Summary
Den nuværende artikel beskriver en detaljeret protokol for isocaloric 2:1 intermitterende faste for at beskytte og behandle mod fedme og nedsat glukose metabolisme i vildtype og OB/OB mus.
Abstract
Intermitterende faste (IF), en kosten intervention, der involverer periodisk energi restriktion, er blevet anset for at give mange fordele og modvirke metaboliske abnormiteter. Hidtil er forskellige typer af hvis modeller med varierende varigheder af faste og fodring perioder er blevet dokumenteret. Fortolkningen af resultaterne er imidlertid udfordrende, da mange af disse modeller involverer multifaktorielle bidrag fra både tids-og kalorie begrænsningsstrategier. For eksempel, den alternative dag fastende model, ofte bruges som en gnaver hvis regime, kan resultere i underernæring, tyder på, at sundhedsmæssige fordele ved denne intervention er sandsynligvis medieret via både kaloriefattige begrænsning og fastende-genfodring cyklusser. For nylig er det lykkedes at påvise, at 2:1 Hvis, bestående 1 dag med fastende efterfulgt af 2 dages fodring, kan yde beskyttelse mod diæt-induceret fedme og metaboliske forbedringer uden en reduktion i samlede kalorieindtag. Præsenteret her er en protokol af denne isocaloric 2:1 Hvis intervention i mus. Også beskrevet er en par-fodring (PF) protokol kræves for at undersøge en musemodel med ændret spise adfærd, såsom hyperphagia. Ved hjælp af 2:1 hvis regime, det er påvist, at isocaloric hvis fører til reduceret kropsvægt øgning, forbedret glukose homøostase, og forhøjede energi udgifter. Således, dette regime kan være nyttige til at undersøge de sundhedsmæssige konsekvenser af hvis på forskellige sygdomstilstande.
Introduction
Moderne livsstil er forbundet med længere daglig fødeindtagelse tid og kortere faste perioder1. Dette bidrager til den nuværende globale fedmeepidemi, med metaboliske ulemper set hos mennesker. Fastende har været praktiseret i hele menneskets historie, og dens forskellige sundhedsmæssige fordele omfatter forlænget levetid, reduceret oxidativ skader, og optimeret energi homøostase2,3. Blandt flere måder at øve fastende, periodisk energi afsavn, betegnes intermitterende faste (hvis), er en populær Kostmetode, der er almindeligt praktiseret af den almindelige befolkning på grund af sin nemme og enkle regime. Nylige undersøgelser i prækliniske og kliniske modeller har vist, at hvis kan give sundhedsmæssige fordele svarende til langvarige faste og kaloriefattige begrænsning, tyder på, at hvis kan være en potentiel terapeutisk strategi for fedme og metaboliske sygdomme2,3,4,5.
Hvis regimer varierer med hensyn til faste varighed og hyppighed. Alternativ dag faste (dvs., 1 dag fodring/1 dag fastende; 1:1 Hvis) har været den mest almindeligt anvendte hvis regime i gnavere til at studere sin gavnlige sundhedsmæssige virkninger på fedme, hjerte-kar-sygdomme, neurodegenerative sygdomme, etc.2,3. Men som vist i tidligere undersøgelser6,7, og yderligere mekanisk bekræftet i vores energi indtag analyse8, 1:1 Hvis resultaterne i underernæring (~ 80%) på grund af manglende tilstrækkelig fodring tid til at kompensere for energis tab. Dette gør det uklart, om de sundhedsmæssige fordele ved 1:1 Hvis er medieret af kalorie begrænsning eller ændring af spisevaner. Derfor, en ny hvis regime er blevet udviklet og er vist her, bestående af en 2 dag fodring/1 dag faste (2:1 Hvis) mønster, som giver mus med tilstrækkelig tid til at kompensere for fødeindtagelse (~ 99%) og legemsvægt. Disse mus sammenlignes derefter med en ad libitum (al) gruppe. Dette regime gør det muligt at undersøge virkningerne af isocaloric, hvis der ikke er kalorie reduktion i vild-type mus.
I modsætning hertil, i en musemodel, der udstiller ændret fodring adfærd, AL fodring kan ikke være en ordentlig kontrol betingelse for at sammenligne og undersøge virkningerne af 2:1 Hvis. For eksempel, da OB/OB mus (en almindeligt anvendt genetisk model for fedme) udviser Hyperfagi på grund af manglen på Leptin regulere appetit og mæthed, dem med 2:1 Hvis udviser ~ 20% reduceret kalorieindtag i forhold til OB/OB mus med al fodring. Således, at korrekt undersøge og sammenligne virkningerne af hvis i OB/OB mus, en par-fodring gruppe som en passende kontrol skal være ansat.
Samlet set leveres en omfattende protokol til udførelse af isocaloric 2:1 Hvis, herunder brug af et par-fodring kontrol. Det er yderligere påvist, at isocaloric 2:1 Hvis beskytter mus mod høj fedt diæt-induceret fedme og/eller metabolisk dysfunktion i både vild-type og OB/OB mus. Denne protokol kan bruges til at undersøge de gavnlige sundhedsmæssige virkninger af 2:1, hvis på forskellige patologiske forhold, herunder neurologiske lidelser, hjerte-kar-sygdomme, og kræft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder og protokoller her er blevet godkendt af dyrepasning udvalg i dyrepasning og veterinærvæsen (ACVS) på universitetet i Ottawa og Center for Phenogenomics (TCP) og overholde standarderne i det canadiske råd om dyrepasning. Det skal bemærkes, at alle de procedurer, der er beskrevet her, bør udføres under institutionel og statslig godkendelse samt af personale, som er teknisk dygtige. Alle mus blev anbragt i standard ventilerede bure i temperatur-og fugtigheds kontrollerede rum med 12 timer/12 timer lys/mørke cyklusser (21 – 22 °C, 30% – 60% fugtighed for normale boliger) og fri adgang til vand. Mandlige C57BL/6J og OB/OB mus blev indhentet fra Jackson Laboratory.
1.2:1 isokalorisk IF-regime
- For lean og diæt-induceret fedme musemodeller, forberede enten en normal kost (17% fedt, ND) eller højt fedtindhold kost (45% fedt, HFD).
Bemærk: 60% HFD kan bruges til at fremkalde svær diæt induceret fedme; men på grund af den blødhed af maden pellet, er det relativt vanskeligt præcist at måle daglige fødeindtagelse. Et automatiseret kontinuerligt målesystem kan forbedre alsidigheden for flere typer kostvaner. - Måle baseline kropsvægt og kropssammensætning af hver mus ved 7 uger af alder ved hjælp af en skala og EchoMRI, hhv.
Bemærk: Se afsnit 3 for måling af kropssammensætning. - Baseret på kropsvægt og kropssammensætning resultater, tilfældigt og ligeligt dividere 7 uger gamle mandlige C57BL/6J mus i to grupper: ad libitum (AL) og intermitterende faste (IF) grupper.
- Placer to til tre mus pr. bur og sørg for fri adgang til drikkevand.
Bemærk: Antallet af mus pr bur kan påvirke fødeindtagelse adfærd. Det anbefales at opretholde et lige antal mus pr bur i alle grupper under studiet. - Giv 1 uges akklikalering til det nye bur miljø og kost, før du starter hvis regime.
- Fastende periode: Flyt mus til et rent bur med frisk strøelse ved 12:00 PM. Tilsæt ikke mad til IF-gruppen, mens du giver en vejet mængde mad til AL-gruppen.
Bemærk: For hver fastende cyklus er det vigtigt at ændre bure for både AL og hvis grupper for at sikre, at begge grupper er udsat for den samme mængde håndteringstiden. - Efter 24 timer måles vægten af mus i begge grupper og rester mad i AL bure.
Bemærk: Sørg for at inkludere vægten af madkrummer på madbeholderen og bunden af buret, især når du bruger HFD, da mus ofte fjerner små pellets eller fragmenter af mad fra tragten og holder dem i nærheden af reden sites. Den gennemsnitlige energiindtagelse pr. mus i slutningen af hver 2:1 cyklus (3 dage) er omkring 35 kcal, svarende til ~ 10 g for en normal kost (3,3 kcal/g) og ~ 7 g for HFD (4,73 kcal/g). - Fodring periode: give en vejet mængde af fødevarer på 12:00 PM for både AL og hvis grupper.
- Efter 48 h at levere fødevarer, måle vægten af rester mad og mus.
- Gentag trin 1.6 – 1.10 for undersøgelsens varighed (f. eks. 16 uger).
2. kontrolgruppe for parring (PF)
Bemærk: For en hvis eksperiment, hvor ændret fodring adfærd er observeret i en musemodel (f. eks Hyperfagi i OB/OB mus), er det nødvendigt at have en par-fodring gruppe som en kontrol for korrekt kalorie-uafhængig sammenligning med IF.
- For PF-kontrolgruppen vakle eksperiment planen således, at den samme mængde mad, der forbruges af IF-koncernen, tilbydes til PF-koncernen (figur 2).
- Måle mængden af fødevarer, som anvendes af IF-gruppen over 2 dages genfodrings periode.
- Opdel denne mængde forbrugt mad i IF gruppe jævnt i tre proportioner og give det dagligt til PF gruppe på 12:00 PM.
Bemærk: At give en lige mængde mad dagligt er kritisk. I tilfælde af mus med hyperphagia, hvis parret-fed mus er forsynet med en mængde fødevarer mindre end deres frivillige forbrug på én gang, de vil sandsynligvis forbruge alle leverede fødevarer og blive effektivt fastede. Dette kan så forhindre korrekt sammenligning med hvis-behandlede mus og forvirre resultatet. - Gentag trin 2.1-2.3 for undersøgelsens varighed.
3. analyse af kropssammensætning
Bemærk: Da langvarig, hvis påvirker kropsvægt i mus, kropssammensætning kan måles på passende cyklusser (f. eks hver 3 eller 4 cyklusser) ved hjælp af en kropssammensætning analysator at kvantificere fedt og lean masse i levende, ikke-bedøvet mus.
- Tænd for kroppen sammensætning analysator.
Bemærk: Før du starter programmet, skal du lade maskinen være tændt i mindst 2 – 3 timer for at varme op. - Kør en system test på krops kompositions analysatoren for at teste målenøjagtigheden. Hvis det er nødvendigt, kalibrere systemet ved hjælp af rapsolie og vandprøver.
- Mål kropsvægten af hver mus.
- Placer musen i en lille dyr cylindrisk holder.
- Indsæt en afgrænser for at begrænse den fysiske bevægelse af musen under målingen og placere holderen i kroppen sammensætning analysator.
- Kør scanningsprogrammet.
Bemærk: Det tager ca. 90 – 120 s at analysere. - Efter måling skal du fjerne holderen fra udstyret og bringe musen tilbage til buret.
Bemærk: En mere detaljeret protokol findes i en tidligere publikation9.
4. test af glucose og insulin tolerance
- For glukosetolerance test (GTT), måle kropsvægt og kropssammensætning af hver mus, før udsætte til faste og markere halen med en permanent markør for nem og hurtig indeksering.
- Placer mus i nye bure uden mad på 7:00 PM for natten faste.
Bemærk: Overnight faste er standardprotokollen, men på grund af musens fysiologi (f. eks. øget glucoseudnyttelse efter langvarig fastende10,11) kan kortere faste (~ 6 timer) anvendes som beskrevet for ITT. - Efter faste 14 – 16 h (9:00 AM i den følgende morgen), måle kropsvægt og kropssammensætning af hver mus og beregne mængden af glukose dosis baseret på kropsvægt.
Bemærk: For at undgå overvurdering af glukose intolerance i fede mus, lean masse opnået fra kroppen sammensætning analyse kan bruges til at beregne glukose dosering12,13. - For hver mus skæres spidsen af halen (0,5 – 1,0 mm) ved hjælp af ren kirurgisk saks. Efter aftørring af den første dråbe blod, tegn en frisk dråbe blod fra halen og måle baseline fastende blodsukkerniveau med glucometer.
Bemærk: Yderligere hale skæring er ikke nødvendig for hver blodglucosemåling under GTT eller ITT. Såret kan opfrises ved at gøre det med gaze for at tegne en dråbe blod. - Underkastes mus til intraperitoneal (IP) injektion af glucose (1 mg/g legemsvægt).
Bemærk: På baggrund af formålet med et eksperiment (f. eks. undersøgelse af inkretineffekter) kan oral indgift af glucose udføres ved oral sonde. Protokollen for mundtlig GTT (OGTT) kan findes i en anden undersøgelse14. - Mål blodglucose fra halen ved 0, 5, 15, 30, 60 og 120 min efter glukose injektion.
- Efter endt GTT, give en tilstrækkelig mængde mad.
- For insulin tolerance testen (ITT), Fjern fødevarer på 9:00 AM.
Bemærk: Da både GTT og ITT er stress-inducerende oplevelser for mus, der kan ophøje blodsukkerniveauet og ændre fysiologi, anbefales det at udføre ITT efter at have mindst 2 – 3 dages restitution efter GTT-eksperiment. - Efter fastende for 6 h (3:00 PM), måle baseline blodsukker fra halen som beskrevet i trin 4,4.
- Om mus til IP-injektion af insulin (0,65 mU/g legemsvægt).
- Mål blodglucose fra halen ved 0, 15, 30, 60, 90 og 120 min injektion efter insulin.
- Efter endt ITT, give en tilstrækkelig mængde mad.
5. indirekte Calorimetri
Bemærk: Energimetabolisme af IF-behandlede mus kan evalueres yderligere gennem indirekte Calorimetri over en enkelt cyklus af IF. Dette vil måle iltforbrug (VO2), carbondioxid produktion (VCO2), RESPIRATORISK udvekslingsforhold (RER) og varme (kcal/h).
- Tænd for det indirekte kalorimeter-Systems effekt mindst 2 timer før forsøget køres.
Bemærk: Dette system warm-up er vigtigt for nøjagtig måling. - Forbered bure med rent sengetøj, fyld vandflasker, og tilsæt den forvejede mængde Chow til madtragte.
- Kontroller tilstanden af Drierite og kalk sodavand. Hvis en farve indikator for Drierite synes pink, hvilket indikerer, at Drierite har absorberet en høj mængde fugt, er det nødvendigt at udskifte eller top med frisk Drierit.
- Kalibrer systemet ved hjælp af en gas med den specifikke sammensætning (0,5% CO2, 20,5% O2).
- Måle kropsvægt og kropssammensætning af hver mus, som vil blive brugt til at normalisere VO2 og VCO2 data.
- Placer forsigtigt én mus pr. bur.
- Saml metaboliske bure, Placer dem i det temperaturstyrede miljøkammer, og Tilslut til gasledninger og aktivitetssensor kabel.
- Når du har konfigureret eksperiment profilen ved at tilføje relevante eksperimentelle parametre ved hjælp af softwaren, skal du køre programmet til måling. Formålet med den første dags måling er at give en periode med akklimatisering og måle baseline energimetabolisme.
- Ved 12:00 PM den følgende dag, subject mus til 24 timer af faste ved at fjerne mad og krummer fra tragten og bunden af buret. Udskift om nødvendigt med rent sengetøj.
- Efter 24 timer tilsættes den forvejede mængde Chow til madbeholderen i genfodrings perioden.
- Fortsæt med at måle for næste 48 h. Kontrollér jævnligt, om systemet kører uden hardware-eller software afbrydelse.
- Efter endt måling, opsige programmet og bringe mus tilbage til deres oprindelige bure. Måle mængden af rester mad til at undersøge fødeindtagelse.
- Den detaljerede protokol for indirekte Calorimetri kan findes i en tidligere undersøgelse9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser fodrings analyserne efter 24 h faste og sammenligningen mellem 1:1 og 2:1 intermitterende faste. En 24 h fastende periode resulterede i en ~ 10% reduktion i legemsvægt, som blev fuldt genvundet efter 2 dages genfodring (figur 1a). En 24-timers fastende periode induceret Hyperfagi i de efterfølgende 2 dages genfodring (figur 1B). Ikke desto mindre afslørede sammenligningen af energi indtag mellem 1:1 alternativ dag faste og 2:1 intermitterende faste, at 1 dag i genfodrings perioden i 1:1, hvis ikke var tilstrækkelig (~ 80%) for at kompensere for det kaloriefattige tab ved faste, sammenlignet med AL tilstand (figur 1C). På den anden side blev 99% af energi indtag fuldt kompenseret under 2 dages genfodring i 2:1 Hvis. Dette regime gør det muligt at undersøge virkningerne af isocaloric, hvis der er uafhængige af kalorieindtag forskel.
Figur 2 illustrerer en skematisk tidslinje for de isokaloriske 2:1 IF-og PF-regimer. For at minimere forskellene i kalorieindtag, en observation foretaget i suppleant dag fastende6,7, denne protokol etableret en ny hvis regime bestående af 2 dag fodring og 1 dag faste perioder (2:1 Hvis)8, som gjorde det muligt at undersøge de sundhedsmæssige virkninger af isocaloric hvis i vilde-type mus. Men i OB/OB mus, som udviste hyperphagisk adfærd, 2:1 Hvis-behandlede OB/OB mus viste en 21% kalorieindtag reduktion, sammenlignet med OB/OB al mus15. Da dette forhindrer en korrekt kalorie-uafhængig sammenligning, blev der anvendt en PF-kontrolgruppe, der opretholdt samme kalorieindtag som IF-behandlede OB/OB -mus. Kort sagt den samlede mængde fødevarer, der forbruges i 2 dage efter fodring i 2:1, hvis mus blev delt ligeligt i tre daglige mængder, derefter leveres til PF-gruppen.
For en omfattende oversigt om de metaboliske resultater af 2:1 Hvis, vi sammenlignede virkningerne af AL, hvis, og PF i kropsvægt, fødeindtagelse og kropssammensætning i vildtype og OB/ob mus under normal kost (ND) og HFD. Sammenlignet med AL, hvis behandlingen medførte lavere vægtøgning i ND-fed og HFD-fodret WT-mus uden signifikante forskelle i fødeindtagelse (figur 3A, B). Kropssammensætning analyse afslørede, at hvis specifikt reduceret fedtmasse uden ændringer i lean masse i vild-type mus (figur 3C). Det er muligt, at en lidt, omend ikke signifikant, lavere akkumuleret energi indtag over 16 uger af IF-programmet kan resultere i reduceret legemsvægtøgning af hvis dyr. Men hvis forsøget med parfodrings regimet bekræftede, at den nedsatte legemsvægtøgning ved hvis ikke skyldtes ændret energi indtag (figur 3D, E). I modsætning til vildtlevende dyr er legemsvægten af OB/OB -mus, der er udsat for IF (OB-IF), lavere end for OB-al-mus (figur 3G). Dette skyldes Hyperfagi (overdreven indtagelse) af OB/OB -mus, hvilket fører til mildt højere (21%) fødeindtagelse i AL-mus sammenlignet med hvis-behandlede dyr (figur 3H). Derfor, til specifikt at undersøge den metaboliske virkning af hvis der på en kalorie-uafhængig måde, en par-fodring kontrolgruppe blev ansat. Men i modsætning til Wild-type mus8, OB-PF mus var umulig at skelne sammenlignet med OB-IF mus i kropsvægt og kropssammensætning15 (figur 3i). Disse resultater tyder på, at Leptin er sandsynligvis impliceret i isocaloric hvis-medieret kropsvægt reduktion i mus.
Den største metaboliske fordel ved isokalorisk, hvis er den forbedrede glucosehomøostase. Som vist i figur 4A, B, C, D, HFD-hvis mus udviste en signifikant forbedring i glucosehomøostase. GTT viste, at blodglucose er hurtigere clearet i IF-behandlede mus, mens ITT afslørede højere insulinfølsomhed i HFD-IF-mus, sammenlignet med HFD-AL eller HFD-PF-mus. Uventet, på trods af svigt i hvis-medieret vægttab, OB-hvis dyrene udstillet signifikant forbedret glukose håndtering med mindre glukose udflugter i GTT, sammenlignet med OB-PF mus (figur 4E), hvorimod insulinfølsomhed var umulig at skelne mellem OB-IF og OB-PF mus (figur 4F). Denne forbedrede glucosehomøostase i OB-IF-mus er sandsynligvis medieret af stigninger i plasmaniveauet af Glucagon-lignende peptid-1 (GLP-1) og glucose-stimuleret insulinsekretion (data ikke vist)15. Samlet, ved hjælp af denne 2:1 Hvis protokol og ordentlig kalorie-uafhængig PF kontrol, vi viste de metaboliske fordele af isocaloric hvis i vild-type og OB/OB mus.
En af de metaboliske virkninger af, hvis i vild-type mus er højere total O2 forbrug, anvendes til at estimere energi udgifter (figur 5A, B). Denne stigning i O2 forbrug blev kun fundet under fodring periode i hvis mus, men ikke faste periode, sammenlignet med al mus. Den øgede energiforbrug var stort set medieret af fedtvæv termogenese, såsom bruning af hvidt fedtvæv og aktivering af brunt fedtvæv (data ikke vist)8,16. Hvis-medieret fedtvæv termogenese ville formentlig forklare, hvordan vild-type mus udsat for, hvis udstillet den reducerede kropsvægt gevinst uden forskel i fødeindtagelse, sammenlignet med al mus. På den anden side, hvis det ikke lykkedes at øge O2 forbrug i OB/OB mus (figur 5C-D), og selv førte til en reduktion i energiudgifterne i faste periode. Konsekvent, hvis-induceret fedtvæv termogenese blev helt afskaffet i OB/OB mus (data ikke vist). Disse data tyder på en mulig begrænsning af, hvis da det kan fungere forskelligt for personer med forskellige genetiske og miljømæssige baggrunde.
Figur 1: fodring analyser efter 24 h faste og sammenligning mellem 1:1 og 2:1 Hvis. (A) daglige kropsvægt ændringer af mus før og efter 24 h faste (n = 10). B) daglig energiindtagelse før og efter 24 h faste (n = 5 bure; 2 mus pr. bur). (C) sammenligning af energi indtag mellem anden dag faste (dvs., 1 dag fodring/1 dag faste, 1:1 Hvis) og 2:1 intermitterende faste (dvs., 2 dag fodring/1 dag faste). I 1:1 hvis regime, kun ~ 80% af fødeindtagelse blev kompenseret i løbet af den efterfølgende 1 dag i genfodring sammenlignet med fødeindtagelse over 2 dage med fodring. På den anden side, 99% af energi indtag blev opnået, når 2 dage med genfodring blev givet, sammenlignet med, at over 3 dage med fodring. Data udtrykkes som middelværdien ± SEM. Dette tal blev gengivet med tilladelse fra Kim et al.8. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: skematisk illustration af det isokaloriske 2:1 hvis regime. For PF kontrol, mængden af fødevarer, der forbruges i løbet af 2 dage fodring af IF-behandlede mus er opdelt i tre lige store portioner, som derefter leveres dagligt til PF mus under den næste cyklus. AL = ad libitum; PF = par-fodring. En del af dette tal blev gengivet med tilladelse fra Kim et al.8. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: sammenligning af AL, IF, og PF virkninger på legemsvægt, fødeindtagelse, og kropssammensætning mellem vild-type og OB/OB mus. (A, B, C) Legemsvægt, fødeindtagelse og kropssammensætning i AL eller hvis-behandlet vild-type mus under normal kost (ND) eller højt fedtindhold kost (HFD) i 16 uger af hvis regime. Data udtrykkes som middelværdien ± SEM. (ND-AL: n = 7; ND-IF: n = 8; HFD-AL: n = 7; og HFD-IF: n = 8); en-eller to-vejs ANOVA med elev-Newman-Keuls post-hoc-analyse; * * p < 0,01 vs. HFD-AL. (D, E, F) legemsvægt, fødeindtagelse og kropssammensætning i PF vs. hvis mus fodret med højt fedtindhold kost (HFD) i løbet af 12 uger af hvis regime. (PF: n = 6 og IF: n = 6); to-sidet ikke-parret Student's t-test; * p < 0,05 vs. HFD-PF; NS = ikke signifikant. (G, H, I) Legemsvægt, fødeindtagelse og kropssammensætning i AL, PF eller IF-behandlede OB/OB -mus fodret med normal Chow (OB-al: n = 4; OB-PF: n = 7; OB-IF: n = 6); OB-AL imod OB-PF: *p < 0,05; OB-AL imod OB-IF: * p < 0,05; OB-PF imod OB-IF. Paneler A – F blev gengivet med tilladelse fra Kim et al.8. Paneler G – jeg blev gengivet med tilladelse fra Kim et al.15. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: forbedret glucosehomøostase ved hvis i både vild-type og OB/OB mus. (A, B) Intraperitoneal GTT og ITT i HFD-AL og HFD-hvis Wild-type mus efter 16 ugers IF regime. Justerings viser arealet under kurven (AUC); * p < 0,05 vs. HFD-al. (C, D) GTT og ITT i HFD-PF sammenlignet med HFD-hvis Wild-type mus efter 12 ugers IF regime. Justerings viser AUC; * p < 0,05 vs. HFD-PF. (E, F) GTT og ITT i OB-IF sammenlignet med OB-PF mus efter 16 ugers IF regime. Justerings viser AUC (* p < 0,05 vs. OB-PF). Paneler A – D blev gengivet med tilladelse fra Kim et al.8. Panelerne E og F blev gengivet med tilladelse fra Kim et al.15. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: analyse af energi udgifter i IF-behandlede vildtype-og OB/OB -mus. A) spor af O2 -forbrug i en cyklus på 2:1, hvis det er i vildtlevende mus (dvs. 1 dages faste efterfulgt af 2 dages fodring). (B) gennemsnit af O2 forbrug pr. time under faste, fodring og en cyklus på 2:1 Hvis. Data udtrykkes som middelværdien ± SEM (HFD-AL: n = 6; og HFD-IF: n = 12); * p < 0,05 vs. HFD-AL. (C) O2 forbrug spor af OB/OB mus i en cyklus af 2:1 Hvis. D) gennemsnit af O2 forbrug pr. time under faste, fodring og en cyklus på 2:1, hvis (OB-PF: n = 7; OB-IF: n = 6); * p < 0,05 vs. OB-PF. panel B blev gengivet med tilladelse fra Kim et al.8. Paneler C og D blev gengivet med tilladelse fra Kim et al.15. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det har været veldokumenteret, at hvis der giver gavnlige sundhedsmæssige virkninger på forskellige sygdomme hos både mennesker og dyr8,15,16,17,18,19. Dens underliggende mekanismer, såsom autophagy og Gut mikrobiome, er for nylig blevet belyst. Den præsenterede protokol beskriver en isocaloric 2:1 hvis regime i mus til at undersøge kalorie-uafhængige metaboliske fordele af hvis mod diæt-induceret fedme og associeret metabolisk dysfunktion. I modsætning til den alternative dag fastende (1:1 IF) protokol, der resulterer i en reduktion i den samlede kalorieindtag6,7, giver 1 mere dag i genfodring i 2:1 hvis regime muliggør vedligeholdelse af en isokalorisk tilstand i vild-type mus.
Desuden, sammenlignet med 1:1 Hvis, 2:1 hvis regime kan reducere mulige fastende-medieret stress eller sløvhed i mus20 og er også sammenlignelig med en populær Kostmetode, den 5:2 Diet2. Selv om dens virkninger ikke er blevet testet, kan regimet ændres ved at give yderligere dage med genfodring (f. eks 3:1 eller 4:1 Hvis). Desuden kan denne protokol præsenteret let justeres til en time-skala kaldet tidsbegrænset fodring (TRF), hvor adgang til fødevarer er begrænset til 8 h pr. dag i den aktive fase21, som er kendt for at opnå en isocaloric diæt regime og give metaboliske fordele mod HFD-induceret fedme og diabetes19,21,22.
Som vist i fodrings analysen (figur 1B) falder hyperphagisk adfærd umiddelbart efter 24 timers fastende gradvist i vild-type-mus, hvilket muliggør isokalorisk IF. Men, denne isokaloriske tilstand kan ikke opnås i OB/OB mus, da de mangler Leptin signalering-medieret mæthed og energimetabolisme, fører til en kontinuerlig hyperphagisk fænotype23,24. Derfor, før du udfører en hvis eksperiment, anbefales det at undersøge fodring opførsel af musen model af interesse. For at undersøge virkningerne af hvis du bruger en hyperphagisk musemodel (f. eks. OB/OB, DB/DB, Sim1+/-, MC4R-/-)24,25,26, som beskrevet i denne protokol, er ansættelse af en parfodrings gruppe som en isokalorisk eksperimentel kontrol vigtig for at foretage passende sammenligninger. Det kræver også omhyggelig planlægning, når du tester en musemodel med en hypophagisk fænotype (f. eks. melanin-holdige hormon KO-mus)27.
En vigtig faktor at overveje for hvis undersøgelser er bolig temperatur, som påvirker forskellige fysiologiske og adfærdsmæssige parametre i mus. Især kulde eksponering (4 – 6 °C) øger energi indtag betydeligt for at opretholde kroppens kernetemperatur28. I de termodynamiske forhold (30 °C), hvorunder varme gevinsten opvejes af varmetab, er reduktionen i fødevareforbruget derimod markant reduceret med8. Med hensyn til metaboliske resultater inducerer kold eksponering fedtvæv termogenese, som er hæmmet af termodynamik tilstand. Derfor forventes det, at bolig temperaturen påvirker de metaboliske phenotyper af IF og passende fodring: fastende ratio for at opnå isokalorisk hvis.
Det har tidligere vist sig, at isocaloric 2:1, hvis det kan opnås i termodynamik forhold, hvilket fører til forbedret metabolisk sundhed i diæt-induceret fedme og metabolisk dysfunktion uden forskelle i fødeindtagelse mellem IF og AL grupper8. Men isocaloric, hvis det ikke kan opnås med 2:1 ratio ved kolde temperaturer, fordi mus under kold eksponering vil vise en hyperphagisk fænotype, hvilket fører til underernæring i IF-gruppen. Da kold eksponering og hvis vise sammenlignelige metaboliske resultater og mekanismer (dvs. fedtvæv termogenese og forbedret glukose homøostase), der hjælper med at bekæmpe fedme, der er interesse i at kombinere disse to interventioner for at maksimere metaboliske virkning. For at teste dette korrekt, anbefales det derfor at udføre fodrings analysen, før der køres et hvis-eksperiment, og ved hjælp af en par-fodring kontrolgruppe under kold eksponering.
Andre faktorer, der potentielt kan påvirke resultaterne af hvis undersøgelser omfatter bolig tæthed. Svarende til den tidligere undersøgelse, som viste reduceret fødeindtagelse i mere tætbefolkede mus29, mus fra et bur af fem forbruges betydeligt mindre mad end dem fra et bur af to (ikke offentliggjorte resultater). Desuden er det blevet påvist, at bolig tætheden i betydelig grad påvirker omgivende temperatur, da temperaturen inde i et bur hus fem mus er 1 – 2 °C højere end dem, der huser en til to mus30. Selv om denne undersøgelse konkluderede, at bolig tæthed ikke signifikant påvirke fødeindtagelse (undersøgt i 5 uger), i en hvis undersøgelse varede 12 – 16 uger, temperatur inde i buret påvirket af bolig tæthed kan stadig påvirke fødeindtagelse og energimetabolisme. Sammen, det er vigtigt at holde det samme antal mus anbragt i et bur og minimere ændre antallet pr bur i løbet af en undersøgelse.
Sammenfattende viser denne rapport en enkel og reproducerbar protokol til testning af isokalorisk 2:1, hvis den er i mus. Selv om den nuværende undersøgelse er fokuseret på metaboliske fordele af hvis i diæt-induceret fedme og metabolisk dysfunktion, det kan let tilpasses til at undersøge de beskyttende og terapeutiske virkninger af isocaloric, hvis mod andre tilstande, såsom kardiovaskulære og neurologiske sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
K.-H. K blev støttet af Heart and Stroke Foundation of Canada tilskud-in-Aid (G-18-0022213), J. P. Bickell Foundation og University of Ottawa Heart Institute start-up fund; H.-K.S. fik støtte fra de canadiske institutter for sundhedsforskning (PJT-162083), Reuben og Helene Dennis Scholar og Sun Life Financial ny investigator Award for diabetes forskning fra Banting & bedste Diabetes Center (BBDC) og Natural Sciences og tekniske Forskningsråd (NSERC) i Canada (RGPIN-2016-06610). R.Y.K. blev støttet af et stipendium fra University of Ottawa Cardiology Research begavelse fund. J.H.L. blev støttet af NSERC ph. d.-stipendiet og Ontario Graduate Scholarship. Y. s. blev støttet af UOHI begavet Graduate Award og dronning Elizabeth II Graduate Scholarship i videnskab og teknologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Comprehensive Lab Animal Monitoring System (CLAMS) | Columbus Instruments | Indirect calorimeter | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 | For GTT |
| EchoMRI 3-in-1 | EchoMRI | EchoMRI 3-in-1 | Body composition analysis |
| Glucometer and strips | Bayer | Contour NEXT | These are for GTT and ITT experiments |
| High Fat Diet (45% Kcal% fat) | Research Diets Inc. | #D12451 | 3.3 Kcal/g |
| High Fat Diet (60% Kcal% fat) | Research Diets Inc. | #D12452 | 4.73 Kcal/g |
| Insulin | El Lilly | Humulin R | For ITT |
| Mouse Strain: B6.Cg-Lepob/J | The Jackson Laboratory | #000632 | Ob/Ob mouse |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | #000664 | |
| Normal chow (17% Kcal% fat) | Harlan | #2918 | |
| Scale | Mettler Toledo | Body weight and food intake measurement |
References
- Gill, S., Panda, S. A Smartphone App Reveals Erratic Diurnal Eating Patterns in Humans that Can Be Modulated for Health Benefits. Cell Metabolism. 22 (5), 789-798 (2015).
- Longo, V. D., Panda, S. Fasting, Circadian Rhythms, and Time-Restricted Feeding in Healthy Lifespan. Cell Metabolism. 23 (6), 1048-1059 (2016).
- Longo, V. D., Mattson, M. P. Fasting: molecular mechanisms and clinical applications. Cell Metabolism. 19 (2), 181-192 (2014).
- Patterson, R. E., et al. Intermittent Fasting and Human Metabolic Health. Journal of the Academy of Nutrition and Dietetics. 115 (8), 1203-1212 (2015).
- Fontana, L., Partridge, L. Promoting health and longevity through diet: from model organisms to humans. Cell. 161 (1), 106-118 (2015).
- Boutant, M., et al. SIRT1 Gain of Function Does Not Mimic or Enhance the Adaptations to Intermittent Fasting. Cell Reports. 14 (9), 2068-2075 (2016).
- Gotthardt, J. D., et al. Intermittent Fasting Promotes Fat Loss With Lean Mass Retention, Increased Hypothalamic Norepinephrine Content, and Increased Neuropeptide Y Gene Expression in Diet-Induced Obese Male Mice. Endocrinology. 157 (2), 679-691 (2016).
- Kim, K. H., et al. Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage. Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).
- Lancaster, G. I., Henstridge, D. C. Body Composition and Metabolic Caging Analysis in High Fat Fed Mice. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Disease Models & Mechanisms. 3 (9-10), 525-534 (2010).
- Heijboer, A. C., et al. Sixteen h of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. Journal of Lipid Research. 46 (3), 582-588 (2005).
- McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 297 (4), 849-855 (2009).
- Jorgensen, M. S., Tornqvist, K. S., Hvid, H. Calculation of Glucose Dose for Intraperitoneal Glucose Tolerance Tests in Lean and Obese Mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 95-97 (2017).
- Nagy, C., Einwallner, E. Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT). Journal of Visualized Experiments. (131), 56672 (2018).
- Kim, Y. H., et al. Thermogenesis-independent metabolic benefits conferred by isocaloric intermittent fasting in ob/ob mice. Scientific Reports. 9 (1), 2479 (2019).
- Li, G., et al. Intermittent Fasting Promotes White Adipose Browning and Decreases Obesity by Shaping the Gut Microbiota. Cell Metabolism. 26 (4), 672-685 (2017).
- Mitchell, S. J., et al. Daily Fasting Improves Health and Survival in Male Mice Independent of Diet Composition and Calories. Cell Metabolism. 29 (1), 221-228 (2019).
- Cignarella, F., et al. Intermittent Fasting Confers Protection in CNS Autoimmunity by Altering the Gut Microbiota. Cell Metabolism. 27 (6), 1222-1235 (2018).
- Martinez-Lopez, N., et al. System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy. Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).
- Lo Martire, V., et al. Changes in blood glucose as a function of body temperature in laboratory mice: implications for daily torpor. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 315 (4), 662-670 (2018).
- Chaix, A., Zarrinpar, A., Miu, P., Panda, S. Time-restricted feeding is a preventative and therapeutic intervention against diverse nutritional challenges. Cell Metabolism. 20 (6), 991-1005 (2014).
- Chaix, A., Lin, T., Le, H. D., Chang, M. W., Panda, S. Time-Restricted Feeding Prevents Obesity and Metabolic Syndrome in Mice Lacking a Circadian Clock. Cell Metabolism. 29 (2), 303-319 (2019).
- Wang, B., Chandrasekera, P. C., Pippin, J. J. Leptin- and leptin receptor-deficient rodent models: relevance for human type 2 diabetes. Current Diabetes Reviews. 10 (2), 131-145 (2014).
- Pan, W. W., Myers, M. G. Leptin and the maintenance of elevated body weight. Nature Reviews: Neuroscience. 19 (2), 95-105 (2018).
- Jackson, D. S., Ramachandrappa, S., Clark, A. J., Chan, L. F. Melanocortin receptor accessory proteins in adrenal disease and obesity. Frontiers in Neuroscience. 9, 213 (2015).
- Tolson, K. P., et al. Postnatal Sim1 deficiency causes hyperphagic obesity and reduced Mc4r and oxytocin expression. Journal of Neuroscience. 30 (10), 3803-3812 (2010).
- Shimada, M., Tritos, N. A., Lowell, B. B., Flier, J. S., Maratos-Flier, E. Mice lacking melanin-concentrating hormone are hypophagic and lean. Nature. 396 (6712), 670-674 (1998).
- Reitman, M. L. Of mice and men - environmental temperature, body temperature, and treatment of obesity. FEBS Letters. 592 (12), 2098-2107 (2018).
- Chvedoff, M., Clarke, M. R., Irisarri, E., Faccini, J. M., Monro, A. M. Effects of housing conditions on food intake, body weight and spontaneous lesions in mice. A review of the literature and results of an 18-month study. Food and Cosmetics Toxicology. 18 (5), 517-522 (1980).
- Toth, L. A., Trammell, R. A., Ilsley-Woods, M. Interactions Between Housing Density and Ambient Temperature in the Cage Environment: Effects on Mouse Physiology and Behavior. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 708-717 (2015).
