Summary
Текущая статья описывает подробный протокол для изокалорийных 2:1 прерывистый пост для защиты и лечения от ожирения и нарушения метаболизма глюкозы в диком типе и об / об мышей.
Abstract
Было сочтено, что прерывистое голодание (ИФ), диетическое вмешательство, связанное с периодическим ограничением энергии, обеспечивает многочисленные преимущества и противодействует нарушениям обмена веществ. До сих пор были задокументированы различные типы моделей IF с различной продолжительностью периодов поста и кормления. Однако интерпретация результатов является сложной задачей, поскольку многие из этих моделей включают в себя многофакторный вклад как от стратегий ограничения времени, так и от ограничений калорий. Например, альтернативная модель поста дня, часто используемая в качестве режима ГРЫЗУНов IF, может привести к недостаточному питанию, что позволяет предположить, что польза для здоровья от этого вмешательства, вероятно, опосредована как с помощью ограничения калорий, так и циклов кормления натощак. Недавно было успешно продемонстрировано, что 2:1 IF, состоящий из 1 дня поста, а затем 2 дня кормления, может обеспечить защиту от диетического ожирения и метаболических улучшений без сокращения общего потребление калорий. Представлен протокол этого изокалория 2:1 ЕСЛИ вмешательства у мышей. Также описан протокол парного кормления (PF), необходимый для изучения модели мыши с измененным поведением еды, таким как гиперфагия. Использование 2:1 IF режим, показано, что изокалории IF приводит к снижению веса тела, улучшение гомеостаза глюкозы, и повышенные расходы энергии. Таким образом, этот режим может быть полезным для изучения воздействия if на здоровье.
Introduction
Современный образ жизни связан с более длительным ежедневным временем вхожжья пищи и более короткими периодами поста1. Это способствует нынешней глобальной эпидемии ожирения, с метаболическим недостатки видели в организме человека. Пост практиковался на протяжении всей истории человечества, и его разнообразные преимущества для здоровья включают длительную продолжительность жизни, снижение окислительного повреждения, и оптимизированный энергетический гомеостаз2,3. Среди нескольких способов практики поста, периодические лишения энергии, называют прерывистый пост (IF), является популярным диетическим методом, который широко практикуется населением в связи с его легкой и простой режим. Недавние исследования в доклинических и клинических моделях показали, что ЕСЛИ может обеспечить преимущества для здоровья, сопоставимые с длительным постом и ограничением калорий, предполагая, что IF может быть потенциальной терапевтической стратегией для ожирения и метаболических заболеваний2,3,4.
Схемы IF различаются с точки зрения продолжительности и частоты поста. Альтернативный день поста (т.е. 1 день кормления / 1 день поста; 1:1 IF) был наиболее часто используемый режим IF у грызунов для изучения его благотворное воздействие на здоровье ожирения, сердечно-сосудистых заболеваний, нейродегенеративных заболеваний и т.д.2,3. Однако, как показано в предыдущих исследованиях6,7, и далее механически подтверждено в нашем анализе потребление энергии8, 1:1 IF результаты в недоедания (80%) из-за отсутствия достаточного времени кормления, чтобы компенсировать потерю энергии. Это делает неясным, являются ли преимущества для здоровья, предоставленные 1:1, если опосредовано ограничением калорий или изменением структуры питания. Таким образом, новый режим IF был разработан и показан здесь, включающий 2-дневного кормления/1 день поста (2:1 IF) шаблон, который предоставляет мышам достаточно времени, чтобы компенсировать потребление пищи (99%) и массы тела. Эти мыши затем по сравнению с ad libitum (AL) группы. Этот режим позволяет иссучить эффекты изокалорийного ЕСЛИ при отсутствии снижения калорий у мышей дикого типа.
В отличие от мыши модели, которая exhibits измененное поведение кормления, AL кормления не может быть надлежащим условием контроля для сравнения и изучения последствий 2:1 IF. Например, так как ob/ob мышей (обычно используется генетическая модель для ожирения) экспонат гиперфагии из-за отсутствия лептина, регулирующего аппетит и сытость, те, с 2:1 IF экспонат 20% снижение калорий по сравнению с об / об мышей с AL кормления. Таким образом, чтобы должным образом изучить и сравнить эффекты IF у ob/ob мышей, пара кормления группы в качестве подходящего контроля должны быть использованы.
В целом, предусмотрен всеобъемлющий протокол для выполнения изокалорийных 2:1 IF, включая использование пара кормления управления. Кроме того, показано, что изокалорийные 2:1 IF защищает мышей от ожирения с высоким содержанием жира, вызванного диетой и/или метаболической дисфункцией как у диких, так и у мышей типа "об/об". Этот протокол может быть использован для изучения благотворного воздействия 2:1 IF на различные патологические заболевания, включая неврологические расстройства, сердечно-сосудистые заболевания и рак.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы и протоколы здесь были одобрены комитетами по уходу за животными в службе по уходу за животными и ветеринарной службы (ACVS) Университета Оттавы и Центра феногеномики (TCP) и соответствуют стандартам Канадского совета по уходу за животными. Следует отметить, что все описанные здесь процедуры должны осуществляться на институциональном и правительственном уровне, а также сотрудниками, которые технически владеют. Все мыши были размещены в стандартных вентилируемых клетках в помещениях с температурой и влажностью с 12 ч/12 ч светлыми/темными циклами (21-22 градусов по Цельсию, 30%-60% влажности для нормального жилья) и бесплатным доступом к воде. Мужские C57BL/6J и ob/ob мышей были получены из лаборатории Джексона.
1. 2:1 Исокалорийный IF Regimen
- Для постных и диетических моделей мыши ожирения, подготовить либо нормальную диету (17% жира, ND) или с высоким содержанием жира диеты (45% жира, HFD).
ПРИМЕЧАНИЕ: 60% HFD может быть использован для индуцирования тяжелой диеты индуцированного ожирения; тем не менее, из-за мягкости пищевых гранул, это относительно трудно точно измерить ежедневное потребление пищи. Автоматизированная система непрерывного измерения может улучшить универсальность для нескольких типов диет. - Измерьте базовый вес тела и состав тела каждой мыши в возрасте 7 недель, используя шкалу и EchoMRI, соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к разделу 3 для измерения состава тела. - Основываясь на весе тела и результатах состава тела, случайным образом и в равной степени разделите 7 недельных мышей C57BL/6J на две группы: ad libitum (AL) и прерывистые группы голодания (IF).
- Поместите от двух до трех мышей на клетку и обеспечить свободный доступ к питьевой воде.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество мышей в клетке может повлиять на поведение в пищу. Рекомендуется поддерживать равное количество мышей на клетку во всех группах во время исследования. - Предоставьте 1 неделю акклиматизации к новой среде клетки и диеты перед началом режима IF.
- Период поста: переместить мышей в чистую клетку со свежими постельными принадлежностями в 12:00 вечера. Не добавляйте пищу для группы IF, обеспечивая при этом взвешенное количество пищи для группы AL.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого цикла поста важно менять клетки для групп AL и IF, чтобы обе группы подвергались одинаковому времени обработки. - После 24 ч, измерить вес мышей в обеих группах и остатки пищи в клетках AL.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, чтобы включить вес пищевой крошки на пищевой бункер и дно клетки, особенно при использовании HFD, как мыши часто удалить небольшие гранулы или фрагменты пищи из бункера и держать их вблизи гнезда сайтов. Среднее потребление энергии на мышь в конце каждого цикла 2:1 (3 дня) составляет около 35 ккал, что эквивалентно 10 г для нормальной диеты (3,3 ккал/г) и 7 г для HFD (4,73 ккал/г). - Период кормления: обеспечить взвешенное количество пищи в 12:00 вечера для al и IF групп.
- После 48 ч обеспечения пищи, измерить вес остатков пищи и мышей.
- Повторите шаги 1.6-1.10 в течение всего исследования (например, 16 недель).
2. Контрольная группа по парной кормлению (ПФ)
ПРИМЕЧАНИЕ: Для эксперимента IF, в котором измененное поведение кормления наблюдается в модели мыши (например, гиперфагия у мышей об/об), необходимо иметь группу кормления пара в качестве контроля для правильного независимого от калорий сравнения с IF.
- Для контрольной группы PF, ошеломить график эксперимента так, что такое же количество пищи, потребляемой группой IF предлагается группе PF (Рисунок 2).
- Измерьте количество пищи, потребляемой группой If в течение 2 дней периода кормления.
- Разделите это количество потребляемой пищи в группе IF равномерно на три пропорции и предоставьте его ежедневно группе ПФ в 12:00.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечение равного количества пищи ежедневно имеет решающее значение. В случае мышей с гиперфагией, если пары кормили мышей обеспечены количество пищи меньше, чем их добровольное потребление сразу, они, скорее всего, потребляют все при условии, питание и стать эффективно поститься. Это может предотвратить надлежащее сравнение с МФ лечения мышей и затруднить результат. - Повторите шаги 2.1-2.3 в течение всего периода исследования.
3. Анализ состава тела
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку долгосрочный IF влияет на вес тела у мышей, состав тела может быть измерен на соответствующих циклах (например, каждые 3 или 4 цикла) с помощью анализатора состава тела для количественной оценки жира и мышечной массы в живых, неанестезиированных мышей.
- Включите анализатор композиции тела.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом программы, оставьте машину на, по крайней мере 2-3 ч, чтобы согреться. - Выполнить системный тест на анализаторе состава тела, чтобы проверить его точность измерения. При необходимости откалибруем систему с использованием рапсового масла и проб воды.
- Измерьте массу тела каждой мыши.
- Поместите мышь в небольшой животных цилиндрический держатель.
- Вставьте делимитер, чтобы ограничить физическое движение мыши во время измерения и поместить держатель в анализатор состава тела.
- Запустите программу сканирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ занимает примерно 90-120 с. - После измерения снимите держатель с оборудования и верните мышь в клетку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробный протокол можно найти в предыдущей публикации9.
4. Тесты на толерантность к глюкозе и инсулину
- Для теста на толерантность к глюкозе (GTT) измерьте массу тела и состав тела каждой мыши перед постом и пометьте хвост постоянным маркером для легкой и быстрой индексации.
- Поместите мышей в новые клетки без пищи в 7:00 вечера для ночного поста.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ночной пост является стандартным протоколом, но из-за физиологии мыши (например, увеличение использования глюкозы после длительного поста10,11), короче поста (6 ч) могут быть использованы, как описано для ITT. - После поста 14-16 ч (9:00 утра на следующее утро), измерить вес тела и состав тела каждой мыши и рассчитать количество дозы глюкозы на основе массы тела.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать переоценки непереносимости глюкозы у тучных мышей, мышечная масса, полученная в ходе анализа состава тела, может быть использована для расчета дозировки глюкозы12,13. - Для каждой мыши, вырезать кончик хвоста (0,5-1,0 мм) с помощью чистых хирургических ножниц. После вытирания первой капли крови, сделать свежую каплю крови из хвоста и измерить базовый уровень глюкозы в крови натощак с глюкометра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительная резка хвоста не требуется для каждого измерения глюкозы в крови во время GTT или ITT. Рана может быть освежена, погнав ее марлей, чтобы нарисовать каплю крови. - Обязать мышей интраперитонеальной (т.п.) инъекции глюкозы (1 мг/г массы тела).
ПРИМЕЧАНИЕ: На основе цели эксперимента(например, изучения эффектов инкретина), пероральное введение глюкозы может быть выполнено устные gavage. Протокол для устного GTT (OGTT) можно найти в другом исследовании14. - Измерьте уровень глюкозы в крови из хвоста на 0, 5, 15, 30, 60 и 120 минут после инъекции глюкозы.
- После окончания GTT, обеспечить достаточное количество пищи.
- Для теста на толерантность к инсулину (ITT) удалите пищу в 9:00 утра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Так как GTT и ITT являются стресс-индуцирующих опытом для мышей, которые могут повысить уровень глюкозы в крови и изменить физиологию, рекомендуется выполнять ITT после предоставления по крайней мере 2-3 дней восстановления после эксперимента GTT. - После поста в течение 6 ч (3:00 вечера), измерьте базовый уровень глюкозы в крови из хвоста, как описано в шаге 4.4.
- Обязать мышей i.p. инъекции инсулина (0.65 мЕ/г массы тела).
- Измерьте уровень глюкозы в крови из хвоста на 0, 15, 30, 60, 90 и 120 мин после инсулиновой инъекции.
- После окончания ITT, обеспечить достаточное количество пищи.
5. Непрямая калория
ПРИМЕЧАНИЕ: Энергетический метаболизм обработанных ИФ мышей можно дополнительно оценить с помощью косвенной калорийности в течение одного цикла If. Это позволит измерять потребление кислорода (VO2),производство двуокиси углерода (VCO2),соотношение дыхательного обмена (RER) и тепла (ккал/ч).
- Включите мощность непрямой системы калорий, по крайней мере 2 ч перед запуском эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта система разогрева имеет важное значение для точного измерения. - Подготовка клетки с чистыми постельными принадлежностями, заполнить бутылки с водой, и добавить предварительно взвешенное количество чау в пищу бункеров.
- Проверьте состояние соды Drierite и извести. Если цветной индикатор дририта выглядит розовым, что указывает на то, что дририт впитал большое количество влаги, необходимо заменить или сверху свежим дририритом.
- Калибровать систему с помощью газа с определенным составом (0,5% CO2,20,5% O2).
- Измерьте массу тела и состав тела каждой мыши, которая будет использоваться для нормализации данных VO2 и VCO2.
- Аккуратно поместите одну мышь на клетку.
- Соберите метаболические клетки, поместите их в температурно-контролируемую камеру окружающей среды и подключитесь к газовым линиям и кабелю датчика активности.
- После настройки профиля эксперимента путем добавления соответствующих экспериментальных параметров с помощью программного обеспечения запустите программу для измерения. Целью измерения первого дня является обеспечение периода акклиматизации и измерение базового энергетического метаболизма.
- В 12:00 вечера на следующий день, подвергнуть мышей 24 ч поста, удалив пищу и крошки из бункера и нижней части клетки. При необходимости замените чистыми постельными принадлежностями.
- После 24 ч добавьте предварительно взвешенное количество чау в пищевой бункер для периода кормления.
- Продолжайте измерять в течение следующих 48 ч. Регулярно проверяйте, работает ли система без аппаратного обеспечения или прерывания программного обеспечения.
- После завершения измерения, прекратить программу и вернуть мышей в свои первоначальные клетки. Измерьте количество оставшейся пищи для изучения пищи.
- Подробный протокол для косвенной калорийности можно найти в предыдущем исследовании9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показаны анализы кормления после 24 ч поста и сравнение между 1:1 и 2:1 прерывистым постом. Период голодания в 24 ч привел к снижению массы тела на 10%, что было полностью восстановлено после 2 дней кормления(рисунок 1А). 24 ч постный период индуцированной гиперфагии в течение последующих 2 дней кормления(Рисунок 1B). Тем не менее, сравнение потребление энергии между 1:1 альтернативный день поста и 2:1 прерывистый пост показал, что 1 день периода кормления в 1:1 IF не было достаточно (80%) чтобы компенсировать потерю калорий натощак, по сравнению с состоянием AL(рисунок 1C). С другой стороны, 99% энергии было полностью компенсировано в течение 2 дней кормления в 2:1 IF. Этот режим позволяет изучить эффекты изокалорийных ЕСЛИ, которые не зависят от разницы калорий.
Рисунок 2 иллюстрирует схематическую временную шкалу для изокалорийных режимов 2:1 IF и PF. Чтобы свести к минимуму различия в потребление калорий, наблюдение, сделанное в альтернативный день поста6,7, этот протокол установил новый режим ЕСЛИ, состоящий из 2 дней кормления и 1 день поста периоды (2:1 IF)8, что позволило изучение воздействия на здоровье изокалорийных IF у диких мышей типа. Тем не менее, в об / об мышей, которые выставлены гиперфагическое поведение, 2:1 IF-обработанных об / об мышей показали 21% калорий ногой сокращения, по сравнению с об / об AL мышей15. В виду того что это предотвращает правильное калорийно-независимое сравнение, группа управления PF которая поддерживала такое же потребление калории как IF-обработанные ob/ob мыши были использованы. Короче говоря, общее количество пищи, потребляемой в течение 2 дней кормления в 2:1 IF мышей были разделены поровну на три ежедневных количества, а затем предоставлены группы ПФ.
Для всестороннего обзора метаболических исходов 2:1 IF, мы сравнили эффекты AL, IF, и PF в весе тела, потребление пищи и состав тела в диком типе и ob/ob мышей при нормальной диете (ND) и HFD. По сравнению с AL, ЕСЛИ лечение привело к снижению веса тела увеличение ND-кормили и HFD кормили WT мышей без значительных различий в пище(Рисунок 3A,B). Анализ состава тела показал, что ЕСЛИ специально снижение жировой массы без изменений в мышечной массы у мышей дикого типа(рисунок 3C). Вполне возможно, что несколько, хотя и не значительно, снижение накопленного энергопотребление в течение 16 недель программы IF может привести к снижению веса тела животных, если. Тем не менее, эксперимент IF с режимом кормления пары подтвердил, что снижение веса тела по IF не было связано с измененным потреблением энергии(рисунок 3D,E). В отличие от диких животных, вес тела ob/ob мышей подвергается IF (Ob-IF) был ниже, чем у мышей Ob-AL(рисунок 3G). Это связано с гиперфагией (чрезмерное употребление) об/об мышей, что приводит к слегка более высокой (21%) потребление пищи у а.л. мышей, по сравнению с IF-обработанных животных(Рисунок 3H). Поэтому для специального изучения метаболического эффекта If в калорийно-независимом порядке была использована группа контроля парного кормления. Однако, в отличие от диких мышей8, Ob-PF мышей были неразличимы по сравнению с Ob-IF мышей в весе тела и состав тела15 (Рисунок 3I). Эти результаты показывают, что лептин, вероятно, замешан в изокалории IF-опосредованного снижения массы тела у мышей.
Основным метаболическим преимуществом, предоставленным изокалорией, ЕСЛИ является улучшение гомеостаза глюкозы. Как показано на рисунке 4A,B,C,D, HFD-IF мышей выставлены значительное улучшение в гомеостазе глюкозы. GTT показал, что уровень глюкозы в крови более быстро очищается у машей, обработанных МФ, в то время как ITT выявил более высокую чувствительность к инсулину у мышей HFD-IF, по сравнению с мышами HFD-AL или HFD-PF. Неожиданно, несмотря на неудачи в IF-опосредованного снижения веса, Ob-IF животных выставлены значительно улучшилось обработки глюкозы с меньшими глюкозы экскурсии в GTT, по сравнению с Ob-PF мышей(рисунок 4E), в то время как чувствительность инсулина была неразличима между Ob-IF и Ob-PF мышей(рисунок 4F). Это улучшение гомеостаза глюкозы у мышей Об-IF, вероятно, опосредовано повышением уровня плазмы глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1) и глюкозостимулированной секреции инсулина (данные не показаны)15. В целом, используя этот протокол 2:1 IF и надлежащий калорийно-независимый контроль PF, мы показали метаболические преимущества изокалорийных IF у диких типа и об/об мышей.
Одним из метаболических эффектов IF у мышей дикого типа является более высокое общее потребление O2, используемое для оценки затрат энергии(рисунок 5A,B). Это повышение в O2 потребления было обнаружено только в период кормления у мышей, если мышей, но не постный период, по сравнению с AL мышей. Увеличение расходов на энергию было в значительной степени опосредовано жировой термогенез, такие как подрумянивание белых жировые ткани и активации коричневой жировой ткани (данные не показаны)8,16. IF-опосредованный термогенез adipose предположительно объяснил бы как дикие-тип мышей подвергли к IF exhibited уменьшенное увеличение веса тела без разницы в еде в еде, сравненных к мышам AL. С другой стороны, ЕСЛИ не удалось увеличить потребление O2 в ob/ob мышей(рисунок 5C-D), и даже привело к сокращению расходов на энергию в период поста. Последовательно, IF-индуцированный термогенез жирового утилизировать в ob/ob мышах (данные не показаны). Эти данные свидетельствуют о возможном ограничении ИФ, поскольку он может работать по-разному для лиц с различным генетическим и экологическим происхождением.
Рисунок 1: Анализ кормления после 24 ч поста и сравнение между 1:1 и 2:1 IF. (A) Ежедневные изменения массы тела мышей до и после 24 ч поста (n No 10). (B) Ежедневный потребление энергии до и после 24 ч поста (n - 5 клеток; 2 мышей на клетку). (C) Сравнение потребление энергии между альтернативным днем поста (т.е., 1 день кормления / 1 день поста, 1:1 IF) и 2:1 прерывистый пост (т.е. 2 дня кормления / 1 день поста). В режиме 1:1 IF, только 80% от потребление пищи было компенсировано в течение последующего 1 дня кормления по сравнению с потреблением пищи в течение 2 дней кормления. С другой стороны, 99% энергии было достигнуто, когда 2 дней кормления было дано, по сравнению с тем, что в течение 3 дней кормления. Данные выражаются как средние - SEM. Эта цифра была воспроизведена с разрешения Ким и др.8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Схематическая иллюстрация изокалорийного режима 2:1 IF. Для контроля ПФ, количество пищи, потребляемой в течение 2 дней кормления маминых мышей, обработанных ЕСЛИ, делится на три равные части, которые затем ежедневно предоставляются pf мышам в течение следующего цикла. AL и ad libitum; PF - парное кормление. Часть этой цифры была воспроизведена с разрешения Ким и др.8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Сравнение AL, IF и ПФ воздействия на вес тела, потребление пищи, и состав тела между диким типом и об / об мышей. (A,B, C) Вес тела, потребление пищи, и состав тела в AL или IF-обработанных диких мышей типа при нормальной диете (ND) или диеты с высоким содержанием жира (HFD) в течение 16 недель режима IF. Данные выражаются как средние - SEM. (ND-AL: n No 7; НД-ИФ: n No 8; HFD-AL: n No 7; и HFD-IF: n No 8); одно- или двустороннее ANOVA со студенческим-Ньюман-Кеулс пост-специальный анализ; Злт; 0,01 против. HFD-AL. (D, E,F) Вес тела, потребление пищи, и состав тела в PF против IF мышей кормили с высоким содержанием жира диеты (HFD) в течение 12 недель режима IF. (PF: n No 6 и IF: n no 6); двуххвостый неспаренный студенческаяt-test; Злт; 0,05 против. HFD-PF; NS - не существенно. (G,H,I) Вес тела, потребление пищи, и состав тела в AL, PF, или IF-обработанных ob/ob мышей кормили с нормальным чау(Ob-AL: n No 4; Об-ПФ: n No 7; Ob-IF: n no 6); Об-АЛ против. Об-ПФ: пзлт; 0,05; Об-АЛ против. Об-ИФ: Эт этт; 0,05; Об-ПФ против. Об-ИФ. Панели A-F были воспроизведены с разрешения Ким и др.8. Панели G-I были воспроизведены с разрешения Ким и др.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Улучшение гомеостаза глюкозы, если у диких типа и об / об мышей. (A, B) Интраперитонеальные GTT и ITT в HFD-AL и HFD-IF диких мышей типа после 16 недель режима IF. Всет показывает область под кривой (AUC); Злт; 0,05 против HFD-AL. (C,D) GTT и ITT в HFD-PF по сравнению с HFD-IF диких мышей типа после 12 недель режима IF. Всет показывает AUC; Злт; 0,05 против HFD-PF. (E,F) GTT и ITT в Об-IF по сравнению с Ob-PF мышей после 16 недель режима IF. Всет показывает AUC (Злит; 0,05 против. Ob-PF). Панели A-D были воспроизведены с разрешения Ким и др.8. Панели E и F были воспроизведены с разрешения Ким и др.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Анализ расходов на энергию в обработанных if диких типа и об /ob мышей. (A) Следы потребления O2 в течение одного цикла 2:1 IF у мышей дикого типа (т.е., 1 день поста с последующим 2 днями кормления). (B) Среднее потребление O2 в час во время голодания, кормления, и один цикл 2:1 IF. Данные выражаются в виде среднего значения - SEM (HFD-AL: n No 6; hFD-IF: n no 12); Злт; 0,05 против. HFD-AL. (C) O2 потребление следы об / об мышей в течение одного цикла 2:1 IF. (D) Среднее потребление O2 в час во время голодания, кормления, и один цикл 2:1 IF (Ob-PF: n No 7; Ob-IF: n no 6); Злт; 0,05 против. Ob-PF. Панель B была воспроизведена с разрешения Ким и др.8. Панели C и D были воспроизведены с разрешения Ким и др.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хорошо задокументировано, что ЕСЛИ обеспечивает благотворное воздействие на здоровье различных заболеваний у людей и животных8,15,16,17,18,19. Его основные механизмы, такие как аутофагия и микрофлора кишечника, недавно были выяснены. Представленный протокол описывает изокалорийный режим 2:1 IF у мышей для исследования калорий-независимых метаболических преимуществ IF против диетического ожирения и связанной с этим метаболической дисфункции. В отличие от альтернативного дня поста (1:1 IF) протокол, что приводит к сокращению общего потребление калорий6,7, обеспечивая еще 1 день кормления в 2:1 IF режим позволяет обслуживание изокалорийного состояния в диких мышей типа.
Кроме того, по сравнению с 1:1 IF, 2:1 IF режим может уменьшить возможные постопового опосредованного стресса или оцепенения у мышей20, а также сопоставимы с популярным диетическим методом, 5:2 диета2. Хотя его последствия не были протестированы, режим может быть изменен путем предоставления дополнительных дней кормления (например, 3:1 или 4:1 IF). Кроме того, этот протокол, представленный может быть легко скорректирован анатицированной в почасовой шкале, называемой ограниченной по времени кормлением (TRF), в котором доступ к пище ограничен 8 ч в день во время активной фазы21, который, как известно, достигает изокалорийного режима диеты и обеспечивает метаболические преимущества против HFD-индуцированного ожирения и диабета19,21,22.
Как показано в анализе кормления(рисунок 1В), гиперфагическое поведение сразу после 24 ч поста постепенно уменьшается у мышей дикого типа, что позволяет изокалорийным IF. Тем не менее, это изокалорийное состояние не может быть достигнуто в об / об мышей, так как они не имеют лептина сигнализации опосредованного сытости и энергетического метаболизма, что приводит к непрерывной гиперфагической фенотип23,24. Поэтому, прежде чем выполнять эксперимент IF, рекомендуется изучить поведение кормления мыши модели интереса. Для изучения влияния IF с помощью гиперфагической мышимодели (например, ob/ob, db/db, Sim1q/-, MC4R-/-24,25,26, как описано в этом протоколе, занятость пары кормления группы в качестве изокалорийного экспериментального контроля имеет важное значение для проведения надлежащих сравнений. Он также требует тщательного планирования при тестировании мыши модели с гипофагическим фенотипом (например, меланин-содержащий гормон KO мышей)27.
Важным фактором, который следует учитывать для исследований IF, является температура жилья, которая влияет на различные физиологические и поведенческие параметры у мышей. В частности, холодное воздействие (4-6 градусов по Цельсию) значительно увеличивает потребление энергии для поддержания температуры тела ядра28. В отличие от этого, в термонейтральных условиях (30 градусов по Цельсию), при которых теплоусиление уравновешивается потерей тепла, снижение потребления пищи заметно снижаетсяна 8. Что касается метаболических исходов, то холодное воздействие вызывает жировой термогенез, который затрудняется термонейтральным состоянием. Таким образом, ожидается, что температура жилья влияет на метаболические фенотипы IF и соответствующее соотношение кормления:fasting для достижения изокалорийных IF.
Действительно, ранее было продемонстрировано, что изокалорийные 2:1 IF может быть достигнуто в термонейтральных условиях, что приводит к улучшению метаболического здоровья в диете индуцированного ожирения и метаболической дисфункции без различий в пище между IF и AL групп8. Тем не менее, изокалорийные ЕСЛИ не могут быть достижимы при соотношении 2:1 при низких температурах, потому что мыши при холодном воздействии покажут гиперфагический фенотип, что приводит к недокормлению в группе IF. Поскольку холодное воздействие и ЕСЛИ отображают сопоставимые метаболические исходы и механизмы (т.е. жировой термогенез и улучшенный гомеостаз глюкозы), которые помогают бороться с ожирением, есть заинтересованность в объединении этих двух вмешательств, чтобы максимизировать метаболическое воздействие. Поэтому, чтобы правильно проверить это, выполняя анализ кормления перед запуском эксперимента IF и используя паровую группу управления кормления под холодным воздействием рекомендуется.
Другие факторы, которые потенциально могут повлиять на результаты исследований, которые могут быть включены в плотность жилья. Подобно предыдущему исследованию, которое показало снижение потребления пищи в более плотно размещены мышей29, мышей из клетки из пяти потребляется значительно меньше пищи, чем те, из клетки из двух (неопубликованные результаты). Кроме того, было продемонстрировано, что плотность жилья значительно влияет на температуру окружающей среды, так как температура внутри клетки жилья пять мышей на 1-2 градуса выше, чем те, жилье от одного до двух мышей30. Хотя это исследование пришло к выводу, что плотность жилья не оказала существенного влияния на потребление пищи (рассматривается в течение 5 недель), в исследовании IF продолжительностью 12-16 недель, температура внутри клетки, пострадавших от плотности жилья, все еще может влиять на потребление пищи и метаболизм энергии. Вместе, важно держать такое же количество мышей, размещенных в клетке и свести к минимуму изменение числа на клетку в течение исследования.
Таким образом, этот отчет показывает простой и воспроизводимый протокол для тестирования изокалорийных 2:1 IF у мышей. Хотя текущее исследование сосредоточено на метаболические преимущества IF в диете индуцированной ожирения и метаболической дисфункции, он может быть легко адаптирован для изучения защитных и терапевтических эффектов изокалорийных IF против других условий, таких как сердечно-сосудистые и неврологических заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
K.-H.K была поддержана Фондом сердца и инсульта Канады Грант-в-помощи (G-18-0022213), J. P. Bickell Фонд и Университет Оттавы Институт сердца Стартовый фонд; H.-K.S. была поддержана грантами от Канадских институтов исследований в области здравоохранения (PJT-162083), Рубен и Хелен Деннис стипендиат и Sun Life Финансовый Новый следователь премии за диабет исследований от Бантинг и лучший диабет центр (BBDC) и естественных наук и Совет инженерных исследований (NSERC) Канады (RGPIN-2016-06610). R.Y.K. была поддержана стипендией от Фонда исследований кардиологии Университета Оттавы. J.H.L. была поддержана докторской стипендией NSERC и стипендией Онтарио. Y.O. была поддержана UOHI наделенной высшей наградой и стипендией королевы Елизаветы II в области науки и техники.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Comprehensive Lab Animal Monitoring System (CLAMS) | Columbus Instruments | Indirect calorimeter | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 | For GTT |
| EchoMRI 3-in-1 | EchoMRI | EchoMRI 3-in-1 | Body composition analysis |
| Glucometer and strips | Bayer | Contour NEXT | These are for GTT and ITT experiments |
| High Fat Diet (45% Kcal% fat) | Research Diets Inc. | #D12451 | 3.3 Kcal/g |
| High Fat Diet (60% Kcal% fat) | Research Diets Inc. | #D12452 | 4.73 Kcal/g |
| Insulin | El Lilly | Humulin R | For ITT |
| Mouse Strain: B6.Cg-Lepob/J | The Jackson Laboratory | #000632 | Ob/Ob mouse |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | #000664 | |
| Normal chow (17% Kcal% fat) | Harlan | #2918 | |
| Scale | Mettler Toledo | Body weight and food intake measurement |
References
- Gill, S., Panda, S. A Smartphone App Reveals Erratic Diurnal Eating Patterns in Humans that Can Be Modulated for Health Benefits. Cell Metabolism. 22 (5), 789-798 (2015).
- Longo, V. D., Panda, S. Fasting, Circadian Rhythms, and Time-Restricted Feeding in Healthy Lifespan. Cell Metabolism. 23 (6), 1048-1059 (2016).
- Longo, V. D., Mattson, M. P. Fasting: molecular mechanisms and clinical applications. Cell Metabolism. 19 (2), 181-192 (2014).
- Patterson, R. E., et al. Intermittent Fasting and Human Metabolic Health. Journal of the Academy of Nutrition and Dietetics. 115 (8), 1203-1212 (2015).
- Fontana, L., Partridge, L. Promoting health and longevity through diet: from model organisms to humans. Cell. 161 (1), 106-118 (2015).
- Boutant, M., et al. SIRT1 Gain of Function Does Not Mimic or Enhance the Adaptations to Intermittent Fasting. Cell Reports. 14 (9), 2068-2075 (2016).
- Gotthardt, J. D., et al. Intermittent Fasting Promotes Fat Loss With Lean Mass Retention, Increased Hypothalamic Norepinephrine Content, and Increased Neuropeptide Y Gene Expression in Diet-Induced Obese Male Mice. Endocrinology. 157 (2), 679-691 (2016).
- Kim, K. H., et al. Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage. Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).
- Lancaster, G. I., Henstridge, D. C. Body Composition and Metabolic Caging Analysis in High Fat Fed Mice. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Disease Models & Mechanisms. 3 (9-10), 525-534 (2010).
- Heijboer, A. C., et al. Sixteen h of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. Journal of Lipid Research. 46 (3), 582-588 (2005).
- McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 297 (4), 849-855 (2009).
- Jorgensen, M. S., Tornqvist, K. S., Hvid, H. Calculation of Glucose Dose for Intraperitoneal Glucose Tolerance Tests in Lean and Obese Mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 95-97 (2017).
- Nagy, C., Einwallner, E. Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT). Journal of Visualized Experiments. (131), 56672 (2018).
- Kim, Y. H., et al. Thermogenesis-independent metabolic benefits conferred by isocaloric intermittent fasting in ob/ob mice. Scientific Reports. 9 (1), 2479 (2019).
- Li, G., et al. Intermittent Fasting Promotes White Adipose Browning and Decreases Obesity by Shaping the Gut Microbiota. Cell Metabolism. 26 (4), 672-685 (2017).
- Mitchell, S. J., et al. Daily Fasting Improves Health and Survival in Male Mice Independent of Diet Composition and Calories. Cell Metabolism. 29 (1), 221-228 (2019).
- Cignarella, F., et al. Intermittent Fasting Confers Protection in CNS Autoimmunity by Altering the Gut Microbiota. Cell Metabolism. 27 (6), 1222-1235 (2018).
- Martinez-Lopez, N., et al. System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy. Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).
- Lo Martire, V., et al. Changes in blood glucose as a function of body temperature in laboratory mice: implications for daily torpor. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 315 (4), 662-670 (2018).
- Chaix, A., Zarrinpar, A., Miu, P., Panda, S. Time-restricted feeding is a preventative and therapeutic intervention against diverse nutritional challenges. Cell Metabolism. 20 (6), 991-1005 (2014).
- Chaix, A., Lin, T., Le, H. D., Chang, M. W., Panda, S. Time-Restricted Feeding Prevents Obesity and Metabolic Syndrome in Mice Lacking a Circadian Clock. Cell Metabolism. 29 (2), 303-319 (2019).
- Wang, B., Chandrasekera, P. C., Pippin, J. J. Leptin- and leptin receptor-deficient rodent models: relevance for human type 2 diabetes. Current Diabetes Reviews. 10 (2), 131-145 (2014).
- Pan, W. W., Myers, M. G. Leptin and the maintenance of elevated body weight. Nature Reviews: Neuroscience. 19 (2), 95-105 (2018).
- Jackson, D. S., Ramachandrappa, S., Clark, A. J., Chan, L. F. Melanocortin receptor accessory proteins in adrenal disease and obesity. Frontiers in Neuroscience. 9, 213 (2015).
- Tolson, K. P., et al. Postnatal Sim1 deficiency causes hyperphagic obesity and reduced Mc4r and oxytocin expression. Journal of Neuroscience. 30 (10), 3803-3812 (2010).
- Shimada, M., Tritos, N. A., Lowell, B. B., Flier, J. S., Maratos-Flier, E. Mice lacking melanin-concentrating hormone are hypophagic and lean. Nature. 396 (6712), 670-674 (1998).
- Reitman, M. L. Of mice and men - environmental temperature, body temperature, and treatment of obesity. FEBS Letters. 592 (12), 2098-2107 (2018).
- Chvedoff, M., Clarke, M. R., Irisarri, E., Faccini, J. M., Monro, A. M. Effects of housing conditions on food intake, body weight and spontaneous lesions in mice. A review of the literature and results of an 18-month study. Food and Cosmetics Toxicology. 18 (5), 517-522 (1980).
- Toth, L. A., Trammell, R. A., Ilsley-Woods, M. Interactions Between Housing Density and Ambient Temperature in the Cage Environment: Effects on Mouse Physiology and Behavior. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 708-717 (2015).
