Summary
توضح المقالة الحالية بروتوكولا مفصلا ل الكالوريات 2:1 الصيام المتقطعة لحماية وعلاج ضد السمنة وضعف استقلاب الجلوكوز في البرية من نوع والفئران ob/ob .
Abstract
الصيام المتقطع (IF) ، وهو التدخل الغذائي الذي ينطوي علي قيود الطاقة الدورية ، وقد اعتبر لتوفير العديد من الفوائد والتصدي لتشوات الأيض. حتى الآن ، تم توثيق أنواع مختلفه من نماذج IF مع فترات مختلفه من الصيام وفترات الرضاعة. ومع ذلك ، فان تفسير النتائج يشكل تحديا ، لان العديد من هذه النماذج ينطوي علي مساهمات متعددة العوامل من استراتيجيات تقييد الوقت والسعرات الحرارية. علي سبيل المثال ، يمكن ان يؤدي نموذج الصيام اليوم البديل ، وغالبا ما يستخدم كنظام IF القوارض ، في التغذية الناقصة ، مما يوحي بان الفوائد الصحية من هذا التدخل من المرجح ان توسط عن طريق تقييد السعرات الحرارية والصيام-دورات أعاده التغذية. في الاونه الاخيره ، وقد ثبت بنجاح ان 2:1 IF ، والتي تشمل 1 يوم من الصيام تليها يومين من التغذية ، يمكن ان توفر الحماية ضد السمنة الناجمة عن النظام الغذائي والتحسينات الايضيه دون انخفاض في المدخول الحراري الكلي. المقدمة هنا هو بروتوكول لهذا التدخل ال2:1 التلقائية IF في الفئران. كما هو موضح أيضا بروتوكول التغذية زوج (PF) المطلوبة لفحص نموذج الماوس مع السلوكيات الأكل المتغيرة ، مثل hyperphagia. باستخدام نظام if 2:1, ومن الواضح ان الكالوريات if يؤدي إلى انخفاض زيادة وزن الجسم, تحسين التوازن الجلوكوز, وارتفاع نفقات الطاقة. وهكذا ، قد يكون هذا النظام مفيدا للتحقيق في الآثار الصحية لل IF علي مختلف الامراض المرضية.
Introduction
ويرتبط نمط الحياة الحديثة مع وقت أطول يوميا تناول الطعام وأقصر فترات الصيام1. وهذا يسهم في وباء السمنة العالمية الحالية, مع عيوب الأيض ينظر في البشر. وقد مورس الصيام في جميع انحاء التاريخ البشري ، والفوائد الصحية المتنوعة تشمل العمر المديد ، والحد من الضرر التاكسدي ، والطاقة الأمثل التوازن2،3. من بين عده طرق لممارسه الصيام ، والحرمان الدوري الطاقة ، ويطلق عليه الصيام المتقطع (IF) ، هو أسلوب الغذائية الشعبية التي تمارس علي نطاق واسع من قبل السكان عموما بسبب نظامه سهله وبسيطه. وقد أثبتت الدراسات الاخيره في النماذج السريرية والسريرية انه إذا كان يمكن ان توفر الفوائد الصحية مماثله لفترات الصيام المطول وتقييد السعرات الحرارية ، مما يوحي بأنه إذا يمكن ان تكون استراتيجية علاجيه محتمله للسمنة والامراض الايضيه2،3،4،5.
إذا كانت الانظمه العلاجية تختلف من حيث مده الصيام والتردد. الصيام يوم بديل (اي ، يوم واحد التغذية/1 يوم الصيام ؛ 1:1 if) وكان الأكثر استخداما إذا نظام في القوارض لدراسة اثارها الصحية المفيدة علي السمنة ، وامراض القلب والاوعيه الدموية ، وامراض الأعصاب ، وما إلى ذلك2،3. ومع ذلك ، كما هو مبين في الدراسات السابقة6،7، وكذلك أكد ميكانيكيا في تحليل مدخولنا الطاقة8، 1:1 إذا كانت النتائج في التغذية الناقصة (~ 80 ٪) بسبب عدم كفاية وقت التغذية للتعويض عن فقدان الطاقة. وهذا يجعل من غير الواضح ما إذا كانت الفوائد الصحية التي تمنحها 1:1 IF يتم بوساطة تقييد السعرات الحرارية أو تعديل أنماط الأكل. ولذلك ، تم تطوير نظام IF جديده ويظهر هنا ، والتي تتالف من 2 يوم التغذية/1 يوم الصيام (2:1 IF) نمط ، الذي يوفر الفئران مع الوقت الكافي للتعويض عن تناول الطعام (~ 99 ٪) ووزن الجسم. وتقارن هذه الفئران بعد ذلك بمجموعه الإعلانات (AL). هذا النظام يتيح الفحص للآثار الكالوريات IF في غياب خفض السعرات الحرارية في الفئران من النوع البري.
وعلي النقيض من ذلك ، في نموذج الماوس الذي يسلك سلوك التغذية المتغيرة ، قد لا تكون التغذية الشرط المناسب السيطرة علي مقارنه ودراسة اثار 2:1 IF. علي سبيل المثال ، منذ ob/ob الفئران (نموذج وراثي شائع الاستخدام للسمنة) معرض فرط نظرا لعدم وجود ليبتين تنظيم الشهية والشبع ، تلك مع 2:1 IF المعرض ~ 20 ٪ انخفاض السعرات الحرارية مقارنه مع ob/ob الفئران مع التغذية. وهكذا ، لفحص بشكل صحيح ومقارنه اثار IF في الفئران ob/ob ، مجموعه التغذية زوج كعنصر تحكم مناسب يحتاج إلى استخدامها.
وبشكل عام ، يتم توفير بروتوكول شامل لأداء ال2:1 الحرارية المتوسطة ، بما في ذلك استخدام التحكم في تغذيه الزوج. ومن الواضح أيضا ان الكالوريات 2:1 IF يحمي الفئران من ارتفاع الدهون التي يسببها النظام الغذائي السمنة و/أو الخلل الأيضي في كل من نوع البرية والفئران ob/ob . ويمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة الآثار الصحية المفيدة من 2:1 IF في الحالات المرضية المختلفة بما في ذلك الاضطرابات العصبية, امراض القلب والاوعيه الدموية, والسرطان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تمت الموافقة علي جميع الأساليب والبروتوكولات هنا من قبل لجان الرعاية الحيوانية في الرعاية الحيوانية والخدمات البيطرية (ACVS) من جامعه اوتاوا ومركز فينوجينوميكس (TCP) ومطابقه لمعايير المجلس الكندي للعناية بالماشية. وتجدر الاشاره إلى ان جميع الإجراءات الموصوفة هنا ينبغي القيام بها تحت الموافقة المؤسسية والحكومية وكذلك من قبل الموظفين الذين يتقنون تقنيا. وقد تم إيواء جميع الفئران في أقفاص تهويه قياسيه في الغرف التي تسيطر عليها درجه الحرارة والرطوبة مع 12 ساعة/12 ساعة الضوء/الظلام (21-22 درجه مئوية ، 30 ٪-60 ٪ الرطوبة للإسكان العادي) وحريه الوصول إلى المياه. تم الحصول علي الذكور C57BL/6J والفئران ob/ob من مختبر جاكسون.
1.2:1 نظام isocaloric IF
- للحصول علي العجاف والحمية التي يسببها السمنة نماذج الماوس ، واعداد اما النظام الغذائي العادي (17 ٪ من الدهون ، ND) أو نظام غذائي عالي الدهون (45 ٪ من الدهون ، HFD).
ملاحظه: 60 ٪ hfd يمكن استخدامها للحث علي السمنة التي يسببها النظام الغذائي الشديد ؛ حتى الآن ، وذلك بسبب ليونة من بيليه الغذاء ، فمن الصعب نسبيا لقياس بدقه تناول الطعام اليومي. ويمكن لنظام القياس المستمر الألى تحسين براعة لأنواع متعددة من الوجبات الغذائية. - قياس وزن الجسم الأساسي وتكوين الجسم لكل ماوس في 7 أسابيع من العمر باستخدام مقياس و EchoMRI ، علي التوالي.
ملاحظه: راجع القسم 3 لقياس تكوين الجسم. - استنادا إلى وزن الجسم ونتائج تكوين الجسم ، وتقسيم عشوائيا التساوي 7 الذكور C57BL/6j الفئران القديمة في مجموعتين: الإعلان حسب (AL) والصيام المتقطع (IF) الجماعات.
- وضع اثنين إلى ثلاثه الفئران لكل قفص وضمان الوصول المجاني إلى مياه الشرب.
ملاحظه: عدد الفئران لكل قفص يمكن ان تؤثر علي سلوك تناول الطعام. من المستحسن الحفاظ علي عدد متساو من الفئران لكل قفص في جميع المجموعات اثناء الدراسة. - توفير 1 أسبوع من التاقلم مع بيئة القفص الجديد والنظام الغذائي قبل البدء في نظام IF.
- فتره الصيام: نقل الفئران إلى قفص نظيف مع الفراش الطازجة في 12:00 PM. لا تضيف الطعام لمجموعه IF ، مع توفير كميه وزن من الطعام للمجموعة AL.
ملاحظه: بالنسبة لكل دوره صيام ، من المهم تغيير الأقفاص لكل من المجموعتين AL و IF لضمان تعرض كلتا المجموعتين لنفس مقدار وقت المعالجة. - بعد 24 ساعة ، وقياس أوزان الفئران في كل من المجموعات وبقايا الطعام في أقفاص AL.
ملاحظه: تاكد من تضمين وزن فتات الطعام علي قادوس الطعام وأسفل القفص ، وخاصه عند استخدام HFD ، حيث ان الفئران غالبا ما تزيل الكريات الصغيرة أو شظايا الطعام من القادوس وتبقيها بالقرب من مواقع العش. متوسط كميه الطاقة لكل ماوس في نهاية كل دوره 2:1 (3 أيام) حوالي 35 كيلو كالورى ، اي ما يعادل ~ 10 غرام لنظام غذائي عادي (3.3 كيلو كالورى/ز) و ~ 7 ز ل HFD (4.73 كيلو كالورى/ز). - فتره التغذية: توفير كميه وزنها من المواد الغذائية في 12:00 PM لكل من المجموعات AL و IF.
- بعد 48 h من توفير الغذاء ، وقياس وزن بقايا الطعام والفئران.
- كرر الخطوات من 1.6 – 1.10 لمده الدراسة (علي سبيل المثال ، 16 أسبوعا).
2. الزوج التغذية (PF) مجموعه التحكم
ملاحظه: لتجربه IF في التي لوحظ سلوك التغذية المتغيرة في نموذج الماوس (علي سبيل المثال ، فرط في الفئران ob/ob ) ، فمن الضروري ان يكون مجموعه الزوج التغذية كعنصر تحكم للمقارنة السليمة السعرات الحرارية المستقلة إلى IF.
- بالنسبة لمجموعه التحكم PF ، قم بإرباك جدول التجربة بحيث يتم تقديم نفس كميه الطعام المستهلكة من قبل مجموعه IF إلى مجموعه PF (الشكل 2).
- قياس كميه المواد الغذائية التي تستهلكها مجموعه IF علي مدي يومين من فتره أعاده التغذية.
- يقسم هذا المبلغ من الاغذيه المستهلكة في مجموعه IF بالتساوي إلى ثلاثه ابعاد وتقديمه يوميا إلى مجموعه PF في 12:00 PM.
ملاحظه: توفير كميه متساوية من الغذاء يوميا أمر بالغ الاهميه. في حاله الفئران مع فرط ، إذا تم توفير الفئران التي تغذيها الزوج مع كميه من المواد الغذائية اقل من استهلاكها الطوعي في ان واحد ، فانها من المرجح ان تستهلك جميع المواد الغذائية المقدمة وتصبح بشكل فعال fasted. هذا يمكن بعد ذلك منع المقارنة المناسبة للفئران المعالجة والعثور علي النتيجة. - كرر الخطوات 2.1 – 2.3 لمده الدراسة.
3. تحليل تكوين الجسم
ملاحظه: منذ المدى الطويل IF يؤثر علي وزن الجسم في الفئران ، ويمكن قياس تكوين الجسم في دورات مناسبه (علي سبيل المثال ، كل 3 أو 4 دورات) باستخدام محلل تكوين الجسم لقياس الدهون والكتلة الهزيل في الفئران الحية ، غير تخدير.
- قم بتشغيل محلل تكوين الجسم.
ملاحظه: قبل البدء في البرنامج ، اترك الجهاز لمده 2 – 3 ساعات علي الأقل للتدفئة. - تشغيل اختبار نظام علي محلل تكوين الجسم لاختبار دقه القياس الخاصة به. إذا لزم الأمر ، معايره النظام باستخدام زيت الكانولا وعينات المياه.
- قياس وزن الجسم من كل الماوس.
- وضع الماوس في حامل أسطواني الحيوانية الصغيرة.
- ادراج محدد لتقييد الحركة الفعلية للماوس اثناء القياس ووضع حامل في محلل تكوين الجسم.
- تشغيل برنامج المسح الضوئي.
ملاحظه: يستغرق الأمر حوالي 90 – 120 ثانيه للتحليل. - بعد القياس ، وأزاله حامل من المعدات وأعاده الماوس إلى القفص.
ملاحظه: ويمكن الاطلاع علي بروتوكول أكثر تفصيلا في المنشور السابق9.
4. اختبارات الجلوكوز والانسولين التسامح
- لاختبار تحمل الجلوكوز ، وقياس وزن الجسم وتكوين الجسم من كل الماوس قبل تعريض لصوم ووضع علامة علي الذيل مع علامة دائمة لفهرسه سهله وسريعة.
- ضع الفئران في أقفاص جديده بدون طعام في الساعة 7:00 مساء لصوم الليل.
ملاحظه: الصيام بين عشيه وضحيها هو البروتوكول القياسي ، ولكن بسبب فسيولوجيا الماوس (علي سبيل المثال ، زيادة استخدام الجلوكوز بعد الصيام لفترات طويلة10،11) ، أقصر الصيام (~ 6 h) يمكن استخدامها كما هو موضح ل ITT. - بعد الصيام 14 – 16 ح (9:00 صباحا في الصباح التالي) ، وقياس وزن الجسم وتكوين الجسم من كل الماوس وحساب كميه جرعه الجلوكوز علي أساس وزن الجسم.
ملاحظه: لتجنب الإفراط في تقدير عدم تحمل الجلوكوز في الفئران البدينة ، يمكن استخدام كتله العجاف التي تم الحصول عليها من تحليل تكوين الجسم لحساب جرعه الجلوكوز12،13. - لكل ماوس ، قطع غيض من الذيل (0.5-1.0 ملم) باستخدام مقص الجراحية النظيفة. بعد مسح القطرة الاولي من الدم ، ورسم قطره جديده من الدم من الذيل وقياس مستوي السكر في الدم الصيام خط الأساس مع غلوكوتير.
ملاحظه: لا يلزم قطع الذيل الاضافيه لكل قياس الجلوكوز في الدم خلال القطاع الخاص أو اي تي اي. يمكن ان تكون منعشه الجرح عن طريق القيام بذلك مع الشاش لرسم قطره من الدم. - الفئران الموضوع إلى حقن داخل الجسم (i.p.) من الجلوكوز (1 مغ/ز من وزن الجهاز).
ملاحظه: استنادا إلى الهدف من تجربه (علي سبيل المثال، فحص تاثيرات التشكك) ، يمكن اجراء الاداره عن طريق الفم من الجلوكوز بواسطة gavage الشفوي. ويمكن الاطلاع علي بروتوكول المكتب العام للشغل عن طريق الفم (OGTT) في دراسة أخرى14. - قياس الجلوكوز في الدم من الذيل في 0, 5, 15, 30, 60, و 120 دقيقه حقن ما بعد الجلوكوز.
- بعد الانتهاء من المجموعة التونسية للشغل ، توفير كميه كافيه من الغذاء.
- لاختبار التسامح الانسولين (ITT) ، أزاله المواد الغذائية في 9:00 صباحا.
ملاحظه: ونظرا لان كلا من العمل العام والتونسي للاستثمار هما تجربتان تحفزان الضغط علي الفئران والتي يمكنها رفع مستويات الجلوكوز في الدم وتغيير فسيولوجيا ، فمن المستحسن أداء اي تي اي بعد توفير ما لا يقل عن 2 – 3 أيام من التعافي بعد تجربه العمل العام. - بعد الصيام لمده 6 ساعات (3:00 مساء) ، يقيس مستوي جلوكوز الدم القاعدي من الذيل كما هو موضح في الخطوة 4.4.
- الفئران الموضوع لi.p. حقن الانسولين (0.65 مو/ز من وزن الجسم).
- قياس الجلوكوز في الدم من الذيل في 0, 15, 30, 60, 90, و 120 دقيقه حقن ما بعد الانسولين.
- بعد الانتهاء من ITT ، توفير كميه كافيه من المواد الغذائية.
5. الحرارية غير المباشرة
ملاحظه: التمثيل الغذائي للطاقة من الفئران المعالجة يمكن ان تكون أكثر تقييما من خلال المسعر غير المباشر علي مدي دوره واحده من IF. وهذا سيقيس استهلاك الأكسجين (VO2) ، وإنتاج ثاني أكسيد الكربون (vco 2) ، ونسبه الصرف التنفسي (RER) ، والحرارة (كيلوكالورى/ساعة).
- قم بتشغيل قوه نظام المسعر غير المباشر علي الأقل 2 ساعة قبل تشغيل التجربة.
ملاحظه: هذا النظام الإحماء مهم لقياس دقيقه. - اعداد أقفاص مع الفراش نظيفه ، وملء زجاجات المياه ، وأضافه كميه قبل وزنها من تشاو إلى النطاط الغذاء.
- تحقق من حاله دريريت وصودا الجير. إذا كان مؤشر اللون من Drierite يظهر الوردي ، مما يدل علي ان Drierite قد استوعبت كميه عاليه من الرطوبة ، فمن الضروري استبدال أو اعلي مع Drierite الطازجة.
- معايره النظام باستخدام الغاز مع تكوين محدد (0.5 ٪ CO2، 20.5 ٪ س2).
- قياس وزن الجسم وتكوين الجسم من كل الماوس ، والتي سيتم استخدامها لتطبيع VO2 و vco2 البيانات.
- ضع برفق ماوس واحد لكل قفص.
- تجميع أقفاص الايضيه ، ووضعها في غرفه البيئة التي تسيطر عليها درجه الحرارة ، والاتصال بخطوط الغاز والنشاط كابل الاستشعار.
- بعد اعداد ملف تعريف التجربة عن طريق أضافه المعلمات التجريبية المناسبة باستخدام البرنامج ، تشغيل البرنامج للقياس. الغرض من قياس اليوم الأول هو توفير فتره من التاقلم وقياس الأيض الطاقة الاساسيه.
- في 12:00 PM في اليوم التالي ، الفئران الموضوع إلى 24 ساعة من الصيام عن طريق أزاله المواد الغذائية والفتات من النطاط والجزء السفلي من القفص. إذا لزم الأمر ، استبدله بفراش نظيف.
- بعد 24 ساعة ، أضافه كميه قبل وزنها من تشاو إلى هوبر الغذاء لفتره أعاده التغذية.
- الاستمرار في قياس ل48 القادمة ح. تحقق بانتظام ما إذا كان النظام قيد التشغيل دون انقطاع الاجهزه أو البرامج.
- بعد الانتهاء من القياس ، وإنهاء البرنامج وجلب الفئران مره أخرى إلى أقفاص الأصلي. قياس كميه الطعام المتبقية لفحص تناول الطعام.
- ويمكن الاطلاع علي البروتوكول المفصل لقياس المسعر غير المباشر في الدراسة السابقة9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1 تحليلات التغذية بعد الصيام 24 ساعة والمقارنة بين 1:1 و 2:1 الصيام المتقطع. وقد أدت فتره الصيام 24 ساعة إلى انخفاض في وزن الجسم بنسبه ~ 10% ، والذي تم استرداده بالبالكامل بعد يومين من أعاده التغذية (الشكل 1ا). فتره صيام 24 ساعة تسبب فرط التعرق خلال اليومين التاليين من أعاده التغذية (الشكل 1ب). ومع ذلك ، فان المقارنة بين استهلاك الطاقة بين 1:1 الصيام اليوم البديل و 2:1 الصيام متقطعه كشفت ان يوم 1 من فتره أعاده التغذية في 1:1 IF لم يكن كافيا (~ 80 ٪) للتعويض عن فقدان السعرات الحرارية عن طريق الصيام ، بالمقارنة مع حاله AL (الشكل 1ج). من ناحية أخرى ، 99 ٪ من كميه الطاقة التي تم تعويضها بالبالكامل خلال 2 أيام من أعاده التغذية في 2:1 IF. يتيح هذا النظام فحص تاثيرات الحالات التي تكون مستقله عن اختلاف السعرات الحرارية.
ويوضح الشكل 2 مخططا زمنيا تخطيطيا للانظمه ال2:1ه التلقائية والنظم PF. 2:1 ومع ذلك ، في الفئران ob/ob ، التي عرضت السلوك هايبرفاجيك ، 2:1 IF-معالجه الفئران ob/ob أظهرت 21 ٪ خفض السعرات الحرارية ، بالمقارنة مع ob/ob AL الفئران15. وبما ان هذا يمنع المقارنة السليمة السعرات الحرارية المستقلة, وقد استخدمت مجموعه التحكم PF التي حافظت علي نفس السعرات الحرارية كما لو-معالجه الفئران ob/ob . وباختصار ، فان الكمية الاجماليه من الاغذيه المستهلكة خلال يومين من التغذية في 2:1 إذا كانت الفئران مقسمه بالتساوي إلى ثلاثه مقادير يوميه ، ثم قدمت إلى مجموعه PF.
للحصول علي نظره شامله علي النتائج الايضيه من 2:1 IF ، قارننا اثار ال ، IF ، و PF في وزن الجسم ، وتناول الطعام وتكوين الجسم في البرية من نوع والفئران ob/ob تحت النظام الغذائي العادي (ND) و hfd. المقارنة مع ال ، ادي العلاج IF إلى انخفاض وزن الجسم الزيادة في الفئران الفيدرالية و WT التغذية الاحتياطية الفيدرالية بدون اختلافات كبيره في تناول الطعام (الشكل 3ا ، ب). وكشف تحليل تكوين الجسم انه إذا خفضت علي وجه التحديد كتله الدهون دون تغييرات في كتله الهزيل في الفئران من النوع البري (الشكل 3ج). فمن الممكن ان قليلا, وان لم يكن بشكل ملحوظ, انخفاض كميه الطاقة المتراكمة علي مدي 16 أسابيع من برنامج IF يمكن ان يؤدي إلى انخفاض في زيادة وزن الجسم من الحيوانية IF. ومع ذلك ، فان تجربه IF مع نظام التغذية الزوجية أكدت ان زيادة وزن الجسم من قبل IF لم يكن بسبب تغير استهلاك الطاقة (الشكل 3د ، ه). علي عكس البرية من نوع الحيوانية ، وزن الجسم من الفئران ob/ob تعرض ل If (أوب-if) كان اقل من الفئران OB-AL (الشكل 3ز). ويرجع ذلك إلى فرط الأكل (الإفراط في تناول الطعام) من الفئران ob/ob ، مما يؤدي إلى اعلي ما يقال (21 ٪) تناول الطعام في الفئران ، بالمقارنة مع الماشية المعالجة (الشكل 3ح). لذلك ، لدراسة علي وجه التحديد التاثير الأيضي لل IF بطريقه مستقله السعرات الحرارية ، وقد استخدمت مجموعه مراقبه التغذية زوج. ومع ذلك ، علي عكس الفئران من النوع البري8، كانت الفئران OB-PF لا يمكن تمييزها بالمقارنة مع OB-إذا الفئران في أوزان الجسم وتكوين الجسم15 (الشكل 3ط). وتشير هذه النتائج إلى انه من المحتمل ان يكون ليبتين متورطا في تقليل وزن الجسم الذي يتوسطه الجهاز في الفئران.
الفائدة الايضيه الرئيسية التي تمنحها الكالوريات IF هو تحسين التوازن الجلوكوز. كما هو مبين في الشكل 4ا ، ب ، ج ، د، hfd-إذا الفئران أظهرت تحسنا كبيرا في التوازن الجلوكوز. وأظهرت الشركة ان نسبه الجلوكوز في الدم يتم مسحها بسرعة أكبر في الفئران المعالجة ، في حين كشفت ITT عن حساسية اعلي للانسولين في الفئران HFD-IF ، مقارنه بالفئران HFD-AL أو HFD-PF. بشكل غير متوقع ، علي الرغم من الفشل في خفض الوزن بوساطة IF ، أظهرت الحشرات Ob-IF تحسنا كبيرا في التعامل مع الجلوكوز مع الرحلات الصغيرة الجلوكوز في المعهد التونسي للشغل ، مقارنه مع الفئران Ob-pf (الشكل 4ه) ،في حين ان حساسية الانسولين لا يمكن تمييزها هذا تحسين التوازن الجلوكوز في الفئران Ob-IF من المرجح توسط من خلال زيادات في مستوي البلازما من جلوكاجون-مثل الببتيد-1 (GLP-1) وإفراز الانسولين حفزت الجلوكوز (البيانات لم تظهر)15. عموما ، باستخدام هذا البروتوكول if 2:1 والسليمة السعرات الحرارية المستقلة PF السيطرة ، وأظهرنا الفوائد الايضيه من الكالوريات if في البرية من نوع والفئران ob/ob .
واحده من الآثار الايضيه من IF في الفئران من النوع البري هو اعلي مجموع O2 الاستهلاك ، وتستخدم لتقدير نفقات الطاقة (الشكل 5ا ، ب). تم العثور علي هذا الارتفاع في O2 الاستهلاك فقط خلال فتره التغذية في IF الفئران ، ولكن ليس فتره الصيام ، مقارنه مع الفئران. وتوسطت الزيادة في نفقات الطاقة إلى حد كبير من الحرارة الدهنية ، مثل براوننج من الانسجه الدهنية البيضاء وتنشيط الانسجه الدهنية البني (البيانات لم تظهر)8،16. ومن المفترض ان تفسر الحرارة الدهنية التي تم التوسط فيها كيف ان الفئران البرية التي تعرضت ل IF أظهرت انخفاضا في وزن الجسم مع عدم وجود فرق في تناول الطعام ، مقارنه بالفئران. من ناحية أخرى ، IF فشلت في زيادة O2 الاستهلاك في الفئران ob/Ob (الشكل 5C-D) ، وحتى ادي إلى انخفاض في نفقات الطاقة خلال فتره الصيام. باستمرار ، تم إلغاء الحرارة الدهنية المستحثة بالبالكامل في الفئران ob/ob (لا تظهر البيانات). وتشير هذه البيانات إلى امكانيه تقييد الحالة لأنها قد تعمل بشكل مختلف بالنسبة للافراد ذوي الخلفيات الوراثية والبيئية المختلفة.
الشكل 1: تحليل التغذية بعد 24 ساعة من الصيام والمقارنة بين 1:1 و 2:1. (ا) تغيير وزن الجسم يوميا من الفئران قبل وبعد 24 ح الصيام (ن = 10). (ب) الاستهلاك اليومي للطاقة قبل وبعد 24 ساعة من الصيام (ن = 5 أقفاص ؛ 2 فئران لكل قفص). (ج) مقارنه مدخول الطاقة بين الصيام اليومي البديل(اي يوم واحد للتغذية/يوم واحد للصيام ، 1:1 إذا) و 2:1 الصيام المتقطع (اي يومين للتغذية/الصيام ليوم واحد). في نظام IF 1:1, فقط ~ 80% من تناول الطعام تم تعويضه خلال اليوم التالي 1 من أعاده التغذية مقارنه مع تناول الطعام علي مدي 2 أيام من التغذية. من ناحية أخرى ، 99 ٪ من كميه الطاقة التي تم تحقيقها عندما تم إعطاء يومين من أعاده التغذية ، بالمقارنة مع ان أكثر من 3 أيام من التغذية. يتم التعبير عن البيانات كمتوسط ± SEM. وقد استنسخ هذا الرقم باذن من كيم وآخرون8. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الرسم التخطيطي لنظام ال2:1 الحرارية النسبة للسيطرة علي PF ، فان كميه الاغذيه المستهلكة خلال يومين من التغذية بواسطة الفئران المعالجة تنقسم إلى ثلاثه أجزاء متساوية ، والتي يتم توفيرها يوميا إلى الفئران PF خلال الدورة القادمة. AL = الإعلان; PF = التغذية الزوجية. وقد استنسخ جزء من هذا الرقم باذن من كيم وآخرون8. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مقارنه بين الآثار المترتبة علي ال, IF, و PF علي وزن الجسم, تناول الطعام, وتكوين الجسم بين البرية من نوع والفئران ob/ob . (الف ، باء ، جيم) وزن الجسم ، وتناول الطعام ، وتكوين الجسم في الفئران من النوع البري أو في حاله المعالجة تحت النظام الغذائي العادي (ND) أو نظام غذائي عالي الدسم (HFD) خلال 16 أسبوعا من نظام IF. يتم التعبير عن البيانات كمتوسط ± SEM. (الثاني: n = 7; الثاني-IF: n = 8 ؛ HFD-AL: n = 7 ؛ و HFD-IF: n = 8) ؛ [ان-ور-وي] [أنوفا] مع طالبه-[نيومان-كول] تحليل [بوست-فل]; * * p < 0.01 vs. HFD-AL. (D, E, F) وزن الجسم ، وتناول الطعام ، وتكوين الجسم في PF مقابل الفئران تغذيه مع نظام غذائي عالي الدهون (hfd) خلال 12 أسبوعا من نظام if. (PF: n = 6 و IF: n = 6) ؛ ثنائي الذيل الطالب غير المقترنة t-اختبار; * p < 0.05 vs. HFD-PF ؛ NS = غير هامه. (زاي ، حاء ، طاء) وزن الجسم ، وتناول الطعام ، وتكوين الجسم في AL ، PF ، أو IF-معالجه الفئران ob/ob تغذيه مع الطعام العادي (OB-AL: n = 4 ؛ Ob-PF: n = 7 ؛ Ob-IF: n = 6) ؛ أوب-ال vs. Ob-PF: *p < 0.05 ؛ أوب-ال vs. Ob-IF: * p < 0.05 ؛ Ob-PF vs. أوب-IF. واستنسخت اللوحات من الف إلى واو باذن من كيم وآخرون8. واستنسخت اللوحات G – I باذن من كيم وآخرون15. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحسين التوازن الجلوكوز بواسطة IF في كل من نوع البرية والفئران ob/ob . (الف ، باء) الشركة العامة التونسية للشغل و ITT في HFD-AL و HFD-IF الفئران من النوع البري بعد 16 أسابيع من نظام IF. يظهر الملحق منطقه تحت منحني ([اوك]); * p < 0.05 vs. HFD-AL. (C, D) الشركة العامة التونسية للشغل و ITT في hfd-PF مقارنه مع hfd-if الفئران من النوع البري بعد 12 أسابيع من نظام if. الملحق يظهر اوك. * p < 0.05 vs. HFD-pf. (E, F) المؤسسة العامة التونسية للشغل و ITT في ob-IF مقارنه مع الفئران ob-pf بعد 16 أسابيع من نظام if. يظهر الملحق اوك (* p < 0.05 vs. [أوب-بف]). واستنسخت اللوحات من الف إلى دال باذن من كيم وآخرون8. واستنسخت اللوحتان E و F باذن من كيم وآخرون15. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تحليل نفقات الطاقة في الفئران البرية المعالجة والجرذان المكشوفة/ المكشوفة. (ا) اثار الاستهلاك O2 خلال دوره واحده من 2:1 إذا كان في الفئران من النوع البري(اي يوم 1 الصيام تليها يومين من التغذية). (ب) متوسط استهلاك O2 في الساعة خلال الصيام ، والتغذية ، ودوره واحده من 2:1 إذا. ويعبر عن البيانات بأنها تعني ± SEM (HFD-AL: n = 6 ؛ و HFD-IF: n = 12) ؛ * p < 0.05 vs. HFD-AL. (C) O2 اثار الاستهلاك من الفئران ob/ob خلال دوره واحده من 2:1 إذا. (د) متوسط استهلاك O2 في الساعة اثناء الصيام والتغذية ودوره واحده من 2:1 IF (Ob-PF: n = 7 ؛ Ob-IF: n = 6) ؛ * p < 0.05 vs. واستنسخ الفريق باء باذن من كيم وآخرون8. واستنسخت اللوحتان جيم ودال باذن من كيم وآخرون15. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد تم توثيقه جيدا انه إذا كان يوفر الآثار الصحية المفيدة علي مختلف الامراض في كل من البشر والحيوانية8,15,16,17,18,19. وقد تم مؤخرا توضيح ألياته الاساسيه ، مثل اليه التلقائية والأمعاء الميكروبيوم. البروتوكول المعروض يصف النظام ال2:1 IF في الفئران للتحقيق في الفوائد الايضيه المستقلة السعرات الحرارية من IF ضد السمنة الناجمة عن النظام الغذائي والخلل الأيضي المرتبطة بها. علي عكس الصيام اليوم البديل (1:1 IF) بروتوكول الذي يؤدي إلى انخفاض في السعرات الحرارية الاجماليه6,7, توفير 1 يوم آخر من أعاده التغذية في 2:1 إذا نظام تمكن من الحفاظ علي حاله ايسووكريك في الفئران من النوع البري.
بالاضافه إلى ذلك ، بالمقارنة مع 1:1 if ، فان نظام if 2:1 قد يقلل من الإجهاد بوساطة الصوم الممكن أو سبات في الفئران20 وأيضا مماثله لطريقه الغذائية الشعبية ، والنظام الغذائي 5:22. علي الرغم من ان أثاره لم يتم اختبارها ، يمكن تعديل النظام عن طريق توفير أيام اضافيه من أعاده التغذية (علي سبيل المثال ، 3:1 أو 4:1 IF).
كما هو مبين في تحليل التغذية (الشكل 1ب) ، فان السلوك المفرط بعد 24 ساعة من الصيام ينخفض تدريجيا في الفئران من النوع البري ، والتي تمكن من الحالات التي يمكن فيها القيام بذلك. ومع ذلك ، لا يمكن تحقيق هذا الشرط الكالوريات في الفئران ob/ob ، كما انها تفتقر إلى الإشارات التي توسطت ليبتين الإشباع والأيض الطاقة ، مما يؤدي إلى النمط الظاهري المستمر هايبرفاجيك23،24. ولذلك ، قبل اجراء تجربه IF ، فمن المستحسن لفحص سلوك التغذية نموذج الماوس من الفائدة. لفحص اثار إذا كان استخدام نموذج الماوس هايبرفاجيك (علي سبيل المثال ، ob/ob، db/db، Sim1 +/-، MC4R-/-)24،25،26، كما هو موضح في هذا البروتوكول ، وتوظيف مجموعه التغذية زوج كعنصر تحكم تجريبية الكالوريات مهم لاجراء مقارنات المناسبة. كما انه يتطلب التخطيط الدقيق عند اختبار نموذج الماوس مع النمط الظاهري هيبوفياجيك (علي سبيل المثال ، الفئران التي تحتوي علي الميلانين هرمون KO)27.
عامل مهم للنظر في دراسات IF هو درجه حرارة السكن ، والتي تؤثر علي المعلمات الفسيولوجية والسلوكية المختلفة في الفئران. بشكل خاص ، التعرض للبرد (4 – 6 درجه مئوية) يزيد بشكل كبير من استهلاك الطاقة للحفاظ علي درجه حرارة الجسم الاساسيه28. وعلي النقيض من ذلك ، في ظروف معتدل (30 درجه مئوية) التي توازن بين كسب الحرارة عن طريق فقدان الحرارة ، وتخفيضات في استهلاك الغذاء هو انخفاض ملحوظ8. وفيما يتعلق بالنتائج الايضيه ، يؤدي التعرض البارد إلى توليد الحرارة الدهنية ، والذي يعوقه شرط معتدل. ولذلك ، فمن المتوقع ان درجه حرارة السكن يؤثر علي الظواهر الايضيه من if والتغذية المناسبة: نسبه الصيام لتحقيق الكالوريات if.
في الواقع ، لقد ثبت سابقا ان الكالوريات 2:1 if يمكن ان يتحقق في ظروف معتدل ، مما يؤدي إلى تحسين الصحة الايضيه في السمنة الناجمة عن النظام الغذائي والخلل الأيضي دون اختلافات في تناول الطعام بين IF و AL مجموعات8. ومع ذلك ، الكالوريات IF قد لا تكون قابله للتحقيق مع نسبه 2:1 في درجات الحرارة الباردة لان الفئران تحت التعرض البارد سوف تظهر النمط الظاهري هايبرفاجيك ، الأمر الذي يؤدي إلى التغذية الناقصة في المجموعة IF. منذ التعرض الباردة وإذا عرض النتائج الايضيه مقارنه واليات (اي ، توليد الحرارة الدهنية وتحسين التوازن الجلوكوز) التي تساعد علي مكافحه السمنة ، وهناك مصلحه في الجمع بين هذه التدخلات اثنين لتعظيم التاثير الأيضي. ولذلك ، لاختبار هذا بشكل صحيح ، وتنفيذ تحليل التغذية قبل تشغيل التجربة IF والاستفادة من مجموعه التحكم تغذيه زوج تحت التعرض الباردة ينصح.
وتشمل العوامل الأخرى التي قد تؤثر علي نتائج دراسات IF كثافة السكن. علي غرار الدراسة السابقة ، التي أظهرت انخفاض استهلاك المواد الغذائية في الفئران أكثر اكتظاظا بالمساكن29، الفئران من قفص من خمسه تستهلك الغذاء اقل بكثير من تلك التي من قفص اثنين (نتائج غير منشوره). الاضافه إلى ذلك ، فقد ثبت ان كثافة السكن يؤثر بشكل كبير علي درجه الحرارة المحيطة ، ودرجه الحرارة داخل قفص السكن خمسه فئران هو 1-2 درجه مئوية اعلي من تلك التي تؤوي واحده إلى اثنين من الفئران30. علي الرغم من ان هذه الدراسة خلصت إلى ان كثافة السكن لم تؤثر بشكل كبير علي تناول الطعام (فحص لمده 5 أسابيع) ، في دراسة IF يدوم 12-16 أسابيع ، ودرجه الحرارة داخل القفص المتضررة من كثافة السكن قد لا تزال تؤثر علي تناول الطعام والأيض الطاقة. معا ، من المهم الحفاظ علي نفس العدد من الفئران الموجودة في قفص وتقليل تغيير الرقم لكل قفص علي مدار الدراسة.
وباختصار ، يظهر هذا التقرير بروتوكولا بسيطا وقابلا للتكرار لاختبار ال2:1 الكالوريات IF في الفئران. علي الرغم من ان الدراسة الحالية تركز علي الفوائد الايضيه من IF في السمنة الناجمة عن النظام الغذائي والخلل الأيضي, ويمكن تكييفها بسهوله للتحقيق في الآثار الوقائية والعلاجية من الكالوريات IF ضد ظروف أخرى, مثل القلب والاوعيه الدموية والامراض العصبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
وقد دعمت المؤسسة الكندية للقلب والسكتة الدماغية منحه المعونة المقدمة من كندا (G-18-0022213) ، ومؤسسه j. p. بيكسيل ، والصندوق الناشئ لمعهد القلب في جامعه اوتاوا ؛ K.S. تم دعمها من قبل المنح من المعاهد الكندية للبحوث الصحية (PJT-162083) ، روبن وهيلين دينيس الباحث والحياة المالية الجديدة جائزه الباحث عن مرض السكري من Banting & أفضل مركز للسكري (BBDC) والعلوم الطبيعية ومجلس البحوث الهندسية (NSERC) في كندا (RGPIN-2016-06610). وكانت R.Y.K. مدعومة بزمالة من صندوق الهبات الخاص بجامعه اوتاوا لبحوث القلب. وقد تم دعم J.H.L. من قبل منحه الدكتوراه NSERC ومنحه اونتاريو للدراسات العليا. وقد دعمت Y.O. من قبل جائزه الخريجين UOHI ومنحه الملكة اليزابيث الثانية الدراسات العليا في العلوم والتكنولوجيا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Comprehensive Lab Animal Monitoring System (CLAMS) | Columbus Instruments | Indirect calorimeter | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 | For GTT |
| EchoMRI 3-in-1 | EchoMRI | EchoMRI 3-in-1 | Body composition analysis |
| Glucometer and strips | Bayer | Contour NEXT | These are for GTT and ITT experiments |
| High Fat Diet (45% Kcal% fat) | Research Diets Inc. | #D12451 | 3.3 Kcal/g |
| High Fat Diet (60% Kcal% fat) | Research Diets Inc. | #D12452 | 4.73 Kcal/g |
| Insulin | El Lilly | Humulin R | For ITT |
| Mouse Strain: B6.Cg-Lepob/J | The Jackson Laboratory | #000632 | Ob/Ob mouse |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | #000664 | |
| Normal chow (17% Kcal% fat) | Harlan | #2918 | |
| Scale | Mettler Toledo | Body weight and food intake measurement |
References
- Gill, S., Panda, S. A Smartphone App Reveals Erratic Diurnal Eating Patterns in Humans that Can Be Modulated for Health Benefits. Cell Metabolism. 22 (5), 789-798 (2015).
- Longo, V. D., Panda, S. Fasting, Circadian Rhythms, and Time-Restricted Feeding in Healthy Lifespan. Cell Metabolism. 23 (6), 1048-1059 (2016).
- Longo, V. D., Mattson, M. P. Fasting: molecular mechanisms and clinical applications. Cell Metabolism. 19 (2), 181-192 (2014).
- Patterson, R. E., et al. Intermittent Fasting and Human Metabolic Health. Journal of the Academy of Nutrition and Dietetics. 115 (8), 1203-1212 (2015).
- Fontana, L., Partridge, L. Promoting health and longevity through diet: from model organisms to humans. Cell. 161 (1), 106-118 (2015).
- Boutant, M., et al. SIRT1 Gain of Function Does Not Mimic or Enhance the Adaptations to Intermittent Fasting. Cell Reports. 14 (9), 2068-2075 (2016).
- Gotthardt, J. D., et al. Intermittent Fasting Promotes Fat Loss With Lean Mass Retention, Increased Hypothalamic Norepinephrine Content, and Increased Neuropeptide Y Gene Expression in Diet-Induced Obese Male Mice. Endocrinology. 157 (2), 679-691 (2016).
- Kim, K. H., et al. Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage. Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).
- Lancaster, G. I., Henstridge, D. C. Body Composition and Metabolic Caging Analysis in High Fat Fed Mice. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Disease Models & Mechanisms. 3 (9-10), 525-534 (2010).
- Heijboer, A. C., et al. Sixteen h of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. Journal of Lipid Research. 46 (3), 582-588 (2005).
- McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 297 (4), 849-855 (2009).
- Jorgensen, M. S., Tornqvist, K. S., Hvid, H. Calculation of Glucose Dose for Intraperitoneal Glucose Tolerance Tests in Lean and Obese Mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 95-97 (2017).
- Nagy, C., Einwallner, E. Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT). Journal of Visualized Experiments. (131), 56672 (2018).
- Kim, Y. H., et al. Thermogenesis-independent metabolic benefits conferred by isocaloric intermittent fasting in ob/ob mice. Scientific Reports. 9 (1), 2479 (2019).
- Li, G., et al. Intermittent Fasting Promotes White Adipose Browning and Decreases Obesity by Shaping the Gut Microbiota. Cell Metabolism. 26 (4), 672-685 (2017).
- Mitchell, S. J., et al. Daily Fasting Improves Health and Survival in Male Mice Independent of Diet Composition and Calories. Cell Metabolism. 29 (1), 221-228 (2019).
- Cignarella, F., et al. Intermittent Fasting Confers Protection in CNS Autoimmunity by Altering the Gut Microbiota. Cell Metabolism. 27 (6), 1222-1235 (2018).
- Martinez-Lopez, N., et al. System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy. Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).
- Lo Martire, V., et al. Changes in blood glucose as a function of body temperature in laboratory mice: implications for daily torpor. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 315 (4), 662-670 (2018).
- Chaix, A., Zarrinpar, A., Miu, P., Panda, S. Time-restricted feeding is a preventative and therapeutic intervention against diverse nutritional challenges. Cell Metabolism. 20 (6), 991-1005 (2014).
- Chaix, A., Lin, T., Le, H. D., Chang, M. W., Panda, S. Time-Restricted Feeding Prevents Obesity and Metabolic Syndrome in Mice Lacking a Circadian Clock. Cell Metabolism. 29 (2), 303-319 (2019).
- Wang, B., Chandrasekera, P. C., Pippin, J. J. Leptin- and leptin receptor-deficient rodent models: relevance for human type 2 diabetes. Current Diabetes Reviews. 10 (2), 131-145 (2014).
- Pan, W. W., Myers, M. G. Leptin and the maintenance of elevated body weight. Nature Reviews: Neuroscience. 19 (2), 95-105 (2018).
- Jackson, D. S., Ramachandrappa, S., Clark, A. J., Chan, L. F. Melanocortin receptor accessory proteins in adrenal disease and obesity. Frontiers in Neuroscience. 9, 213 (2015).
- Tolson, K. P., et al. Postnatal Sim1 deficiency causes hyperphagic obesity and reduced Mc4r and oxytocin expression. Journal of Neuroscience. 30 (10), 3803-3812 (2010).
- Shimada, M., Tritos, N. A., Lowell, B. B., Flier, J. S., Maratos-Flier, E. Mice lacking melanin-concentrating hormone are hypophagic and lean. Nature. 396 (6712), 670-674 (1998).
- Reitman, M. L. Of mice and men - environmental temperature, body temperature, and treatment of obesity. FEBS Letters. 592 (12), 2098-2107 (2018).
- Chvedoff, M., Clarke, M. R., Irisarri, E., Faccini, J. M., Monro, A. M. Effects of housing conditions on food intake, body weight and spontaneous lesions in mice. A review of the literature and results of an 18-month study. Food and Cosmetics Toxicology. 18 (5), 517-522 (1980).
- Toth, L. A., Trammell, R. A., Ilsley-Woods, M. Interactions Between Housing Density and Ambient Temperature in the Cage Environment: Effects on Mouse Physiology and Behavior. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 708-717 (2015).
