Det er ikke en lett oppgave å utføre in vitro-eksperimenter for å reflektere in vivo-forhold så godt som mulig. Bruken av primær cellekulturer er et viktig skritt mot å forstå cellebiologi i en hel organisme. Den oppgitte protokollen skisserer hvordan du lykkes vokse og kultur embryonale musen lillehjernen neurons.
Bruken av primær cellekulturer har blitt en av de viktigste verktøyene for å studere nervesystemet in vitro. Det endelige målet med å bruke dette forenklede modell systemet er å gi en kontrollert mikromiljøet og opprettholde den høye overlevelsesraten og de naturlige egenskapene til dissosiert neuronal og nonneuronal celler så mye som mulig under in vitro forhold. I denne artikkelen viser vi en metode for å isolere primære neurons fra å utvikle musen lillehjernen, plassere dem i et in vitro miljø, etablere sin vekst, og overvåke deres levedyktighet og differensiering i flere uker. Denne metoden gjelder for embryonale neurons dissosiert fra lillehjernen mellom embryonale dager 12-18.
I flere ti år har cellelinjer blitt mye brukt som en høy gjennomstrømming verktøy i prekliniske studier og biologisk forskning. Kostnadseffektivitet, rask vekst, og reduksjon av levende dyr bruk er noen fordeler ved å bruke disse cellene. Men genetiske endringer og phenotypical endringer akkumuleres etter flere passasjer in vitro1. Forveksling av cellelinjer og genetiske dissimilarity fra primær celler kan føre til ved uforklarlige eksperimenter og falske konklusjoner2,3,4,5. Derfor, til tross for noen likheter med differensiert celler som neurons (f. eks, nevrotransmittere, ion kanaler, reseptorer, og andre Nevron-spesifikke proteiner), neuronal cellelinjer kan ikke gjenskape den fulle fenotype av neurons. Bruke modne neurons er et annet alternativ; disse cellene er imidlertid ikke-dividere postmitotic celler som er vanskelig å spre i kulturen. Videre re-oppføring i celle syklus kan utløse apoptose6.
Tredimensjonal (3D) cellekultur, organotypic skive kulturer, og organoid kulturer har blitt utviklet for å gi et miljø der cellene kan ordne i en 3D-form som etterligner in vivo innstillingen. Således, celle-til-celle kommunikasjon, migrasjon, invasjon av tumorceller i omkringliggende vev, og angiogenese kan bli studert7. Men, ekstra kostnader ved bruk av ekstra mobilnettet matrise (ECM) proteiner eller syntetiske hydrogeler som et sengetøy, vanskeligheter med bildebehandling, og kompatibilitet med høy gjennomstrømming screening instrumenter er betydelige ulemper av 3D celle dyrking. En stor ulempe med organotypic vev Slice kultur er bruken av et stort antall dyr og de negative virkningene av axotomy, som fører til utilgjengelighet av mål og vekstfaktorer for axons, og følgelig neuronal død8.
Derfor er en alternativ tilnærming, som unngår problemer med cellelinjer, vanskeligheten av voksende modne celler, og kompleksiteten av vev, er in vitro modning av umodne primære celler. Primær-celler er avledet direkte fra menneske eller animalsk vev og dissosiert ved hjelp av enzymatisk og/eller mekaniske metoder9. De viktigste prinsippene for isolasjon, seeding, og vedlikehold i kultur medium er like uavhengig av vevs kilden. Imidlertid er de trofiske faktorene som er nødvendige for å fremme spredning og modning svært celle spesifikk6.
Å vite det ‘ fødselsdato av hver lillehjernen celle type er en forutsetning for å designe en primær kultur eksperiment. Generelt, Purkinje celler (PCs) og neurons av lillehjernen kjerner (CN), er født før de mindre cellene, inkludert interneurons (f. eks, kurv, Stel celler) og granule celler. I mus, PCer komme mellom embryonale dagen (E) 10-E13, mens CN neurons på ca E9-E1210.
Andre lillehjernen neurons er født mye senere. For eksempel, i mus, Golgi pasientpopulasjonen av interneurons er generert fra VZ på (~ E14 − E18) og de resterende interneurons (kurv celle og Stel celler) som ligger i molekyl laget komme fra å dele stamceller i den hvite saken mellom tidlig Postnatal (P) 0 – P711. Granule celler er generert fra den eksterne Germinal sonen (EGZ), en sekundær Germinal sone som er avledet fra rostral rhombic leppe og går gjennom Terminal divisjon etter fødselen. Men før deres forløpere oppstår fra rhombic leppe fra E13-E16, har cellene allerede migrert rostrally langs Pia overflate for å gjøre et tynt lag av celler på rygg overflaten av lillehjernen anlage. Nonneuronal macroglial celler som astrocytter og oligodendrocytes, som stammer fra ventrikkel neuroepithelium, er født på e 13,5 − p0 og p0 − P7 henholdsvis11,12,13,14 ,15. Mikroglia er avledet fra eggeplomme-SAC primitive myelogen stamceller mellom E8-E10 og etter invasjonen i sentralnervesystemet kan oppdages i musen hjernen ved E916.
Metoden som presenteres i denne artikkelen er basert på den som opprinnelig ble utviklet av FURUYA et al. og Tabata et al.17,18, som var optimalisert for primær dyrking av Purkinje celler avledet fra Wistar Rat cerebella. Vi har nå tilpasset denne metoden og nøye modifisert den til å studere veksten av mus lillehjernen neurons19. I motsetning til inne våre ny protokollen, kulden disseksjon medium er det hovedavdeling vasket buffer anvendt i løpet av disseksjon og dissosiasjon skritt tidligere tilføyer seeding medium inne FURUYA ‘ protokollen17. Denne bufferen mangler ernæring, vekstfaktorer, og hormoner (alt i Dulbecco ‘ s modifisert Eagle medium: næringsstoff blanding F-12 [DMEM/F12]) som er nødvendig for å støtte cellevekst og overlevelse i løpet av de nevnte trinnene. I tillegg, basert på vår omfattende erfaring med murine primære lillehjernen kulturer, har vi brukt 500 μL av kultur medium i hver brønn (i stedet for 1 mL) og økt Tri-iodothyronine konsentrasjon til 0,5 ng/mL, noe som forbedrer veksten av neuronal celler, i spesielt de med en Purkinje celle fenotype, og fremmer utvekst av dendrittiske grener i kulturen. Den viktigste metoden omtalt i denne artikkelen kan grovt brukes på andre små gnagere (f. eks, ekorn og hamstere) under embryonale utviklingen og kan brukes til å studere lillehjernen neurogenesis og differensiering i de ulike embryonale stadier, som variere mellom arter.
Bruk av primære kulturer er en velkjent metode som gjelder for alle typer neurons17,18,19. I den presenterte protokollen, forklarer vi hvordan å isolere lillehjernen neurons og opprettholde sin levedyktighet med optimal overlevelse in vitro for maksimalt 3 uker. Primær kultur av lillehjernen celler, som ble isolert ved E15-E18, bekrefter samlingen av tre klasser av store neurons: PCer, Golgi celler, og CNs. Cellen organer og …
The authors have nothing to disclose.
Disse studiene ble støttet av tilskudd fra Natural Sciences og engineering Research Council (HM: NSERC Discovery Grant # RGPIN-2018-06040), og Children Hospital Research Institute of Manitoba (HM: Grant # 320035), og ALS Canada-Brain Canada Arthur J. Hudson translational team Grant (JK, HM).
Adobe Photoshop CS5 Version 12 | Adobe Inc | ||
Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6) | Sigma | S0438 | 3 μg/mL |
Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A3608 | |
CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Polyclonal) | CB38 | 1/5000 dilution |
CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Monoclonal) | 300 | 1/1000 dilution |
Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C) | Millipore Sigma | C1768 | |
DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
Dressing Forceps | Delasco | DF-45 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12) | Lonza | 12-719F | |
Fisherbrand Cover Glasses: Circles | fisher scientific | 12-545-81 | |
Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
Insulin from bovine pancreas | Millipore sigma | I5500, I6634, I1882, and I4011 | |
Large Scissor | Stoelting | 52134-38 | |
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
Metallized Hemacytometer | Hausser Bright-Line | 3100 | |
Microdissection Forceps | Merlan | 624734 | |
Pattern 5 Tweezer | Dixon | 291-9454 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher BioReagents | BP399-26 | |
Poly-L-Ornithine | Millipore Sigma | P4638 | |
Progesteron (P4) | Millipore sigma | P8783 | |
PVALB | Swant Swiss Antibodies | 235 | 1/1500 dilution |
Samll Scissor | WPI Swiss Scissors, 9cm | 504519 | |
Sodium Selenite | Millipore Sigma | S9133 | |
Transferrin | Millipore Sigma | T8158 | |
Tri-iodothyronine (T3) | Millipore Sigma | T2877 | |
Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
Zeiss Fluorescence microscope | Zeiss | Z2 Imager |