Summary
Het huidige artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor isocaloric 2:1 intermitterende vasten te beschermen en te behandelen tegen obesitas en verminderde glucose metabolisme in wild-type en ob/ob muizen.
Abstract
Intermitterende vasten (als), een dieet interventie met periodieke energiebeperking, is overwogen om talrijke voordelen te bieden en metabole afwijkingen tegen te gaan. Tot nu toe zijn er verschillende soorten IF-modellen met wisselende duur van vasten-en voeder perioden gedocumenteerd. Het interpreteren van de uitkomsten is echter een uitdaging, omdat veel van deze modellen betrekking hebben op multifactoriële bijdragen uit zowel tijd-als calorie beperkings strategieën. Bijvoorbeeld, de alternatieve dag vasten model, vaak gebruikt als een knaagdier als regime, kan leiden tot ondervoeding, suggereren dat gezondheidsvoordelen van deze interventie waarschijnlijk worden bemiddeld via zowel calorie beperking en vasten-hervoederen cycli. Onlangs, het is met succes aangetoond dat 2:1 als, bestaande uit 1 dag van vasten gevolgd door 2 dagen van voeding, kan bescherming bieden tegen dieet-geïnduceerde obesitas en metabole verbeteringen zonder een vermindering van de totale calorie-inname. Hier gepresenteerd is een protocol van deze isocaloric 2:1 als interventie bij muizen. Ook beschreven is een paar-Feeding (PF) protocol vereist voor het onderzoeken van een muismodel met veranderde eetgedrag, zoals hyperphagia. Met behulp van de 2:1 als regime, het is aangetoond dat isocaloric als leidt tot verminderde lichaamsgewicht aanwinst, verbeterde glucose homeostase, en verhoogde energie-uitgaven. Dus, dit regime kan nuttig zijn om te onderzoeken van de gevolgen van de gezondheid van als op verschillende ziekte aandoeningen.
Introduction
Moderne levensstijl wordt geassocieerd met een langere dagelijkse voedselinname tijd en kortere vasten perioden1. Dit draagt bij aan de huidige wereldwijde obesitasepidemie, met metabole nadelen gezien bij mensen. Vasten is beoefend in de hele menselijke geschiedenis, en de diverse gezondheidsvoordelen omvatten langdurige levensduur, verminderde oxidatieve schade, en geoptimaliseerde energie homeostase2,3. Onder verschillende manieren om te oefenen vasten, periodieke energie deprivatie, genoemd intermitterende vasten (als), is een populaire voedingsmethode die op grote schaal wordt beoefend door de algemene bevolking als gevolg van de eenvoudige en eenvoudige regime. Recente studies in preklinisch en klinische modellen hebben aangetoond dat als kan bieden gezondheidsvoordelen vergelijkbaar met langdurig vasten en calorie beperking, suggereren dat als kan een potentiële therapeutische strategie voor obesitas en metabole ziekten2,3,4,5.
Als regimes variëren in termen van vasten duur en frequentie. Afwisselende dag vasten (dat wil zeggen, 1 dag voeden/1 dag vasten; 1:1 als) is de meest gebruikte als regime bij knaagdieren te bestuderen van de gunstige gezondheidseffecten op obesitas, cardiovasculaire aandoeningen, neurodegeneratieve ziekten, etc.2,3. Echter, zoals blijkt uit voorgaande studies6,7, en verder mechanistisch bevestigd in onze energie inname analyse8, 1:1 als resulteert in ondervoeding (~ 80%) vanwege het gebrek aan voldoende voedertijd om energieverlies te compenseren. Dit maakt het onduidelijk of de gezondheidsvoordelen die worden verleend door 1:1 als ze worden gemedieerd door calorie beperking of wijziging van eetpatronen. Daarom is er een nieuw IF-regime ontwikkeld en hier getoond, bestaande uit een 2-daagse voeding/1 dag vasten (2:1 IF) patroon, dat muizen voldoende tijd geeft om voedselinname te compenseren (~ 99%) en lichaamsgewicht. Deze muizen worden vervolgens vergeleken met een ad libitum (al) groep. Dit regime maakt onderzoek van de effecten van isocaloric als bij afwezigheid van calorie reductie in wild-type muizen.
In tegenstelling, in een muismodel dat veranderde voedingsgedrag vertoont, kan AL voeden niet een goede controle voorwaarde zijn om de effecten van 2:1 te vergelijken en te onderzoeken. Bijvoorbeeld, aangezien ob/ob muizen (een veelgebruikte genetische model voor obesitas) vertonen hyperphagia als gevolg van het gebrek aan leptine regulering van de eetlust en verzadiging, die met 2:1 als vertonen ~ 20% verminderde calorie-inname in vergelijking met ob/ob muizen met al voeden. Om de effecten van IF in ob/ob -muizen naar behoren te onderzoeken en te vergelijken, moet dus een paar-voedende groep als geschikte controle worden gebruikt.
Over het algemeen wordt een uitgebreid protocol verstrekt om isocaloric 2:1 uit te voeren, met inbegrip van het gebruik van een controle met twee voer. Het is verder aangetoond dat isocaloric 2:1 als beschermt muizen tegen hoge vet dieet-geïnduceerde obesitas en/of metabole disfunctie in zowel wild-type en ob/ob muizen. Dit protocol kan worden gebruikt om de heilzame gezondheidseffecten van 2:1 te onderzoeken als er verschillende pathologische aandoeningen zijn, waaronder neurologische aandoeningen, hart-en vaatziekten en kanker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden en protocollen zijn hier goedgekeurd door Dierenzorg commissies in de Dierenzorg en veterinaire dienst (ACV'S) van de Universiteit van Ottawa en het centrum voor Fenogenomics (TCP) en voldoen aan de normen van de Canadese Raad voor dierverzorging. Hierbij moet worden opgemerkt dat alle hier beschreven procedures moeten worden uitgevoerd onder institutionele en overheids goedkeuringen, alsmede door personeel dat technisch bekwaam is. Alle muizen werden ondergebracht in standaard geventileerde kooien in kamers met temperatuur-en vochtigheidscontrole met 12 h/12 h licht/donker cycli (21 – 22 °C, 30% – 60% vochtigheid voor normale huisvesting) en vrije toegang tot water. Male C57BL/6J en ob/ob muizen werden verkregen uit het Jackson laboratorium.
1.2:1 isocaloric als regime
- Voor mager en dieet-geïnduceerde obesitas muismodellen, bereiden ofwel een normaal dieet (17% vet, ND) of vetrijke voeding (45% vet, HFD).
Opmerking: 60% Hfd kan worden gebruikt voor het opwekken van ernstige dieet-geïnduceerde obesitas; Toch is het vanwege de zachtheid van de voedsel pellet relatief moeilijk om de dagelijkse voedselinname nauwkeurig te meten. Een geautomatiseerd continu meetsysteem kan de veelzijdigheid voor meerdere soorten diëten verbeteren. - Meet Baseline lichaamsgewicht en lichaamssamenstelling van elke muis op een leeftijd van 7 weken met behulp van respectievelijk een schaal en EchoMRI.
Opmerking: Zie rubriek 3 voor de meting van de lichaamssamenstelling. - Op basis van lichaamsgewicht en lichaamssamenstelling resultaten, willekeurig en gelijkmatig verdelen 7 week-oude mannelijke C57BL/6J muizen in twee groepen: ad libitum (AL) en intermitterende vasten (IF) groepen.
- Plaats twee tot drie muizen per kooi en zorg voor vrije toegang tot drinkwater.
Opmerking: Het aantal muizen per kooi kan het voedselinname gedrag beïnvloeden. Het wordt aanbevolen om tijdens de studie een gelijk aantal muizen per kooi in alle groepen te behouden. - Geef 1 week acclimatie aan de nieuwe kooi omgeving en voeding voordat u begint met het IF-regime.
- Vastenperiode: Verplaats muizen naar een schone kooi met schoon beddengoed op 12:00 PM. Voeg geen voedsel toe voor de IF-groep, terwijl een gewogen hoeveelheid voedsel wordt verstrekt aan de AL-groep.
Opmerking: Voor elke vasten cyclus is het belangrijk om kooien te veranderen voor zowel AL als groepen om ervoor te zorgen dat beide groepen worden blootgesteld aan dezelfde hoeveelheid verwerkingstijd. - Meet na 24 uur het gewicht van muizen in zowel groepen als overgebleven levensmiddelen in AL kooien.
Opmerking: Zorg ervoor dat u het gewicht van voedsel kruimels op de voedsel container en bodem van de kooi opneemt, vooral bij het gebruik van HFD, omdat muizen vaak kleine pellets of fragmenten van voedsel uit de trechter verwijderen en ze in de buurt van nest-sites houden. De gemiddelde energie-inname per muis aan het einde van elke 2:1 cyclus (3 dagen) is ongeveer 35 kcal, equivalent aan ~ 10 g voor een normaal dieet (3,3 kcal/g) en ~ 7 g voor HFD (4,73 kcal/g). - Voeder periode: zorg voor een gewogen hoeveelheid voedsel bij 12:00 PM voor zowel de AL-als de IF-groep.
- Na 48 h van het verstrekken van het voedsel, het gewicht van overgebleven voedsel en muizen te meten.
- Herhaal stap 1.6 – 1.10 voor de duur van de studie (bijv. 16 weken).
2. controlegroep voor paar voeding (PF)
Opmerking: Voor een IF-experiment waarbij gewijzigd voedingsgedrag wordt waargenomen in een muismodel (bijv. hyperfagie in ob/ob -muizen), is het noodzakelijk om een paar-voedende groep te hebben als een controle voor een goede calorie-onafhankelijke vergelijking met if.
- Voor de PF controlegroep, het experiment schema zodanig dat dezelfde hoeveelheid voedsel verbruikt door de groep als wordt aangeboden aan de PF-groep (Figuur 2).
- Meet de hoeveelheid voedsel die door de IF-groep wordt verbruikt gedurende 2 dagen na het opnieuw voederen.
- Verdeel deze hoeveelheid verbruikt voedsel in de IF-groep gelijkmatig in drie verhoudingen en geef deze dagelijks aan de PF-groep op 12:00 PM.
Opmerking: Het verstrekken van een gelijke hoeveelheid voedsel dagelijks is van cruciaal belang. In het geval van muizen met hyperfagie, als de met een paar gevoede muizen in een keer worden voorzien van een hoeveelheid voedsel dat minder is dan hun vrijwillige consumptie, zullen ze waarschijnlijk alle geleverde levensmiddelen consumeren en effectief worden vastgevaald. Dit kan dan voorkomen dat een goede vergelijking met als-behandelde muizen en het resultaat te vinden. - Herhaal stap 2.1 – 2.3 voor de duur van de studie.
3. analyse van de lichaamssamenstelling
Opmerking: Aangezien op lange termijn het lichaamsgewicht bij muizen beïnvloedt, kan de lichaamssamenstelling worden gemeten op geschikte cycli (bijv. elke 3 of 4 cycli) met behulp van een analyse van de lichaamssamenstelling om vet en magere massa in levende, niet-anesthetized muizen te kwantificeren.
- Zet de Body Composition Analyzer aan.
Opmerking: Voor het starten van het programma, laat de machine op ten minste 2 – 3 h om op te warmen. - Voer een systeem test uit op de Body Composition Analyzer om de meetnauwkeurigheid te testen. Kalibreer indien nodig het systeem met behulp van koolzaadolie en watermonsters.
- Meet het lichaamsgewicht van elke muis.
- Plaats de muis in een kleine dieren cilindrisch houder.
- Voeg een scheidingsteken in om de fysieke beweging van de muis tijdens de meting te beperken en plaats de houder in de Body Composition Analyzer.
- Voer het scanprogramma uit.
Opmerking: Het duurt ongeveer 90 – 120 s om te analyseren. - Na het meten, verwijder de houder van de apparatuur en breng de muis terug naar de kooi.
Opmerking: Een gedetailleerder protocol kan worden gevonden in een vorige publicatie9.
4. glucose en insuline tolerantie tests
- Voor glucosetolerantie test (GTT), meet het lichaamsgewicht en de lichaamssamenstelling van elke muis alvorens te onderwerpen aan vasten en markeer de staart met een permanente marker voor eenvoudige en snelle indexering.
- Plaats muizen in nieuwe kooien zonder voedsel om 7:00 uur 's nachts te vasten.
Opmerking: 'S nachts vasten is het standaardprotocol, maar als gevolg van muis fysiologie (bijv. verhoogd glucose gebruik na langdurig vasten10,11), kan korter vasten (~ 6 h) worden gebruikt zoals beschreven voor ITT. - Na vasten 14 – 16 h (9:00 AM in de volgende ochtend), meten lichaamsgewicht en lichaamssamenstelling van elke muis en bereken de hoeveelheid glucose dosering op basis van lichaamsgewicht.
Opmerking: Om te voorkomen dat een overschatting van glucose-intolerantie in zwaarlijvige muizen, vetvrije massa verkregen uit de analyse van de lichaamssamenstelling kan worden gebruikt voor het berekenen van de glucose dosering12,13. - Snijd voor elke muis de punt van de staart (0,5 – 1,0 mm) met een schone chirurgische schaar. Na het afvegen van de eerste druppel bloed, trek een frisse druppel bloed uit de staart en meet Baseline vasten bloedglucose niveau met de Glucometer.
Opmerking: Extra staart zagen is niet vereist voor elke bloedglucosemeting tijdens GTT of ITT. De wond kan worden opgefrisser door het met gaas te schuren om een druppel bloed te tekenen. - Onderworpen muizen aan een intraperitoneale (i.p.) injectie van glucose (1 mg/g lichaamsgewicht).
Opmerking: Op basis van het doel van een experiment (bijv. het onderzoeken van incretineeffecten), kan orale toediening van glucose worden uitgevoerd via een orale maagsonde. Het protocol voor Oral GTT (OGTT) kan gevonden worden in een andere studie14. - Meet de bloedglucose van de staart op 0, 5, 15, 30, 60 en 120 min na glucose injectie.
- Zorg na het afronden van de GTT voor een voldoende hoeveelheid voedsel.
- Voor de insuline tolerantie test (ITT), verwijder voedsel op 9:00 AM.
Opmerking: Aangezien zowel GTT als ITT stress-inducerende ervaringen hebben voor muizen die de bloedglucosespiegels kunnen verhogen en de Fysiologie veranderen, is het aanbevolen om ITT uit te voeren na het verstrekken van ten minste 2 – 3 dagen van herstel na het GTT-experiment. - Na vasten voor 6 h (3:00 PM), meet Baseline bloedglucose van de staart zoals beschreven in stap 4,4.
- Subject muizen tot i.p. injectie van insuline (0,65 mU/g lichaamsgewicht).
- Meet de bloedglucose van de staart op 0, 15, 30, 60, 90 en 120 min post-insuline injectie.
- Zorg na het afronden van ITT voor een voldoende hoeveelheid voedsel.
5. indirecte calorimetrie
Opmerking: Het energiemetabolisme van als-behandelde muizen kan verder worden geëvalueerd via indirecte calorimetrie over een enkele cyclus van IF. Dit zal het zuurstofverbruik meten (VO2), koolstofdioxide productie (VCO2), respiratoire WISSELINGS verhouding (RER) en warmte (kcal/h).
- Schakel de kracht van het indirecte meter systeem ten minste 2 uur in voordat u het experiment uitvoert.
Opmerking: Dit systeem warming-up is belangrijk voor nauwkeurige meting. - Maak kooien met schoon beddengoed, vul waterflessen en voeg de vooraf gewogen hoeveelheid Chow toe aan de voedsel hoppers.
- Controleer de toestand van de Drieriet-en limoen soda. Als er een kleur indicator van de Drieriet roze is, wat aangeeft dat de Drieriet een hoge hoeveelheid vocht heeft geabsorbeerd, is het noodzakelijk om te vervangen of boven met verse Drieriet.
- Kalibreer het systeem met behulp van een gas met de specifieke samenstelling (0,5% CO2, 20,5% O2).
- Meet het lichaamsgewicht en de lichaamssamenstelling van elke muis, die zal worden gebruikt om VO2 -en VCO2 -gegevens te normaliseren.
- Plaats één muis per kooi zachtjes.
- Monteer stofwisselings kooien, plaats ze in de omgevings kamer met temperatuurregeling en maak verbinding met gasleidingen en activiteit sensorkabel.
- Nadat u het experiment profiel hebt ingesteld door de juiste experimentele parameters toe te voegen met de software, voert u het programma uit voor de meting. Het doel van de meting van de eerste dag is om een periode van acclimatisering te bieden en de uitgangswaarde van het energiemetabolisme te meten.
- Bij 12:00 PM de volgende dag, onderwerp muizen tot 24 h van vasten door het verwijderen van voedsel en kruimels uit de trechter en bodem van de kooi. Vervang indien nodig door schoon beddengoed.
- Voeg na 24 uur de vooraf gewogen hoeveelheid Chow toe aan de voedsel trechter voor de hervoer periode.
- Ga door met meten voor de volgende 48 h. Controleer regelmatig of het systeem wordt uitgevoerd zonder hardware-of software onderbreking.
- Na het voltooien van de meting, beëindigt u het programma en brengt u muizen terug naar hun oorspronkelijke kooien. Meet de hoeveelheid overgebleven voedsel om de voedselinname te onderzoeken.
- Het gedetailleerde protocol voor indirecte calorimetrie is te vinden in een eerdere studie9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont de voeder analyses na 24 uur vasten en de vergelijking tussen 1:1 en 2:1 intermitterend vasten. Een vastenperiode van 24 uur resulteerde in een ~ 10% afname van het lichaamsgewicht, die volledig werd teruggewonnen na 2 dagen opnieuw voeden (Figuur 1a). A 24 h vastenperiode geïnduceerde hyperphagia tijdens de daaropvolgende 2 dagen van opnieuw voeden (Figuur 1B). Niettemin bleek de vergelijking van de energie inname tussen 1:1 alternatieve dag vasten en 2:1 intermitterende vasten dat de 1 dag van de hervoer periode in 1:1 als niet voldoende was (~ 80%) om het calorie verlies door vasten te compenseren, in vergelijking met de AL-aandoening (Figuur 1C). Aan de andere kant, 99% van de energie-inname werd volledig gecompenseerd tijdens 2 dagen van het opnieuw voeden in 2:1 als. Dit regime maakt onderzoek van de effecten van isocaloric als die onafhankelijk van calorie inname verschil zijn.
Figuur 2 illustreert een schematische tijdlijn voor de isocaloric 2:1 if en PF regimes. Om de verschillen in calorie-inname te minimaliseren, een observatie gemaakt in een alternatieve dag vasten6,7, dit protocol vastgesteld een nieuwe als regime bestaande uit 2 dag voeden en 1 dag vasten periodes (2:1 als)8, waardoor het onderzoek van de gezondheidseffecten van isocaloric als in wild-type muizen. Echter, in ob/ob muizen, die hyperfagisch gedrag vertoonden, 2:1 als-behandelde ob/ob muizen toonde een 21% calorie-inname reductie, in vergelijking met ob/ob al muizen15. Aangezien dit voorkomt een goede calorie-onafhankelijke vergelijking, een PF controlegroep die dezelfde calorie-inname als behandeld ob/ob muizen gehandhaafd werd gebruikt. Kort, de totale hoeveelheid voedsel verbruikt tijdens 2 dagen van voeding in 2:1 als muizen gelijk werden verdeeld in drie dagelijkse hoeveelheden, vervolgens verstrekt aan de PF-groep.
Voor een uitgebreid overzicht van de metabole uitkomsten van 2:1 als, we vergeleken de effecten van AL, IF, en PF in lichaamsgewicht, voedselinname en lichaamssamenstelling in wild-type en ob/ob muizen onder normale voeding (ND) en Hfd. In vergelijking met AL, als de behandeling leidde tot een lagere lichaamsgewicht toename van ND-Fed en HFD-gevoede WT Muizen zonder significante verschillen in voedselinname (Figuur 3A, B). Lichaamssamenstelling analyse bleek dat als specifiek verminderd vet massa zonder veranderingen in vetvrije massa in wild-type muizen (Figuur 3C). Het is mogelijk dat een iets, zij het niet significant, lagere geaccumuleerde energie inname over 16 weken van het IF-programma kan resulteren in een verminderde gewichtstoename van als dieren. Echter, als het experiment met het paar-voeding regime bevestigde dat de daling van het lichaamsgewicht door als niet was te wijten aan veranderde energie inname (Figuur 3D, E). In tegenstelling tot wilde dieren, is het lichaamsgewicht van de ob/ob muizen onderworpen aan if (ob-if) lager dan die van OB-al muizen (Figuur 3G). Dit is te wijten aan hyperfagie (overmatig eten) van ob/ob muizen, wat leidt tot licht hoger (21%) voedselinname bij AL muizen, vergeleken met als behandelde dieren (Figuur 3H). Daarom, om specifiek te onderzoeken het metabolische effect van als op een calorie-onafhankelijke wijze, een paar-voeden controlegroep werd gebruikt. Echter, in tegenstelling tot wild-type muizen8, ob-PF muizen waren niet te onderscheiden in vergelijking met ob-als muizen in lichaamsgewicht en lichaamssamenstelling15 (Figuur 3I). Deze resultaten suggereren dat leptine is waarschijnlijk betrokken bij isocaloric als-gemedieerde lichaamsgewicht vermindering van muizen.
De belangrijkste metabole voordeel verleend door isocaloric als is de verbeterde glucose homeostase. Zoals weergegeven in Figuur 4A, B, C, D, Hfd-als muizen een significante verbetering in glucose homeostase vertoonden. GTT toonde aan dat bloedglucose sneller wordt geklaard bij als-behandelde muizen, terwijl ITT een hogere insulinegevoeligheid in HFD-IF-muizen openbaarde, vergeleken met HFD-AL-of HFD-PF-muizen. Onverwacht, ondanks de mislukkingen in als-gemedieerde gewichtsreductie, ob-als dieren vertoonden significant verbeterde glucose behandeling met kleinere glucose-excursies in GTT, in vergelijking met ob-PF muizen (Figuur 4E), overwegende dat insulinegevoeligheid was niet te onderscheiden tussen ob-if en ob-PF muizen (Figuur 4F). Deze verbeterde glucose homeostase in OB-als muizen is waarschijnlijk gemedieerd door verhogingen in plasma niveau van glucagon-achtige peptide-1 (GLP-1) en glucose-gestimuleerd insuline secretie (gegevens niet weergegeven)15. Algemene, met behulp van deze 2:1 als protocol en de juiste calorie-onafhankelijke PF controle, we toonden de metabole voordelen van isocaloric als in wild-type en ob/ob muizen.
Een van de metabole effecten van IF in wild-type muizen is hoger totaal O2 verbruik, gebruikt om de energie-uitgaven te schatten (Figuur 5A, B). Deze verhoging in O2 verbruik werd alleen gevonden tijdens de voeder periode in als muizen, maar niet vastenperiode, vergeleken met al muizen. De toegenomen energie-uitgaven werd grotendeels gemedieerd door de adipeus thermogenese, zoals bruinen van witte vetweefsel en activering van bruin vetweefsel (gegevens niet weergegeven)8,16. Indien-gemedieerde adipeus thermogenese zou vermoedelijk uitleggen hoe wild-type muizen onderworpen aan als tentoongesteld de verminderde lichaamsgewicht aanwinst zonder verschil in voedselinname, in vergelijking met AL muizen. Aan de andere kant, als er geen toename van het verbruik van O2 in ob/ob muizen (Figuur 5C-D), en zelfs leidde tot een vermindering van de energie-uitgaven tijdens de vastenperiode. Consequent, als-geïnduceerde vetweefsel thermogenese werd volledig afgeschaft in ob/ob muizen (gegevens niet weergegeven). Deze gegevens suggereren een mogelijke beperking van als het anders kan werken voor individuen met verschillende genetische en ecologische achtergronden.
Figuur 1: voeren analyses na 24 h vasten en vergelijking tussen 1:1 en 2:1 als. A) dagelijkse veranderingen van het lichaamsgewicht van muizen vóór en na 24 uur vasten (n = 10). B) dagelijkse energie inname voor en na 24 uur vasten (n = 5 kooien; 2 muizen per kooi). C) vergelijking van de energie inname tussen de dag vasten (d.w.z. 1 dag voeden/1 dag vasten, 1:1 als) en 2:1 intermitterende vasten (d.w.z. 2 dagen voeden/1 dag vasten). In de 1:1 als regime, slechts ~ 80% van de inname van voedsel werd gecompenseerd tijdens de daaropvolgende 1 dag van hervoederen in vergelijking met voedselinname gedurende 2 dagen van voeding. Aan de andere kant, 99% van de energie-inname werd bereikt toen 2 dagen van opnieuw voeden werd gegeven, in vergelijking met die over 3 dagen van voeding. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. Dit cijfer werd gereproduceerd met toestemming van Kim et al.8. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Schematische illustratie van de isocaloric 2:1 als regime. Voor de controle van de PF is de hoeveelheid voedsel die wordt verbruikt tijdens de 2 dagen van het voeden door als-behandelde muizen verdeeld in drie gelijke porties, die vervolgens dagelijks worden verstrekt aan PF-muizen tijdens de volgende cyclus. AL = ad libitum; PF = paar-voeding. Een deel van dit cijfer werd gereproduceerd met toestemming van Kim et al.8. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: vergelijking van AL, IF, en PF effecten op lichaamsgewicht, voedselinname, en lichaamssamenstelling tussen wild-type en ob/ob muizen. (a, B, C) Lichaamsgewicht, voedselinname en lichaamssamenstelling in AL of als behandelde wilde muizen onder normale voeding (ND) of vetrijke voeding (HFD) gedurende 16 weken van als regime. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. (ND-AL: n = 7; ND-IF: n = 8; HFD-AL: n = 7; en HFD-IF: n = 8); een-of tweeweg ANOVA met student-Newman-Keuls post-hoc analyse; * * p < 0,01 VS. HFD-AL. (D, E, F) lichaamsgewicht, voedselinname en lichaamssamenstelling in PF VS. als muizen gevoed met VETRIJKE voeding (Hfd) tijdens 12 weken van als regime. (PF: n = 6 en IF: n = 6); tweezijdige ongepaarde student t-toets; * p < 0,05 VS. HFD-PF; NS = niet significant. (G, H, I) Lichaamsgewicht, voedselinname en lichaamssamenstelling in AL-, PF-of IF-behandelde ob/ob -muizen gevoed met normale Chow (ob-al: n = 4; OB-PF: n = 7; OB-IF: n = 6); OB-AL VS. OB-PF: *p < 0,05; OB-AL VS. OB-IF: * p < 0,05; OB-PF VS. OB-IF. Panelen A – F werden gereproduceerd met toestemming van Kim et al.8. Panels G – ik werd gereproduceerd met toestemming van Kim et al.15. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: verbeterde glucose homeostase door IF in zowel wild-type en ob/ob muizen. (a, B) Intraperitoneale GTT en ITT in HFD-AL en HFD-als wild-type muizen na 16 weken van als regime. De inzet toont gebied onder curve (AUC); * p < 0,05 VS. Hfd-al. (C, D) GTt en ITT in Hfd-pf in vergelijking met Hfd-als wild-type muizen na 12 weken van als regime. De inzet toont de AUC; * p < 0,05 VS. Hfd-pf. (E, F) GTt en ITT in OB-in vergelijking met ob-PF muizen na 16 weken van als regime. De inzet toont de AUC (* p < 0,05 VS. OB-PF). Panelen A – D werden gereproduceerd met toestemming van Kim et al.8. Panelen E en F werden gereproduceerd met toestemming van Kim et al.15. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: analyse van de energie-uitgaven in als behandelde wild-en ob/ob -muizen. A) sporen van O2 -verbruik gedurende één cyclus van 2:1 Indien bij wilde muizen(d.w.z. 1 dag vasten gevolgd door 2 dagen voeding). B) gemiddelde van O2 verbruik per uur tijdens het vasten, voeden en één cyclus van 2:1 indien. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM (HFD-AL: n = 6; en HFD-IF: n = 12); * p < 0,05 VS. HFD-AL. (C) O2 consumptie sporen van ob/ob muizen tijdens één cyclus van 2:1 indien. D) gemiddelde van O2 verbruik per uur tijdens het vasten, het voeden en één cyclus van 2:1 indien (ob-PF: n = 7; OB-IF: n = 6); * p < 0,05 VS. OB-PF. panel B werd gereproduceerd met toestemming van Kim et al.8. Panelen C en D werden gereproduceerd met toestemming van Kim et al.15. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het is goed gedocumenteerd dat als biedt gunstige gezondheidseffecten op verschillende ziekten bij mensen en dieren8,15,16,17,18,19. De onderliggende mechanismen, zoals autophagie en gut microbiome, zijn onlangs opgehelderd. Het gepresenteerde protocol beschrijft een isocaloric 2:1 als regime in muizen voor het onderzoeken van calorie-onafhankelijke metabole voordelen van als tegen dieet-geïnduceerde obesitas en geassocieerde metabole dysfunctie. In tegenstelling tot de alternatieve dag vasten (1:1 if) protocol dat resulteert in een afname van de totale calorie-inname6,7, verstrekken van 1 meer dag van opnieuw voeden in de 2:1 als regime maakt onderhoud van een isocaloric aandoening in wild-type muizen.
Bovendien, in vergelijking met 1:1 als, de 2:1 als regime mogelijke vasten-gemedieerde stress of verdoving in muizen20 kan verminderen en is ook vergelijkbaar met een populaire voedingsmethode, de 5:2 dieet2. Hoewel de effecten niet zijn getest, kan het regime worden aangepast door extra dagen te geven voor het opnieuw voeden (bijv. 3:1 of 4:1 als). Bovendien kan dit protocol gemakkelijk worden aangepast aan een uurschaal genaamd tijdbeperkt voeden (TRF), waarbij de toegang tot voedsel beperkt is tot 8 uur per dag tijdens de actieve fase21, waarvan bekend is dat het een isocalorisch dieet regime bereikt en metabole voordelen biedt tegen Hfd-geïnduceerde obesitas en diabetes19,21,22.
Zoals blijkt uit de voedings analyse (Figuur 1B), daalt hyperfagisch gedrag onmiddellijk na 24 uur vasten geleidelijk in wild-type muizen, wat isocaloric mogelijk maakt als. Echter, deze isocaloric aandoening kan niet worden bereikt in ob/ob muizen, als ze gebrek aan leptine signalering-gemedieerde verzadiging en energiemetabolisme, leidt tot een continue hyperphagic fenotype23,24. Daarom is het raadzaam om, voordat u een IF-experiment uitvoert, het voedingsgedrag van het muismodel te onderzoeken. Om de effecten van het gebruik van een hyperphagisch muismodel (bijv. ob/ob, db/DB, Sim1+/-, MC4R-/-)24,25,26, zoals beschreven in dit protocol, te onderzoeken, is de tewerkstelling van een paar-voedende groep als een isocaloric experimentele controle belangrijk voor het maken van juiste vergelijkingen. Het vereist ook zorgvuldige planning bij het testen van een muismodel met een hypophagisch fenotype (bijv. melinebevattende hormoon KO-muizen)27.
Een belangrijke factor om te overwegen voor als studies woon temperatuur, die verschillende fysiologische en gedragsparameters in muizen beïnvloedt. Met name de koude blootstelling (4 – 6 °C) verhoogt de energie inname aanzienlijk om de lichaamstemperatuur te behouden28. In thermoneutrale omstandigheden (30 °C), waarbij warmte winst wordt gecompenseerd door warmteverlies, wordt de afname van de voedselconsumptie aanzienlijk verminderd met8. Wat de metabole uitkomsten betreft, induceert de koude blootstelling de thermogenese, die wordt belemmerd door de thermoneutrale aandoening. Daarom wordt verwacht dat de behuizing temperatuur van invloed op de metabole fenotypes van IF en passende voeding: vasten ratio om te bereiken van isocaloric als.
Inderdaad, het is eerder aangetoond dat isocaloric 2:1 als kan worden bereikt in thermoneutral voorwaarden, leidt tot verbeterde metabole gezondheid in dieet-geïnduceerde obesitas en metabole dysfunctie zonder verschillen in voedselinname tussen als en AL groepen8. Echter, isocaloric indien mogelijk niet haalbaar met 2:1 ratio bij koude temperaturen, omdat muizen onder koude blootstelling zal een hyperphagic fenotype vertonen, wat leidt tot ondervoeding in de IF-groep. Sinds koude blootstelling en als vertonen vergelijkbare metabole uitkomsten en mechanismen (dat wil zeggen, adipeus thermogenese en verbeterde glucose homeostase) die helpen bij de bestrijding van obesitas, er is belangstelling voor het combineren van deze twee interventies te maximaliseren metabole impact. Daarom, om dit goed te testen, het uitvoeren van de Voer analyse vóór het uitvoeren van een IF-experiment en het gebruik van een paar-voedende controlegroep onder koude blootstelling worden aanbevolen.
Andere factoren die mogelijk van invloed kunnen zijn op de uitkomsten van IF-studies omvatten de huisvestings dichtheid. Vergelijkbaar met de vorige studie, die verminderde voedselconsumptie toonde in meer dichtbevolkte muizen29, muizen uit een kooi van vijf verbruikt aanzienlijk minder voedsel dan die uit een kooi van twee (niet-gepubliceerde resultaten). Bovendien is aangetoond dat de behuizings dichtheid een aanzienlijke invloed heeft op de omgevingstemperatuur, aangezien de temperatuur in een kooi met vijf muizen 1 – 2 °C hoger is dan die van één tot twee muizen30. Hoewel deze studie concludeerde dat huisvestings dichtheid niet significant van invloed was op de voedselinname (onderzocht gedurende 5 weken), in een IF-studie van 12 tot 16 weken, kan de temperatuur in de kooi die door de behuizings dichtheid wordt beïnvloed nog steeds invloed hebben op de voedselinname en het energiemetabolisme. Samen is het belangrijk om hetzelfde aantal muizen gehuisvest in een kooi te houden en het aantal per kooi tijdens een studie te minimaliseren.
Samenvattend toont dit rapport een eenvoudig en reproduceerbaar protocol voor het testen van isocaloric 2:1 bij muizen. Hoewel de huidige studie is gericht op metabole voordelen van als in dieet-geïnduceerde obesitas en metabole dysfunctie, het kan gemakkelijk worden aangepast om te onderzoeken van de beschermende en therapeutische effecten van isocaloric als tegen andere voorwaarden, zoals cardiovasculaire en neurologische aandoeningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
K.-H. K werd gesteund door het hart en beroerte Stichting van Canada Grant-in-Aid (G-18-0022213), J. P. Bickell Foundation en de Universiteit van Ottawa Heart Institute start-up Fonds; H.-K.S. werd gesteund door subsidies van de Canadian Institutes of Health Research (PJT-162083), Reuben en Helene Dennis Scholar en Sun Life Financial nieuwe Investigator Award voor diabetes onderzoek van Banting & beste diabetes centrum (BBDC) en natuurwetenschappen en Engineering Research Council (NSERC) van Canada (RGPIN-2016-06610). R.Y.K. werd gesteund door een Fellowship van de Universiteit van Ottawa cardiology Research Endowment Fund. J.H.L. werd gesteund door de NSERC doctoraats beurs en Ontario Graduate beurs. Hij werd gesteund door de UOHI begiftigde Graduate Award en koningin Elizabeth II Graduate beurs in Science and Technology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Comprehensive Lab Animal Monitoring System (CLAMS) | Columbus Instruments | Indirect calorimeter | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 | For GTT |
| EchoMRI 3-in-1 | EchoMRI | EchoMRI 3-in-1 | Body composition analysis |
| Glucometer and strips | Bayer | Contour NEXT | These are for GTT and ITT experiments |
| High Fat Diet (45% Kcal% fat) | Research Diets Inc. | #D12451 | 3.3 Kcal/g |
| High Fat Diet (60% Kcal% fat) | Research Diets Inc. | #D12452 | 4.73 Kcal/g |
| Insulin | El Lilly | Humulin R | For ITT |
| Mouse Strain: B6.Cg-Lepob/J | The Jackson Laboratory | #000632 | Ob/Ob mouse |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | #000664 | |
| Normal chow (17% Kcal% fat) | Harlan | #2918 | |
| Scale | Mettler Toledo | Body weight and food intake measurement |
References
- Gill, S., Panda, S. A Smartphone App Reveals Erratic Diurnal Eating Patterns in Humans that Can Be Modulated for Health Benefits. Cell Metabolism. 22 (5), 789-798 (2015).
- Longo, V. D., Panda, S. Fasting, Circadian Rhythms, and Time-Restricted Feeding in Healthy Lifespan. Cell Metabolism. 23 (6), 1048-1059 (2016).
- Longo, V. D., Mattson, M. P. Fasting: molecular mechanisms and clinical applications. Cell Metabolism. 19 (2), 181-192 (2014).
- Patterson, R. E., et al. Intermittent Fasting and Human Metabolic Health. Journal of the Academy of Nutrition and Dietetics. 115 (8), 1203-1212 (2015).
- Fontana, L., Partridge, L. Promoting health and longevity through diet: from model organisms to humans. Cell. 161 (1), 106-118 (2015).
- Boutant, M., et al. SIRT1 Gain of Function Does Not Mimic or Enhance the Adaptations to Intermittent Fasting. Cell Reports. 14 (9), 2068-2075 (2016).
- Gotthardt, J. D., et al. Intermittent Fasting Promotes Fat Loss With Lean Mass Retention, Increased Hypothalamic Norepinephrine Content, and Increased Neuropeptide Y Gene Expression in Diet-Induced Obese Male Mice. Endocrinology. 157 (2), 679-691 (2016).
- Kim, K. H., et al. Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage. Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).
- Lancaster, G. I., Henstridge, D. C. Body Composition and Metabolic Caging Analysis in High Fat Fed Mice. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Disease Models & Mechanisms. 3 (9-10), 525-534 (2010).
- Heijboer, A. C., et al. Sixteen h of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. Journal of Lipid Research. 46 (3), 582-588 (2005).
- McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 297 (4), 849-855 (2009).
- Jorgensen, M. S., Tornqvist, K. S., Hvid, H. Calculation of Glucose Dose for Intraperitoneal Glucose Tolerance Tests in Lean and Obese Mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 95-97 (2017).
- Nagy, C., Einwallner, E. Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT). Journal of Visualized Experiments. (131), 56672 (2018).
- Kim, Y. H., et al. Thermogenesis-independent metabolic benefits conferred by isocaloric intermittent fasting in ob/ob mice. Scientific Reports. 9 (1), 2479 (2019).
- Li, G., et al. Intermittent Fasting Promotes White Adipose Browning and Decreases Obesity by Shaping the Gut Microbiota. Cell Metabolism. 26 (4), 672-685 (2017).
- Mitchell, S. J., et al. Daily Fasting Improves Health and Survival in Male Mice Independent of Diet Composition and Calories. Cell Metabolism. 29 (1), 221-228 (2019).
- Cignarella, F., et al. Intermittent Fasting Confers Protection in CNS Autoimmunity by Altering the Gut Microbiota. Cell Metabolism. 27 (6), 1222-1235 (2018).
- Martinez-Lopez, N., et al. System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy. Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).
- Lo Martire, V., et al. Changes in blood glucose as a function of body temperature in laboratory mice: implications for daily torpor. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 315 (4), 662-670 (2018).
- Chaix, A., Zarrinpar, A., Miu, P., Panda, S. Time-restricted feeding is a preventative and therapeutic intervention against diverse nutritional challenges. Cell Metabolism. 20 (6), 991-1005 (2014).
- Chaix, A., Lin, T., Le, H. D., Chang, M. W., Panda, S. Time-Restricted Feeding Prevents Obesity and Metabolic Syndrome in Mice Lacking a Circadian Clock. Cell Metabolism. 29 (2), 303-319 (2019).
- Wang, B., Chandrasekera, P. C., Pippin, J. J. Leptin- and leptin receptor-deficient rodent models: relevance for human type 2 diabetes. Current Diabetes Reviews. 10 (2), 131-145 (2014).
- Pan, W. W., Myers, M. G. Leptin and the maintenance of elevated body weight. Nature Reviews: Neuroscience. 19 (2), 95-105 (2018).
- Jackson, D. S., Ramachandrappa, S., Clark, A. J., Chan, L. F. Melanocortin receptor accessory proteins in adrenal disease and obesity. Frontiers in Neuroscience. 9, 213 (2015).
- Tolson, K. P., et al. Postnatal Sim1 deficiency causes hyperphagic obesity and reduced Mc4r and oxytocin expression. Journal of Neuroscience. 30 (10), 3803-3812 (2010).
- Shimada, M., Tritos, N. A., Lowell, B. B., Flier, J. S., Maratos-Flier, E. Mice lacking melanin-concentrating hormone are hypophagic and lean. Nature. 396 (6712), 670-674 (1998).
- Reitman, M. L. Of mice and men - environmental temperature, body temperature, and treatment of obesity. FEBS Letters. 592 (12), 2098-2107 (2018).
- Chvedoff, M., Clarke, M. R., Irisarri, E., Faccini, J. M., Monro, A. M. Effects of housing conditions on food intake, body weight and spontaneous lesions in mice. A review of the literature and results of an 18-month study. Food and Cosmetics Toxicology. 18 (5), 517-522 (1980).
- Toth, L. A., Trammell, R. A., Ilsley-Woods, M. Interactions Between Housing Density and Ambient Temperature in the Cage Environment: Effects on Mouse Physiology and Behavior. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 708-717 (2015).
