Cultura primária de neurônios isolados do cerebelo embrionário do rato

Por diversas décadas, as linhas de pilha foram amplamente utilizadas como uma ferramenta elevada da passagem em estudos preclinical e na pesquisa biológica. Custo-efetividade, crescimento rápido e redução do uso de animais vivos são alguns benefícios do uso dessas células. No entanto, alterações genéticas e alterações fenotípicas se acumulam após várias passagens in vitro¹. A identificação incorreta das linhas celulares e a dessemelhança genética das células primárias pode levar a experimentos irreprodutíveis e conclusões falsas^2,3,4,5. Portanto, apesar de algumas semelhanças com células diferenciadas, como neurônios (por exemplo, neurotransmissores, canais de íons, receptores e outras proteínas neuronais específicas), as linhas celulares neuronais não podem replicar o fenótipo completo dos neurônios. Usar neurônios maduros é outra opção; no entanto, essas células são células pós-mitocóticas não divisórias que são difíceis de propagar na cultura. Além disso, a reentrada no ciclo celular pode precipitar a apoptose⁶.

Cultura celular tridimensional (3D), culturas organotípicas de fatias e culturas organóides foram desenvolvidas para fornecer um ambiente no qual as células podem organizar em uma forma 3D que imita o cenário in vivo. Assim, a comunicação célula-célula, migração, invasão de células tumorais em tecidos circundantes, e angiogênese pode ser estudado⁷. No entanto, os custos adicionais do uso de proteínas de matriz celular extra (ECM) ou hidrogéis sintéticos como cama, dificuldade em imagem e compatibilidade com instrumentos de triagem de alta taxa de produção são desvantagens consideráveis de cultivo de células 3D. Uma grande desvantagem da cultura organotípica fatia de tecido é o uso de um grande número de animais e os efeitos adversos da axotomia, o que leva à inacessibilidade de alvos e fatores de crescimento para axônios, e, conseqüentemente, a morte neuronal⁸.

Portanto, uma abordagem alternativa, que evita os problemas com as linhas celulares, a dificuldade de crescimento de células maduras e complexidade dos tecidos, é a maturação in vitro das células primárias imaturas. As células primárias são derivadas diretamente do tecido humano ou animal e dissociadas usando métodos enzimáticos e/ou mecânicos^9. Os principais princípios de isolamento, semeade e manutenção em meio de cultura são semelhantes, independentemente da fonte do tecido. No entanto, os fatores tróficos necessários para promover a proliferação e maturação são altamente específicos^{de células 6.}

Conhecer a "data de nascimento" de cada tipo de célula cerebellar é um pré-requisito para projetar um experimento de cultura primária. Em geral, as células de Purkinje (PCs) e os neurônios dos núcleos cerebelares (CN), nascem diante das células menores, incluindo interneurônios (por exemplo, cesta, células stellate) e células de grânulos. Em camundongos, os PCs emergem entre o dia embrionário (E)10-E13, enquanto os neurônios CN em aproximadamente E9-E12¹⁰.

Outros neurônios cerebelares nascem muito mais tarde. Por exemplo, em camundongos, a subpopulação golgi de interneurônios são gerados a partir de VZ em (~E14-E18) e os interneurônios restantes (células cestos e células stellate) localizados na camada molecular emergem da divisão de células progenitoras na matéria branca entre os primeiros pós-natal (P)0-P7¹¹. As células granule são geradas a partir da zona germinal externa (EGZ), uma zona germinal secundária que é derivada do lábio romébico rostral e passa por divisão terminal após o nascimento. Mas antes de seus precursores surgirem a partir do lábio rébico de E13-E16, as células já migraram rosatralido ao longo da superfície da pia para fazer uma fina camada de células na superfície dorsal do âmino anlage. Células macrogliais não neuronais, como astrócitos e oligodendrócitos, que se originam do neuroepitélio ventricular, nascem em E13,5−P0 e P0−P7 respectivamente^{11,12,13,14 15.} Microglia são derivados de células progenitoras mieloides primitivas de gema-sac entre E8-E10 e após a invasão no sistema nervoso central pode ser detectado no cérebro do rato por E9¹⁶.

O método apresentado neste artigo é baseado no originalmente desenvolvido por Furuya et al. e Tabata et al.^17,18, que foi otimizado para o cultivo primário de células Purkinje derivadas de cerebelo de rato Wistar. Nós já adaptou este método e cuidadosamente modificado para estudar o crescimento dos neurônios cerebelares do rato¹⁹. Ao contrário do nosso novo protocolo, o meio de dissecação a frio é o principal amortecedor de lavagem usado durante as etapas de dissecção e dissociação antes de adicionar o meio de semeada no protocolo¹⁷de Furuya. Este amortecedor não tem a nutrição, fatores de crescimento e hormônios (tudo no meio modificado de Águia de Dulbecco: mistura de nutrientes F-12 [DMEM/F12]) que são necessárias para apoiar o crescimento celular e a sobrevivência durante os passos acima mencionados. Além disso, com base em nossa extensa experiência com culturas cerebelares primárias murina, usamos 500 μL de meio de cultura em cada poço (em vez de 1 mL) e aumentamos a concentração de tri-iodothyronine para 0,5 ng/mL, o que melhora o crescimento das células neuronais, em particularaqueles com um fenótipo de célula sardrugiano Purkinje, e promove a conseqüência de ramos dendríticos na cultura. O principal método apresentado neste artigo pode ser amplamente aplicado a outros pequenos roedores (por exemplo, esquilos e hamsters) durante o desenvolvimento embrionário e pode ser usado para estudar neurogênese cerebelar e diferenciação nas várias fases embrionárias, que diferem entre as espécies.

Todos os procedimentos animais foram realizados de acordo com os regulamentos institucionais e o Guia para o Cuidado e Uso de Animais Experimentais do Conselho Canadense de Cuidados Com Animais e foi aprovado pelas autoridades locais ("o Bannatyne Campus Animal Care Comitê"). Todos os esforços foram feitos para minimizar o número e o sofrimento dos animais utilizados. A profundidade adequada da anestesia foi confirmada observando que não houve alteração na frequência respiratória associada à manipulação e pitada do dedo do dedo do ar ou reflexo da córnea.

1. Preparação

NOTA: Programe o fornecimento de camundongos grávidas cronometrados, com base no plano de pesquisa, para o E12-E18 pós-concepção. A escolha do tempo depende das características celulares desejadas (veja abaixo). Prepare os deslizamentos de tampa e placas pelo menos 2 dias antes do experimento. Poli-L-ornithine é usado como um material de revestimento para realçar o acessório da pilha aos deslizamentos da tampa.

1. Cubra a tampa desliza 2 dias antes do isolamento celular.
   1. Coloque a tampa redonda desliza em uma placa de 24 poços, condições estéreis em um armário de biossegurança. Deixe uma lacuna entre cada deslizamento de cobertura para evitar qualquer contaminação.
   2. Adicione 90 μL de poli-L-ornithine (OLP, 500 μg/mL) ao centro de cada deslizamento de cobertura. Feche a tampa e coloque suavemente a placa em uma incubadora de CO₂ de 37 °C/5% por 2 dias.
      NOTA: Um volume maior pode derramar fora os deslizamentos da tampa durante a incubação. O deslizamento de cobertura não precisa ser completamente coberto com a OLP depois de colocar uma gota. Durante a incubação durante a noite, a OLP distribui igualmente para a borda dos deslizamentos de cobertura.
2. Um dia antes do isolamento celular, prepare o meio de cultura I (DMEM/F-12 contendo putrescine 100 μM, selenite de sódio 30 nM, L-glutamina 3.9 mM, gentamicin3.5 μg/mL, tri-iodothyronine (T3) 0.5 ng/mL, e n3 suplementos [progesterone 4 μM, insulin 20g/mL, transferrina 20 mg/mL]) e meio de semeada (meio de cultura I [sem N3 e T3] contendo 10% de soro bovino fetal [FBS]) e armazená-los em 4 °C. Preparar a solução de trabalho de tripsina (0,25%) no DMEM/F12 e mantê-lo em 4 °C.
   NOTA: As composições médias são fornecidas na Tabela 1.
3. No dia do isolamento celular, coloque a cultura média I e o meio de semeadura na incubadora a 37 °C.
   NOTA: Antes de iniciar o isolamento do cerebelo, certifique-se de que todas as ferramentas e superfícies de trabalho são estéreis.
4. Lavar deslizamentos de cobertura.
   1. Tire a placa de 24 poços da incubadora.
   2. Lave os deslizamentos de cobertura na placa de 24 poços 3x com água destilada dupla (DDW) em um armário de biossegurança em condições estéreis. Cada vez que deixe a tampa desliza embeber em DDW por 5 min antes de começar a aspiração.
   3. Deixe a tampa desliza em um armário de biossegurança para pelo menos 2 h para secar completamente.

2. Coleção Cerebellum

1. Prepare três placas de Petri de plástico estéril de 10 cm cheias de sisino sológico apimentado a fosfato gelado (PBS), 3 placas de Petri cheias de solução de sal equilibrado (HBSS) gelada de Hank 1x e aproximadamente 5 placas de Petri cheias de meio de dissecção gelada (1x HBSS contendo gentamicina 10 μg/mL). Mantenha-os no gelo.
2. Anestesie o rato grávido E18 CD1 com 40% isoflurane. Realize luxação cervical no mouse. Esterilizar o abdômen com solução de etanol de 70%.
3. Use um par de tesouras para fazer uma incisão da pele da sinfonia púbica para o processo xifórico. Em seguida, segure a pele com fórceps e abra a cavidade abdominal.
4. Excise os chifres uterinos com fórceps e lave-os 3x no gelo-frio 1x PBS no gelo.
   NOTA: Todos os seguintes passos devem ser conduzidos no gelo para minimizar a taxa metabólica e evitar danos nos tecidos e celulares.

3. Dissecando o cerebelo

1. Após a última etapa de lavagem, usando um par de fórceps finos separar os embriões do útero em 1x HBSS e transferi-los para o meio de dissecação gelada. No meio da dissecação, decapitar os embriões com tesoura. Coloque o tecido em um meio de dissecação limpa.
   NOTA: Usar um estereoscópio para microdissecção é opcional.
2. Segure o crânio com baceps finos e corte o calvarium com um par de pequenas tesouras do aspecto lateral do crânio em uma linha do foramen magnum para o meatus acústico externo e borda inferior da cavidade orbital.
   NOTA: Tomar este passo expõe a cavidade craniana ao nível da base do crânio e torna mais fácil remover o cérebro.
3. Usando um par de fórceps finos, retire a base do crânio e descasque o crânio longe do cérebro.
4. Retire cuidadosamente as meninges no cerebelo, a partir da superfície lateral do pedúnculo cerebelar médio e pons.
5. Corte ambos os pedúnculos cerebelares e separe o ceebellum do resto do cérebro (Figura 1).
6. Coloque imediatamente a cerebella coletada em um tubo cônico estéril de 15 mL preenchido com 14 mL de DMEM/F12 no gelo.
7. Centrífuga do tubo a 1.000 x g, 4 °C para 1 min, 3x. Cada vez remova delicadamente o supernatant com uma pipeta e resuspenda a pelota em DMEM/F12 fresco, gelado.
   NOTA: Para evitar perder as amostras, use a sucção do armário o mínimo possível.

4. Dissociação de Cerebellum

1. Adicione 2 mL de trippsina pré-aquecida (37 °C) à pelota do passo 3.7 e suavemente pipet para mistura adequada.
2. Coloque o tubo em um banho de água de 37 °C por 12 min.
3. Após a incubação, traga o tubo a um armário da biossegurança e adicione 10 mL de DMEM/F12 para inativar o trypsin.
4. Centrífuga a mistura em 1.200 x g por 5 min. Descarte o supernatant e resuspender a pelota em DMEM fresco/ F12. Repita 3x.
5. Prewet um pipet de transferência de plástico estéril com DMEM/F12.
6. Após a lavagem e a centrifugação final, adicione 3,5 mL de solução de trabalho DNase (1 mL de Solução de estoque DNase I [0,05% DNase + 12 mM MgSO₄ + 1x HBSS] em 500 μL de FBS inativado de calor e 2 mL de DMEM/F12) para a pelota no mesmo tubo.
7. Triturar o tecido com um cachimbo pelo menos 30x até que a mistura atinja uma cor leitosa homogênea.

5. Coleção de células

1. Adicione 10 mL de DMEM/F12 gelado à mistura.
2. Centrífuga a amostra a 1.200 x g,4 °C por 5 min.
3. Retire cuidadosamente o supernatant sem perturbar a pelota.
4. Retire o meio de semeadura da incubadora.
5. Adicione 500 μL de meio de semeadura pré-aquecido para a pelota e misture muito bem usando um pipet para resuspender as células.
6. Conte as células usando um hemocytometer.
7. Diluir a suspensão celular com o meio de semeadura a uma densidade de 5 x 10⁵ células/mL.
8. um armário de biossegurança, adicione 90 μL da mistura diluída a cada poço no centro do deslizamento da tampa.
   NOTA: Não carregue as partículas que não suspenderam no DNase.
9. Coloque a placa na incubadora a 37 °C para 3-4 h.
10. Após a incubação, adicione 500 μL de meio de cultura pré-aquecido I a cada poço e coloque a placa de volta na incubadora (37 °C).

6. Tratamento das células recuperadas

1. Após 7 dias, substitua o velho meio por uma cultura fresca média II (meio de cultura eu complementado com citosina arabinoside [Ara-C, 4 μM] e 100 μg/mL albumina de soro bovino [BSA]; ver Tabela 1).
   NOTA: Este passo é fundamental para evitar o crescimento de células não neuronais.
2. Monitorar o meio de cultura uma vez por dia. Se o pH muda (indicado por uma mudança acentuada na cor, geralmente mais amarelado), remover metade (quase 250 μL) do meio antigo de todos os poços e adicionar 300 μL de meio de cultura pré-aquecida I para cada um deles para evitar a perda de nutrientes.
   NOTA: Fenol vermelho no meio da cultura é um bom indicador do pH do meio e da atividade das células. Tente minimizar o tempo de exposição das células para fora das condições de incubadora. Isso evita qualquer estresse que possa afetar sua viabilidade.

7. Coleta e fixação de células

NOTA: Dependendo do projeto experimental, as células podem ser coletadas a qualquer dia, a qualquer momento.

1. Prepare uma placa separada de 24 poços com a organização numérica correspondente e adicione 100 μL de paraformaldeído de 4% (PFA) a cada poço.
2. Para colher as células nos dias desejados (dependendo do protocolo experimental), retire suavemente os deslizamentos de cobertura dos poços da placa de cultura original e coloque-os nos poços correspondentes da placa cheia de PFA.
3. Adicione PFA aos poços para imergir completamente os deslizamentos da tampa.
   NOTA: Para evitar o desapego celular do deslizamento de cobertura, não adicione o PFA diretamente no deslizamento de cobertura.
4. Mantenha a placa PFA a 4 °C por 30 a 120 min.
5. Após a incubação, restaurar a placa à temperatura ambiente.
6. Lave delicadamente os deslizamentos da tampa 3x para 5 min com 1x PBS.
7. Siga para o processo de imunocoloração.
   NOTA: Neste estudo, um microscópio de fluorescência equipado com uma câmera foi usado para capturar as imagens e montado em montagens usando um aplicativo de software de edição de imagem.

Com base nas diferentes datas de nascimento dos subtipos neuronais no cerebelo, as culturas dos embriões de camundongos E12-E18 produziram diferentes tipos de células. Neurônios de projeção grande, como neurônios CN (E9-E12) e PCs (E10-E13), surgiram cedo durante o desenvolvimento cerebelar. Em camundongos, células de grânulo e Golgi surgiram entre ~E13-E18 e foram submetidas a divisões terminais até a semana pós-natal 4.

Substituindo o velho meio I por uma cultura fresca média II em dias in vitro (DIV) 7 acabará por impedir a proliferação de células gliais. Os interneurônios da camada molecular, como cesta e células stellate, diferenciam após o nascimento. Portanto, a maioria das células do meio cultural do E18 deveria ser uma combinação de PCs, células de grânulo, CN e algumas células Golgi. Calbindin 1 (CALB1), um marcador específico de PCs, foi usado para acompanhar as mudanças morfológicas durante o curso de 21 dias. Na DIV 0, os corpos celulares dos PCs eram detectáveis (por exemplo, 10 a 11 h de incubação), mas a conseqüência do neurito ainda não tinha começado (Figura 2A). Por DIV 3, a extensão axonal mostrou progresso, enquanto os processos dendríticos tinham acabado de começar. Este status permaneceu quase inalterado até a segunda semana in vitro (WIV) (Figura 2B-D). Na DIV 10, alguns ramos esparsos e dendritos primários com espinhos começaram a crescer (Figura 2E). O surgimento dos novos dendritos primários ocorreu continuamente após a DIV 14. Portanto, após a DIV 14, o número de dendritos secundários e terciários aumentou e desenvolveu amplos ramos na DIV 21 (Figura 2F,G).

É importante saber que o momento das mudanças morfológicas in vitro pode não seguir o mesmo padrão que in vivo. Após esses resultados, em outro experimento, a primordia cerebellar dissociada da E12, E13, E14 e E15 foi cultivada por 3 semanas. Os PCs cultivados da E12 e da E13 não desenvolveram qualquer crescimento dendrítico no DIV 18, exceto extensões axonais (Figura 3A,B). No entanto, após o mesmo período de tempo, as culturas de primordium cerebellar dissociadas da E14 e da E15 apresentaram conseqüência dendrítica e arborização (Figura 3C,D). Esta variação do ritmo de crescimento entre as células neurais in vitro lança luz sobre uma grande mudança que aconteceu em seu ambiente natural entre o estágio inicial e tardio do desenvolvimento cerebelar, que precisa ser aplicado in vitro para otimização média.

Junto com PCs, existem outros tipos de células neuronais no cerebelum que se desenvolvem durante culturas cerebelares primárias dissociadas que podem ser detectadas usando marcadores neuronais específicos. A rotulagem de imunofluorescência dupla para CALB1 e uma proteína de albumina de ligação ao cálcio, parvalbumina (PVALB), mostraram que a expressão CALB1 foi restrita exclusivamente a PCs nas culturas cerebelares primárias, enquanto o PVALB foi expresso nos neurônios CALB1+ ( ou seja, PCs) e PVALB+/CALB1- neurônios, que são interneurônios de camada molecular (células cestos/stellate) (Figura 4A-C). A subunidade alfa (Nav1.6) do canal de sódio (SCN) é um marcador para células de granule e PCs no cerebelo20. A rotulagem dupla com anti-SCN e anti-CALB1 mostra a colocalização de corpos de células de grânulo e PCs no meio cultural em DIV 21 (Figura 4D-F). Para outros tipos específicos de células cerebelares de culturas cerebelares primárias dissociadas, consulte Marzban e Hawkes19.

Figura 1: Aspecto dorsal do cérebro do rato que esboça o cerebelo em E18. As meninges são indicadas por quadrados amarelos. A localização do cerebelo é delineada pela linha amarela, que é limitada rosadamente pelo midbrain e caudally pela medulla oblongata (delineada por linhas marrom tracejadas). Os vermis e o hemisfério do cerebelo são mostrados por linhas tracejadas marrons. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 2: Desenvolvimento de células Purkinje (PCs) derivada do cerebelo do rato na E18 na cultura primária por dias in vitro (DIV) 0-21. (A)Somata PC (pontas de flecha) foram rotulados pela imunofluorescência usando anti-calbindina 1 (CALB1) em DIV 0 (após 10 h). (B) A primeira extensão axonal (seta) e a conseqüência dendrítica adiantada (seta) aparecem em DIV 3. O crescimento dendrítico e o desenvolvimento dos PCs (ponta de flecha) continuam no DIV 5 (C)e DIV 7 (D). Os ramos dendríticos dos PCs são claramente distinguíveis no DIV 10 (E) e DIV 14(F)(pontas de flecha) e elaboradas árvores dendríticas são detectáveis no DIV 21 (ponta de flecha) (G). Barras de escala: A = 100 μm (aplica-se aos painéis B, C, D, E e F); G = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 3: Desenvolvimento de células Purkinje (PCs) derivada do primordium cerebellar do rato na E12, E13, E14 e E15 após 18 dias na cultura primária (DIV 18). Os axônios são as únicas extensões (seta) do PC somata na cultura primária do E12 e E13 cerebella primordium após 18 dias in vitro (DIV 18) (A,B). A conseqüência e a extensão dendrite dos PCs tornam-se por DIV 18 (arrowhead) somente de E14 (C)e de E15(D)culturas preliminares cerebellar. Barra de escala = 20 μm (aplica-se aos painéis A−D). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 4: Rotulagem de imunofluorescência de PCs, interneurônios GABAergic (cesta e células stellate), e células de grânulo da cultura primária cerebellar do rato E18 no DIV 21. (A−C) A rotulagem dupla com anti-CALB1 (verde) e anti-PVALB (vermelho) mostra PCs e alguns interneurônios (seta) em contato com os arbors dendríticos do PC. (D−F) Canais de sódio com hastedeada de tensão (SCNs) em corpos de PC com dendritos elaborados e numerosos pequenos corpos de células de granule (ponta de flecha) são rotulados com anti-SCN (vermelho) e rotulados com anti-CALB1 (verde). Abreviaturas: células Purkinje = PCs; CALB1 = calbindin 1; PVALB = parvalbumin; SCN = canal de sódio de voltagem-gated. Barra de escala = 100 μm (aplica-se a A−F). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Tabela 1: Composições de mídia.

Os autores não têm nada a divulgar.