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Biochemistry

Quantificação da coenzima A em células e tecidos

Published: September 27, 2019 doi: 10.3791/60182
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Infectious Diseases, St. Jude Children's Research Hospital

Summary

Este método descreve a preparação da amostra de células cultivadas e tecidos animais, extração e derivatização da coenzima A nas amostras, seguida de cromatografia líquida de alta pressão para purificação e quantificação da coenzima a derivatizada por absorvância ou detecção de fluorescência.

Abstract

A pesquisa emergente revelou que a fonte celular da coenzima A (CoA) pode tornar-se limitando com um impacto prejudicial no crescimento, no metabolismo e na sobrevivência. A medida do COA celular é um desafio devido a sua abundância relativamente baixa e à conversão dinâmica de COA livre aos tioésteres de COA que, por sua vez, participam em reações metabólicas numerosas. Um método é descrito que navega através das armadilhas potenciais durante a preparação da amostra para render um ensaio com uma escala linear larga da deteção que seja apropriada para o uso em muitos laboratórios biomédicos.

Introduction

Coenzima A (COA) é um cofator essencial em todos os organismos vivos e é sintetizada a partir de ácido pantotênico, também chamado pantotenato (o sal do ácido pantotênico) ou vitamina B5. O CoA é o principal portador intracelular de ácidos orgânicos, incluindo ácidos de cadeia curta, como acetato e succinato, ácidos de cadeia ramificada, como propionato e metilmalonato, ácidos graxos de cadeia longa, como palmitato e oleato, ácidos graxos de cadeia muito longa, como ácidos graxos poliinsaturados e xenobióticos, como o ácido valproico. O ácido orgânico dá forma a um enlace do Tioéster enzymaticamente com o COA para permitir seu uso como um substrato em mais de 100 reações no metabolismo intermediário1. Os tioésteres de COA são também reguladores alostérico e activators transcricional. É apreciado agora2 que a fonte total celular do COA é regulada3,4; assim, a disponibilidade de CoA pode ser limitante, e que as deficiências de CoA podem ser catastróficas, como exemplificada por desordens genéticas herdadas que impactam o biossynthesis5do COA. A quinase de pantothenate catalisa a primeira etapa na biossíntese de CoA (Figura 1) e a neurodegeneração associada Pantothenate da quinase, chamada pkan, é causada por mutações no gene PANK2 6. A enzima CoA sintase, codificada pelo gene Coasyn , catalisa os dois últimos passos na biossíntese de COA (Figura 1) e a neurodegeneração associada à proteína Coasy, denominada Copan, é causada por uma mutação no gene da coasyn 7. Ambos pkan e Copan são doenças neurodegenerativas herdadas associadas com a acumulação do ferro nas deficiências do cérebro e do COA Underly as patologias da doença.

Os níveis celulares do CoA total variam entre os tecidos8 e o COA total pode aumentar ou diminuir uma variedade de Estados fisiológicos, patológicos e farmacológicos. O CoA do fígado aumenta durante o switching do combustível do FED ao estado jejuado9, e os níveis do COA do fígado são anormalmente elevados em ratos obesos leptin-deficientes10. O CoA do fígado diminui em resposta à ingestão crônica do etanol11. Os níveis do CoA do cérebro no modelo do rato do Knockout Pank2 são deprimidos durante o período perinatal, mas mais tarde no índice adulto do COA do cérebro do estágio são equivalentes aos níveis do selvagem-tipo, indicando uma resposta adaptativa do COA durante o desenvolvimento12. A manipulação do conteúdo de COA tecidual por métodos de transgênese ou de entrega gênica impacta as funções metabólicas e neurais13,14,15. O desenvolvimento pré-clínico de terapias potenciais para pkan ou Copan inclui medidas da célula ou do tecido COA como indicadores da eficácia16,17,18,19,20 . A avaliação de todas estas condições e suas conseqüências metabólicas ou funcionais exige um método quantitativo para a medida do CoA total.

Um ensaio preciso e fiável para a medição de CoA em amostras biológicas é um desafio técnico em muitos laboratórios. Infelizmente, não há sondas disponíveis para avaliar ou quantificar tioésteres de COA ou CoA em células intactas, embora os análogos de tioésteres de CoA natural tenham sido amplamente utilizados como sondas mecanísticas em estudos de éster CoA utilizando enzimas21. A conversão do COA, com uma fração livre do sulfidrila (-SH), a um Tioéster de COA (ou reciprocamente) é rápida nas pilhas ou nos tecidos animais durante a transferência a um ambiente diferente e durante o lysis da pilha. Numerosas sinthetases de acilo-CoA e tioesterases de acilo-CoA nas células mediam as interconversões dentro da piscina CoA, e enzimas adicionais que utilizam tioésteres de CoA como substratos permanecem ativas em amostras biológicas até serem extinto por substâncias químicas ou físicas Significa. O off-loading de Acyl-grupos do COA à carnitina por Acyl-transferases é um exemplo dentro da rede das reações que podem alterar a distribuição do Tioéster de COA/COA. Os traçadores radioativos podem ser usados para medir as taxas de síntese de CoA nas células. Os métodos atuais para a medição de derivados de CoA e CoA em amostras biológicas foram revisados22 e incluem ensaios espectrofotométricos enzimáticos acoplados, cromatografia líquida de alta pressão e procedimentos baseados em espectrometria de massas. Entretanto, estes métodos são centrados frequentemente em espécies moleculars específicas do CoA e são cegos à variação da associação total do CoA. Os ensaios enzimáticos acoplados geralmente exigem maiores quantidades de material de entrada devido a baixas sensibilidades de detecção e têm uma faixa limitada de linearidade.

Nosso laboratório desenvolveu um procedimento de confiança para a quantificação do CoA total em pilhas cultivadas e em tecidos animais. A estratégia inclui a hidrólise de todos os tioésteres de COA para render somente o COA livre durante a preparação da amostra, um pouco do que fazendo esforços para manter e analisar o espectro inteiro de espécies de COA. O procedimento é uma compilação de métodos publicados individuais para a preparação da amostra, a derivação do COA, a purificação e a identificação depois da cromatografia líquida de alta pressão (HPLC), e a quantificação do COA derivatizado pela absorvência ou detecção de fluorescência23,24,25. As determinações do CoA obtidas usando este procedimento permitiram nossa compreensão da regulação do CoA e o desenvolvimento de uma aproximação terapêutica para o tratamento de deficiências de CoA.

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Protocol

O procedimento animal referido neste protocolo foi realizado de acordo com os protocolos 323 e 556 e especificamente aprovado pelo Comitê de cuidados e uso de animais institucionais do hospital de pesquisa infantil St. Jude.

1. preparação de soluções

Nota: Use água ultrapura para todas as soluções e quando indicado nos procedimentos.

  1. Prepare 1 mM de hidróxido de potássio (KOH) em água.
  2. Prepare 0,25 M KOH na água.
  3. Prepare 1 M de Trizma-HCl em água e ajuste para pH 8,0.
  4. Prepare 100 mM monobromobimane (mBBr) em acetonitrila (optima grade). As soluções conservadas em estoque de mbbr são estáveis em-20 ° c por muitos meses contanto que são mantidas no escuro como a exposição à luz pode photolyze o monobromobimane ao moiraghi26.
  5. Prepare o tampão de lavagem para a coluna de extração em fase sólida (SPE): 50% metanol (optima grade) + 2% de ácido acético.
  6. Prepare o tampão de eluição para a coluna SPE: 95% etanol (HPLC grau) contendo 50 mM de amônio formate.

2. preparação do padrão de CoA-bimane

  1. Adquira um padrão CoA de alta qualidade de uma fonte respeitável (por exemplo, Avanti polar lipídios, Inc.).
  2. Prepare uma solução de estoque de alta concentração de CoA em 20 mM Tris, pH 8. A quantidade de CoA no estoque de alta concentração é determinada ou confirmada por absorbância espectrofotométrica a λ 260 nm (ɛ = 16.800 M-1∙ cm-1). Adicionar 4 vezes o excesso molar de mBBr; vórtice no alto para 10 s. Por exemplo, para 10 mM CoA em buffer, adicione 40 mM mBBr. O mBBr é adicionado no excesso para assegurar-se de que todo o CoA esteja derivatized.
  3. Incubar à temperatura ambiente durante 4 h no escuro sem agitar para derivatizar o CoA com mBBr. o mBBr reage com o grupo do tiol do CoA, e é pH e dependente da temperatura27. A adição do mBBr converte CoA a um fluorescente solúvel em água (ou absorsor ultravioleta) CoA-bimane (CoA-bimane; Figura 2).
  4. Adicionar 100 μL de ácido acético e vórtice em altura por 10 s para parar a reacção.
  5. Centrifugue a 2.000 x g durante 15 minutos para remover qualquer precipitante.
  6. Limpe o sobrenadante usando uma coluna SPE para remover o mBBr não reagido (descrito abaixo). A filtração e a centrifugação do eluato não são necessárias após a limpeza da coluna SPE (secção 5,8).
  7. Colete o eluato da coluna SPE contendo o CoA-bimane em um tubo pré-pesado, seque gás nitrogenado, pese e construa uma curva de calibração padrão com quantidades conhecidas de CoA-bimane.
    1. Verifique a norma CoA-bimana para a pureza por HPLC (ver abaixo) com detecção de absorvência em ambos λ 260 (fração de adenina) e λ 393 (fração bimana) e coincidência de ambos os picos no cromatograma.
    2. Confirme a quantidade do padrão CoA-bimane no estoque de alta concentração usando λ 260 nm (ɛ = 16.800 M-1∙ cm-1).
  8. Registre o tempo de retenção da HPLC para a identificação de CoA-bimane em amostras experimentais usando o padrão de CoA-bimane.
  9. Alíquotas da loja do estoque elevado da concentração do padrão de COA-bimane protegido da luz e armazenado em-20 ° c por até 2 anos. Evite o descongelamento repetido e a re-congelação.

3. extração e derivatização de CoA em células cultivadas

  1. Colha células aderentes na cultura quando se aproxima densidades subconfluentes tardias. Por exemplo, as células humanas HepG2/C3A são cultivadas para uma densidade de 6-8 x 106, ou as células HEK 293T são cultivadas para uma densidade de ~ 1,3 x 107 por 100 mm prato.
    1. Use culturas duplicadas ou triplicatas rotineiramente para determinações de CoA. Incubar pratos de cultura separados em paralelo com as culturas de células de amostra para determinar o número de células viáveis. Calcule a quantidade de CoA por 106-107 pilhas após a purificação da HPLC.
  2. Aspirar meio de cultura fora do prato. Lave rapidamente as células no prato com soro fisiológico com tampão de fosfato gelado (PBS) para remover qualquer meio residual e aspirar o PBS fora do prato. Lave rapidamente as células com água gelada para remover a PBS residual e aspirar a água para fora do prato rapidamente. Evite perturbar as células aderentes ao adicionar o PBS ou água.
  3. Adicione 1 mL de água gelada ao prato de cultura. Raspar as células na água fria no prato e transferir a suspensão celular para um tubo de ensaio de vidro contendo 400 μL de 0,25 M KOH e 1,5 mL de água.
    1. Misture a suspensão vigorosamente pelo vórtice no alto por 10 s. Em seguida, cubra firmemente com película de parafina e incubar a 55 ° c por 1 h sem tremer num banho de água. O pH da amostra deve ser ≥ 12. O pH elevado é importante para hidrolisar os tioésteres de COA e pode ser ajustado com alíquotas adicionais do Koh se necessário.
  4. Colher células cultivadas crescendo em suspensão por centrifugação a baixa velocidade: 136 x g por 6 min a 4 ° c. Lave uma vez com PBS gelado, depois lave brevemente novamente com água fria e, finalmente, ressuscite em 2,5 mL de água fria mais 400 μL 0,25 M KOH. Misture vigorosamente e incubar a 55 ° c como descrito acima.
  5. Adicionar 160 μL de 1 M de Trizma-HCl e 10 μL de 100 mM de mBBr e misturar por vórtice no alto por 10 s. Isto traz o pH a aproximadamente 8 para suportar a reação de mBBr com CoA livre. Cubra e incubar amostras à temperatura ambiente durante 2 h no escuro para que o mBBr reaja com o tiol do CoA.
  6. Adicionar 100 μL de ácido acético e misturar por vórtice no alto por 10 s para parar a reacção
  7. Centrifugue a 2.000 x g durante 15 min para remover detritos de células precipitadas.
  8. Retire e guarde o sobrenadante num tubo de ensaio de vidro para a limpeza da coluna SPE descrita abaixo.

4. extração e derivatização de CoA nos tecidos

  1. Peças de tecido animal Dissect, cerca de 0,5 cm de diâmetro ou menor, e blot brevemente (1-2 s) em papel absorvente e, em seguida, Flash congelar em nitrogênio líquido e armazenar a-80 ° c até o processamento. O COA nos tecidos é hidrolisado ou convertido a um Tioéster se não o flash congelado. Esta etapa é importante para obter o rendimento máximo de CoA nos tecidos.
  2. Pesar pedaços de tecido congelado (5 – 60 mg) rapidamente antes de iniciar a análise, e registrar o peso para cada amostra. Esta determinação de peso molhado é usada para o cálculo do conteúdo CoA após a purificação de HPLC. Evite o descongelamento completo das peças do tecido.
  3. Adicione 2 mL de KOH de 1 mM a um tubo de ensaio de vidro (por exemplo, 13 mm x 100 mm descartável) destinado à inserção de uma sonda e ruptura tecidual com um homogeneizador de estator de rotor. Mantenha o tubo no gelo até o uso. Isto é feito para assegurar-se de que as amostras estejam homogeneizadas em uma temperatura fria e o CoA não esteja destruído devido ao calor gerado durante a homogeneização.
  4. Transfira e Homogeneize o tecido (30 – 40 MGS) no tubo de ensaio de vidro (que contem o frio 1 milímetro KOH) para 30 s. Evite o descongelar completo do tecido.
  5. Adicionar 500 μL de KOH de 0,25 M; vórtice em alta por 10 s e manter no gelo até que todas as amostras são homogeneizadas. Isto trará o pH da amostra acima de 12 para hidrolisar os tioésteres do COA para render o COA total (COA livre + tioésteres hidrolisado de COA).
  6. Incubar amostras a 55 ° c durante 2 h num banho de água sem agitação para suportar a hidrólise.
  7. Adicionar 150 μL de 1 M de Trizma-HCl e 10 μL de 100 mM mBBr; vórtice no alto por 10 segundos. Isto traz o pH a aproximadamente 8 para suportar a reação de mBBr com CoA livre.
  8. Incubar amostras à temperatura ambiente durante 2 h no escuro para garantir que todo o CoA é derivatizado com mBBr.
  9. Adicionar 100 μL de ácido acético e vórtice no alto por 10 s para parar a reacção.
  10. Centrifugador em 2.000 x g por 15 minutos aos restos precipitados da pilha da pelota.
  11. Retire e guarde o sobrenadante num tubo de ensaio de vidro para a limpeza da coluna SPE (descrita abaixo).

5. amostra de limpeza com coluna de extração de fase sólida (SPE)

  1. À temperatura ambiente, equilibrar cada coluna descartável 2-(2-piridíl)-gel de sílica etil (1 mL de tamanho) com 1 mL de tampão de lavagem para garantir que o grupo funcional piridíl é protonado e funcionará como um permutador de ânions. 2-(2-pyridyl)-o gel de silicone do Ethyl é um cambista fraco do Anion que seja ideal para CoA-bimane em um pH básico. 2-(2-pyridyl)-o gel de silicone do Ethyl tem um pKa de 6 e a eluição é feita pH ≥ 7.
  2. Adicione o sobrenadante da amostra (etapa 4,11) à coluna e colete o eluate.
  3. Lave a coluna duas vezes com 1 mL de tampão de lavagem para remover qualquer espécie não retida.
  4. Lave a coluna uma vez com 1 mL de água.
  5. Lave a coluna duas vezes com 1 mL de tampão de eluição num tubo de ensaio de vidro separado (12 mm x 75 mm) para recolher o CoA-bimane.
  6. Amostra seca do CoA-bimane no tubo o gás do nitrogênio à secura. A amostra seca é estável na temperatura ambiente até o uso mais adicional. Sele e cubra completamente o tubo e armazene-o.
  7. Quando pronto para a análise de HPLC, reressuscite a amostra em 300 μL de água e misture vigorosamente pelo Vortex na elevação por 10 s.
  8. Transfira a amostra ressuscipended a um filtro do tubo de centrifugação (acetato de celulose de 0,22 μm, tamanho de 2 mL) e Centrifugue em 5.000 x g por 10 minutos para remover todo o precipitant.
  9. Transfira a amostra filtrada para um frasco de vidro adequado para injeção de HPLC.

6. purificação de HPLC e medição de CoA-bimane

  1. Prepare buffers. Tampão A: 50 mM KH2po4, pH 4,6; Tampão B: acetonitrila (grau optima).
  2. Ligue o sistema de HPLC.
    Nota: o sistema HPLC em nosso laboratório é um módulo de separações Waters e2695 equipado com um detector de absorvância ultravioleta-visível (UV-VIS) 2489 e um detector de fluorescência 2475 controlado com o software Empower 3. O sistema igualmente tem um injector automatizado da amostra.
  3. Injetar cada amostra (por exemplo, 20 μL) para a separação em um Gemini C18, 3 μm 100 Å, 4,6 mm x 150 mm coluna usando o programa na tabela 1 com uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min. A temperatura da coluna é de 25 ° c. Meça a absorvância do detector UV/visível a λ 393 nm e a detecção fluorescente em λex = 393 nm, λem = 470 nm. O tempo de retenção é determinado executando uma curva padrão CoA-bimane antes de cada conjunto de amostras.
  4. Registre a área o pico de CoA-bimane para cada amostra e compare com a curva padrão para calcular o pmol do CoA-bimane injetado na coluna da HPLC. A curva padrão da absorvência de CoA-bimane é usada para amostras do tecido, e a curva padrão da fluorescência de CoA-bimane é usada para amostras da cultura do tecido.
  5. Como os valores de CoA-bimana representam CoA total para cada amostra, normalizam para o número de células viáveis para amostras de cultura, ou mg de peso molhado para amostras de tecido (Figura 6). Alternativamente, calcule os valores totais do CoA que seguem a normalização ao índice do ADN ou da proteína para cada amostra. O conteúdo de DNA ou proteína pode ser determinado separadamente usando alíquotas de amostra que são removidas durante a preparação da amostra antes da adição de KOH.

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Representative Results

Um método relativamente rápido e de confiança para a deteção do COA total em pilhas e em tecidos cultivados foi desenvolvido derivatização o tiol do COA a um agente fluorescente usando o mbbr, e então purificante o COA-bimane derivatizado usando a HPLC da fase reversa. Uma curva padrão é gerada pela primeira vez, onde as quantidades conhecidas e crescentes da norma CoA-bimana são injetadas individualmente e as áreas os picos dos cromatogramas CoA-bimane são plotadas em função da entrada CoA-bimana (Figura 4). O CoA-bimane tem um máximo de absorbância a λ 393 nM e um perfil de HPLC representativo mostra o tempo de retenção do padrão CoA-bimano em uma coluna de HPLC C18 (Figura 3) usando o programa de eluição na tabela 1. As curvas-padrão representativas do CoA-bimano, detectadas pela medição de absorvância ou por unidades de fluorescência, são mostradas na Figura 4A e na Figura 4B, respectivamente. A curva padrão na Figura 4a reflete a magnitude da absorvência de COA-bimane a λ 393 nm e a Figura 4B representa a fluorescência de CoA-bimane (λex = 393 nm e λem = 470 nm) plotada versus a quantidade de entrada de CoA-bimane. O padrão de CoA-bimane pode ser detectado de 0, 1 a 12.000 pmol e cobre uma escala de 106dobras quando a deteção usando a absorvência e a fluorescência são combinadas. Embora o limite inferior de detecção da norma seja 0, 1 pmol, o limite inferior da quantificação de CoA-bimane em amostras experimentais é de 0,2 pmol, que é cerca de 5 vezes maior do que a fluorescência basal ou de fundo no cromatograma. A escolha da detecção por absorvância ou fluorescência de CoA-bimano depende da quantidade de CoA normalmente presente nos tecidos ou células, juntamente com a praticidade de trabalhar com tamanhos amostrais maiores ou menores. A absorvência é geralmente útil para amostras de tecido, pois a manipulação 40-50 mg de material de partida produz melhor recuperação do que 5 mg amostras de tecido, enquanto que a fluorescência é geralmente útil para amostras de células cultivadas que são menores em tamanho e há maior confiança na interpolação de valores na extremidade inferior da curva padrão de fluorescência. Os laboratórios com detecção de absorvência somente podem considerar aumentar ou diminuir o tamanho da amostra inicial, aumentando o volume de injeção de HPLC ou diminuindo o volume para a ressuscitura da amostra (seção 5,9 acima) para medições em células cultivadas.

As condições para hidrolisamento de acilo-CoAs de tecidos e células cultivadas foram otimizadas ajustando a concentração de KOH, e o tempo e a temperatura da incubação subsequente (dados não mostrados). A condição óptima foi encontrada para ser 0,25 M em 55 ° c por 2 horas. O grupo do tiol do COA livre mais todo o COA liberado dos tioésteres foi derivatizado pela reação com o mbbr depois do ajuste do pH. A separação subsequente da HPLC e os perfis típicos da deteção para o fígado do rato ou as pilhas C3A cultivadas humanas são indicados em Figura 5 como picos vermelhos, com um tempo de retenção entre 11 e 12 minutos usando o programa da eluição descrito na tabela 1. Quantidades típicas de material de partida biológica são 30-40 mg de fígado murino (peso molhado), 6-8 x 106 células para células C3a humanas "fígado-like", ou ~ 1,3 x 107 células para células HEK293T humanas. As células C3A foram tratadas com uma droga experimental de PanK PZ-2891 a 10 uM que eleva o CoA17 (Figura 6). As medições de CoA em células HEK293T quando as isoformas PanK são superexpressas mostram medidas de CoA em uma ampla faixa (431-6925 pmoles/μL) (Figura 6). Os tamanhos de amostra exigidos para esta metodologia são práticos para a aplicação a muitos contextos experimentais.

A área o pico de CoA-bimane foi calculada utilizando-se o software fornecido com a HPLC. Os limites máximos podem ser determinados automaticamente pelo software da HPLC que pendem o ajuste apropriado de valores da entrada para a correção da linha de base e a definição do pico, mas nosso laboratório prefere designar manualmente o pico do CoA-bimane em cada cromatograma, particular para amostras biológicas desconhecidas.

Tempo (min) Taxa de fluxo (mL/min) % A % B Curva
0 0,5 90 10 0
2 0,5 90 10 6
6 0,5 85 15 6
18 0,5 60 40 6
23 0,5 60 40 6
25 0,5 90 10 6
30 0,5 90 10 66

Tabela 1: programa de HPLC para separação de COA-bimane. Tampão A: 50 mM KH2po4, pH 4,6; Tampão B: acetonitrila. A mistura do tampão A e do amortecedor B segue a curva 6 que é um inclinação linear, com uma curva 8 de intervenção que seja um inclinação côncavo médio.

Figure 1
Figura 1. Via de biossíntese de coenzima A. A quinase de pantotenato (Pank) catalisa o fosforilação do pantotenato (vitamina B5) a 4 ′-phosphopantothenate na primeira etapa da biossíntese de COA. A formação de fosfopantotenato é seguida por condensação com cisteína catalisada por 4 ′-fosfopantothenoylcysteine sintase e, em seguida, descarboxilação para formar 4 ′-fosfopantetheine por 4 ′-fosfopanthenoylcysteine decarboxylase. 4 ′-phosphopantetheine é convertido ao Coenzyme A (CoA) em um processo Two-Step catalisado pelo sintase do CoA. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. reação de mBBr com COA. Monobromobimane (mbbr) é misturado com COA-sh (COA livre) e incubadas na temperatura ambiente por 2 horas no escuro. O mBBr não-fluorescente torna-se fluorescente quando acoplado ao CoA para formar CoA-bimane. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: traço da HPLC da absorvência do padrão de COA-bimane. O CoA-bimane foi separado em uma coluna de Gemini C18 usando o programa de HPLC na tabela 1. O tempo de retenção típico (min) é indicado por unidades de aborbance (UA). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: curvas padrão COA-bimana detectadas por absorvância ou fluorescência. (A) a curva padrão medida utilizando unidades de detecção de absorvância para COA-bimano foi medida a λ 393 nm. As amostras de tecido são geralmente avaliadas usando a curva padrão de absorvância. (B) a curva padrão medida usando unidades de detecção de fluorescência para COA-bimane em λex = 393 nm, λem = 470 nm. As células cultivadas são geralmente avaliadas para o conteúdo de CoA usando a curva padrão de fluorescência. Padrões duplicados (e amostras) são avaliados rotineiramente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: traços de HPLC de amostras típicas de células hepáticas ou cultivadas. (A) identificação do COA-bimane e quantificação do índice no extrato do fígado do rato. Unidades de absorvância (UA) são indicadas. (B) identificação de COA-bimane e quantificação de conteúdo em células cultivadas HEPG2/C3a. As unidades de emissão de fluorescência (UE) são indicadas. Os picos de CoA-bimane são mostrados em vermelho. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6. Os níveis de CoA no fígado do rato, cultivadas C3A e HEK293T células. (A) medida do COA no fígado do rato do knockout do pantotenato da quinase (Pank1-/-) e animais selvagens-tipo combinados (WT). Pank1-/- os animais têm COA inferior no fígado em comparação com os animais em peso devido à ausência de Pank1 expressão9. Os dados foram obtidos por meio de 5 camundongos machos por genótipo e representados como a média ± SEM. (B) níveis de COA em células HEPG2/C3a tratadas com dimetilsulfóxido (controle do veículo) ou PZ-2891, uma droga experimental que modula a atividade de Pank em 10 um o nível de CoA celular 17. The é elevado que segue a incubação de 24 horas com PZ-2891. (C) os níveis de COA em pilhas HEK293T transfected com o vetor vazio pcDNA 3.1, ou cDNAs que codificam isoforms humanos de Pank: PANK1β, PANK2m que é o isoforma maduro, processado do PANK2 humano, ou PANK3. Os níveis de COA são elevados pelo superexpressão de todas as isoformas ativas de Pank. Os dados em (B) e (C) são de amostras independentes de triplicado e são representados como a média ± sem. A análise estatística foi realizada por meio do teste t não pareado e os valores de significância são mostrados em vermelho. Os dados nos painéis (B) e (C) são adaptados de Sharma et al. 12por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Aqui nós demonstramos um procedimento de confiança, passo a passo para quantificar o CoA total nas pilhas e nos tecidos animais com uma escala larga da deteção linear que seja acessível em muitos laboratórios que têm um HPLC com uma absorvência ou um detector da saída da fluorescência. Alternativamente, a espectrometria de massas é uma técnica comum para a avaliação de tioésteres de CoA e CoA, mas não está amplamente disponível devido ao custo da instrumentação e ao conhecimento especializado exigido para o desenvolvimento da metodologia e interpretação dos dados. O COA isotopicamente etiquetado que é apropriado para o uso como um padrão interno para a quantificação de COA livre na espectrometria maciça não está comercialmente disponível, e o COA livre não é detectado pelo instrumento com a mesma sensibilidade que os tioésteres de COA tais como o acetyl-CoA. Assim, os níveis livres do CoA são subestimados frequentemente grosseiramente pela espectrometria maciça a menos que os dados da saída forem comparados com uma curva padrão da calibração do CoA.

Nós comparamos o método descrito aqui com um método diferente usado previamente em nosso laboratório e encontramos a maior recuperação do CoA do fígado do rato, 123,4 ± 7,9 pmol/peso molhado do magnésio, com este método atual comparado a ~ 80 pmol/magnésio peso molhado usando um ensaio enzimático que COA livre derivatizado com uma etiqueta radioativa28. O método para medir o CoA total que é descrito aqui é consideravelmente menos incômodo, mais rápido e mais fácil controlar comparado ao método usado previamente em nosso laboratório28. Anteriormente, o COA foi determinado após a extração do hexano do lisado da pilha e submetido à conversão enzimática ao Lauryl-COA radioativo [14C] negociado pelo sintetase do Acyl-COA de Escherichia coli (FADD). Os Acyl-CoAs de cadeia curta solúveis em ácido e os acilo-CoAs de cadeia longa insolúveis em ácido no lisado de células foram hidrolisados com KOH para produzir CoA livre e depois submetidos à extração de hexano antes da conversão enzimática para o CoA livre29. Embora este procedimento prévio tivesse boa especificidade e sensibilidade, na prática a tarefa exigia 2 dias úteis para completar e a sintetase recombinante de e. coli Acyl-COA tinha que ser preparada, purificada e medida para atividade específica enzimática antes da análise do CoA. Também necessitava de instrumentação capaz de detectar e quantificar isótopos radioactivos que é muito menos comum em laboratórios biomédicos na história mais recente. O método atual como descrito aqui é o mais apropriado para nosso interesse da pesquisa na quinase do pantotenato (Pank). O Pank controla o fluxo através da via biossintética do COA e assim o nível total do COA é o leitura para a atividade de Pank em amostras biológicas.

A têmpera de reações metabólicas em uma amostra biológica para manter uma quantidade verdadeira de CoA exige o cuidado e a rapidez e é crítica para este procedimento. O desproteinization rápido com um solvente ácido ou orgânico, ou o flash-congelação das amostras são dois métodos que foram usados nos30,31passados. No método atual, a água do ultrapura Ice-Cold é adicionada rapidamente às pilhas PBS-lavadas gelo-frias das culturas, e as pilhas aderentes mais a água são raspadas então fora do prato da cultura antes da transferência ao Koh. O congelamento da suspensão de células cultivadas em [KOH + água] para armazenamento a-80 ° c antes da preparação da amostra é um ponto de parada aceitável. Entretanto, os valores de CoA das amostras congeladas da pilha devem ser comparados àqueles das amostras recentemente preparadas para determinar se há uma perda substancial do sinal do CoA. A perda de ≤ 10% CoA ocorreu em nossas mãos depois da congelação da amostra da pilha e pode ser relacionada ao tempo prolongado da amostra no KOH que precisa de ser controlado. Peças de tecido animal são rapidamente congelados em uma pequena folha ' Raft ' flutuando no LN2 imediatamente após a excisão do tecido de um animal eutanasiado. Os tamanhos de amostra de 5 mgs a 60 mgs de tecido congelado são apropriados para este método com rendimentos lineares do CoA. Uma vez congelados, as amostras de tecido armazenadas a-80 ° c são estáveis por pelo menos 3 meses, desde que a descongelação intermitente não ocorra.

A preparação da amostra antes da análise de HPLC não é rendimento elevado e exige um meio-dia de trabalho cheio. Recomenda-se que o operador manipule um máximo de 30 amostras de uma só vez, iniciando com homogeneização de um conjunto de 15 amostras seguidas de homogeneização do segundo conjunto de 15 amostras durante a incubação de 2 h com KOH para o primeiro conjunto. O período de incubação de KOH foi otimizado pela primeira vez usando tioésteres de CoA adquiridos com tempos de incubação variando de 30 min a 4 h e, em seguida, a incubação de 2 h foi escolhida para acomodar o tempo para a hidrólise completa de Tioéster de CoA em uma variedade de amostras de tecido, variando do músculo esquelético ao fígado8. A incubação para a derivação do CoA com o mBBr é ajustada em 2 h em aproximadamente pH 8 e um excesso 20-fold de mBBr é adicionado para converter completamente o CoA nas amostras biológicas. As metades de sulhydryl das proteínas e dos metabolitos à excepção do COA tais como a carnitina ou a glutationa na amostra serão derivatizado além do que o COA, e o excesso 20-fold foi calculado com base na quantidade esperada do fígado total do COA que tem o nível o mais elevado entre os tecidos. O pH é reduzido antes da incubação com mBBr porque bromobimanes em geral são menos reativos em relação a outros nucleófilos como aminas e carboxilatos em soluções aquosas mais neutras. O tempo de derivação não deve exceder 2 h para evitar ou diminuir a reação com tióis proteicos26. É preciso usar buffers não nucleofílicos para reduzir e manter o pH, pois a presença de ânions tampão em altas concentrações pode interferir na derivação de mBBr do CoA.

A limpeza da amostra na coluna SPE é feita manualmente em nosso laboratório e pode ser realizada com o auxílio de um colector de vácuo para encurtar o tempo necessário para esta etapa. A boa recuperação do COA derivatizado da coluna de SPE é rotineiramente atingível e esta foi determinada separada usando os tioésteres radioativos de [13C] COA que são retidos igualmente na coluna de SPE. A recuperação de [13c] acetil-coa era 97,6% e a recuperação de [13c] palmitoyl-COA era 96,1%. A evaporação do eluato da SPE-coluna é executada geralmente o gás do nitrogênio durante a noite em nosso laboratório como uma matéria da conveniência, mas a secagem pode ser terminada dentro de 4 horas o gás do nitrogênio ou usando um concentrador do speedvac. As etapas mais críticas do método estão relacionadas ao ajuste do pH e podem ser verificadas com tiras de papel de pH ao longo do caminho. Para a hidrólise de Koh, o pH precisa de ser ≥ 12 para conseguir a liberação completa do Tioéster do COA. O pH precisa ser 7,8 – 8,5 para suportar a reatividade do mBBr-derivatização, e após a derivação estar completa, o pH deve ser ajustado para se tornar muito ácido, sobre pH 1-2, para que o CoA-bimane se vincule à coluna SPE. A coluna SPE limpa a amostra para eliminar o excesso de mBBr não reagido e algumas substâncias biológicas não relacionadas.

O programa da HPLC é projetado de modo que a lavagem e o re-equilibration da coluna C18 sejam suficientes eliminar o fundo e os sinais do transição entre amostras. As amostras em branco da água são inseridas após cada 5 amostras na amostra experimental ajustada como uma precaução para monitorar o transição possível entre jogos e para assegurar a limpeza da coluna. Um erro ocasional da injeção imprópria da amostra pode ocorrer ao usar um injector automatizado da amostra para o HPLC, e este pode facilmente ser verific comparando os volumes que permanecem nos frascos da amostra após a injeção ou a inspeção dos picos relacionados non-CoA no cromatograma de saída. Se os valores de CoA excederem o intervalo linear da curva de calibração para detecção de fluorescência, os valores provavelmente estarão no intervalo para a detecção de absorvância ultravioleta. Se não, a diluição da amostra com um volume conhecido de água pode reduzir o sinal para estar na faixa linear e os cálculos devem levar em conta qualquer fator de diluição.

Os níveis de COA variarão entre cepas de camundongo linhagens com diferentes origens genéticas, embora os valores sejam reprodutíveis quando amostras biológicas forem obtidas da mesma cepa nas mesmas condições. Nós estimamos CoA em diversas linhas diferentes do rato em vários estudos10,12,16,17. O COA foi medido igualmente em diversas linhas de pilha cultivadas16,17 usando pilhas preliminares ou imortalizado.

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Disclosures

MWF, CS e SJ escreveram o artigo, MWF e CS forneceram os dados e figuras, o COR projetou os experimentos e revisou criticamente o manuscrito. SJ e cor são inventores em um pedido de patente pendente (PCT/US17/39037) "moduladores de pequenas moléculas de pantotenato kinases" detidos por St. Jude Children ' s Research hospital que abrange o composto PZ-2891 referenciado neste artigo.

Acknowledgments

Os autores reconhecem o financiamento para a pesquisa patrocinada fornecida pela CoA Therapeutics, Inc., uma subsidiária da BridgeBio LLC, a concessão nacional dos institutos de saúde GM34496, e as instituições de caridade associadas sírias americanas libanesas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column Millipore-Sigma 54127-U
coenzyme A Avanti Polar Lipids 870700
Gemini C18 3 μm 100 Å HPLC column Phenomenex 00F-4439-E0
monobromobimane ThermoFisher Scientific M-1378
Omni-Tip probe tissue disrupter Omni International 32750H
Parafilm Fisher S37440
PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer ThermoFisher Scientific NC0530997
Spin-X centrifuge tube filter CoStar 8161
Trizma-HCl Fisher T395-1
Waters 2475 fluorescence detector Waters 2475
Waters 2489 UV-Vis detector Waters 2489
Waters e2695 separations module Waters e2695

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Frank, M. W., Subramanian, C., Rock, C. O., Jackowski, S. Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues. J. Vis. Exp. (151), e60182, doi:10.3791/60182 (2019).

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