Summary
El propósito de este estudio es establecer y validar un modelo animal para la investigación en las etapas de recuperación y secuenciación de la isquemia cerebral mediante la prueba de infarto cerebral y la función sensorimotor después de la oclusión/reperfusión de la arteria cerebral media (MCAO/R) después de 1-90 días en ratas.
Abstract
El propósito de este estudio fue establecer y validar un modelo de isquemia cerebral animal en las etapas de recuperación y sequela. Se eligió un modelo de oclusión/reperfusión de arteria súbdito súbdito súbdeo medio (MCAO/R) en ratas macho Sprague-Dawley. Al cambiar el peso de la rata (260-330 g), el tipo de perno de rosca (2636/2838/3040/3043) y el tiempo de infarto cerebral (2-3 h), una puntuación de Longa más alta, un volumen de infarto más grande y una mayor proporción de éxito del modelo se examinaron utilizando la puntuación de Longa y la tinción TTC. La condición óptima del modelo (300 g, perno de rosca 3040, tiempo de infarto cerebral de 3 horas) se adquirió y utilizó en un período de observación de 1-90 días después de la perfusión a través de la evaluación de las funciones del sensorimotor y el volumen del infarto. En estas condiciones, la prueba de asimetría bilateral tuvo una diferencia significativa de 1 a 90 días, y la prueba de caminar en la red tuvo una diferencia significativa de 1 a 60 días; ambas diferencias podrían ser una prueba funcional sensorimotor adecuada. Así, se encontró la condición más adecuada de un modelo de rata novedoso en las etapas de recuperación y secuencia de la isquemia cerebral: 300 g de ratas que se sometieron a MCAO con un perno de hilo 3040 para un infarto cerebral de 3 horas y luego reperfused. Las pruebas funcionales sensorimotores apropiadas fueron una prueba bilateral de asimetría y una prueba de caminar en la red.
Introduction
La isquemia cerebral se divide en tres etapas con diferentes indicadores post-accidente cerebrovascular: la etapa aguda (dentro de 1 semana), la etapa de recuperación (1 semana a 6 meses) y la etapa de secuencias (más de 6 meses). Actualmente, la mayoría de los estudios se centran en la etapa aguda de la isquemia cerebral debido a su efecto significativo y modelos de investigación multifamiliar1,2,3. Sin embargo, las etapas de recuperación y secuencias de la isquemia cerebral no pueden ser ignoradas debido a su complicación a largo plazo de las discapacidades. Por lo tanto, el propósito de este estudio es explorar un modelo animal estable, confiable y relativamente simple para investigar las etapas de recuperación y secuencia de la isquemia cerebral.
Entre los muchos modelos experimentales de isquemia cerebral, utilizamos oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) a través de la inserción del perno de rosca en la arteria cerebral media derecha (MCA). Este modelo es similar al accidente cerebrovascular humano, que puede producir mayores volúmenes de infarto, dar lugar a muchos trastornos conductuales relacionados con el accidente cerebrovascular, y puede permitir la reperfusión de sangre (R) mediante la eliminación del perno de rosca4,5,6. MCAO/R también se considera el modelo animal estándar de oro de la isquemiacerebral 7. Además, la gravedad de la lesión cerebral depende del diámetro y la longitud de inserción del perno de rosca, la duración de la isquemia cerebral y el peso animal (las ratas más grandes tienen cerebros más grandes y vasos cerebrales más gruesos)8. Por lo tanto, cambiando el tipo de perno de rosca, el tiempo de infarto y el peso de la rata, se puede encontrar un modelo adecuado para las etapas de recuperación y secuencia de la isquemia cerebral en ratas MCAO/R. Para validar el modelo de rata, realizamos un estudio de 1 día, 35 días, 60 días y 90 días del modelo MCAO/R utilizando experimentos de tinción TTC y función sensorimotor (una prueba de asimetría bilateral, una prueba de caminar en la red, una prueba de rotarod y una prueba de cuerda de elevación).
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Protocol
El procedimiento y el uso de sujetos animales han sido aprobados por el Instituto Nacional de Salud para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Este protocolo se ajusta específicamente para las pruebas de oclusión/reperfusión de la arteria cerebral media (MCAO/R) y la función sensorimotor.
1. Diseño experimental y agrupación
- Utilice un modelo MCAO/R de rata para analizar un método de modelo isquémico de cerebro de rata con lesión cerebral más grave y una mayor relación de éxito del modelo utilizando la puntuación de Longa y la tinción TTC.
- Realizar el experimento en ratas macho Sprague-Dawley que pesan 260 a 330 g que tienen 7 a 9 semanas de edad. El peso real de la rata es de 275 a 15 g para 275 g, 300 x 10 g para 300 g y 320 a 10 g para 320 g.
- Utilice las siguientes siete agrupaciones (peso, tipo de perno de rosca, tiempo de infarto): grupo 1 con 15 ratas (275 g, 2636, 2 h); grupo 2 con 15 ratas (275 g, 2636, 3 h); grupo 3 con 15 ratas (275 g, 2838, 2 h); grupo 4 con 15 ratas (275 g, 2838, 3 h); grupo 5 con 13 ratas (300 g, 3040, 3 h); grupo 6 con 10 ratas (320 g, 3040, 3 h); grupo 7 con 13 ratas (300 g, 3043, 3 h).
- Estudiar el estado de recuperación cerebral mediante tinción TTC, y utilizar pruebas adecuadas de la función sensorimotor para indicar los déficits funcionales a largo plazo mediante la prueba de asimetría bilateral, prueba de caminar en la red, prueba de rotarod y prueba de cuerda de elevación después de 1, 35, 60, 90 días de MCAO /R.
- Utilice ratas macho Sprague-Dawley que pesen 300 x 10 g que sean de 8 a 9 semanas de edad.
- Utilice las siguientes cinco agrupaciones: un grupo de control (normal) con 20 ratas; un grupo de 1 día con 16 ratas; un grupo de 35 días con 16 ratas; un grupo de 60 días con 17 ratas; y un grupo de 90 días con 19 ratas.
- Después de la puntuación de Longa en el paso 1.1 o pruebas funcionales sensorimotor en el paso 1.2, anestesia y decapita a todas las ratas para la tinción TTC.
2. Establecimiento de un modelo unilateral de MCAO/R en ratas9
NOTA: Durante la operación, utilice suavemente las microfuerzas para evitar la rotura del vaso sanguíneo. Evitar el daño a los nervios y otros vasos sanguíneos en el cuello de la rata cuando el vaso está aislado. Se debe tener cuidado de presentar una técnica aséptica adecuada para todos los procedimientos quirúrgicos de supervivencia. La técnica ilustrada más adelante en el video debe practicarse a través de todo el procedimiento.
- A lo largo de la cirugía, mantenga la temperatura corporal de las ratas a 37,0 o0,5 oC en un pequeño termostato animal. Preparar cuatro suturas de 6 cm 5-0.
- Establezca el caudal de oxígeno de una pequeña máquina de anestesia animal (con un dispositivo de tratamiento de gases residuales) en 0,4 x 0,6 L/min y la concentración de isoflurano en un 5%. Coloque la rata en la máquina de anestesia.
- Después de que el animal se haya desmayado, coloque la rata en una mesa de fijación quirúrgica. Conectar la boca de la rata a la máscara de la máquina de anestesia (el caudal de oxígeno permanece inalterado; ajuste la concentración de isoflurano a 3%). Confirme que el animal ha ingresado anestesia profunda observando la falta de tensión en las extremidades, reflejos corneales y dolor.
- Fije sus extremidades para que se acuesten en la mesa de operaciones con vendas de papel (u otras herramientas).
- Retire la capa del cuello con una afeitadora eléctrica y esterilice con 75% de alcohol (el yodoforo es mejor). Fija la boca de la rata con un gancho.
- Corte 2 x 3 cm a lo largo de la forma longitudinal central del cuello con tijeras oftálmicas.
- Separe la arteria carótida común. Separe el músculo subcutáneo con fórceps oftálmicos. Utilice un retractor casero para exponer completamente el campo de visión. Después de separar el músculo anterior de la tráquea con fórceps oftálmicos, separe a lo largo del tendón esternocleidomastoideo derecho hasta que la arteria carótida común sea visible.
- Aísle la arteria carótida común, la arteria carótida externa y la arteria carótida interna con fórceps oftálmicos. Ligar la arteria carótida común (nudo duro), la arteria carótida externa lejos del extremo del corazón (nudo duro), y la arteria carótida interna (nudo suelto) con 5-0 suturas. Forre la arteria carótida externa cerca del extremo del corazón con 5-0 suturas.
- Inserte un perno de rosca. Corte una pequeña abertura en la arteria carótida externa con tijeras oftálmicas e inserte suavemente un perno de rosca. Ligar la sutura de la arteria carótida externa que ha estado en nudo suelto y cortar la arteria carótida externa.
- Aflojar el nudo suelto de la arteria carótida interna y continuar insertando el perno de rosca al principio de la arteria cerebral media (sutura marcada). A continuación, corte el perno de rosca expuesto.
- Después de alcanzar el tiempo isquémico (2-3 h), fijar la fractura de la arteria carótida externa con una microfuerza, y extraer suavemente el perno de rosca con otra microcólceps. Cuando el extremo frontal del perno de rosca se retira completamente de la arteria carótida interna, ligar la arteria carótida externa que estaba forrada con 5-0 suturas, y luego extraer el perno de rosca por completo.
- Afloje la arteria carótida común, y el daub 50.000 U de polvo de penicilina en sodio en la superficie de la herida para prevenir la infección. Sutura los músculos subcutáneos y la piel con 4 suturas.
- Dar 0,2 ml de solución salina estéril a la rata por vía oral utilizando una jeringa de 1 ml (la inyección DeSQ-PEN es mejor) para evitar la escasez de agua postoperatoria después de colocar la rata de nuevo en la jaula.
- Elija los animales después de 24 horas de reperfusión de acuerdo con la puntuación de Longa10. Seleccione animales con una puntuación de Longa de 1 a 3 para el siguiente tinción TTC en el paso 1.1, y los animales con una puntuación de Longa de 2 a 3 para el estudio de 1, 35, 60, 90 días en el paso 1.2.
NOTA: Puntuación de Longa10: 0 puntuación, sin déficit neurológico; 1 puntuación, falta de extensión de la garra derecha; 2 partituras, dando vueltas a la izquierda; 3 puntuación, cayendo a la izquierda; 4 puntuación, no puede caminar espontáneamente y tiene una conciencia deprimida. - Analice la puntuación de Longa por ANOVA unidireccional. Los valores mostrados representan la media de S.D. P < 0.05 indican la diferencia.
3. TTC tinción
NOTA: El molde y la cuchilla de la rebanada del cerebro de la rata deben ser preenfriados en un refrigerador de -20 oC antes de su uso para evitar la adhesión causada por una gran diferencia de temperatura. Durante la tinción, evitar la adhesión entre las rebanadas del cerebro y la placa de cultivo, lo que puede resultar en una tinción insuficiente.
- Anestetizar la rata mediante inyección intraperitoneal de 400 mg/kg de hidrato cloral después de la puntuación de Longa en el paso 1.1 o pruebas funcionales sensorimotor en el paso 1.2.
- Decapitar a la rata con tijeras quirúrgicas o con un aparato de decapitación de rata. Retire el cerebro con tijeras quirúrgicas y fórceps hemostáticos.
- Poner el cerebro en el refrigerador a -20 oC durante 30 minutos para facilitar el corte.
- Retire el cerebro del refrigerador y colóquelo en el molde de corte de cerebro de rata pre-enfriado. Corta el cerebro en seis secciones consecutivas de 2 mm de espesor con una hoja preenfriada.
- Mancha las secciones con cloruro de 2% 5-trifenilo-2H-tetrazolium (TTC) en una placa de cultivo de 6 pocillos.
- Cultivar las secciones durante 30 x 60 min a 37 oC en una cama temblorosa. Voltee las secciones cada 10 minutos hasta que el área de la isquemia cerebral y el área normal sean claramente blancos y rojos.
- Alinee las rebanadas cerebrales verticalmente en orden desde la parte posterior hasta la parte frontal del cerebro. Utilice una regla para asegurarse de que la longitud total de cada línea es la misma. Tome fotos con la cámara digital.
- Analice el volumen del infarto.
- Pre-tratamiento de la foto con el software photoshop
- Importe la foto con photoshop CS6. 00:00-00:14
- Haga clic en Seleccionar para seleccionar los sectores del cerebro, haga clic en Seleccionar . Inverso. 00:15-00:36
- Haga clic en Primer plano para seleccionar negro y haga clic en Aceptar. 00:37-00:42
- Presione Alt +Eliminar para rellenar el color de fondo y CTRL +D para anular la selección. 00:43-00:46
- Haga clic en Archivo (File) ? Guardar en el escritorio. 00:47-01:08
- Pre-tratamiento de la foto con el software Image Pro Plus.
- Abra el software Image Pro Plus 6.0 e importe la foto. 01:09-01:24
- Para la modificación de defectos, ajuste el brillo con la herramienta Mejora de contraste, de modo que el fondo sea negro. 01:25-01:37
- Utilice la herramienta Mediana en Filtro para eliminar los resaltados. 01:38-01:46
- Calcula el área cerebral izquierda (normal) con el software Image Pro Plus
- Seleccione el color con Segmentación y ajuste el valor de H/S/I,para que las rebanadas cerebrales estén separadas del fondo negro. 01:47-02:12
- Volver al conde ? Tamaño. 02:13-02:16
- Haga clic en Contar (Count) Dividir objetos en Editar para separar el cerebro de la línea media. El software distinguirá automáticamente las áreas del cerebro izquierdo y derecho. 02:17-02:49
- Calcule el área cerebral del infarto con el software Image Pro Plus
- Implemente el paso 3.8.1-3.8.2. 02:50-03:14
- Seleccione Contar (Contar) Tamaño. 03:15-03:21
- Haga clic en Dibujar ( Draw) Herramienta Combinar objetos en Editar. Seleccione manualmente el área isquémica y haga clic en Recuento para calcular el área isquémica. 03:16-05:31
- Calcula el área del cerebro de salud con el software Image Pro Plus
- Implemente el paso 3.8.1-3.8.2. 05:32-06:44
- Seleccione el color con Segmentación y ajuste el valor de H/S/I,de modo que la parte normal de las rebanadas cerebrales se separe del fondo negro. 06:45-07:10
- Volver al conde ? Tamaño y haga clic en Recuento para calcular esta área. 07:11-07:21
- Haga clic en Dividir objetos en Editar para separar el cerebro de la línea media. El software distinguirá automáticamente las áreas del cerebro izquierdo y derecho. 07:22-08:08
- Pre-tratamiento de la foto con el software photoshop
- Calcular el volumen del infarto (%) y el volumen de infarto y contracción (%):
Volumen del infarto (%) á [área del infarto derecho/(2 x área del cerebro izquierdo)] x 100.
Infarto y volumen de contracción (%) á [(área del cerebro izquierdo - área correcta del cerebro de salud) / (2 x área del cerebro izquierdo)] x 100.
NOTA: El cerebro derecho es la parte lesionada. Los datos fueron analizados por ANOVA unidireccional. Los valores mostrados representan la media de S.D. P < 0.05 indican la diferencia.
4. Evaluación de la función sensorimotor
NOTA: Las ratas (300 g, perno de rosca 3040, tiempo de infarto cerebral de 3 horas) con una puntuación de Longa de 2 a 3 fueron seleccionadas para realizar los experimentos de función sensorimotor de 1-90 días. Mantenga silencio y no moleste a los animales durante este período de estudio. Los datos fueron analizados por ANOVA bidireccional. Los valores mostrados representan la media de S.D. P < 0.05 indican la diferencia.
- Prueba de asimetría bilateral11
- Envuelva la cinta de papel (5 cm de largo, 0,8 cm de ancho) en la parte safenosa de cada garra de una rata tres veces con la misma presión.
- Para cada rata, registre el número de veces que se contacta a cada garra anterior y se retira la cinta en 5 minutos con la cámara, incluidos los tiempos de pata no afectados y los tiempos de pata afectados.
- Después de 30 min, repita los pasos 4.1.1 y 4.1.2 de nuevo.
- Calcular el valor medio del sesgo sensorimotor (%):
Sesgo del sensorimotor (%) (tiempos de pata no afectados - tiempos de pata afectados)/(tiempos de pata no afectados + tiempos de pata afectados) x 100
- Prueba de caminar en red
- Coloque la rata en el centro de una plataforma elevada de superficie de rejilla (área: 1 m2;altura: 90 cm) con aberturas de rejilla de 2,5 cm2.
- Empuje las caderas de la rata ligeramente para animar a la rata a atravesar la superficie de la rejilla.
- Registre el número de fallas en los pies realizadas por las extremidades no afectadas (derecha) y afectadas (izquierda) y el número de paso total en 1 min con la cámara.
- Calcular los tiempos de error:
Tiempos de error (%) - [extremidad no afectada (derecha) - extremidad afectada (izquierda)]/número de paso total x 100.
NOTA: Se eliminó el número total de pasos por debajo de los datos de 20 pasos.
- Rotarod prueba12,13
- Configure el aparato de fatiga de la barra giratoria de rata (diámetro 90 mm) de ratas utilizando el software de apoyo a una velocidad de 13 rpm durante un período de 5 minutos en el ordenador.
- Inicie los programas informáticos y coloque la rata en los peldaños rotarod al mismo tiempo.
- Terminar un ensayo si la rata se cae del peldaño o sigue caminando durante 5 minutos y registrar el tiempo de rotación.
- Que la rata descanse durante 30 minutos.
- Repita los pasos 4.3.2-4.3.4 dos veces más y elija el valor máximo para que sea el último tiempo de rotación.
- Prueba de cuerda de elevación14
- Coloque el instrumento de cuerda de elevación (70 cm de altura; la cuerda es de 0,2 cm de diámetro y 40 cm de largo) en el escritorio.
- Haz que la rata agarre la cuerda con sus extremidades delanteras y cuelgue la rata.
- Registre el tiempo de suspensión y calcule las puntuaciones.
NOTA: Una puntuación de 3: 0 x 2 s en la cuerda; Una puntuación de 2: 3 x 4 s en la cuerda; Una puntuación de 1: 5 x 6 s en la cuerda; Una puntuación de 0: más de 7 s en la cuerda.
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Representative Results
Utilizando el procedimiento antes mencionado para un modelo MCAO/R con puntuación de Longa y tinción TTC, diferentes tratamientos de peso medio (275/300/320 g), tipos de pernos (2636/2838/3040/3043; Tabla 1) y los tiempos isquémicos (2-3 h) y la reperfusión de 1 día se utilizaron para detectar el modelo óptimo de isquemia cerebral en ratas. Los parámetros del modelo de 300 g de peso, perno de rosca 3040 y tiempo de infarto cerebral de 3 horas fueron los más adecuados para el infarto cerebral más grande, la puntuación más alta de Longa y la mayor relación de éxito del modelo. Esto se mejoró significativamente en el tratamiento convencional de un peso de 275 g, un perno de rosca de 2636 y un tiempo de infarto cerebral de 2 horas(Figura 1).
Además, las ratas con 300 g de peso, perno de rosca 3040, tiempo de infarto cerebral de 3 horas y una puntuación de 2-3 Longa se sometieron a pruebas de función sensorimotor (una prueba de asimetría bilateral, una prueba de caminar en la red, una prueba de rotarod y una prueba de cuerda de elevación) y tinción TTC para estudiar la recuperación estado de la isquemia cerebral de 1-90 días. El volumen de infarto y contracción fue del 23,4%, 19,6%, 16,1%(P < 0,01, en comparación con el primer día) y 15,7%(P < 0,01, en comparación con el primer día) después de 1, 35, 60 y 90 días después de MCAO/R, respectivamente (Figura 2). El primer día después de MCAO/R, el volumen de infarto fue mayor. Con el tiempo, el volumen del infarto se hizo más pequeño y el volumen de contracción se hizo más grande. El volumen de infarto y de contracción ya no cambia después de 60 días de MCAO/R.
El sesgo sensorimotor en la prueba de asimetría bilateral, los tiempos de error de caminar en la rejilla en la prueba de caminar en la rejilla y la puntuación de la cuerda de elevación en la prueba de cuerda de elevación aumentaron significativamente, mientras que el tiempo de rotarod en la prueba de rotarod disminuyó significativamente después de 1 MCAO/R(Figura 3), que indicaba que las cuatro pruebas eran significativas en la etapa de la isquemia cerebral aguda. Sin embargo, sólo el sesgo sensorimotor mantuvo grandes trastornos funcionales con una manera dependiente del tiempo después de 35, 60 y 90 días de MCAO/R. Hubo diferencias significativas en los tiempos de error de recorrido en la red en la prueba de caminata de la red después de 35 y 60 días de MCAO/R. Estos resultados indicaron que la prueba bilateral de asimetría y la prueba de caminar en la red podrían ser pruebas adecuadas de la función sensorimotor para la etapa de recuperación y la secuencia en ratas.
Figura 1: 300 g de peso, 3040 pernos de rosca, 3 h tiempo de infarto cerebral puede ser la condición óptima de la lesión isquémica cerebral inducida por MCAO /R. (A,B) Imágenes y cartograma del volumen infarto del tejido cerebral (n.o 9 x 12). (C) Puntuación de Longa (n-9-12). (D) Las estadísticas de la relación de éxito del modelo de las ratas (n a 10 a 15). Relación de éxito del modelo (número total de ratas - ratas de la muerte después de MCAO/R - ratas de falla después de MCAO /R)/número total de ratas. Las ratas de falla son las ratas modelo que no tienen una puntuación adecuada de Longa. Las barras de error representan S.D., *P < 0.05, **P < 0.01. Esta cifra ha sido modificada de Liu et al.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El volumen de infarto y reducción disminuyó gradualmente de 1 a 90 días después de MCAO/R. (A) La tinción TTC del tejido cerebral de rata. (B) El cartograma del volumen infarto y de la contracción (n a 16 a 19). Las barras de error representan S.D., **P < 0.01 frente al primer día después de MCAO/R. Esta cifra ha sido modificada de Liu et al.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La prueba de asimetría bilateral y la prueba de caminar en la red fueron las pruebas de función sensorimotor adecuadas en la etapa de recuperación y secuencia de la isquemia cerebral. (A) La favorabilidad de desgarro de las extremidades derechas en el experimento de desvinculación. (B) Los tiempos de error de recorrido en la cuadrícula en la prueba de recorrido de la red. (C) El período de tiempo en la prueba de rotarod. (D) La puntuación en la prueba de cuerda de elevación. Las barras de error representan S.D., n a 15 a 19, *P < 0,05, ***P < 0,001. Esta cifra ha sido modificada de Liu et al.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tipo | El diámetro del perno de rosca | El diámetro del cabezal del perno de rosca | Peso recomendado de la rata | Nivel |
| 2636 | 0,26 mm | 0,36 mm | 250-280 g | A4 |
| 2838 | 0,28 mm | 0,38 mm | 280-350 g | A4 |
| 3040 | 0,30 mm | 0,40 mm | 360-400 g | A4 |
| 3043 | 0,30 mm | 0,43 mm | >400 g | A4 |
| Nota: El perno de rosca de nivel A4 es el estándar que el extremo de la cabeza es hemisférico, el extremo frontal está cubierto con polilisina, marcado, esterilizado y de compra en uso sin ningún tratamiento (esta tabla ha sido modificada de Liu et al., 2018). | ||||
Tabla 1: Información de la mancha de subprocesos. Esta tabla ha sido modificada de Liu et al.15.
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Discussion
Muchos modelos que establecen métodos e indicadores de comportamiento que se utilizan bien en la isquemia cerebral aguda pueden no tener cambios significativos en las etapas de recuperación y sequela de la isquemia cerebral16,17. Sin embargo, el número de pacientes con isquémica cerebral en las etapas de recuperación y sequela es el mayor. Es esencial seleccionar un modelo animal adecuado para las etapas de recuperación y secuencia ción del accidente cerebrovascular de isquemia.
Utilizamos el modelo MCAO/R en ratas para detectar el peso adecuado de ratas (260-330 g), el tipo de perno de rosca (2636/2838/3040/3043), y el tiempo de infarto cerebral (2-3 h) para la lesión infarto más grave, una alta relación de éxito del modelo e indicadores de comportamiento visibles , que será adecuado para las etapas de recuperación y secuencias de la isquemia cerebral.
Las ratas que pesan 300 g con un perno de rosca 3040 y 3 h de tiempo de infarto cerebral tienen volúmenes de infarto más grandes, defectos de comportamiento más graves y una mayor relación de éxito del modelo(Figura 1). Además, proporcionamos métodos de validación de este modelo de rata mediante pruebas de tinción TTC y de función sensorimotor (prueba de asimetría bilateral, prueba de caminar en la rejilla, prueba de rotarod y prueba de cuerda de elevación) 1-90 días después de la reperfusión. Encontramos que la prueba de asimetría bilateral y la prueba de caminar en red podrían utilizarse para investigar las etapas de recuperación y secuencia de la isquemia porque las diferencias significativas de estos indicadores duran 90 días y 60 días, respectivamente. Cuanto mayor sea el volumen de infarto y reducto, más graves serán los déficits sensorimotores, que se pueden ver en la Figura 2 y la Figura 3.
Este método es principalmente adecuado para la isquemia cerebral causada por LA MCAO. Sin embargo, el modelo tiene diferencias en las anatomías cerebrales entre humanos y ratas, como el grado de circulación colateral. Otra limitación es que la recuperación de la materia blanca no puede verse por la tinción TTC. Otros estudios de la circulación colateral y la recuperación de la materia blanca con imágenes por RMN u otros métodos pueden confirmar el valor predictivo de este modelo.
La cuestión más crítica es que la habilidad de crear un modelo MCAO/R en ratas no es fácil y requiere práctica. Antes del experimento, confirme una relación de éxito del modelo aceptable y paralelo. Se necesitan más instrumentos y métodos para probar la función sensorimotor en las etapas de recuperación y secuenciación de la carrera. Si se utilizó una tarea más difícil, como aumentar la velocidad de 10 a 30 rpm, puede aparecer un período de déficit más largo en la prueba de rotarod. Otras pruebas de comportamiento también pueden ser adecuadas para este modelo, como la detección de marchas. Se deben utilizar métodos de detección más precisos para los pacientes en las etapas de recuperación y secuencia de la isquemia cerebral, que puede identificar el efecto de fármacos u otras herramientas terapéuticas.
Como un nuevo modelo animal para estudiar la isquemia cerebral en las etapas de recuperación y secuencia, el método presentado aquí es significativo y merece la popularización.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81603315, 81603316), Plan clave de I+D de la provincia de Jiangxi en China (20171ACH80001), proyectos de cooperación industrial y académica en colegios y universidades de la provincia de Fujian en China (2018Y41010011).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anatomical Microscope | Leica (Germany) | S8 | Microscopic operating instrument |
| Blade | Gellette | / | Cutting brain sections |
| Constant Temperature Shaking Bed | Taicang Experimental Equipment Factory | THZ-C | To keep the brain sections stained evenly and at a constant temperature |
| Digital Camera | Canon | 700D | For taking pictures of TTC staining |
| Electric Shaver | Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. | 3000# | Removal of hair from the neck of rats |
| Forceps Hamostatic | Shanghai Medical device Co., Ltd. | 14 cm | Using for brain removing |
| Image Pro Plus Software | Media Cybernetics Inc. | 6.0 | Analyze the infarct volume |
| Isoflurane | RWD Life Science | 217170702 | Anesthetic gas |
| Microforceps | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Vascular micromanipulation |
| Microshear | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Vascular micromanipulation |
| Ophthalmic Forceps | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Auxiliary skin and muscle anatomy |
| Pphthalmic Scissors | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Using for cutting the skin of neck |
| Rat Brain Slice Mold | Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. | 400 g | For standard, uniform cutting of brain tissue |
| Rat Rotating Bar Fatigue Apparatus | Anhui Zhenghua Biological Instrument and Equipment Co., Ltd. | ZH-300B | To test the sensorimotor function |
| Small Animal Anaesthesia Machine | Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. | ABM3000 | A gas anesthetic machine |
| Small Animal Thermostat | Beijing Damida Technology Co., Ltd. | DM.7-YLS-20A | To maintain animal body temperature constant during operation |
| Surgical Scissors | Shanghai Medical device Co., Ltd. | 16 cm | Using for decapitate and brain removing |
| Suture | Shanghai Jinhuan Medical Devices Co., Ltd. | 4-0 / 5-0 | Using for skin and muscle sutures / Using for vascular ligations |
| Thread Bolt | Beijing Cinontech Co. Ltd. | 2636/2838/3040/3043-A4 | Blockage of the middle cerebral artery in rats |
| 5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride (TTC) | Sigma | LOT#BCBP3272V | Brain section staining reagent |
References
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