Summary
L'articolo corrente descrive un protocollo dettagliato per il digiuno intermittente isocalorico 2:1 per proteggere e trattare contro l'obesità e il metabolismo alterato del glucosio nei topi selvatici e ob/ob.
Abstract
Il digiuno intermittente (IF), un intervento dietetico che prevede la restrizione energetica periodica, è stato considerato per fornire numerosi benefici e contrastare le anomalie metaboliche. Finora sono stati documentati diversi tipi di modelli IF con durate variabili di periodi di digiuno e di alimentazione. Tuttavia, interpretare i risultati è impegnativo, poiché molti di questi modelli comportano contributi multifattoriali da strategie di restrizione del tempo e calorie. Ad esempio, il modello di digiuno giornaliero alternativo, spesso utilizzato come regime DI ROditore IF, può provocare l'alimentazione inedito, suggerendo che i benefici per la salute di questo intervento sono probabilmente mediati tramite limiti calorici e cicli di rifornimento di digiuno. Recentemente, è stato dimostrato con successo che 2:1 IF, che comprende 1 giorno di digiuno seguito da 2 giorni di alimentazione, può fornire protezione contro l'obesità indotta dalla dieta e miglioramenti metabolici senza una riduzione dell'apporto calorico complessivo. Presentato qui è un protocollo di questo intervento isocalorico 2:1 SE nei topi. È inoltre descritto un protocollo di alimentazione a coppie (PF) necessario per esaminare un modello murino con comportamenti alimentari alterati, come l'iperfagia. Utilizzando il regime 2:1 IF, è dimostrato che isocalorico IF porta a ridotto aumento di peso corporeo, migliore omeostasi del glucosio, e il dispendio energetico elevato. Pertanto, questo regime può essere utile per studiare gli impatti sulla salute di IF su varie condizioni di malattia.
Introduction
Lo stile di vita moderno è associato a un tempo di assunzione giornaliero più lungo e a periodi di digiuno più lunghi1. Ciò contribuisce all'attuale epidemia globale di obesità, con svantaggi metabolici osservati nell'uomo. Il digiuno è stato praticato nel corso della storia umana, e i suoi diversi benefici per la salute includono durata prolungata, ridotto danno ossidativo, e ottimizzata energia omeostasi2,3. Tra i vari modi per praticare il digiuno, la privazione periodica di energia, definita digiuno intermittente (IF), è un metodo dietetico popolare che è ampiamente praticato dalla popolazione generale a causa del suo regime facile e semplice. Recenti studi in modelli preclinici e clinici hanno dimostrato che SE può fornire benefici per la salute paragonabili a prolungati a digiuno prolungato e restrizione calorica, suggerendo che IF può essere una potenziale strategia terapeutica per l'obesità e le malattie metaboliche2,3,4,5.
I regimi IF variano in termini di durata e frequenza del digiuno. Il digiuno alternato del giorno (ad esempio, 1 giorno di alimentazione/1 giorno di digiuno; 1:1 IF) è stato il regime IF più comunemente usato nei roditori per studiare i suoi effetti benefici sulla salute, le malattie cardiovascolari, le malattie neurodegenerative, ecc.2,3. Tuttavia, come mostrato negli studi precedenti6,7, e ulteriormente confermata meccanicamente nella nostra analisi di assunzione di energia8, 1:1 IF risultati in underfeeding ( . a causa della mancanza di tempo di alimentazione sufficiente per compensare la perdita di energia. Questo rende poco chiaro se i benefici per la salute conferiti da 1:1 SE sono mediati da restrizione calorica o modifica dei modelli alimentari. Pertanto, è stato sviluppato un nuovo regime IF che è mostrato qui, che comprende un modello di digiuno di 2 giorni /1 giorno (2:1 IF), che fornisce ai topi il tempo sufficiente per compensare l'assunzione di cibo (99%) e peso corporeo. Questi topi vengono quindi confrontati con un gruppo ad libitum (AL). Questo regime consente l'esame degli effetti dell'IF isocalorico in assenza di riduzione calorica nei topi selvatici.
Al contrario, in un modello murino che mostra un comportamento di alimentazione alterato, l'alimentazione AL potrebbe non essere una condizione di controllo adeguata per confrontare ed esaminare gli effetti di 2:1 IF. Ad esempio, poiché i topi ob/ob (un modello genetico comunemente usato per l'obesità) presentano iperfagia a causa della mancanza di leptina che regola l'appetito e la sazietà, quelli con 2:1 IF presentano un apporto calorico ridotto del 20% rispetto ai topi ob/ob con alimentazione AL. Pertanto, per esaminare e confrontare correttamente gli effetti dell'IF nei topi ob/ob, è necessario impiegare un gruppo di coppia di alimentazione come controllo adeguato.
Nel complesso, viene fornito un protocollo completo per eseguire isocalorico 2:1 IF, compreso l'uso di un controllo di alimentazione di coppia. È inoltre dimostrato che isocalorico 2:1 SE protegge i topi dall'obesità indotta dalla dieta ad alto contenuto di grassi e/o dalla disfunzione metabolica nei topi di tipo selvaggio e ob/ob. Questo protocollo può essere utilizzato per esaminare gli impatti benefici sulla salute di 2:1 IF su varie condizioni patologiche tra cui disturbi neurologici, malattie cardiovascolari e cancro.
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Protocol
Tutti i metodi e protocolli qui sono stati approvati dai Comitati per la cura degli animali nel The Animal Care and Veterinary Service (ACVS) dell'Università di Ottawa e del Centro di Phenogenomica (TCP) e sono conformi agli standard del Canadian Council on Animal Care. Va notato che tutte le procedure qui descritte dovrebbero essere eseguite sotto l'approvazione istituzionale e governativa, nonché da personale tecnicamente abile. Tutti i topi erano alloggiati in gabbie ventilate standard in ambienti con temperatura e umidità con 12 h/12 h di cicli di luce/scuro (21-22 gradi centigradi, 30%-60% di umidità per l'alloggiamento normale) e libero accesso all'acqua. I topi maschi C57BL/6J e ob/ob sono stati ottenuti dal Jackson Laboratory.
1. 2:1 Isocalorico IF Regimen
- Per i modelli di topo di obesità magra e indotta dalla dieta, preparare una dieta normale (17% di grassi, ND) o dieta ad alto contenuto di grassi (45% di grassi, HFD).
NOTA: il 60% di HFD può essere utilizzato per indurre una grave obesità indotta dalla dieta; tuttavia, a causa della morbidezza del pellet alimentare, è relativamente difficile misurare con precisione l'assunzione quotidiana di cibo. Un sistema di misurazione continua automatizzato può migliorare la versatilità per più tipi di diete. - Misurare il peso corporeo della linea di base e la composizione corporea di ogni topo a 7 settimane di età utilizzando una scala e EchoMRI, rispettivamente.
NOT: Fare riferimento alla sezione 3 per la misurazione della composizione corporea. - Sulla base del peso corporeo e dei risultati della composizione corporea, dividono casualmente e allo stesso modo i topi maschi C57BL/6J di 7 settimane in due gruppi: ad libitum (AL) e gruppi di digiuno intermittente (IF).
- Mettere da due a tre topi per gabbia e garantire l'accesso gratuito all'acqua potabile.
NOT: Il numero di topi per gabbia può influenzare il comportamento di assunzione di cibo. Si raccomanda di mantenere lo stesso numero di topi per gabbia in tutti i gruppi durante lo studio. - Fornire 1 settimana di acclimatamento al nuovo ambiente gabbia e dieta prima di iniziare il regime IF.
- Periodo di digiuno: spostare i topi in una gabbia pulita con biancheria da letto fresca alle 12:00. Non aggiungere cibo per il gruppo IF, fornendo al gruppo AL una quantità ponderata di cibo.
NOT: Per ogni ciclo di digiuno, è importante modificare le gabbie per entrambi i gruppi AL e IF per garantire che entrambi i gruppi siano esposti alla stessa quantità di tempo di movimentazione. - Dopo 24 h, misurare i pesi dei topi in entrambi i gruppi e negli avanzi di cibo nelle gabbie AL.
NOT: Assicurarsi di includere il peso delle briciole di cibo sulla tramoggia alimentare e sul fondo della gabbia, soprattutto quando si utilizza HFD, poiché i topi spesso rimuovono piccoli pellet o frammenti di cibo dalla tramoggia e li tengono vicino ai siti di nidificazione. L'assunzione media di energia per mouse alla fine di ogni ciclo 2:1 (3 giorni) è di circa 35 kcal, equivalente a 10 g per una dieta normale (3,3 kcal/g) e 7 g per HFD (4,73 kcal/g). - Periodo di alimentazione: fornire una quantità ponderata di cibo alle 12:00 per entrambi i gruppi AL e IF.
- Dopo 48 h di fornire il cibo, misurare il peso del cibo e dei topi rimasti.
- Ripetere i passaggi da 1,6 a 1,10 per la durata dello studio(ad es. 16 settimane).
2. Gruppo di controllo di alimentazione a coppie (PF)
NOT: Per un esperimento IF in cui si osserva un comportamento di alimentazione alterato in un modello di topo (ad esempio, iperfagia nei topi ob/ob), è necessario disporre di un gruppo di alimentazione di coppia come controllo per un corretto confronto indipendente dalle calorie con IF.
- Per il gruppo di controllo PF, scaglionare la pianificazione dell'esperimento in modo che la stessa quantità di cibo utilizzata dal gruppo IF venga offerta al gruppo PF (Figura 2).
- Misurare la quantità di cibo consumato dal gruppo IF per 2 giorni di periodo di rialimentazione.
- Dividere questa quantità di cibo consumato nel gruppo IF in tre proporzioni e fornirlo quotidianamente al gruppo PF alle 12:00 PM.
NOT: Fornire la stessa quantità di cibo ogni giorno è fondamentale. Nel caso di topi con iperfagia, se i topi alimentati in coppia sono dotati di una quantità di cibo inferiore al loro consumo volontario in una sola volta, probabilmente consumeranno tutto il cibo fornito e saranno effettivamente digiunati. Ciò può quindi impedire un corretto confronto con i topi trattati con IF e confondere il risultato. - Ripetere i passaggi da 2.1–2.3 per la durata dello studio.
3. Analisi della composizione corporea
NOT: Poiché l'IF a lungo termine influisce sul peso corporeo nei topi, la composizione corporea può essere misurata a cicli appropriati (ad esempio, ogni 3 o 4 cicli) utilizzando un analizzatore di composizione corporea per quantificare il grasso e la massa magra in topi vivi non anestesizzati.
- Accendere l'analizzatore della composizione corporea.
NOT: Prima di avviare il programma, lasciare la macchina accesa per almeno 2-3 h per riscaldarsi. - Eseguire un test di sistema sull'analizzatore della composizione corporea per verificarne l'accuratezza della misurazione. Se necessario, calibrare il sistema utilizzando campioni di olio di canola e acqua.
- Misurare il peso corporeo di ogni mouse.
- Posizionare il mouse in un piccolo supporto cilindrico animale.
- Inserire un delimitatore per vincolare il movimento fisico del mouse durante la misurazione e posizionare il supporto nell'analizzatore di composizione del corpo.
- Eseguire il programma di scansione.
NOT: Ci vogliono circa 90–120 s per analizzare. - Dopo la misurazione, rimuovere il supporto dall'apparecchiatura e riportare il mouse nella gabbia.
NOT: Un protocollo più dettagliato può essere trovato in una precedente pubblicazione9.
4. Test di tolleranza al glucosio e all'insulina
- Per il test di tolleranza al glucosio (GTT), misurare il peso corporeo e la composizione corporea di ogni mouse prima di sottoporre al digiuno e contrassegnare la coda con un marcatore permanente per un'indicizzazione facile e rapida.
- Mettere i topi in nuove gabbie senza cibo alle 19:00 per il digiuno notturno.
NOT: Il digiuno notturno è il protocollo standard, ma a causa della fisiologia del topo (ad esempio, aumento dell'utilizzo del glucosio dopo il digiuno prolungato di10,11), il digiuno più breve (6 h) può essere utilizzato come descritto per l'ITT. - Dopo il digiuno 14-16 h (9:00 AM nel mattino seguente), misurare il peso corporeo e la composizione corporea di ogni topo e calcolare la quantità di dosaggio del glucosio in base al peso corporeo.
NOT: Per evitare una sopraelevazione dell'intolleranza al glucosio nei topi obesi, la massa magra ottenuta dall'analisi della composizione corporea può essere utilizzata per calcolare il dosaggio del glucosio12,13. - Per ogni mouse, tagliare la punta della coda (0,5–1,0 mm) utilizzando forbici chirurgiche pulite. Dopo aver ripulito la prima goccia di sangue, disegna una nuova goccia di sangue dalla coda e misura il livello di glucosio nel sangue del digiuno al basale con il glucometer.
NOT: Il taglio della coda aggiuntivo non è necessario per ogni misurazione della glicemia durante GTT o ITT. La ferita può essere rinfrescata da abradendola con garza per disegnare una goccia di sangue. - Sottoporre i topi a un'iniezione intraperitale (i.p.) di glucosio (1 mg/g di peso corporeo).
NOT: Sulla base dell'obiettivo di un esperimento (adesempio, esaminando gli effetti dell'incretina), la somministrazione orale del glucosio può essere eseguita mediante gavage orale. Il protocollo per orale GTT (OGTT) può essere trovato in un altro studio14. - Misurare la glicemia dalla coda a 0, 5, 15, 30, 60 e 120 min iniezione post-glucosio.
- Dopo aver terminato la GTT, fornire una quantità sufficiente di cibo.
- Per il test di tolleranza all'insulina (ITT), rimuovere il cibo alle 9:00.
NOT: Dal momento che sia GTT che ITT sono esperienze che inducono stress per i topi che possono aumentare i livelli di glucosio nel sangue e cambiare la fisiologia, si consiglia di eseguire ITT dopo aver fornito almeno 2-3 giorni di recupero dopo l'esperimento GTT. - Dopo il digiuno per 6 h (3:00 PM), misurare il glucosio nel sangue di base dalla coda come descritto al passaggio 4.4.
- Soggetti all'iniezione di insulina i.p. (0,65 mU/g di peso corporeo).
- Misurare la glicemia dalla coda a 0, 15, 30, 60, 90 e 120 min di iniezione post-insulina.
- Dopo aver terminato ITT, fornire una quantità sufficiente di cibo.
5. Calorimetria indiretta
NOT: Il metabolismo energetico dei topi trattati con IF può essere ulteriormente valutato attraverso la calorimetria indiretta su un singolo ciclo di IF. Ciò misurerà il consumo di ossigeno (VO2),la produzione di biossido di carbonio (VCO2),il rapporto di cambio respiratorio (RER) e il calore (kcal/h).
- Accendere la potenza del sistema calorimetrico indiretto almeno 2 h prima di eseguire l'esperimento.
NOT: Questo riscaldamento del sistema è importante per una misurazione accurata. - Preparare le gabbie con biancheria da letto pulita, riempire le bottiglie d'acqua e aggiungere la quantità pre-pesata di chow alle tramogge di cibo.
- Controllare le condizioni del Drierite e calce soda. Se un indicatore di colore del Drierite appare rosa, che indica che il Drierite ha assorbito una grande quantità di umidità, è necessario sostituire o top con Drierite fresco.
- Calibrare il sistema utilizzando un gas con la composizione specifica (0,5% CO2, 20,5% O2).
- Misurare il peso corporeo e la composizione corporea di ogni mouse, che verrà utilizzato per normalizzare i dati VO2 e VCO2.
- Posizionare delicatamente un mouse per gabbia.
- Assemblare le gabbie metaboliche, posizionarle nella camera ambiente a temperatura controllata e collegarle alle linee di gas e al cavo del sensore di attività.
- Dopo aver impostato il profilo dell'esperimento aggiungendo parametri sperimentali appropriati utilizzando il software, eseguire il programma per la misurazione. Lo scopo della misurazione del primo giorno è quello di fornire un periodo di acclimatazione e misurare il metabolismo energetico di base.
- Alle 12:00 del giorno seguente, sottoporre i topi a 24 h di digiuno rimuovendo cibo e briciole dalla tramoggia e dal fondo della gabbia. Se necessario, sostituire con biancheria da letto pulita.
- Dopo 24 h, aggiungere la quantità pre-pesata di chow alla tramoggia per il periodo di rialimentazione.
- Continuare a misurare per i prossimi 48 h. Controllare regolarmente se il sistema è in esecuzione senza interruzioni hardware o software.
- Dopo aver completato la misurazione, terminare il programma e riportare i topi nelle gabbie originali. Misurare la quantità di cibo residuo per esaminare l'assunzione di cibo.
- Il protocollo dettagliato per la calorimetria indiretta può essere trovato in uno studio precedente9.
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Representative Results
La figura 1 mostra le analisi di alimentazione dopo il digiuno di 24 h e il confronto tra il digiuno intermittente 1:1 e 2:1. Un periodo di digiuno di 24 h ha comportato una riduzione del peso corporeo del 10%, che è stata completamente recuperata dopo 2 giorni di refeeding (Figura 1A). Un periodo di digiuno di 24 h ha indotto l'iperfagia durante i successivi 2 giorni di refeeding (Figura 1B). Tuttavia, il confronto tra l'assunzione di energia tra il digiuno di un giorno alternativo 1:1 e il digiuno intermittente 2:1 ha rivelato che il giorno 1 del periodo di refeeding in 1:1 IF non era sufficiente (-80%) per compensare la perdita calorica mediante digiuno, rispetto alla condizione AL (Figura 1C). D'altra parte, il 99% dell'assunzione di energia è stata completamente compensata durante 2 giorni di refeeding in 2:1 IF. Questo regime consente l'esame degli effetti della SE isocalorica che sono indipendenti dalla differenza di apporto calorico.
Figura 2 illustra una sequenza temporale schematica per i regimi isocalorico 2:1 IF e PF. Per ridurre al minimo le differenze nell'apporto calorico, un'osservazione fatta nel digiuno giornaliero alternativo6,7, questo protocollo ha stabilito un nuovo regime IF che comprende l'alimentazione di 2 giorni e 1 giorno di periodi di digiuno (2:1 IF)8, che ha permesso l'esame degli effetti sulla salute di ISocaloric IF in topi selvatici. Tuttavia, nei topi ob/ob, che presentavano un comportamento iperfagico, 2:1 topi ob/ob trattati con IF hanno mostrato una riduzione dell'apporto calorico del 21%, rispetto ai topi ob/ob AL15. Poiché questo impedisce un corretto confronto indipendente dall'itcalorico, è stato utilizzato un gruppo di controllo PF che ha mantenuto lo stesso apporto calorico dei topi ob/ob trattati con IF. In breve, la quantità totale di cibo consumato durante 2 giorni di alimentazione in 2:1 Se i topi sono stati divisi equamente in tre quantità giornaliere, quindi forniti al gruppo PF.
Per una panoramica completa sugli esiti metabolici di 2:1 IF, abbiamo confrontato gli effetti di AL, IF e PF in peso corporeo, assunzione di cibo e composizione corporea in topi wild-type e ob/ob sotto dieta normale (ND) e HFD. Rispetto alla AL, il trattamento IF ha portato a un aumento del peso corporeo nei topi WT alimentati da ND e HFD senza differenze significative nell'assunzione di cibo (Figura 3A,B). L'analisi della composizione corporea ha rivelato che IF ha ridotto specificamente la massa grassa senza cambiamenti nella massa magra nei topi selvatici (Figura 3C). È possibile che un apporto energetico leggermente, anche se non significativamente, accumulato nel corso di 16 settimane del programma IF potrebbe comportare una riduzione del peso corporeo degli animali IF. Tuttavia, l'esperimento IF con il regime di alimentazione delle coppie ha confermato che la diminuzione dell'aumento di peso corporeo da parte di IF non era dovuta all'assunzione di energia alterata (Figura 3D,E). A differenza degli animali selvatici, il peso corporeo dei topi ob/ob sottoposti a IF (Ob-IF) era inferiore a quello dei topi Ob-AL (Figura 3G). Ciò è dovuto all'iperfagia (alimentazione eccessiva) di topi ob/ob, che portano a un lieve aumento (21%) assunzione di cibo nei topi AL, rispetto agli animali trattati con IF (Figura 3H). Pertanto, per esaminare specificamente l'effetto metabolico di IF in modo indipendente dal calorico, è stato impiegato un gruppo di controllo di alimentazione di coppia. Tuttavia, a differenza dei topi di tipo selvaggio8, i topi Ob-PF erano indistinguibili rispetto ai topi Ob-IF nei pesi corporei e nella composizionecorporea15 ( Figura 3I). Questi risultati suggeriscono che la leptina è probabilmente implicata nella riduzione del peso corporeo isocalorico se-mediato nei topi.
Il principale beneficio metabolico conferito da ISocaloricifo-IF è l'omeostasi del glucosio migliorata. Come mostrato nella Figura 4A,B,C,D, i topi HFD-IF hanno mostrato un miglioramento significativo nell'omeostasi del glucosio. GTT ha dimostrato che la glicemia viene eliminato più rapidamente nei topi trattati con IF, mentre ITT ha rivelato una maggiore sensibilità all'insulina nei topi HFD-IF, rispetto ai topi HFD-AL o HFD-PF. Inaspettatamente, nonostante i fallimenti nella riduzione del peso mediata da IF, gli animali Ob-IF hanno mostrato un miglioramento significativo della gestione del glucosio con escursioni di glucosio più piccole in GTT, rispetto ai topi Ob-PF(Figura 4E), mentre la sensibilità all'insulina era indistinguibile tra i topi Ob-IF e Ob-PF (Figura 4F). Questo miglioramento dell'omeostasi del glucosio nei topi Ob-IF è probabilmente mediato da aumenti del livello plasmatico di peptide-1 glucagon -come (GLP-1) e secrezione di insulina stimolata dal glucosio (dati non mostrati)15. Nel complesso, utilizzando questo protocollo 2:1 IF e un corretto controllo PF indipendente dal calorico, abbiamo mostrato i benefici metabolici dell'isocalorico SE nei topi di tipo selvatico e ob/ob.
Uno degli effetti metabolici dell'IF nei topi selvatici è un maggiore consumo totale di O2, utilizzato per stimare il dispendio energetico (Figura 5A,B). Questa elevazione nel consumo di O2 è stata rilevata solo durante il periodo di alimentazione nei topi IF, ma non nel periodo di digiuno, rispetto ai topi AL. L'aumento del dispendio energetico è stato in gran parte mediato dalla termogenesi adiposa, come la doratura dei tessuti adiposi bianchi e l'attivazione del tessuto adiposo marrone (dati non mostrati)8,16. La termogenesi adiposa mediata da IF spiegherebbe presumibilmente come i topi selvatici sottoposti a IF presentassero un aumento ridotto di peso corporeo senza alcuna differenza nell'assunzione di cibo, rispetto ai topi AL. D'altra parte, SE non è riuscito ad aumentare il consumo di O2 nei topi ob/ob (Figura 5C-D),e ha anche portato a una riduzione del dispendio energetico durante il periodo di digiuno. Coerentemente, la termogenesi adiposa indotta da IF è stata completamente abolita nei topi ob/ob (dati non mostrati). Questi dati suggeriscono una possibile limitazione dell'IF in quanto potrebbe funzionare in modo diverso per gli individui con diversi background genetici e ambientali.
Figura 1: Analisi di alimentazione dopo 24 h di digiuno e confronto tra 1:1 e 2:1 IF. (A) Cambiamenti giornalieri del peso corporeo dei topi prima e dopo il digiuno di 24 h (n - 10). (B) Assunzione giornaliera di energia prima e dopo il digiuno di 24 ore (n - 5 gabbie; 2 topi per gabbia). (C) Confronto dell'assunzione di energia tra il digiuno alternato del giorno (cioèl'alimentazione di 1 giorno/1 giorno di digiuno, 1:1 IF) e il digiuno intermittente 2:1 (ad es. alimentazione di 2 giorni/1 giorno di digiuno). Nel regime IF 1:1, solo l'80% dell'assunzione di cibo è stata compensata durante il successivo 1 giorno di rifornimento rispetto all'assunzione di cibo per 2 giorni di alimentazione. D'altra parte, il 99% dell'assunzione di energia è stata raggiunta quando sono stati dati 2 giorni di rialimentazione, rispetto a quelli in 3 giorni di alimentazione. I dati sono espressi come media: SEM. Questa cifra è stata riprodotta con il permesso di Kim et al.8. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Illustrazione schematica del regime isocalorico 2:1 IF. Per il controllo PF, la quantità di cibo consumato durante i 2 giorni di alimentazione da topi trattati con IF è divisa in tre porzioni uguali, che vengono poi fornite quotidianamente ai topi PF durante il ciclo successivo. AL - ad libitum; PF - accoppiamento di coppia. Parte di questa figura è stata riprodotta con il permesso di Kim et al.8. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Confronto degli effetti AL, IF e PF sul peso corporeo, l'assunzione di cibo e la composizione corporea tra topi wild-type e ob/ob. (A,B,C) Peso corporeo, assunzione di cibo, e la composizione corporea in al o SE-trattati topi selvatici sotto dieta normale (ND) o dieta ad alto contenuto di grassi (HFD) durante 16 settimane di regime IF. I dati sono espressi come media : SEM. (ND-AL: n - 7; ND-IF: n - 8; HFD-AL: n e HFD-IF: n a una o due vie ANOVA con analisi post-hoc di Student-Newman-Keuls; < 0,01 vs. HFD-AL.(D,E,F)Peso corporeo, assunzione di cibo e composizione corporea nei topi PF contro IF alimentati con dieta ad alto contenuto di grassi (HFD) durante 12 settimane di regime IF. (PF: n - 6 e SE: n - 6); test t-testdi Student non accoppiato a due code; < 0,05 vs. HFD-PF; NS - non significativo. (G,H,I) Peso corporeo, assunzione di cibo e composizione corporea in AL, PF, o topi ob/ob trattati con IF alimentati con chow normale (Ob-AL: n Ob-PF: n - 7; Ob-IF: n Ob-AL vs. Ob-PF: p< 0,05; Ob-AL vs. Ob-IF: s< 0.05; Ob-PF vs. Ob-IF. I pannelli A–F sono stati riprodotti con il permesso di Kim et al.8. I pannelli G–I sono stati riprodotti con il permesso di Kim etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Migliore omeostasi del glucosio di IF sia nei topi wild-type che in ob/ob. (A,B) Intraperitoneal GTT e ITT in hFD-AL e HFD-IF topi wild-type dopo 16 settimane di regime IF. L'insetto mostra l'area sotto curva (AUC); (C,D)GTT e ITT in HFD-PF rispetto ai mouse wild-type HFD-IF dopo 12 settimane di regime IF. L'insetto mostra AUC; (E,F)GTT e ITT in Ob-IF rispetto ai mouse Ob-PF dopo 16 settimane di regime IF. Nell'inset viene illustrato l'opzione AUC ( <0,05 vs . Ob-PF). I pannelli A–D sono stati riprodotti con il permesso di Kim et al.8. I pannelli E e F sono stati riprodotti con il permesso di Kim etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Analisi del dispendio energetico nei topi di tipo severo e ob/ob trattati con IF. (A) Tracce del consumo di O2 durante un ciclo di 2:1 IF in topi selvatici (cioè, digiuno di 1 giorno seguiti da 2 giorni di alimentazione). (B) Media di O2 consumo all'ora durante il digiuno, l'alimentazione e un ciclo di 2:1 SE. I dati sono espressi come media ( SeM (HFD-AL: n - 6; e HFD-IF: n - 12); < 0,05 vs. HFD-AL. (C) O2 tracce di consumo di topi ob/ob durante un ciclo di 2:1 IF. (D) Media di o2 consumo all'ora durante il digiuno, l'alimentazione e un ciclo di 2:1 IF (Ob-PF: n - 7; Ob-IF: n < 0,05 vs. Il gruppo B è stato riprodotto con il permesso di Kim et al.8. I pannelli C e D sono stati riprodotti con il permesso di Kim etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
È stato ben documentato che SE fornisce effetti benefici sulla salute su varie malattie sia in esseri umani che negli animali8,15,16,17,18,19. I suoi meccanismi alla base, come l'autofagia e il microbioma intestinale, sono stati recentemente chiariti. Il protocollo presentato descrive un regime isocalorico 2:1 IF nei topi per studiare i benefici metabolici ipocalorici di IF contro l'obesità indotta dalla dieta e la disfunzione metabolica associata. A differenza del protocollo di digiuno del giorno alternativo (1:1 IF) che si traduce in una riduzione dell'apporto calorico complessivo6,7, fornendo 1 giorno in più di refeeding nel regime IF 2:1 consente il mantenimento di una condizione isocalorica nei topi selvatici.
Inoltre, rispetto a 1:1 IF, il regime 2:1 IF può ridurre il possibile stress mediato dal digiuno o torpore nei topi20 ed è anche paragonabile a un metodo dietetico popolare, la dieta 5:22 2. Anche se i suoi effetti non sono stati testati, il regime può essere modificato fornendo ulteriori giorni di refeeding (ad esempio, 3:1 o 4:1 IF). Inoltre, questo protocollo presentato può essere facilmente adattato a una scala oraria chiamata alimentazione limitata nel tempo (TRF), in cui l'accesso al cibo è limitato a 8 h al giorno durante la fase attiva21, che è noto per ottenere un regime di dieta isocalorica e fornire benefici metabolici contro l'obesità indotta da HFD e il diabete19,21,22.
Come mostrato nell'analisi di alimentazione (Figura 1B), il comportamento iperfagico immediatamente dopo 24 h di digiuno diminuisce gradualmente nei topi selvatici, che abilita l'IF isocalorico. Tuttavia, questa condizione isocalorica non può essere raggiunta nei topi ob/ob, in quanto mancano di sazietà mediata dalla leptina e metabolismo energetico, portando ad un fenotipo iperfagico continuo23,24. Pertanto, prima di eseguire un esperimento IF, si consiglia di esaminare il comportamento di alimentazione del modello del mouse di interesse. Per esaminare gli effetti di IF utilizzando un modello di mouse iperfagico (ad esempio, ob/ob, db/db, Sim1- -, MC4R-//-)24,25,26, come descritto in questo protocollo, l'impiego di un gruppo di coppia alimenta come controllo sperimentale isocalorico è importante per effettuare confronti corretti. Richiede anche un'attenta pianificazione durante il test di un modello di topo con un fenotipo ipopofacolo (ad esempio, topi KO contenenti melanina)27.
Un fattore importante da considerare per gli studi IF è la temperatura dell'alloggiamento, che colpisce vari parametri fisiologici e comportamentali nei topi. In particolare, l'esposizione al freddo (4-6 gradi centigradi) aumenta significativamente l'assunzione di energia per mantenere la temperatura corporeadel nucleo 28. Al contrario, in condizioni termo-termoneutre (30 gradi centigradi) in cui l'aumento di calore è bilanciato dalla perdita di calore, la riduzione del consumo alimentare è notevolmente ridotta8. Per quanto riguarda gli esiti metabolici, l'esposizione al freddo induce una termogenesi adiposa, che è ostacolata da condizioni termoneutre. Pertanto, si prevede che la temperatura di alloggiamento influenza i fenotipi metabolici di SE e appropriato rapporto di alimentazione:digiuno per raggiungere l'IF isocalorica.
Infatti, è stato precedentemente dimostrato che isocalorico 2:1 SE può essere raggiunto in condizioni termoneutre, portando a una migliore salute metabolica nell'obesità indotta dalla dieta e disfunzione metabolica senza differenze nell'assunzione di cibo tra gruppi SE e AL8. Tuttavia, l'IF isocalorico potrebbe non essere realizzabile con rapporto 2:1 a temperature fredde perché i topi sotto esposizione a freddo mostreranno un fenotipo iperfagico, che porta all'alimentazione nel gruppo IF. Poiché l'esposizione al freddo e l'IF mostrano esiti metabolici e meccanismi comparabili (ad esempio, termogenesi adiposa e omeostasi migliorata del glucosio) che aiutano a combattere l'obesità, c'è interesse a combinare questi due interventi per massimizzare l'impatto metabolico. Pertanto, per testare correttamente questo, si consiglia di eseguire l'analisi di alimentazione prima di eseguire un esperimento IF e di utilizzare un gruppo di controllo dell'alimentazione di coppia sotto esposizione al freddo.
Altri fattori che possono potenzialmente influenzare i risultati degli studi IF includono la densità dell'alloggiamento. Simile allo studio precedente, che ha mostrato una riduzione del consumo di cibo in topi più densamente ospitati29, topi da una gabbia di cinque consumati significativamente meno cibo rispetto a quelli provenienti da una gabbia di due (risultati inediti). Inoltre, è stato dimostrato che la densità dell'alloggiamento influisce in modo significativo sulla temperatura ambiente, poiché la temperatura all'interno di una gabbia che ospita cinque topi è superiore di 1–2 gradi centigradi rispetto a quelli che ospitano da uno a due topi30. Anche se questo studio ha concluso che la densità degli alloggi non ha influenzato in modo significativo l'assunzione di cibo (esaminata per 5 settimane), in uno studio IF della durata di 12-16 settimane, la temperatura all'interno della gabbia colpita dalla densità degli alloggi può ancora influenzare l'assunzione di cibo e il metabolismo energetico. Insieme, è importante mantenere lo stesso numero di topi alloggiati in una gabbia e ridurre al minimo il cambiamento del numero per gabbia nel corso di uno studio.
In sintesi, questo rapporto mostra un protocollo semplice e riproducibile per testare l'isocalorico 2:1 IF nei topi. Anche se lo studio attuale si concentra sui benefici metabolici di IF in obesità indotta dalla dieta e disfunzione metabolica, può essere facilmente adattato per studiare gli effetti protettivi e terapeutici della SE isocalorica contro altre condizioni, come e malattie neurologiche.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
K.-H.K è stato sostenuto dalla Heart and Stroke Foundation of Canada Grant-in-Aid (G-18-0022213), dalla J. P. Bickell Foundation e dal fondo di avviamento dell'University of Ottawa Heart Institute; H.-K.S. è stato sostenuto da sovvenzioni del Canadian Institutes of Health Research (PJT-162083), Reuben e Helene Dennis Scholar e Sun Life Financial New Investigator Award for Diabetes Research del Banting & Best Diabetes Centre (BBDC) e delle scienze naturali e Engineering Research Council (NSERC) del Canada (RGPIN-2016-06610). R.Y.K. è stato sostenuto da una borsa di studio dell'Università di Ottawa Cardiology Research Endowment Fund. J.H.L. è stato sostenuto dalla NSERC Doctoral Scholarship e dalla Ontario Graduate Scholarship. Y.O. è stata sostenuta dall'UOHI Endowed Graduate Award e dalla Queen Elizabeth II Graduate Scholarship in Scienza e Tecnologia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Comprehensive Lab Animal Monitoring System (CLAMS) | Columbus Instruments | Indirect calorimeter | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 | For GTT |
| EchoMRI 3-in-1 | EchoMRI | EchoMRI 3-in-1 | Body composition analysis |
| Glucometer and strips | Bayer | Contour NEXT | These are for GTT and ITT experiments |
| High Fat Diet (45% Kcal% fat) | Research Diets Inc. | #D12451 | 3.3 Kcal/g |
| High Fat Diet (60% Kcal% fat) | Research Diets Inc. | #D12452 | 4.73 Kcal/g |
| Insulin | El Lilly | Humulin R | For ITT |
| Mouse Strain: B6.Cg-Lepob/J | The Jackson Laboratory | #000632 | Ob/Ob mouse |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | #000664 | |
| Normal chow (17% Kcal% fat) | Harlan | #2918 | |
| Scale | Mettler Toledo | Body weight and food intake measurement |
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