Summary
Bu çalışmanın amacı, 1-90 sonrası orta serebral arter oklüzyonu/reperfüzyonu (MCAO/R) sonrası beyin enfarktüsü ve sensorimotor fonksiyonunu test ederek beyin iskemisinin iyileşme ve sekel evrelerinde araştırma için bir hayvan modeli oluşturmak ve doğrulamaktır. farelerde gün.
Abstract
Bu çalışmanın amacı, kurtarma ve sekel aşamalarında bir hayvan beyin iskemi modeli kurmak ve doğrulamak oldu. Erkek Sprague-Dawley sıçanlarında orta serebral arter oklüzyonu/reperfüzyonu (MCAO/R) modeli seçildi. Farenin ağırlığını (260−330 g) değiştirerek, iplik cıvata tipi (2636/2838/3040/3043) ve beyin enfarktüs süresi (2-3 saat), longa skoru, daha büyük bir enfarkt hacmi ve daha büyük bir model başarı oranı Longa skoru ve TTC boyama kullanılarak tarandı. Optimum model durumu (300 g, 3040 iplik cıvata, 3 saat beyin enfarktüs süresi) duyusal motor fonksiyonları ve enfarktüs hacmi nin değerlendirilmesi ile reperfüzyon sonrası 1-90 günlük bir gözlem döneminde elde edilmiş ve kullanılmıştır. Bu koşullarda, ikili asimetri testi 1 ile 90 gün arasında önemli bir fark vardı ve ızgara yürüyüş testi 1 ila 60 gün arasında önemli bir fark vardı; her iki fark uygun bir sensorimotor fonksiyonel test olabilir. Böylece, beyin iskemi kurtarma ve sekel aşamalarında yeni bir sıçan modelinin en uygun durumu bulundu: 3 h beyin enfarktüs için 3040 iplik cıvata ile MCAO yapıldı 300 g sıçanlar ve daha sonra reperfüzyon. Uygun sensorimotor fonksiyonel testler ikili asimetri testi ve ızgara yürüyüş testi idi.
Introduction
Beyin iskemi farklı inme sonrası göstergeleri ile üç aşamaya ayrılır: akut evre (içinde 1 hafta), iyileşme aşaması (1 hafta-6 ay), ve sekel evresi (6 aydan fazla). Şu anda, çoğu çalışma beyin iskemi akut aşamasında çünkü önemli etkisi ve çok göreceli araştırma modelleri1,2,3odaklanmak . Ancak, beyin iskemisinin iyileşme ve sekel aşamaları uzun süreli sakatlık komplikasyonları nedeniyle göz ardı edilemez. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı beyin iskemi kurtarma ve sekel aşamaları araştırmak için istikrarlı, güvenilir ve nispeten basit bir hayvan modeli keşfetmektir.
Birçok deneysel beyin iskemi modelleri arasında, sağ orta serebral arter içine iplik cıvata ekleme yoluyla orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) kullanın (MCA). Bu model insan inme benzer, hangi büyük enfarktk hacimleri üretebilir, inme ile ilgili birçok davranış bozuklukları neden, ve iplik cıvata kaldırarak kan reperfüzyonu izin verebilir (R) iplik cıvatakaldırarak 4,5,6. MCAO / R da beyin iskemi altın standart hayvan modeli olarak kabul edilir7. Ayrıca, beyin hasarının şiddeti çapı ve iplik cıvata ekleme uzunluğuna bağlıdır, beyin iskemi süresi, ve hayvan ağırlığı (büyük sıçanlar daha büyük beyin ve kalın serebral damarlar var)8. Bu nedenle, iplik cıvata tipi değiştirerek, enfarktüs süresi, ve sıçan ağırlığı, uygun bir model kurtarma ve MCAO / R sıçanlarda beyin iskemi sekeli aşamaları için bulunabilir. Sıçan modelini doğrulamak için, TTC boyama ve sensorimotor fonksiyon deneyleri (ikili asimetri testi, ızgara yürüme testi, rotarod testi ve kaldırma ipi testi) kullanarak MCAO/R modelinin 1 günlük, 35 günlük, 60 günlük ve 90 günlük bir çalışmasını gerçekleştirdik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan deneklerin prosedürü ve kullanımı, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından onaylanmıştır. Bu protokol özellikle orta serebral arter oklüzyonu/reperfüzyonu (MCAO/R) ve sensorimotor fonksiyon testleri için ayarlanmıştır.
1. Deneysel tasarım ve gruplandırma
- Longa skoru ve TTC boyama kullanarak daha ciddi beyin hasarı ve daha fazla model başarı oranı ile bir sıçan beyin iskemik model yöntemi ekran için bir sıçan MCAO / R modeli kullanın.
- 7−9 haftalık 260−330 g ağırlığındaki erkek Sprague-Dawley sıçanları üzerinde deney yapın. Gerçek sıçan ağırlığı 275 ± 15 g 275 g, 300 g için 300 ± 10 g ve 320 g için 320 ± 10 g'dır.
- Aşağıdaki yedi gruplandırmayı (ağırlık, iplik cıvata türü, enfarktüs süresi): grup 1'i 15 sıçanla (275 g, 2636, 2 saat); grup 2 ile 15 sıçan (275 g, 2636, 3 saat); grup 3 ile 15 sıçan (275 g, 2838, 2 saat); grup 4 ile 15 sıçan (275 g, 2838, 3 saat); grup 5 ile 13 sıçan (300 g, 3040, 3 saat); grup 6 ile 10 sıçan (320 g, 3040, 3 saat); grup 7 ile 13 sıçan (300 g, 3043, 3 saat).
- Beyin kurtarma durumunu TTC boyama ile incele ve 1, 35, 60, 90 gün SONRA çift taraflı asimetri testi, ızgara yürüyüş testi, rotarod testi ve kaldırma ipi testi ile uzun süreli fonksiyonel açıkları belirtmek için uygun sensorimotor fonksiyon testleri kullanın.
- 8−9 haftalık 300 ± 10 g ağırlığında erkek Sprague-Dawley sıçanları kullanın.
- Aşağıdaki beş gruplandırmayı kullanın: 20 sıçanlı bir kontrol (normal) grubu; 16 sıçan ile 1 günlük bir grup; 16 sıçanile 35 günlük bir grup; 17 sıçanile 60 günlük bir grup; ve 19 faresi olan 90 günlük bir grup.
- Adım 1.1 veya sensorimotor fonksiyonel testlerde Longa skoru sonra adım 1.2, anestezi ve TTC boyama için tüm sıçanların başını kesmek.
2. Sıçanlarda tek taraflı MCAO/R modelinin oluşturulması9
NOT: Operasyon sırasında, kan damarının kırılmasını önlemek için mikroforceps'u nazikçe kullanın. Damar izole edildiğinde sıçan boynunda sinirler ve diğer kan damarlarızarar kaçının. Tüm sağkalım cerrahisi için uygun aseptik tekniğin sunulması için özen sağlanmalıdır. Videoda daha sonra gösterilen teknik tüm yordam boyunca uygulanmalıdır.
- Ameliyat boyunca, küçük bir hayvan termostatında sıçanların vücut ısısını 37.0 ± 0.5 °C'de koruyun. Dört 6 cm 5-0 dikiş hazırlayın.
- Küçük bir hayvan anestezi makinesinin oksijen akış hızını (atık gaz arıtma cihazı ile) 0,4−0,6 L/dk olarak ayarlayın ve isofluran konsantrasyonu %5 olarak ayarlayın. Fareyi anestezi makinesine yerleştirin.
- Hayvan bayıldıktan sonra fareyi cerrahi sabitleme masasına yerleştirin. Sıçanın ağzını anestezi makinesinin maskesine bağlayın (oksijen akış hızı değişmez; isofluran konsantrasyonu %3 olarak ayarlayın. Hayvanın ekstremite gerginliği, kornea refleksleri ve ağrı eksikliğini gözlemleyerek derin anesteziye girdiğini doğrulayın.
- Kağıt bandajları (veya diğer araçlar) ile ameliyat masasına uzanacak şekilde uzuvlarını düzeltin.
- Bir elektrikli tıraş ile boyun kat çıkarın ve% 75 alkol ile sterilize (iodophor daha iyidir). Farenin ağzını kancayla düzelt.
- Oftalmik makas ile boynun merkezi uzunlamasına şekli boyunca 2−3 cm kesin.
- Ortak karotis arteri ayırın. Oftalmik forceps ile deri altı kas ayırın. Tamamen görme alanı ortaya çıkarmak için ev yapımı retraktör kullanın. Oftalmik forceps ile trakea ön kas ayırdıktan sonra, ortak karotis arter görünür olana kadar sağ sternokleidomastoid tendon boyunca ayrı.
- Yaygın karotis arter izole, dış karotis arter ve oftalmik forceps ile iç karotis arter. Yaygın karotis arter ligate (sert düğüm), kalp ucundan uzak dış karotis arter (sert düğüm), ve internal karotis arter (gevşek düğüm) ile 5-0 sütür. 5-0 dikişleri ile kalp ucuna yakın dış karotis arter Hattı.
- Bir iplik cıvatası takın. Oftalmik makas kullanarak dış karotis arter küçük bir açıklık kesin ve yavaşça bir iplik cıvata takın. Gevşek düğüm olmuştur ve dış karotis arter kesilmiş olan dış karotis arter dikiş ligate.
- Internal karotis arter gevşek düğüm gevşetin ve orta serebral arter in başına iplik cıvata eklemeye devam (dikiş işaretli). Sonra maruz kalan iplik cıvatasını kesin.
- Iskemik zaman açıktıktan sonra (2-3 saat), bir mikroforceps ile dış karotis arter kırığı düzeltmek, ve yavaşça başka bir mikroforceps ile iplik cıvata çekin. İplik cıvatasının ön ucu internal karotis arterden tamamen çekildiğinde, 5-0 dikişle kaplı olan dış karotis arteri inkâr edin ve iplik cıvatasını tamamen çekin.
- Yaygın karotis arter gevşetin, ve daub ~ 50,000 U penisilin sodyum tozu yara yüzeyinde enfeksiyonu önlemek için. Dikiş subkutan kaslar ve cilt ile 4 sütür.
- Fareyi kafese geri yerleştirdikten sonra ameliyat sonrası su sıkıntısını önlemek için 1 mL şırınga (SQ-PEN enjeksiyonu daha iyidir) kullanarak fareye ~0,2 mL steril salin verin.
- Longa puanı10göre reperfüzyon 24 saat sonra hayvanları seçin. Adım 1.1'de bir sonraki TTC boyama için Longa'nın 1−3 puanına sahip hayvanları ve 1.2'de 1, 35, 60, 90 günlük çalışma için 2−3 puan alan hayvanları seçin.
NOT: Longa'nın skoru10: 0 skor, nörolojik açık yok; 1 puan, sol önpençe uzatmak için başarısızlık; 2 puan, sola doğru daire çizerek; 3 puan, sola düşüyor; 4 puan, kendiliğinden yürüyemez ve depresif bir bilinç vardır. - Longa'nın skorunu tek yönlü ANOVA ile analiz edin. Gösterilen değerler ortalama ± S.D. P < 0.05 farkı gösterir.
3. TTC boyama
NOT: Fare beyin dilimi kalıp ve bıçak büyük bir sıcaklık farkı nedeniyle yapışmasını önlemek için kullanılmadan önce -20 °C buzdolabında önceden soğutulmalıdır. Boyama sırasında, beyin dilimleri ve kültür plakası arasında yapışmayı önlemek, yetersiz boyama neden olabilir.
- Adım 1.1 veya sensorimotor fonksiyonel testlerde adım 1.1 veya sensorimotor fonksiyonel testlerde Longa skoru sonra 400 mg / kg kloral hidrat intraperitoneal enjeksiyon ile sıçan anestezi.
- Farenin kafasını cerrahi makasla veya fare decapitation cihazıyla deşin. Cerrahi makas ve hemostatik forceps ile beyin çıkarın.
- Dilimlemesi kolaylaştırmak için beyni -20 °C'de 30 dk buzdolabında bekletin.
- Buzdolabından beyin çıkarın ve önceden soğutulmuş sıçan beyin dilim kalıp yerleştirin. Beyni önceden soğutulmuş bir bıçakla 2 mm kalınlığında altı bölüme kesin.
- 6 kuyulu bir kültür plakasında %2 5-triphenyl-2H-tetrazolium klorür (TTC) ile kesitleri lekeleyin.
- Kültür 30−60 dk için bölümleri 37 °C sallayarak yatakta. Beyin iskemi alanı ve normal alan açıkça beyaz ve kırmızı olana kadar her 10 dakikada bir bölümleri çevirin.
- Arkadan beynin önüne doğru sırayla beyin dilimlerini dikey olarak sırayla sırayla sırayla sırayla sırayla yerleştirin. Her satırın toplam uzunluğunun aynı olduğundan emin olmak için bir cetvel kullanın. Dijital fotoğraf makinesiyle fotoğraf çekin.
- Enfarkt hacmini analiz edin.
- Photoshop yazılımı ile fotoğraf ön işlem
- Photoshop CS6 kullanarak fotoğraf alma. 00:00-00:14
- Beyin dilimlerini seçmek için Seç'i tıklatın, Seç'i tıklatın | Ters. 00:15-00:36
- Siyahı seçmek için Foreground'u tıklatın ve Tamam'ıtıklatın. 00:37-00:42
- Arka plan rengini doldurmak için Alt +Sil'e ve select'i seçmek için CTRL +D tuşuna basın. 00:43-00:46
- Dosyayı Tıklatın | Masaüstüne kaydedin. 00:47-01:08
- Image Pro Plus yazılımı ile fotoğrafın ön muamelesi.
- Image Pro Plus 6.0 yazılımını açın ve fotoğrafı içe aktarın. 01:09-01:24
- Hata değişikliği için, arka planın siyah olması için Kontrast Geliştirme aracıyla parlaklığı ayarlayın. 01:25-01:37
- Vurguları kaldırmak için Filtre'deki Ortanca aracını kullanın. 01:38-01:46
- Image Pro Plus yazılımı ile sol (normal) beyin alanını hesaplayın
- Segmentasyon kullanarak renk seçin ve H/S/Ideğerini ayarlayın, böylece beyin dilimleri siyah arka plandan ayrılmıştır. 01:47-02:12
- Saymaya Dön | Boyut. 02:13-02:16
- Count'a tıklayın | Beyni orta hattan ayırmak için Nesneleri Düzenle'de bölün. Yazılım otomatik olarak sol ve sağ beyin alanları ayırt edecektir. 02:17-02:49
- Image Pro Plus yazılımı ile doğru enfarkt beyin alanını hesaplayın
- 3.8.1-3.8.2 adımlarını uygulayın. 02:50-03:14
- Say'ı Seçin | Boyut. 03:15-03:21
- Beraberlik için tıklayınız | Nesneleri Düzenlemearacını birleştir. Iskemik alanı el ile seçin ve iskemik alanı hesaplamak için Say'ı tıklatın. 03:16-05:31
- Image Pro Plus yazılımı ile sağlık beyin alanını hesaplayın
- 3.8.1-3.8.2 adımlarını uygulayın. 05:32-06:44
- Segmentasyon kullanarak renk seçin ve H/S/Ideğerini ayarlayın, böylece beyin dilimlerinin normal kısmı siyah arka plandan ayrılmıştır. 06:45-07:10
- Saymaya Dön | Bu alanı hesaplamak için Boyut ve Count'a tıklayın. 07:11-07:21
- Beyni orta hattan ayırmak için Düzenle'deki Nesneleri Böl'e tıklayın. Yazılım otomatik olarak sol ve sağ beyin alanları ayırt edecektir. 07:22-08:08
- Photoshop yazılımı ile fotoğraf ön işlem
- Enfarkt hacmini hesaplama (%) ve enfarkt ve küçültme hacmi (%):
Enfarkt hacmi (%) = [sağ enfarkt alanı/(2 x sol beyin alanı)] x 100.
Enfarktok ve küçültme hacmi (%) = [(sol beyin bölgesi - sağ sağlık beyin alanı) / (2 x sol beyin alanı)] x 100.
NOT: Sağ beyin yaralı kısmıdır. Veriler tek yönlü ANOVA tarafından analiz edildi. Gösterilen değerler ortalama ± S.D. P < 0.05 farkı gösterir.
4. Sensorimotor fonksiyonun değerlendirilmesi
NOT: Longa'nın 2−3 skoru na sahip sıçanlar (300 g, 3040 iplik cıvata, 3 saat beyin enfarktüs süresi) 1-90 gün arasında sensorimotor fonksiyon deneylerini yapmak üzere seçilmiştir. Sessiz olun ve bu çalışma döneminde hayvanları rahatsız etmeyin. Veriler iki yönlü ANOVA tarafından analiz edildi. Gösterilen değerler ortalama ± S.D. P < 0.05 farkı gösterir.
- İki taraflı asimetri testi11
- Bir sıçanın her bir ön pençesinin safenöz kısmına eşit basınçla üç kez kağıt bant (5 cm uzunluğunda, 0,8 cm genişliğinde) sarın.
- Her sıçan için, her bir foreclaw temas ve bant etkilenmemiş pençe süreleri ve etkilenen pençe süreleri de dahil olmak üzere kamera ile 5 dakika içinde kaldırılır sayısını kaydedin.
- 30 dakika sonra, 4.1.1 ve 4.1.2 adımlarını tekrarlayın.
- Sensorimotor sapmanın ortalama değerini hesaplayın (%):
Sensorimotor önyargı (%) = (etkilenmemiş pençe süreleri - etkilenen pençe süreleri)/(etkilenmemiş pençe süreleri + etkilenen pençe süreleri) x 100
- Izgara yürüyüş testi
- Sıçanı 2,5 cm2'likızgara açıklıkları ile yüksek bir ızgara yüzey platformunun (alan: 1 m2; yükseklik: 90 cm) ortasına yerleştirin.
- Farenin ızgara yüzeyinden geçmesi için fareyi teşvik etmek için farenin kalçalarını hafifçe itin.
- Etkilenmemiş (sağ) ve etkilenen (sol) uzuvlar tarafından yapılan ayak hatalarının sayısını ve 1 dk kamera ile toplam adım numarasını kaydedin.
- Hata sürelerini hesaplayın:
Hata süreleri (%) = [etkilenmemiş (sağ) ekstremite - etkilenen (sol) ekstremite]/toplam adım sayısı x 100.
NOT: 20 adımlı verilerin altındaki toplam adım sayısı kaldırıldı.
- Rotarod testi12,13
- Bilgisayarda 5 dakika süre içinde 13 rpm hıza yardımcı yazılım kullanarak sıçan dönen çubuk yorulma cihazı (çapı 90 mm) ayarlayın.
- Bilgisayar programlarını başlatın ve fareyi aynı anda rotarod basamaklarına yerleştirin.
- Sıçan basamak tan düşerse veya 5 dakika boyunca yürümeye devam ederse denemeyi bitirin ve dönen süreyi kaydedin.
- Fare30 dakika dinlendirin.
- Adımları 4.3.2−4.3.4'ün iki katı daha tekrarlayın ve son dönen zaman olacak maksimum değeri seçin.
- Kaldırma halatı testi14
- Kaldırma halat aletini (70 cm yüksekliğinde; halat 0,2 cm çapında ve 40 cm uzunluğunda) masanın üzerine yerleştirin.
- Farenin ipi ön ayaklarıyla tutup fareyi assın.
- Asılı kalma süresini kaydedin ve puanları hesaplayın.
NOT: İpüzerinde 3 puan: 0−2 s; 2 puan: 3−4 s ipüzerinde; 1 puan: 5−6 s ipte; 0 puan: ipüzerinde 7'den fazla s.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Longa skoru ve TTC boyama, ortalama ağırlık (275/300/320 g), cıvata tipleri (2636/2838/3040/3043) farklı tedaviler ile bir MCAO / R modeli için yukarıda belirtilen prosedürü kullanarak; Tablo 1) sıçanlarda optimal beyin iskemi modelinin taranması için iskemik (2-3 saat) ve 1 gün reperfüzyon kullanılmıştır. 300 g ağırlık, 3040 iplik cıvata ve 3 saat beyin enfarktüs süresi model parametreleri en büyük serebral enfarktüs, en yüksek Longa skoru ve en büyük model başarı oranı için en uygun edildi. Bu önemli ölçüde 275 g ağırlık, 2636 iplik cıvata ve 2 saat beyin enfarktüs süresi konvansiyonel tedavi geliştirilmiştir(Şekil 1).
Ayrıca, 300 g ağırlığı, 3040 iplik cıvata, 3 h beyin enfarktüs süresi ve 2−3 Longa puanı ile sıçanlar sensorimotor fonksiyon testleri (ikili asimetri testi, ızgara yürüme testi, bir rotarod testi ve kaldırma halat testi) ve TTC boyama kurtarma çalışma yapıldı 1-90 gün arasında beyin iskemi durumu. Enfarktüs ve küçültme hacmi sırasıyla 1, 35, 60 ve 90 gün sonra MCAO/R'dan sonra %23,4, %19,6, %16,1(P < 0,01, ilk güne göre) ve %15,7(P < 0,01, ilk güne göre) idi. MCAO/R'dan sonraki ilk gün enfarktüs hacmi en büyüktü. Zamanla, enfarktüs hacmi küçüldü ve küçülme hacmi daha da büyüdü. Enfarkt ve küçültme hacmi 60 günlük MCAO/R'den sonra artık değişmedi.
İki taraflı asimetri testinde sensorimotor sapma, ızgara-yürüme testinde ızgara-yürüme hata süreleri ve kaldırma ipi testindeki kaldırma ipi skoru önemli ölçüde artarken, rotarod testindeki rotarod süresi 1'den sonra önemli ölçüde azalmıştır. dört testin de akut beyin iskemi evresinde anlamlı olduğunu gösteren MCAO/R günü (Şekil 3). Ancak, sadece sensorimotor önyargı MCAO / R 35, 60 ve 90 gün sonra zamana bağlı bir şekilde büyük fonksiyonel bozukluklar muhafaza. 35 ve 60 günlük MCAO/R testinden sonra ızgara yürüyüş testinde ızgara-yürüme hata süreleri önemli farklılıklar vardı. Bu sonuçlar, ikili asimetri testi ve ızgara yürüyüş testinin sıçanlarda iyileşme ve sekel aşaması için uygun sensorimotor fonksiyon testleri olabileceğini göstermiştir.
Şekil 1: 300 g ağırlık, 3040 iplik cıvata, 3 saat beyin enfarktüs süresi MCAO / R tarafından indüklenen beyin iskemik yaralanma optimum durum olabilir. (A,B) Beyin dokusunun enfarkt hacminin resimleri ve kartogramı (n = 9−12). (C) Longa'nın skoru (n = 9−12). (D) Sıçanların model başarı oranı istatistikleri (n = 10−15). Model başarı oranı = (MCAO/R'den sonra toplam sıçan sayısı - MCAO/R'den sonra ölüm sıçanları - MCAO/R'den sonra başarısızlık sıçanları)/toplam sıçan sayısı. Başarısızlık sıçanları uygun bir Longa puanı yok model sıçanlar vardır. Hata çubukları S.D., *P < 0.05, **P < 0.01'i temsil eder. Bu rakam Liu ve ark.15'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: ENfarkt ve küçültme hacmi MCAO/R'dan 1 ila 90 gün sonra kademeli olarak azalmıştır. (A) Sıçan beyin dokusunun TTC boyama. (B) İnfarkt ve küçültme hacminin kartogramı (n = 16−19). Hata çubukları S.D., **P < 0.01 vs. MCAO/R'dan sonraki ilk günü temsil eder. Bu rakam Liu ve ark.15'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İkili asimetri testi ve ızgara-yürüme testi beyin iskemisinin iyileşme ve sekel evresinde uygun sensorimotor fonksiyon testleriidi. (A) Debonding deneyinde olumluluğu yırtan sağ uzuv. (B) Izgara yürüyüş testinde ızgara-yürüme hata süreleri. (C) Rotarod testinde geçen süre. (D) Kaldırma ipi testinde puan. Hata çubukları S.D., n = 15−19, *P < 0.05, ***P < 0.001'i temsil eder. Bu rakam Liu ve ark.15'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Türü | İplik cıvatasının çapı | İplik cıvata kafasının çapı | Farenin önerilen ağırlığı | Düzey |
| 2636 | 0,26 mm | 0,36 mm | 250-280 g | A4 |
| 2838 | 0,28 mm | 0,38 mm | 280-350 g | A4 |
| 3040 | 0,30 mm | 0.40 mm | 360-400 g | A4 |
| 3043 | 0,30 mm | 0,43 mm | >400 g | A4 |
| Not: A4 seviye iplik cıvatası, baş ucunun hemisferik olduğu, ön ucunun poli-lizin, işaretli, sterilize edilmiş ve herhangi bir tedavi olmaksızın kullanımda satın alma ile kaplı olduğu standarttır (Bu Tablo Liu vd., 2018)'den alınmıştır. | ||||
Tablo 1: İş parçacığı blot bilgileri. Bu tablo Liu ve ark.15'tendeğiştirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Akut serebral iskemide iyi kullanılan yöntem ve davranışsal göstergeleri oluşturan birçok modelde beyin iskemisinin iyileşme ve sekeli evrelerinde önemli değişiklikler olmayabilir16,17. Ancak, iyileşme ve sekel aşamalarında beyin iskemik olan hastaların sayısı en büyüktür. İskemi inmenin iyileşme ve sekel aşamaları için uygun bir hayvan modeli seçmek esastır.
Farelerde MCAO/R modelini farelerin uygun ağırlığını (260−330 g), iplik cıvatasının türünü (2636/2838/3040/3043) ve en ağır enfarktüs yaralanması, yüksek model başarı oranı ve görünür davranış göstergelerini görmek için beyin enfarktüs süresini (2-3 saat) taramak için kullanıyoruz. , beyin iskemisinin iyileşme ve sekel aşamaları için uygun olacaktır.
3040 iplik cıvatave 3 saat beyin enfarktüs süresi ile 300 g ağırlığında olan sıçanlar daha büyük enfarktüs hacimleri, daha şiddetli davranış bozuklukları ve daha büyük bir model başarı oranına sahiptir(Şekil 1). Ayrıca reperfüzyondan 1-90 gün sonra TTC boyama ve sensorimotor fonksiyon testleri (bilateral asimetri testi, ızgara yürüyüş testi, rotarod testi ve kaldırma halatı testi) ile bu sıçan modelinin doğrulama yöntemlerini sağladık. Bu göstergelerin önemli farklılıkları sırasıyla 90 gün 60 gün sürdüğünden, ikili asimetri testi ve ızgara yürüyüş testinin iskeminin iyileşme ve sekel aşamalarını araştırmak için kullanılabileceğini bulduk. Enfarktüs ve küçülme hacmi ne kadar büyükse, Şekil 2 ve Şekil 3'tegörülebilen sensorimotor açıkları o kadar şiddetlidir.
Bu yöntem esas olarak MCAO'nun neden olduğu beyin iskemi için uygundur. Ancak, model insanlar ve sıçanlar arasında beyin atomi farklılıkları vardır, teminat dolaşım derecesi gibi. Başka bir sınırlama beyaz madde kurtarma TTC boyama tarafından görülemez olmasıdır. MR görüntüleme veya diğer yöntemlerle teminat dolaşımı ve beyaz madde kurtarma daha fazla çalışmalar bu modelin tahmin değerini teyit edebilirsiniz.
En kritik konu sıçanlarda bir MCAO / R modeli oluşturma becerisi kolay değildir ve uygulama gerektirir. Denemeden önce, kabul edilebilir ve paralel model başarı oranını onaylayın. İnmenin geri kazanım ve sekeli aşamalarında sensorimotor fonksiyonu test etmek için daha fazla araç ve yöntem gereklidir. Hızı 10'dan 30 rpm'ye çıkarmak gibi daha zor bir görev kullanılmışsa, rotarod testinde daha uzun bir açık dönemi ortaya çıkabilir. Yürüyüş algılama gibi diğer davranıştestleri de bu model için uygun olabilir. Daha hassas algılama yöntemleri beyin iskemi kurtarma ve sekel aşamalarında hastalar için kullanılmalıdır, hangi ilaç veya diğer tedavi araçlarının etkisini belirleyebilirsiniz.
Kurtarma ve sekel aşamalarında beyin iskemisini incelemek için yeni bir hayvan modeli olarak, burada sunulan yöntem anlamlıdır ve popülerleşmeyi hak ediyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81603315, 81603316), Çin'deki Jiangxi eyaletinin Önemli Ar-Ge planı (20171ACH80001), Fujian eyaletinin kolej ve üniversitelerinde endüstriyel ve akademik işbirliği projeleri tarafından desteklenmiştir. Çin (2018Y41010011).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anatomical Microscope | Leica (Germany) | S8 | Microscopic operating instrument |
| Blade | Gellette | / | Cutting brain sections |
| Constant Temperature Shaking Bed | Taicang Experimental Equipment Factory | THZ-C | To keep the brain sections stained evenly and at a constant temperature |
| Digital Camera | Canon | 700D | For taking pictures of TTC staining |
| Electric Shaver | Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. | 3000# | Removal of hair from the neck of rats |
| Forceps Hamostatic | Shanghai Medical device Co., Ltd. | 14 cm | Using for brain removing |
| Image Pro Plus Software | Media Cybernetics Inc. | 6.0 | Analyze the infarct volume |
| Isoflurane | RWD Life Science | 217170702 | Anesthetic gas |
| Microforceps | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Vascular micromanipulation |
| Microshear | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Vascular micromanipulation |
| Ophthalmic Forceps | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Auxiliary skin and muscle anatomy |
| Pphthalmic Scissors | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Using for cutting the skin of neck |
| Rat Brain Slice Mold | Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. | 400 g | For standard, uniform cutting of brain tissue |
| Rat Rotating Bar Fatigue Apparatus | Anhui Zhenghua Biological Instrument and Equipment Co., Ltd. | ZH-300B | To test the sensorimotor function |
| Small Animal Anaesthesia Machine | Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. | ABM3000 | A gas anesthetic machine |
| Small Animal Thermostat | Beijing Damida Technology Co., Ltd. | DM.7-YLS-20A | To maintain animal body temperature constant during operation |
| Surgical Scissors | Shanghai Medical device Co., Ltd. | 16 cm | Using for decapitate and brain removing |
| Suture | Shanghai Jinhuan Medical Devices Co., Ltd. | 4-0 / 5-0 | Using for skin and muscle sutures / Using for vascular ligations |
| Thread Bolt | Beijing Cinontech Co. Ltd. | 2636/2838/3040/3043-A4 | Blockage of the middle cerebral artery in rats |
| 5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride (TTC) | Sigma | LOT#BCBP3272V | Brain section staining reagent |
References
- Kong, L. L., et al. Neutralization of chemokine-like factor 1, a novel C-C chemokine, protects against focal cerebral ischemia by inhibiting neutrophil infiltration via MAPK pathways in rats. Journal of Neuroinflammation. 11, 112 (2014).
- Jiang, M., et al. Neuroprotective effects of bilobalide on cerebral ischemia and reperfusion injury are associated with inhibition of pro-inflammatory mediator production and down-regulation of JNK1/2 and p38 MAPK activation. Journal of Neuroinflammation. 11, 167 (2014).
- Thomas, A., Detilleux, J., Flecknell, P., Sandersen, C. Impact of Stroke Therapy Academic Industry Roundtable (STAIR) Guidelines on Peri-Anesthesia Care for Rat Models of Stroke: A Meta-Analysis Comparing the Years 2005 and 2015. PLoS One. 12, e0170243 (2017).
- Kumar, A., Aakriti,, Gupta, V. A review on animal models of stroke: An update. Brain Research Bulletin. 122, 35-44 (2016).
- Tong, F. C., et al. An enhanced model of middle cerebral artery occlusion in nonhuman primates using an endovascular trapping technique. AJNR Am. Journal of Neuroradiology. 36, 2354-2359 (2015).
- Li, F., Omae, T., Fisher, M. Spontaneous hyperthermia and its mechanism in the intraluminal suture middle cerebral artery occlusion model of rats. Stroke. 30, 2464-2470 (1999).
- Herson, P. S., Traystman, R. J. Animal models of stroke: translational potential at present and in 2050. Future Neurology. 9, 541-551 (2014).
- Abrahám, H., Somogyvári-Vigh, A., Maderdrut, J. L., Vigh, S., Arimura, A. Filament size influences temperature changes and brain damage following middle cerebral artery occlusion in rats. Exp. Brain Res. 142, 131-138 (2002).
- Sun, M. N., et al. Coumarin derivatives protect against ischemic brain injury in rats. European Journal of Medicinal Chemistry. 67, 39-53 (2013).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
- Smith, E. J., et al. Implantation site and lesion topology determine efficacy of a human neural stem cell line in a rat model of chronic stroke. Stem Cell. 30, 785-796 (2012).
- Zhang, S., et al. Protective effects of Forsythia suspense extract with antioxidant and anti-inflammatory properties in a model of rotenone induced neurotoxicity. Neurotoxicology. 52, 72-83 (2016).
- Milani, D., et al. Poly-arginine peptides reduce infarct volume in a permanent middle cerebral artery rat stroke model. BMC Neuroscience. 17, 19 (2016).
- DeGraba, T. J., Ostrow, P., Hanson, S., Grotta, J. C. Motor performance, histologic damage, and calcium influx in rats treated with NBQX after focal ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 14, 262-268 (1994).
- Liu, P., et al. Validation of a preclinical animal model to assess brain recovery after acute stroke. European Journal of Pharmacology. 835, 75-81 (2018).
- Zuo, W., et al. IMM-H004 prevents toxicity induced by delayed treatment of tPA in a rat model of focal cerebral ischemia involving PKA-and PI3K-dependent Akt activation. European Journal of Neuroscience. 39, 2107-2118 (2014).
- Yang, L., et al. L-3-n-butylphthalide Promotes Neurogenesis and Neuroplasticity in Cerebral Ischemic Rats. CNS Neuroscience & Therapeutics. 21, 733-741 (2015).
