gruppe 7 med 13 rotter (300 g, 3043, 3 h).
- Studer hjernen utvinning status ved TTC farging, og bruke egnede Sensorimotor funksjonstester for å indikere den langsiktige funksjonelle underskudd av den bilaterale asymmetri test, Grid-walking test, rotarod test og løfting tau test etter 1, 35, 60, 90 dager MCAO/R.
- Bruk hann Sprague-Dawley rotter som veier 300 ± 10 g som er 8 − 9 ukers alder.
- Bruk følgende fem grupperinger: en kontroll (normal) gruppe med 20 rotter; en 1 dag gruppe med 16 rotter; en 35 dag gruppe med 16 rotter; en 60 dag gruppe med 17 rotter; og en 90 dag gruppe med 19 rotter.
- Etter Longa score i trinn 1,1 eller Sensorimotor funksjonstester i trinn 1,2, dop og halshugge alle rotter for TTC farging.
2. etablering av en ensidig MCAO/R-modell i rotter9
Merk: under operasjonen, bruk microforceps forsiktig for å hindre at blodkaret brekker. Unngå skade på nerver og andre blodårer i nakken på rotte når fartøyet er isolert. Det må utvises forsiktighet for å presentere hensiktsmessig aseptisk teknikk for alle kirurgiske inngrep. Teknikken illustrert senere i videoen skal praktiseres gjennom hele prosedyren.
- Gjennom hele operasjonen, opprettholde kroppstemperaturen på rotter ved 37,0 ± 0,5 ° c i en liten dyr termostat. Forbered fire 6 cm 5-0 sting.
- Sett oksygen strømningshastigheten til en liten dyr anestesi maskin (med en avfalls gass behandlingsenhet) ved 0,4 − 0,6 L/min, og konsentrasjonen av isoflurane skal være 5%. Plasser rotta i anestesi maskinen.
- Etter at dyret har besvimte, plassere rotte på et kirurgisk feste bord. Koble munningen av rotte til masken av anestesi maskinen (oksygen strømningshastigheten forblir uendret, justere konsentrasjonen av isoflurane å være 3%). Bekreft at dyret har gått inn i dyp bedøvelse ved å observere en mangel på ekstremiteter spenning, hornhinne reflekser og smerte.
- Fest bena til å ligge på operasjonsbordet med papir bandasjer (eller andre verktøy).
- Fjern hals pelsen med en elektrisk barbermaskin og sterilisere med 75% alkohol (jodofor er bedre). Fix munningen av rotte med en krok.
- Klipp 2 − 3 cm langs den sentrale langsgående formen på nakken med en saks.
- Skill den vanlige hals puls arterien. Skill subkutan muskel med øye tang. Bruk hjemmelaget retractor for å fullt ut eksponere synsfeltet. Etter å separere den fremre muskelen i luftrøret med øye tang, separate langs høyre sternocleidomastoid sene til den vanlige hals puls arterien er synlig.
- Isoler den vanlige hals puls arterien, den ytre hals puls arterien og den innvendige halspulsåren med øye tang. Ombinde den vanlige hals puls arterien (hard knute), ekstern hals puls arterie langt fra hjerte enden (hard knute), og intern hals puls arterie (løs knute) med 5-0 sting. Linje den eksterne hals puls arterien nær hjertet enden med 5-0 sting.
- Sett inn en tråd bolt. Skjær en liten åpning i den ytre hals puls arterien ved hjelp av en saks og forsiktig sette inn en tråd bolt. Ombinde Sutur av den eksterne hals puls arterien som har vært i løs knute og avskåret den eksterne hals puls arterien.
- Løsne den løse knute av den interne halspulsåren og Fortsett å sette inn tråd bolten til begynnelsen av midten cerebral arterien (Sutur merket). Deretter avskåret den eksponerte tråd bolten.
- Etter at iskemiske tiden er nådd (2-3 h), fikse brudd på eksterne hals puls arterien med en microforceps, og forsiktig trekke ut tråden bolten med en annen microforceps. Når den fremre enden av tråden bolten er helt trukket fra den interne halspulsåren, ombinde den eksterne hals puls arterien som var foret med 5-0 sting, og deretter trekke ut tråden bolten helt.
- Løsne den vanlige hals puls arterien, og Daub ~ 50 000 U av penicillin natrium pulver på overflaten av såret for å hindre smitte. Sutur subkutan muskler og hud med 4 sting.
- Gi ~ 0,2 mL sterilt saltvann til rotte oralt ved hjelp av en 1 mL sprøyte (SQ-pennen injeksjon er bedre) for å hindre postoperativ vannmangel etter plassere rotte tilbake til buret.
- Velg dyrene etter 24 timers reperfusion i henhold til Longa score10. Velg dyr med en Longa-poengsum på 1 − 3 for neste TTC-farging i trinn 1,1, og dyr med en Longa-poengsum på 2 − 3 for 1, 35, 60, 90 dagers studie i trinn 1,2.
Merk: Longa poengsum10: 0 poeng, ingen nevrologiske underskudd; 1 poeng, unnlatelse av å forlenge venstre foreclaw; 2 poeng, sirkle til venstre; 3 poeng, fallende til venstre; 4 poeng, kan ikke gå spontant og har en deprimert bevissthet. - Analyser Longa poengsum med enveis ANOVA. Verdiene som vises representerer gjennomsnittlig ± S.D. P < 0,05 indikerer forskjellen.
3. TTC farging
Merk: rotte hjernen Slice mold og blad må være pre-avkjølt i et-20 ° c kjøleskap før bruk for å hindre vedheft forårsaket av en stor temperatur forskjell. Under farging, forhindre vedheft mellom hjerne skiver og kultur platen, noe som kan resultere i utilstrekkelig farging.
- Bedøve rotte ved intraperitoneal injeksjon av 400 mg/kg kloralhydrat hydrat etter Longa poengsum i trinn 1,1 eller Sensorimotor funksjonstester i trinn 1,2.
- Halshugge rotta med kirurgisk saks eller med en rotte halshogging apparat. Fjern hjernen med kirurgisk saks og hemostatic tang.
- Sett hjernen i kjøleskapet på-20 ° c i 30 min for å lette kutting.
- Fjern hjernen fra kjøleskapet og legg den i pre-avkjølt rotte hjernen skive mold. Skjær hjernen i seks 2 mm tykke sammenhengende seksjoner med en pre-avkjølt blad.
- Stain seksjonene med 2% 5-trifenylfosfat-2H-tetrazolium klorid (TTC) i en 6-brønn kultur plate.
- Kultur seksjonene for 30 − 60 min ved 37 ° c i en riste seng. Vend seksjonene hver 10 min til hjernen iskemi området og det normale området er klart hvitt og rødt.
- Linje hjernen skiver vertikalt i rekkefølge fra baksiden til forsiden av hjernen. Bruk en linjal for å sikre at den totale lengden på hver linje er den samme. Ta bilder med digitalkamera.
- Analyser det infarkt volumet.
- Pre-behandling bildet med Photoshop-programvare
- Importer bildet ved hjelp av Photoshop CS6. 00:00-00:14
- Klikk Velg for å velge hjerne sektorene, klikk Velg | Inverse. 00:15-00:36
- Klikk forgrunn for å velge svart, og klikk OK. 00:37-00:42
- Trykk alt + delete for å fylle bakgrunnsfargen, og CTRL + D for å oppheve merkingen. 00:43-00:46
- Klikk på fil | Lagre på skrivebordet. 00:47-01:08
- Pre-behandling bildet med Image Pro Plus-programvare.
- Open Image Pro Plus 6,0 programvare og importere bildet. 01:09-01:24
- For defekt modifisering, Juster lysstyrken med kontrast forbedrings verktøyet, slik at bakgrunnen er svart. 01:25-01:37
- Bruk median -verktøyet i filter til å fjerne høylys. 01:38-01:46
- Beregn venstre (normal) hjerne område med Image Pro Plus-programvare
- Velg farge ved hjelp av segmentering, og Juster verdien for H/S/i, slik at hjerne stykkene skilles fra den svarte bakgrunnen. 01:47-02:12
- Tilbake til Count | Størrelse. 02:13-02:16
- Klikk på Count | Split objekter i redigere å skille hjernen fra midtlinjen. Programvaren vil automatisk skille mellom venstre og høyre hjerneområder. 02:17-02:49
- Beregn det riktige infarkt hjerne området med Image Pro Plus-programvaren
- Iverksette trinn 3.8.1-3.8.2. 02:50-03:14
- Velg antall | Størrelse. 03:15-03:21
- Klikk på Draw | Flett objekter -verktøyet i Rediger. Manuelt velge iskemiske området og klikk Count å beregne iskemiske området. 03:16-05:31
- Beregn helse hjernen området med Image Pro Plus-programvare
- Iverksette trinn 3.8.1-3.8.2. 05:32-06:44
- Velg farge ved hjelp av Segmentering og Juster verdien av H/S/i, slik at den normale delen av hjerne skiver skilles fra den svarte bakgrunnen. 06:45-07:10
- Tilbake til Count | Størrelse og klikk på Count for å beregne dette området. 07:11-07:21
- Falle i staver opp på up emner inne redigere å separat hjernen fra midtlinjen. Programvaren vil automatisk skille mellom venstre og høyre hjerneområder. 07:22-08:08
- Pre-behandling bildet med Photoshop-programvare
- Beregn infarkt volum (%) og infarkt og krympe volum (%):
Infarkt volum (%) = [høyre infarkt område/(2 x venstre hjerne område)] x 100.
Infarkt og krympe volum (%) = [(venstre hjerne område-rett helse hjernen området)/(2 x venstre hjerne området)] x 100.
Merk: den rette hjernen er den skadde delen. Dataene ble analysert av enveis ANOVA. Verdiene som vises representerer gjennomsnittlig ± S.D. P < 0,05 indikerer forskjellen.
4. vurdering av Sensorimotor funksjon
Merk: rotter (300 g, 3040 tråd bolt, 3 h hjerneinfarkt tid) med en Longa score på 2 − 3 ble valgt til å utføre Sensorimotor funksjonen eksperimenter fra 1-90 dager. Hold stille og ikke forstyrre dyrene i denne perioden av studien. Dataene ble analysert av toveis ANOVA. Verdiene som vises representerer gjennomsnittlig ± S.D. P < 0,05 indikerer forskjellen.
- Bilateral asymmetri test11
- Pakk papir tape (5 cm lang, 0,8 cm bred) på den saphenavenen delen av hver foreclaw av en rotte tre ganger med lik trykk.
- For hver rotten, fortegnelse antallet av timene hver foreclaw er henvendte til og tape fjernet inne 5 min med kameraet, inkluderer upåvirket pote timene og berørt pote timene.
- Etter 30 minutter, gjentar du trinn 4.1.1 og 4.1.2 igjen.
- Beregn gjennomsnittsverdien for Sensorimotor bias (%):
Sensorimotor bias (%) = (upåvirket labb ganger-berørte labb ganger)/(upåvirket labb ganger + berørte labb ganger) x 100
- Grid-Turgåing test
- Plasser rotte i midten av en forhøyet Grid overflate plattform (område: 1 m2; høyde: 90 cm) med gitter åpninger på 2,5 cm2.
- Presse rotta ' HIPS lett å oppmuntre rotta å Travers gitteret overflate.
- Registrere antall fot feil gjort av upåvirket (høyre) og berørte (venstre) lemmer og det totale trinn tallet i 1 min med kamera.
- Beregn feilen ganger:
Feil klokkeslett (%) = [upåvirket (høyre) lem-påvirket (venstre) lem]/Total trinn nummer x 100.
Merk: Totalt antall trinn under 20-trinns data ble fjernet.
- Rotarod test12,13
- Sette opp rotta roterer stang fatigue apparat (diameter 90 mm) av rotter benytter det hjelper programvare å en fart av 13 RPM over en 5 min periode på computer.
- Starte computeren planer og sted rotta på rotarod trinnene samtidig.
- End en prøve hvis rotta faller av det rung eller holder gåing for 5 min og fortegnelse det roterer tid.
- Ha rotta hvile for 30 min.
- Gjenta trinn 4.3.2 − 4.3.4 to ganger til, og velg maksimumsverdien som skal være siste roterende tid.
- Løfte tau test14
- Plasser løfte tauet instrument (70 cm høy, tauet er 0,2 cm i diameter og 40 cm lang) på skrivebordet.
- Har rotta grep tauet med dens forelimbs og hang rotta.
- Registrere tidspunktet for hengende og beregne score.
Merk: en poengsum på 3:0 − 2 s på tauet; En poengsum på 2:3 − 4 s på tauet; En poengsum på 1:5 − 6 s på tauet; En poengsum på 0: mer enn 7 s på tauet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av ovennevnte prosedyren for en MCAO/R modell med Longa score og TTC farging, ulike behandlinger av gjennomsnittlig vekt (275/300/320 g), bolt typer (2636/2838/3040/3043; Tabell 1) og iskemiske tider (2-3 h) og 1 dag reperfusion ble brukt til skjermen for den optimale hjernen iskemi modell i rotter. Modell parametre av 300 g vekt, 3040 tråd bolt, og 3 h hjerneinfarkt tid var mest egnet for de største cerebral hjerteinfarkt, høyeste Longa score og beste modell suksess ratio. Dette ble betydelig forbedret på konvensjonell behandling av en 275 g vekt, 2636 tråd bolt, og 2 h Brain infarkt tid (figur 1).
Videre rotter med 300 g vekt, 3040 tråd bolt, 3 h hjerneinfarkt tid og en 2 − 3 Longa poengsum gjennomgikk Sensorimotor funksjonstester (en bilateral asymmetri test, en Grid-walking test, en rotarod test, og en løfting tau test) og TTC flekker å studere utvinning status for hjernen iskemi fra 1-90 dager. Den infarkt og krympe volumet var 23,4%, 19,6%, 16,1% (p < 0,01, sammenlignet med den første dagen) og 15,7% (p < 0,01, sammenlignet med den første dagen) etter 1, 35, 60, og 90 dager post MCAO/R, henholdsvis (figur 2). På den første dagen etter MCAO/R var infarkt volum størst. I tid, infarkt volumet ble mindre og krympe volumet ble større. Det infarkt og Krype Kvantum ikke lenger forandret etter 60 dager av MCAO/R.
Den Sensorimotor bias i den bilaterale asymmetri test, rutenettet-walking feil ganger i rutenettet-walking test og løfte tauet score i løfte tauet testen alle betydelig økt, mens rotarod tid i rotarod testen redusert betraktelig etter 1 dag MCAO/R (Figur 3), som indikerte at alle fire testene var meningsfulle i den fasen av akutte hjernen iskemi. Men, bare Sensorimotor bias opprettholdt store funksjonelle lidelser med en tidsavhengig måte etter 35, 60 og 90 dager MCAO/R. Det var betydelige forskjeller i rutenett-walking feil ganger i rutenettet-walking test etter 35 og 60 dager MCAO/R. Disse resultatene indikerte at den bilaterale asymmetri test og rutenett-walking test kan være egnet Sensorimotor funksjonstester for stadiet av utvinning og sequela i rotter.
Figur 1:300 g vekt, 3040 tråd bolt, 3 h hjernen infarkt tid kan være den optimale tilstanden til hjernen iskemiske skade indusert av MCAO/R. (A, B) Bilder og Cartogram av infarkt volum av hjernevev (n = 9 − 12). (C) Longa poengsum (n = 9 − 12). (D) statistikken for modell suksess ratio av rotter (n = 10 − 15). Modell suksess ratio = (totalt antall rotter-død rotter etter MCAO/R-svikt rotter etter MCAO/R)/total antall rotter. Svikt rotter er modell rottene som ikke har en passende Longa score. Feilfelt representerer S.D., *p < 0,05, * *p < 0,01. Dette tallet har blitt modifisert fra Liu et al.15. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: infarkt og krympe volumet gradvis redusert fra 1 til 90 dager etter MCAO/R. (A) den TTC farging av rotte hjernevev. (B) Cartogram av infarkt og krymper volum (n = 16 − 19). Feilfelt representerer S.D., * *P < 0,01 kontra den første dagen etter MCAO/R. Dette tallet har blitt modifisert fra Liu et al.15. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: bilateral asymmetri test og rutenett-walking test var egnet Sensorimotor funksjonen tester i utvinningen og sequela stadium av hjernen iskemi. (A) høyre lem rive preferanse i limet eksperiment. (B) rutenett-walking feil ganger i rutenett-walking test. (C) hvor lang tid i rotarod test. (D) stillingen i løfte tau test. Feilfelt representerer S.D., n = 15 − 19, *p < 0,05, * * *p < 0,001. Dette tallet har blitt modifisert fra Liu et al.15. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Type | Diameteren av tråd bolt | Diameteren på tråd bolt hodet | Anbefalt vekt av rotte | Nivå |
| 2636 | 0,26 mm | 0,36 mm | 250-280 g | A4 |
| 2838 | 0,28 mm | 0,38 mm | 280-350 g | A4 |
| 3040 | 0,30 mm | 0,40 mm | 360-400 g | A4 |
| 3043 | 0,30 mm | 0,43 mm | > 400 g | A4 |
| Merk: a4-nivå tråd bolt er standarden at hodet enden er halvkuleformet, front end er dekket med Poly-lysin, merket, sterilisert, og Buy-on-bruk uten behandling (denne tabellen er endret fra Liu et al., 2018). | ||||
Tabell 1: Thread blot informasjon. Denne tabellen er endret fra Liu et al.15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mange modeller etablere metoder og atferdsdata indikatorer som er godt brukt i akutte cerebral iskemi kan ikke ha vesentlige endringer i utvinningen og sequela stadier av Brain ischemia16,17. Imidlertid er antall pasienter med hjerne iskemiske i utvinningen og sequela stadier den største. Det er viktig å velge en passende dyremodell for utvinning og sequela stadier av iskemi hjerneslag.
Vi bruker MCAO/R-modellen i rotter til å skjermen den egnede vekten av rotter (260 − 330 g), typen tråd bolt (2636/2838/3040/3043), og tidspunktet for hjerneinfarkt (2-3 h) for de mest alvorlige infarkt Kader, en høy modell suksess ratio, og synlige atferdsdata indikatorer , som vil være egnet for utvinning og sekvele stadier av hjernen iskemi.
Rotter det veie 300 g med en 3040 tråden bolt og 3 h hjerneinfarkt tid ha større infarkt mengder, flere meget streng opptreden feilene, og en betydelig modell hell forhold (skikkelsen 1). Videre har vi gitt validerings metoder av denne rotte modellen av TTC farging og Sensorimotor funksjonstester (bilateral asymmetri test, Grid-walking test, rotarod test og løfting tau test) 1-90 dager etter reperfusion. Vi fant ut at den bilaterale asymmetri test og rutenett-walking test kan brukes til forskning utvinning og sequela stadier av iskemi fordi de betydelige forskjellene av disse indikatorene siste 90 dager og 60 dager, henholdsvis. Jo større infarkt og krympe volum er, jo mer alvorlige Sensorimotor underskudd, som kan sees i figur 2 og Figur 3.
Denne metoden er hovedsakelig egnet for hjernen iskemi forårsaket av MCAO. Men modellen har forskjeller i hjernen anatomi mellom mennesker og rotter, for eksempel karakteren av pant sirkulasjon. En annen begrensning er at hvit materie utvinning ikke kan ses av TTC farging. Videre studier av sikkerhet sirkulasjon og hvit materie utvinning med MR Imaging eller andre metoder kan bekrefte prediktiv verdi av denne modellen.
Den mest kritiske saken er at ferdigheten å skape en MCAO/R modell i rotter er ikke lett og krever praksis. Før eksperimentet, bekrefter en akseptabel og parallell modell suksess ratio. Flere instrumenter og metoder er nødvendig for å teste Sensorimotor funksjon i utvinningen og sequela stadier av hjerneslag. Hvis en vanskeligere oppgave, for eksempel øke hastigheten fra 10 til 30 RPM ble brukt, en lengre periode med underskudd kan vises i rotarod test. Andre atferds tester kan også være egnet for denne modellen, for eksempel å oppdage gange. Mer presise deteksjon metoder bør brukes for pasienter i utvinningen og sequela stadier av hjernen iskemi, som kan identifisere effekten av narkotika eller andre terapeutiske verktøy.
Som en ny dyr modell for å studere hjernen iskemi i utvinningen og sequela stadier, metoden som presenteres her er meningsfull og fortjener popularisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation i Kina (81603315, 81603316), Key R & D plan for Jiangxi provinsen i Kina (20171ACH80001), industriell og faglig samarbeid prosjekter i høgskoler og universiteter i Fujian-provinsen i Kina (2018Y41010011).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anatomical Microscope | Leica (Germany) | S8 | Microscopic operating instrument |
| Blade | Gellette | / | Cutting brain sections |
| Constant Temperature Shaking Bed | Taicang Experimental Equipment Factory | THZ-C | To keep the brain sections stained evenly and at a constant temperature |
| Digital Camera | Canon | 700D | For taking pictures of TTC staining |
| Electric Shaver | Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. | 3000# | Removal of hair from the neck of rats |
| Forceps Hamostatic | Shanghai Medical device Co., Ltd. | 14 cm | Using for brain removing |
| Image Pro Plus Software | Media Cybernetics Inc. | 6.0 | Analyze the infarct volume |
| Isoflurane | RWD Life Science | 217170702 | Anesthetic gas |
| Microforceps | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Vascular micromanipulation |
| Microshear | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Vascular micromanipulation |
| Ophthalmic Forceps | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Auxiliary skin and muscle anatomy |
| Pphthalmic Scissors | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Using for cutting the skin of neck |
| Rat Brain Slice Mold | Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. | 400 g | For standard, uniform cutting of brain tissue |
| Rat Rotating Bar Fatigue Apparatus | Anhui Zhenghua Biological Instrument and Equipment Co., Ltd. | ZH-300B | To test the sensorimotor function |
| Small Animal Anaesthesia Machine | Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. | ABM3000 | A gas anesthetic machine |
| Small Animal Thermostat | Beijing Damida Technology Co., Ltd. | DM.7-YLS-20A | To maintain animal body temperature constant during operation |
| Surgical Scissors | Shanghai Medical device Co., Ltd. | 16 cm | Using for decapitate and brain removing |
| Suture | Shanghai Jinhuan Medical Devices Co., Ltd. | 4-0 / 5-0 | Using for skin and muscle sutures / Using for vascular ligations |
| Thread Bolt | Beijing Cinontech Co. Ltd. | 2636/2838/3040/3043-A4 | Blockage of the middle cerebral artery in rats |
| 5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride (TTC) | Sigma | LOT#BCBP3272V | Brain section staining reagent |
References
- Kong, L. L., et al. Neutralization of chemokine-like factor 1, a novel C-C chemokine, protects against focal cerebral ischemia by inhibiting neutrophil infiltration via MAPK pathways in rats. Journal of Neuroinflammation. 11, 112 (2014).
- Jiang, M., et al. Neuroprotective effects of bilobalide on cerebral ischemia and reperfusion injury are associated with inhibition of pro-inflammatory mediator production and down-regulation of JNK1/2 and p38 MAPK activation. Journal of Neuroinflammation. 11, 167 (2014).
- Thomas, A., Detilleux, J., Flecknell, P., Sandersen, C. Impact of Stroke Therapy Academic Industry Roundtable (STAIR) Guidelines on Peri-Anesthesia Care for Rat Models of Stroke: A Meta-Analysis Comparing the Years 2005 and 2015. PLoS One. 12, e0170243 (2017).
- Kumar, A., Aakriti,, Gupta, V. A review on animal models of stroke: An update. Brain Research Bulletin. 122, 35-44 (2016).
- Tong, F. C., et al. An enhanced model of middle cerebral artery occlusion in nonhuman primates using an endovascular trapping technique. AJNR Am. Journal of Neuroradiology. 36, 2354-2359 (2015).
- Li, F., Omae, T., Fisher, M. Spontaneous hyperthermia and its mechanism in the intraluminal suture middle cerebral artery occlusion model of rats. Stroke. 30, 2464-2470 (1999).
- Herson, P. S., Traystman, R. J. Animal models of stroke: translational potential at present and in 2050. Future Neurology. 9, 541-551 (2014).
- Abrahám, H., Somogyvári-Vigh, A., Maderdrut, J. L., Vigh, S., Arimura, A. Filament size influences temperature changes and brain damage following middle cerebral artery occlusion in rats. Exp. Brain Res. 142, 131-138 (2002).
- Sun, M. N., et al. Coumarin derivatives protect against ischemic brain injury in rats. European Journal of Medicinal Chemistry. 67, 39-53 (2013).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
- Smith, E. J., et al. Implantation site and lesion topology determine efficacy of a human neural stem cell line in a rat model of chronic stroke. Stem Cell. 30, 785-796 (2012).
- Zhang, S., et al. Protective effects of Forsythia suspense extract with antioxidant and anti-inflammatory properties in a model of rotenone induced neurotoxicity. Neurotoxicology. 52, 72-83 (2016).
- Milani, D., et al. Poly-arginine peptides reduce infarct volume in a permanent middle cerebral artery rat stroke model. BMC Neuroscience. 17, 19 (2016).
- DeGraba, T. J., Ostrow, P., Hanson, S., Grotta, J. C. Motor performance, histologic damage, and calcium influx in rats treated with NBQX after focal ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 14, 262-268 (1994).
- Liu, P., et al. Validation of a preclinical animal model to assess brain recovery after acute stroke. European Journal of Pharmacology. 835, 75-81 (2018).
- Zuo, W., et al. IMM-H004 prevents toxicity induced by delayed treatment of tPA in a rat model of focal cerebral ischemia involving PKA-and PI3K-dependent Akt activation. European Journal of Neuroscience. 39, 2107-2118 (2014).
- Yang, L., et al. L-3-n-butylphthalide Promotes Neurogenesis and Neuroplasticity in Cerebral Ischemic Rats. CNS Neuroscience & Therapeutics. 21, 733-741 (2015).
