Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

התרבות הראשית של הנוירונים מבודדים מתוך עכבר ממוח עובריים

Published: October 26, 2019 doi: 10.3791/60168
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1, 2,4, 1,2
1Department of Human Anatomy and Cell Science, Max Rady College of Medicine, Rady Faculty of Health Sciences, University of Manitoba, 2The Children's Hospital Research Institute of Manitoba (CHRIM), Max Rady College of Medicine, Rady Faculty of Health Sciences, University of Manitoba, 3Department of Oral Biology, University of Illinois at Chicago, 4Department of Pathology, Max Rady College of Medicine, Rady Faculty of Health Sciences, University of Manitoba

Summary

ניהול ניסויים בלתי מתורבת כדי לשקף את התנאים הvivo ככל האפשר, אינו משימה קלה. השימוש בתרביות תאים ראשונית הוא צעד חשוב להבנת הביולוגיה התאית באורגניזם שלם. הפרוטוקול שסופקו מתאר כיצד לצמוח בהצלחה תרבות עובריים העכבר מתחלקים נוירונים.

Abstract

השימוש בתרביות תאים ראשונית הפך לאחד הכלים העיקריים לחקר מערכת העצבים בתחומי החוץ. המטרה האולטימטיבית של שימוש במערכת מודל פשוטה זו היא לספק סביבת מיקרו מבוקרת ולשמור על שיעור ההישרדות הגבוה ואת התכונות הטבעיות של תאים עצביים הופלו ושאינם עצביים ככל האפשר תחת בתנאי מבחנה. במאמר זה, אנו מדגימים שיטה של בידוד הנוירונים העיקריים מתוך המוח הראשי מתפתח העכבר, הצבת אותם בסביבה מבחנה, הקמת הצמיחה שלהם, ניטור הכדאיות שלהם בידול במשך מספר שבועות. שיטה זו ישימה הנוירונים עובריים המנתק המוח בין הימים העובריים 12 – 18.

Introduction

במשך כמה עשורים, קווי התא שימשו באופן נרחב ככלי תפוקה גבוהה במחקרים פרה-קליניים ומחקר ביולוגי. עלות-תועלת, צמיחה מהירה, והפחתה של השימוש בעלי חיים חיים הם כמה יתרונות של שימוש בתאים אלה. עם זאת, שינויים גנטיים ופנוטיטינוים מצטברים לאחר מספר פסקאות בתוך מבחנה1. מקריות של קווי תאים וdissimilarity גנטיים מתאים ראשוניים יכולים להוביל לניסויים בחוסר הזדהות ולמסקנות כוזבות2,3,4,5. לכן, למרות קווי דמיון מסוימים כדי הבדיל תאים כגון נוירונים (למשל, נוירוטרנסמיטורים, ערוצי יון, קולטנים, וחלבונים אחרים בתאי העצב), קווי התאים עצביים לא יכול לשכפל את הפנוטיפ מלא של נוירונים. שימוש בנוירונים מבוגרים הוא אופציה אחרת; עם זאת, תאים אלה אינם מחלקים postmitotic תאים שקשה להפיץ בתרבות. יתר על כן, כניסה מחדש לתוך מחזור התא עשוי לזרז אפופטוזיס6.

תרבות תא תלת מימדי (3D), תרביות פרוסה אורגנותמית, ותרבויות אורגנואיד פותחו כדי לספק סביבה שבה תאים יכולים לסדר לתוך טופס 3D המחקה את vivo הגדרה. כך, תקשורת תא אל התא, הגירה, פלישה של תאים סרטניים לתוך הרקמות הסובבות, ו אנגיוגנזה ניתן ללמוד7. עם זאת, עלויות נוספות של שימוש מטריצה סלולרית נוספת (ECM) חלבונים או הידרוג'לים סינתטיים כמצע, קושי הדמיה, ותאימות עם מכשירי סינון תפוקה גבוהה הם חסרונות ניכרים של תא 3D culturing. חיסרון משמעותי בתרבות הפרוסה של רקמת הרקמה הוא השימוש במספר רב של בעלי חיים ובהשפעות השליליות של הפיום, המוביל לנגישות של מטרות וגורמי גדילה לאקסונים, וכתוצאה מכך מוות עצבי8.

לכן, גישה חלופית, אשר מונעת את הבעיות עם קווי התאים, הקושי של הגידול תאים בוגרים, ומורכבות של רקמות, הוא התבגרות מתורבת של תאים ראשוניים לא בוגרים. התאים הראשוניים נגזרים ישירות מרקמת אדם או בעל חיים ומונתק בשיטות אנזימטיות ו/או מכניות9. העקרונות המרכזיים של בידוד, זריעה ותחזוקה במדיום התרבותי דומים ללא קשר למקור הרקמה. עם זאת, הגורמים ההזנה הדרושים כדי לקדם התפשטות והתבגרות הם מאוד מסוימים התא6.

לדעת את ' הלידה ' של כל סוג תא המוח הוא תנאי מוקדם לעיצוב ניסוי התרבות העיקרית. באופן כללי, התאים Purkinje (מחשבים אישיים) ואת הנוירונים של גרעיני המוח (CN), נולדים לפני התאים הקטנים, כולל interneurons (למשל, סל, תאים stellate) ותאי הגרניט. בעכברים, מחשבים מופיעים בין היום העובריים (E) 10 – E13, ואילו נוירונים CN ב כ E9 – E1210.

. מאוחר יותר נולדים המון נוירונים לדוגמה, בעכברים, אוכלוסיית המשנה של Golgi של האינטרנוירונים נוצרות מ-VZ ב (~ E14-E18) ושאר התאים הביננוירונים (תא סל ותאי stellate) הממוקמים בשכבה המולקולרית מגיחים מחלוקת תאים מחולל בחומר הלבן בין תחילת פוסט לנטאל (P) 0 – P711. תאי הגרניט מופקים מאזור נבטי חיצוני (EGZ), אזור נבטי משני שנגזר מהשפתיים הrostral מעובית ועובר דרך החטיבה הסופנית לאחר הלידה. אך לפני שהסמנים שלהם נובעים השפה מעובית מ E13 – E16, התאים כבר הועברו rostrally לאורך משטח הפיה כדי ליצור שכבה דקה של תאים על המשטח החלק הפנימי של אנאג המוח. תאי מקרוגליאל ללא עצבי כגון אסטרוציטים ו oligodendrocytes הפוך, אשר מקורם של נוירואפיתל המוח, נולדים ב e 13.5-P0 וP0-P7 בהתאמה11,12,13,14 ,בן 15 Microglia נגזרות של חלמון-שק מיאלואיד פרימיטיבי התאים בין E8 – E10 ולאחר הפלישה למערכת העצבים המרכזית ניתן לזהות במוח העכבר על ידי E916.

השיטה המוצגת במאמר זה מבוססת על האחד שפותח במקור על ידי furuya et al. ו tabata et al.17,18, אשר היה ממוטב עבור culturing העיקרי של תאים purkinje נגזר של חולדה עכברוש וויסטאר. יש לנו עכשיו להתאים את השיטה הזאת ושינה בקפידה אותו ללמוד את הצמיחה של העכבר מוח הנוירונים19. בניגוד לפרוטוקול החדש שלנו, מדיום לחיתוך קר הוא מאגר הכביסה העיקרי המשמש במהלך הניתוח ושלבי הדיסוציאציה לפני הוספת מדיום זריעה בפרוטוקול של פאראיה17. מאגר זה חסר את התזונה, גורמי גדילה, והורמונים (כל בינוני משתנה הנשר מדולקו: תערובת מזינים F-12 [Dמאמ/F12]) כי יש צורך לתמוך צמיחת תאים והישרדות במהלך השלבים הנ ל. בנוסף, בהתבסס על הניסיון הנרחב שלנו עם תרבויות המוח הראשי murine, השתמשנו 500 μl של התרבות הבינונית בכל טוב (במקום 1 mL) והגדילה את הריכוז tri-iothyronine כדי 0.5 ng/mL, אשר משפר את הצמיחה של תאים עצביים, ב במיוחד אלה עם תא מיוחד Purkinje, ומקדם את הצמיחה של ענפים דנדריטים בתרבות. השיטה העיקרית מובלט במאמר זה ניתן להחיל באופן כללי על מכרסמים קטנים אחרים (למשל, סנאים ואוגרים) במהלך פיתוח עובריים ניתן להשתמש כדי ללמוד נוירוגנזה המוח ובידול בשלבים העובריים השונים, אשר שונים בין המינים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הליכי בעלי החיים בוצעו בהתאם לתקנות מוסדיים והמדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים ניסיוניים מהמועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים ואושרה על ידי הרשויות המקומיות (הטיפול בבעלי חיים בקמפוס בנטלי וועדה "). כל המאמצים נעשו כדי למזער את המספר והסבל של בעלי חיים ששימשו. עומק מתאים של הרדמה אושרה על ידי התבוננות כי לא היה שינוי בקצב הנשימה הקשורים מניפולציה וקמצוץ הבוהן או רפלקס המצמוץ.

1. הכנה

הערה: לתזמן את האספקה של עכברים בהריון מתוזמן, בהתבסס על תוכנית המחקר, לאחר ההתעברות E12 – E18. בחירת העיתוי תלויה במאפייני התאים הרצויים (ראו להלן). הכינו את תעודות הכיסוי והלוחות לפחות יומיים לפני הניסוי. פולי-אל-אורבך משמש כחומר ציפוי כדי לשפר את החיבור המצורף לתא לפתקי הכיסוי.

  1. המעיל מחליק יומיים לפני בידוד התא.
    1. מניחים את העטיפה העגולה גולשת בצלחת של 24 שעות, תחת תנאים סטריליים בארון בטיחות ביולוגי. השאר פער בין כל שובר כיסוי כדי למנוע כל זיהום.
    2. הוסף 90 μL של שכבות פולי אל-האורלך (אש ף, 500 μg/mL) למרכז של כל תגית כיסוי. סגרו את הכיפה ובעדינות הניחו את הצלחת בחממה של 37 ° c/5%2 עבור יומיים.
      הערה: נפח גדול יותר עלול לשפוך את פתקי הכיסוי במהלך הדגירה. מכסה הכיסוי אינו צריך להיות מכוסה לחלוטין עם אש ף לאחר הנחת המסירה. במהלך הדגירה של הלילה, אש ף מפיצה באופן שווה את הקצה של תעודות הכיסוי.
  2. יום אחד לפני בידוד התא, להכין את התרבות בינונית I (DMEM/F-12 המכילים ריקבון מ100 μM, נתרן סלנייט 30 ננומטר, L-גלוטמין 3.9 mM, gentamicin 3.5 μg/mL, tri-iodothyronine (T3) 0.5 ng/mL, ו N3 תוספי מזון [הפרוגסטרון 4 μM, אינסולין 20 μg העברת 20 מ"ג/mL]) ו זריעה בינונית (תרבות בינונית אני [ללא N3 ו-T3] המכיל 10% סרום העובר העוברי [FBS]) ולאחסן אותם ב 4 ° c. הכנת טריפסין פתרון עבודה (0.25%) ב-Dמאמ/F12 ולשמור אותו ב 4 ° c.
    הערה: הקומפוזיציות הבינוניות מסופקות בטבלה 1.
  3. ביום של בידוד התא, המקום בינוני התרבות אני וזריעת בינוני בחממה ב 37 ° c.
    הערה: לפני הפעלת הבידוד המוח ה, ודא שכל הכלים ומשטחי העבודה הם עקרים.
  4. שטוף כיסוי מכסה.
    1. . קח את הצלחת ה -24 היטב מתוך החממה
    2. שטוף את תעודות הכיסוי ב -24 הצלחות בצלחת 3x עם מים מזוקקים כפולים (DDW) בתוך ארון בטיחות בתנאים סטריליים. בכל פעם אפשר לכסות את הכיסוי ב-DDW במשך 5 דקות לפני תחילת השאיפה.
    3. השאירו את תעודות הכיסוי בארונית ביו-בטיחות לפחות 2 שעות כדי להתייבש לחלוטין.

2. אוסף המוח השני

  1. הכינו 3 10 ס מ מאכלים מפלסטיק סטרילי ממולאים בקרח קר 1x פוספט באגירה (PBS), 3 מנות פטרי מלא קרח קר 1x האנק מאוזנת תמיסת מלח (HBSS), ובערך 5 מנות פטרי מלאים בינונית לחיתוך קרח קר (1x HBSS מכיל gentamicin 10 μg/mL). . תשאיר אותם בקרח
  2. הE18 CD1 העכבר ההרה בהריון עם 40% isofלאנה. לבצע פריקה צוואר הרחם על העכבר. לחטא את הבטן עם 70% הפתרון אתנול.
  3. השתמש בזוג מספריים כדי להפוך את העור חתך מתוך סימטרי הערווה לתהליך xiphoid. ואז להחזיק את העור עם מלקחיים ולפתוח את חלל הבטן.
  4. בלו קרניים הרחם עם מלקחיים ולשטוף אותם 3x בקרח קר 1x PBS על הקרח.
    הערה: השלבים הבאים צריכים להתבצע על קרח כדי למזער את קצב חילוף החומרים ולמנוע נזק לרקמות ולתאים.

3. מבתר את המוח ההוא

  1. לאחר שלב הכביסה האחרון, באמצעות זוג מלקחיים עדינים להפריד את העוברים מן הרחם ב-1x HBSS ולהעביר אותם למדיום לנתיחה קר קרח. במדיום הניתוח, ערוף את. ראשו של העוברים במספריים מניחים את הרקמה במדיום חיתוך נקי.
    הערה: שימוש בstereomicroscope לניתוח מיקרו הוא אופציונלי.
  2. להחזיק את הגולגולת עם מלקחיים עדינים לחתוך דרך חילונית עם זוג מספריים קטנים מן ההיבט הצדדי של הגולגולת בקו מגנום foramen לתוך מטוס אקוסטי חיצוני הגבול הנחות של חלל מסלולית.
    הערה: לקיחת צעד זה חושף את חלל הגולגולת ברמה של בסיס הגולגולת והופך את זה קל יותר להסיר את המוח.
  3. באמצעות זוג מלקחיים עדינים, להסיר את בסיס הגולגולת ולקלף את הגולגולת הרחק מהמוח.
  4. הוציאו בזהירות את קרום המוח על החלק השני, החל מהמשטח הרוחבי של הדוד והpons האמצעיים.
  5. חותכים את שני העצמות האלה ומפרידים בין המוח החלק המוח לשאר הראש (איור 1).
  6. מיד למקם את המוח שנאסף ב 15 מ ל סטרילי שפופרת חרוטי ממולא 14 מ ל של Dמאמ/F12 על הקרח.
  7. צנטריפוגה את הצינור ב 1,000 x g, 4 ° צ' עבור 1 דקות, 3x. בכל פעם מסירים בעדינות את הסופרנטנט עם הפיפטה ומשלחים את הגלולה בג הטרי, הקפוא/F12.
    הערה: כדי להימנע מאיבוד הדגימות, השתמש היניקה מעט ככל האפשר.

4. דיסוציאציה המוח

  1. הוסף 2 מ ל של טרום מחומם (37 ° c) טריפסין אל הגלולה משלב 3.7 ובעדינות pipet עבור ערבוב הולם.
  2. הניחו את הצינור באמבט מים בגודל 37 ° c במשך 12 דקות.
  3. לאחר הדגירה, להביא את הצינור לקבינט בטיחות ולהוסיף 10 מ ל של Dמאמ/F12 כדי להשבית את טריפסין.
  4. צנטריפוגה את התערובת ב 1,200 x g עבור 5 דקות. למחוק את הסופרנטאנט ולהשעות מחדש את הגלולה ב-dmem טרי/F12. חזור על 3x.
  5. להרטיב העברת פלסטיק סטרילי pipet עם Dמאמ/F12.
  6. לאחר כביסה ואת צנטריפוגה הסופי, להוסיף 3.5 mL של פתרון העבודה DNase (1 מ ל של הפתרון המלאי DNase I [0.05% DNase + 12 מ"מ MgSO4 + 1X hbss] ב 500 ΜL של fbs חום ו 2 מ"ל של d,/F12) לתוך הגלולה באותה צינורית.
  7. Triturate את הרקמה עם העוגה לפחות 30x עד התערובת משיגה צבע חלבי הומוגנית.

5. אוסף תאים

  1. הוסף 10 מ ל של הקרח קר DMEM/F12 לתערובת.
  2. צנטריפוגה את המדגם ב 1,200 x g, 4 ° צ' עבור 5 דקות.
  3. הסר בזהירות את הסופרנטאנט. מבלי להפריע לגלולה
  4. הסר את מדיום הזריעה מהאינקובטור.
  5. הוסף 500 μL של מדיום שחומם מראש לגלולה ולערבב אותו היטב באמצעות pipet להשעות מחדש את התאים.
  6. לספור את התאים באמצעות הומוציטומטר.
  7. דלל את ההשעיה של התא עם בינוני הזריעה לצפיפות של 5 x 105 תאים/mL.
  8. תחת ארון בטיחות ביולוגי, להוסיף 90 μL של תערובת מדולל לכל באר במרכז שובר הכיסוי.
    הערה: אל תטען את החלקיקים שלא הושהה ב-DNase.
  9. מניחים את הצלחת בחממה ב 37 ° c עבור 3 עד 4 h.
  10. לאחר דגירה, להוסיף 500 μL של מדיום התרבות מראש אני כל טוב למקם את הצלחת בחזרה לתוך החממה (37 ° c).

6. טיפול בתאים המשוחזרים

  1. לאחר 7 ימים, להחליף את המדיום הישן עם תרבות טרייה בינונית השנייה (התרבות בינונית אני בתוספת עם ציטוסין הערביות הדו [Ara-C, 4 μM] ו-100 μg/mL סרום הפרה אלבומין [BSA]; ראה טבלה 1).
    הערה: שלב זה קריטי כדי להימנע מגדילה של תאים שאינם עצביים.
  2. מפקחים על המדיום התרבותי פעם ביום. אם השינויים pH (מצוין על ידי שינוי מסומן בצבע, בדרך כלל הצהף), להסיר מחצית (כמעט 250 μL) של המדיום הישן מכל הבארות ולהוסיף 300 μL של מדיום התרבות prewarmed אני לכל אחד מהם כדי למנוע אובדן מזון.
    הערה: פנול אדום בתווך התרבות הוא אינדיקטור טוב ל-pH של המדיום והפעילות של התאים. נסה למזער את זמן החשיפה של התאים למצב של החממה. זה מונע כל לחץ שעלול. להשפיע על הכדאיות שלהם

7. מאגר וקיבוע תאים

הערה: בהתאם לתכנון הניסיוני, ניתן לאסוף את התאים בכל יום, בכל נקודת זמן.

  1. להכין צלחת נפרדת 24 היטב עם הארגון המספרי המתאים ולהוסיף 100 μL של 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) לכל טוב.
  2. כדי לקצור את התאים בימים הרצויים (בהתאם לפרוטוקול הניסיוני), הסירו בעדינות את תעודות הכיסוי מבארות הלוחיות של התרבות המקורית והניחו אותם בבארות המתאימות של הלוחית המלאה.
  3. הוסיפו את כיסוי הכיוון לבארות כדי לטבול לחלוטין את פתקי הכיסוי.
    הערה: כדי להימנע מניתוק תאים משובר הכיסוי, אל תוסיף את הכיוון הכולייתי ישירות על שובר הכיסוי.
  4. שמרו על לוחית הרישוי ב -4 ° c במשך 30-120 דקות.
  5. לאחר הדגירה, לשחזר את הצלחת לטמפרטורת החדר.
  6. לשטוף בעדינות את המכסה גולשת 3x עבור 5 דקות עם 1x PBS.
  7. . המשך לתהליך החיסוני
    הערה: במחקר זה, מיקרוסקופ פלואורסצנטית מצויד במצלמה שימש כדי ללכוד את התמונות והתאספו לתוך ונטאז באמצעות עריכת תמונה יישום תוכנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בהתבסס על תאריכי ההולדת השונים של סוגי המשנה העצביים בחלק המוח, תרבויות מ E12-E18 העוברים העכבר הניבו סוגים שונים של תאים. הקרנה גדולה נוירונים, כגון נוירונים CN (E9-E12) ומחשבים אישיים (E10-E13), התפתחה מוקדם במהלך התפתחות המוח. בעכברים, התאים הגרתיים ובתאי גולג'י התעוררו בין ~ E13 – E18 ועברו חלוקת מסופים לשבוע הפוסט-לידה 4.

החלפת המדיום הישן אני עם תרבות טרייה בינונית II בימים של מבחנה (DIV) 7 בסופו של דבר למנוע התפשטות התאים גליה. האינטרנוירונים של השכבה המולקולרית, כגון תאים סל ו stellate, להבדיל לאחר הלידה. לכן, רוב התאים במדיום התרבות ב E18 היו צפויים להיות שילוב של מחשבים אישיים, תאים מגרניט, CN, וכמה תאים Golgi. Calbindin 1 (CALB1), סמן מסוים של מחשבים אישיים, שימש למעקב אחר שינויים מורפולוגיים במהלך 21 יום קורס. ב-DIV 0, נמצאו גופי התא של המחשבים (לדוגמה, 10 עד 11 מתוך דגירה), אך הגדילה של neurite עדיין לא החלה (איור 2A). על ידי DIV 3, הארכה סיבי הראה התקדמות, בעוד תהליכים דנדריטים רק התחיל. מצב זה נותר כמעט ללא שינוי עד לשבוע השני במבחנה (WIV) (איור 2B-D). ב-DIV 10, כמה ענפים דלילים ודנדריטים הראשי עם הקוצים החלו לצמוח (איור 2E). בליבלוב הדנדטים הראשוניים החדשים התרחשו ברציפות לאחר DIV 14. לפיכך, לאחר DIV 14, מספר הדנדריטים המשניים והשלישוני גדל והתפתח סניפים רחבים ב-DIV 21 (איור 2F,G).

חשוב לדעת שהתזמון של שינויים מורפולוגיים במבחנה לא יכול לעקוב אחר אותה תבנית כמו בvivo. בעקבות התוצאות הללו, בניסוי אחר, המוח הE12 ביותר מבין השאר, מE13, E14, וE15 היו מתורבתים במשך 3 שבועות. המחשבים המתורערים מ-E12 ו-E13 לא פיתחו את כל הצמיחה הדנדריטית ב-DIV 18 למעט הרחבות סיבי (איור 3a,B). עם זאת, לאחר אותה תקופה של זמן, המוח המנתק הפרידיזציה בתרבויות מ E14 ו E15 הראה הצמיחה הדנדריטי ו arborization (איור 3C,D). זו וריאציה קצב הצמיחה בין תאים עצביים בתוך מבחנה שופך אור על שינוי גדול שקרה בסביבה הטבעית שלהם בין השלב המוקדם והמאוחר של התפתחות המוח, אשר צריך להיות מיושם בתוך מבחנה עבור אופטימיזציה בינונית.

יחד עם מחשבים אישיים, ישנם סוגים אחרים של תאים עצביים במוח הראשי המתפתחים במהלך בתרבויות המוח העיקרי מנתק כי ניתן להבחין באמצעות סמנים נוירוonal ספציפיים. לCALB1 החיסונית כפולה של מחייב סידן חלבון אלבומין, parvalbumin (PVALB), הראה כי CALB1 ביטוי היה מוגבל באופן בלעדי למחשבים בתרבויות המוח הראשי, בעוד PVALB ביטא CALB1+ נוירונים ( i.e., מחשבים) ו PVALB+/Calb1– נוירונים, שהם שכבה מולקולרית interneurons (סל/Stellate תאים) (איור 4a–C). יחידת המשנה האלפא (Nav1.6) של ערוץ הנתרן הסגור במתח (scn) הוא סמן עבור תאים מבוססי ומחשבים אישיים בחלק המוח20. תיוג כפול עם anti-SCN ו-anti-CALB1 מראה את הלוקליזציה של גופים תא הגרריר ומחשבים בינונית תרבותית ב-DIV 21 (איור 4D–F). עבור סוגים אחרים של תאים המוח מתרבויות המוח העיקרי הנתק, אנא ראה Marzban ו הוקס19.

Figure 1
איור 1: ההיבט הגבי של מוח העכבר מתאר את המוח הE18. הקרום מסומן בריבועים צהובים. מיקומו של המוח ההוא מחולק על ידי הקו הצהוב, אשר מוגבל rostrally על ידי המוח האמצע והוא מלווה על ידי לשד מוונגאטה (המוקף בקווים מקווקווים חומים). הורסטיות המוח הזעיר וחצי הכדור מוצגים על-ידי קווים מקווקווים חומים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: פיתוח תאים Purkinje (מחשבים אישיים) נגזר מהמוח הE18 של העכבר בתרבות הראשית במשך ימים בתחום החוץ (DIV) 0 – 21. (א) מחשבsomata (ראשי חץ) סומנו על ידי immunofluorescence באמצעות אנטי-calbindin 1 (CALB1) ב-DIV 0 (אחרי 10 שעות). (ב) הסיומת הסיבי הראשונה (החץ) והגדילה הדנדריטית המוקדמת (ראש חץ) מופיעות ב-DIV 3. מוצלח והתפתחות דנדריטי של המחשבים ממשיכים ב-DIV 5 (C) ו-div 7 (D). הענפים הדנדריטים האישיים של המחשבים ברורים באופן ברור ב-DIV 10 (E) ו-DIV 14 (F) (חץ ראשי) ועצי דנדריטי מורכבים מסומנים ב-DIV 21 (ראש חץ) (ז). סרגל שורות: A = 100 יקרומטר (חל על פאנלים B, C, D, E ו-F); G = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: פיתוח תאים Purkinje (מחשבים אישיים) נגזר מתוך המוח הראשי של מE12, E13, E14, ו E15 לאחר 18 ימים בתרבות הראשית (DIV 18). האקסונים הם ההרחבות היחידות (חץ) מ somata PC בתרבות הראשית של E12 ו E13 הפריבלה הראשוניים לאחר 18 ימים מחוץ למוח (DIV 18) (A,B). המחשב ' דנדריטים מגדילה והרחבה להתפתח על ידי DIV 18 (ראש חץ) רק מ E14 (ג) ו E15 (ד) התרבויות הראשיות המוח. סרגל קנה מידה= 20 יקרומטר (חל על לוחות A-D). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: מimmunofluorescence תיוג של מחשבים אישיים, האינטרנוירונים בתאי (סל ו stellate תאים), ואת התאים הגרסטי מE18 עכבר המוח העיקרי בתרבות DIV 21. (א-ג) תיוג כפול עם anti-CALB1 (ירוק) ו anti-PVALB (אדום) מראה מחשבים אישיים ו interneurons כמה (חץ) במגע עם arbors המחשב הדנדריטי. (ד-נ) ערוצי נתרן מגודרת מתח (SCNs) בגופים PC עם דנדריטים הפירט וגופים קטנים של תא הגרניט (ראש חץ) מסומנים עם anti-SCNS (אדום) ו כפול התווית עם anti-CALB1 (ירוק). קיצורים: התאים של Purkinje = מחשבים אישיים; CALB1 = קלבינדין 1; PVALB = parvalbumin; SCN = מגודרת מתח ערוץ נתרן. סרגל קנה מידה= 100 יקרומטר (חל על A-F). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

שם בינונית-בסיסית ריקבון מצוי סודיום סלניט ל-גלוטמין Gentamicin T3 N3 BSA Ara-C מיכל הפבס
בינונית תרבותית Dמאמ/F12 100 μM 30 ננומטר 3.9 ממ ' 3.5 μg/mL 0.5 ng/mL פרוגסטרון 4 μM, אינסולין 20 μg/mL, Transferrin 20 מ"ג/mL - - -
זורעי מדיום Dמאמ/F12 100 μM 30 ננומטר 3.9 ממ ' 3.5 μg/mL - - - - 10% עם התרבות הבינונית
תרבות בינונית 2 בינונית תרבותית 100 μg/mL 4 μM -

טבלה 1: קומפוזיציות מדיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השימוש בתרבויות הראשיות הוא שיטה ידועה הישימה עבור כל סוגי הנוירונים17,18,19. בפרוטוקול המוצג, אנו מסבירים כיצד לבודד נוירונים מקרבלאר ולשמור על הכדאיות שלהם עם הישרדות אופטימלית בתוך מבחנה מקסימלית של 3 שבועות. התרבות העיקרית של תאים המוח, אשר היו מבודדים ב E15-E18, מאשרת את האוסף של שלושה כיתות של נוירונים גדולים: מחשבים אישיים, תאי Golgi, ו-Cn. הגופים התא והתחזיות של תאים golgi (שחלקם להגיח ב E19-P5) ו סומה של תאים גרגר עושה ניתן לזהות על ידי neurogranin (nrgn) ו SMI32 נוגדנים, בהתאמה, בתוך 21 ימים של תרבות19,21.

גורם קריטי להישרדות ותחזוקה של נוירונים המוח הוא סוג של מדיום התרבות בשימוש. FBS שיושלם בינוני כבר תנאי סטנדרטי עבור קווי תאים התרבות העיקרית במשך עשורים. עם זאת, חששות אתיים, השתנות בהרכב הסרום, והפוטנציאל שלה להיות מקור לזיהום, הובילו כמה זהירות22. לאחרונה, תוסף מועשר/F-12 בינוני נמצא כדי להפחית את הפער בין התנאים הפיזיולוגיים ובמודלים נוירולוגיים מתורבת. המדיום המוצעים על ידי furuya et al. שיעור ההישרדות של מחשבים אישיים ושיפור בידול הדנדריטים שלהם בהשוואה בשימוש נרחב הנשר המדיום בינונית (bme) מבוסס סרום-מדיום חינם17,18,23. מדיום זה הפך לבסיס של מדיה המוגדרים כימית מיושם בתרבות המוח התא הראשי.

התא הראשי culturing של נוירונים יש מגבלות. כמו בכל תרבות מבחנה, תאים יכולים לשרוד לתקופה מוגבלת של זמן. ללא יוצא מן הכלל, התאים העצביים הראשוניים שאינם מתורבתים בחוץ יכולים להיות רק מספר מוגבל של פעמים. שימוש מוגזם ישפיע על בריאות הסלולר, התפקוד והפנוטיפים, וככאלה תוצאות נסיוניות משתנה. לכן, בדרך כלל מתקיימים בשלושת השבועות הראשונים של התרבות הראשונה ניסויים מבוססי-תרבות, המבוססיםעל תרבויותשאינן מבוססות על כפתונאליות. בתנאים מחוץ למבחנה עדיין לא היתה מיטבית מספיק כדי לשרת את כל התאים של מערכת העצבים בו זמנית, באופן דומה לסביבה הטבעית שלהם. לדוגמה, שימוש ב-Ara-C כדי לעכב התפשטות של תאים שאינם עצביים הוא נפוץ למדי במחקרים שבהם השגת שיעור הישרדות גבוה יותר של תאים עצביים היא עדיפות. לפיכך, איכות התרבויות הראשיות נשענת על שיטות שמאזנות באופן מלאכותי את אוכלוסיית תאי החוץ המלאכותית לטובת סוגי התאים המעניינים25,26. למרות המגבלות שלה, התרבות הסלולרית העיקרית היא גישה מצוינת ללמוד מנגנונים סלולריים, איתות מסלולים, ו-ו-ו-ו-ו-וגנומית שינויים בתנאים שבהם צמיחה הסלולר אופטימיזציה (בכפוף למטרות מחקר ספציפי) הוא בזהירות אופיין ובהשוואה למצב הvivo. בנוסף, התרבות העיקרית המוח כמו מערכת מודל פשוטה מספקת מיקרוסביבה מבוקרת לחקור שפע של השפעות פיזיולוגיות מורפולוגית ופיזיולוגית בתיווך על ידי מולקולות רבות המשפיעות על תאים עצביים27, . עשרים ושמונה עם זאת, עד כמה המאפיינים הפיזיולוגיים של תאים אלה נשמרים מחוץ ההגדרה vivo נשאר להבהיר לגמרי.

השיטה המוצגת היא פרוטוקול כללי חסכוני עבור תאים ראשוניים של culturing. הוא מספק אפשרויות רחבות יותר לטיפול בתאים ובדיקת סמים מבלי לשנות את אופי התאים, שהוא חיוני (טרום) ניסויים קליניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

מחקרים אלה היו נתמכים על ידי מענקים מדעי הטבע ומועצת המחקר ההנדסה (HM: מענק דיסקברי NSERC RGPIN-2018-06040), וילדים החולים מחקר המכון של מניטובה (HM: גרנט 320035), ו-ALS קנדה-המוח קנדה ארתור J. צוות הדסון טרנסלtional גרנט (JK, HM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adobe Photoshop CS5 Version 12 Adobe Inc
Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6) Sigma S0438 3 μg/mL
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A3608
CALB1 Swant Swiss Antibodies (Polyclonal) CB38 1/5000 dilution
CALB1 Swant Swiss Antibodies (Monoclonal) 300 1/1000 dilution
Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C) Millipore Sigma C1768
DNase I from bovine pancreas Roche 11284932001
Dressing Forceps Delasco DF-45
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12) Lonza 12-719F
Fisherbrand Cover Slips: Circles Fisher Scientific 12-545-81
Gentamicin Gibco 15710-064
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco 14185-052
Insulin from bovine pancreas Millipore sigma I5500, I6634, I1882, and I4011
Large Scissor Stoelting 52134-38
L-glutamine Gibco 25030-081
Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line 3100
Microdissection Forceps Merlan 624734
Pattern 5 Tweezer Dixon 291-9454
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher BioReagents BP399-26
Poly-L-Ornithine Millipore Sigma P4638
Progesteron (P4) Millipore sigma P8783
PVALB Swant Swiss Antibodies 235 1/1500 dilution
Samll Scissor WPI Swiss Scissors, 9cm 504519
Sodium Selenite Millipore Sigma S9133
Transferrin Millipore Sigma T8158
Tri-iodothyronine (T3) Millipore Sigma T2877
Trypsin Gibco 15090-046
Zeiss Fluorescence microscope Zeiss Z2 Imager

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Giffard, R. G., Ouyang, Y. B. Cell culture: primary neural cells. Encyclopedia of Neuroscience. Squire, L. R. , Academic Press. Cambridge, MA. 633-637 (2009).
  2. Huang, Y., Liu, Y., Zheng, C., Shen, C. Investigation of Cross-Contamination and Misidentification of 278 Widely Used Tumor Cell Lines. PLoS One. 12 (1), 0170384 (2017).
  3. Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
  4. Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
  5. Capes-Davis, A., et al. Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines. International Journal of Cancer. 127 (1), 1-8 (2010).
  6. Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
  7. Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 5517-5527 (2015).
  8. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  9. Voloboueva, L., Sun, X., Ouyang, Y. B., Giffard, R. G. Cell culture: primary neural cells. Reference Module in Neuroscience and Biobehavioral Psychology. , Elsevier. Amsterdam, Netherlands. (2017).
  10. Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 450 (2014).
  11. Sudarov, A., et al. Ascl1 genetics reveals insights into cerebellum local circuit assembly. Journal of Neuroscience. 31 (30), 11055-11069 (2011).
  12. Rahimi-Balaei, M., et al. Zebrin II Is Ectopically Expressed in Microglia in the Cerebellum of Neurogenin 2 Null Mice. Cerebellum. 18 (1), 56-66 (2019).
  13. Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal Migration During Development of the Cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484 (2018).
  14. Buffo, A., Rossi, F. Origin, lineage and function of cerebellar glia. Progress in Neurobiology. 109, 42-63 (2013).
  15. Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic Precursor Cells from the Rhombic Lip Are Specified to a Cerebellar Granule Neuron Identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
  16. Reemst, K., Noctor, S. C., Lucassen, P. J., Hol, E. M. The Indispensable Roles of Microglia and Astrocytes during Brain Development. Frontiers in Human Neuroscience. 10, 566 (2016).
  17. Furuya, S., Makino, A., Hirabayashi, Y. An improved method for culturing cerebellar Purkinje cells with differentiated dendrites under a mixed monolayer setting. Brain research. Brain Research Protocols. 3 (2), 192-198 (1998).
  18. Tabata, T., et al. A reliable method for culture of dissociated mouse cerebellar cells enriched for Purkinje neurons. Journal of Neuroscience Methods. 104 (1), 45-53 (2000).
  19. Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
  20. Schaller, K. L., Caldwell, J. H. Expression and distribution of voltage-gated sodium channels in the cerebellum. Cerebellum. 2 (1), 2-9 (2003).
  21. Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
  22. van der Valk, J., Gstraunthaler, G. Fetal Bovine Serum (FBS) - A pain in the dish. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (6), 329-332 (2017).
  23. Froud, S. J. The development, benefits and disadvantages of serum-free media. Developments in Biological Standardization. 99, 157-166 (1999).
  24. Kwist, K., Bridges, W. C., Burg, K. J. The effect of cell passage number on osteogenic and adipogenic characteristics of D1 cells. Cytotechnology. 68 (4), 1661-1667 (2016).
  25. Uysal, O., SevimLi, T., SevimLi, M., Gunes, S., Eker Sariboyaci, A. Cell and tissue culture: the base of biotechnology. Omics Technologies and Bio-Engineering. Barh, D., Azevedo, V. , Academic Press. Cambridge, MA. 391-429 (2018).
  26. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), e3634 (2012).
  27. Nelson, K. B., Bauman, M. L. Thimerosal and autism. Pediatrics. 111 (3), 674-679 (2003).
  28. Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).

Tags

מדעי המוח סוגיה 152 עובר המוח העצמי תא העצב התא Purkinje התרבות הראשית העכבר
התרבות הראשית של הנוירונים מבודדים מתוך עכבר ממוח עובריים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shabanipour, S., Dalvand, A., Jiao,… More

Shabanipour, S., Dalvand, A., Jiao, X., Rahimi Balaei, M., Chung, S. H., Kong, J., Del Bigio, M. R., Marzban, H. Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum. J. Vis. Exp. (152), e60168, doi:10.3791/60168 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter