Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

القياس الكمي لانزيم A في الخلايا والانسجه

Published: September 27, 2019 doi: 10.3791/60182
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Infectious Diseases, St. Jude Children's Research Hospital

Summary

يصف هذا الأسلوب اعداد العينات من الخلايا المستزرعة والانسجه الحيوانية ، واستخراج واشتقاق انزيم A في العينات ، تليها اللوني السائل عاليه الضغط لتنقيه والتقدير الكمي لانزيم ديريفاتيزيد A من قبل الامتصاص أو الكشف عن الفلورية.

Abstract

وقد كشفت البحوث الناشئة ان الانزيم الخلوي A (CoA) العرض يمكن ان تصبح الحد مع تاثير ضار علي النمو, التمثيل الغذائي والبقاء علي قيد الحياة. قياس CoA الخلوية هو التحدي بسبب وفره منخفضه نسبيا والتحويل الديناميكي لل CoA الحرة إلى ثيوترات CoA التي ، بدورها ، والمشاركة في العديد من ردود الفعل الايضيه. يتم وصف الأسلوب الذي يتنقل من خلال المزالق المحتملة اثناء اعداد العينة للحصول علي فحص مع مجموعه خطيه واسعه من الكشف التي هي مناسبه للاستخدام في العديد من المختبرات الطبية الحيوية.

Introduction

انزيم A (CoA) هو عامل مساعد أساسي في جميع الكائنات الحية ويتم توليفها من حمض الثنائية ، وتسمي أيضا بانتوثينات (الملح من حمض الثنائي) أو فيتامين B5. CoA هو الناقل الرئيسي داخل الخلايا من الأحماض العضوية ، بما في ذلك الأحماض القصيرة السلسلة مثل خلات والسكينات ، فرع سلسله الأحماض مثل بروبيونات وميثيل مالوناتي ، الأحماض الدهنية طويلة السلسلة مثل بالميتات والأوليات ، والأحماض الدهنية طويلة السلسلة جدا مثل الأحماض الدهنية غير المشبعة ، و xenobiotics مثل حمض فالبرويك. يشكل الحامض عضويه [ثيوستر] ربط انزيمي مع [CoA] ان يمكن استعماله كركيزة في علي 100 رد فعل في وسيطه أيض1. هي أيضا المنظمين تفارغي والمنشطات الناقلة. هو الآن يقدر2 ان الخلوية إجماليه [CoA] نظمت إمداد تموين3,4; التالي ، يمكن ان يكون الحد من توافر CoA ، وان نقص CoA يمكن ان تكون كارثية ، كما يتمثل في الاضطرابات الوراثية الموروثة التي تؤثر علي التخليق الحيوي CoA5. بانتوثينات كيناز يحفز الخطوة الاولي في التخليق الحيوي CoA (الشكل 1) و بانتوثينات العصبية المرتبطة المقترنة ، ودعا pkan ، هو سبب الطفرات في الجينات PANK2 6. CoA synthase ، المشفرة من قبل جين Coasyn ، يحفز الخطوتين الأخيرتين في التخليق الحيوي coa (الشكل 1) و Coasy البروتين المرتبطة نيوروتنكس ، ودعا copan ، هو سبب طفرة في الجينات coasyn 7. كل من PKAN و CoPAN موروثه الامراض العصبية المرتبطة بتراكم الحديد في الدماغ ونقص CoA بشكل سلبي امراض المرض.

المستويات الخلوية من مجموع CoA تختلف بين الانسجه8 ومجموع coa يمكن زيادة أو نقصان تحت مجموعه متنوعة من الولايات الفسيولوجية والمرضية والدوائية. الكبد الزيادات coa اثناء التبديل الوقود من بنك الاحتياطي الفيدرالي إلى الدولة صام9، ومستويات coa الكبد هي عاليه بشكل غير طبيعي في الفئران البدناء ناقص ليبتين ،10. انخفاض CoA الكبد استجابه لابتلاع الايثانول المزمن11. مستويات CoA الدماغ في نموذج الماوس Pank2 الضربة القاضية هي الاكتئاب خلال فتره ما قبل الولادة ، ولكن في وقت لاحق في الدماغ مرحله الكبار coa المحتوي يعادل مستويات البرية ، مما يدل علي استجابه CoA التكيف اثناء التطوير12. التلاعب في محتوي CoA الانسجه عن طريق التكوين أو الجينات طرق التسليم تؤثر علي وظائف الأيض والعصبية13،14،15. التطوير الإكلينيكي للعلاجات المحتملة لل pkan أو كوبان يتضمن قياسات الخلايا أو الانسجه CoA كمؤشرات للفعالية16،17،18،19،20 . يتطلب تقييم كل هذه الشروط ونتائجها الايضيه أو الوظيفية طريقه كميه لقياس مجموع CoA.

ويعد الفحص الدقيق والموثوق لقياس CoA في العينات البيولوجية تحديا تقنيا في العديد من المختبرات. لسوء الحظ ، لا توجد تحقيقات متاحه لتقييم أو قياس CoA أو CoA ثيوترات في الخلايا السليمة ، علي الرغم من ان النظير من الطبيعية CoA thioesters وقد استخدمت علي نطاق واسع كتحقيقات ميكانيكيه في دراسات CoA استر استخدام الانزيمات21. التحويل من CoA, مع [سلفهيدراريل] حره (-[ش]) [موليتي], إلى [CoA] [ثيوستر] (أو العكس) سريعة في خلايا أو نسيج حيوانيه اثناء انتقال إلى بيئة مختلفه واثناء خليه تحلل. العديد من acyl-CoA synthetases و acyl-CoA thioesterases في الخلايا توسط التحويلات داخل تجمع CoA ، والانزيمات الاضافيه التي تستخدم CoA ثيوترات كما ركائز تبقي نشطه في عينات بيولوجية حتى مروي من قبل الكيميائية أو الفيزيائية يعني. التحميل من acyl-المجموعات من CoA إلى كارنيتين بواسطة المحولات acyl هو مثال واحد داخل شبكه من ردود الفعل التي يمكن ان تغير من CoA/CoA التوزيع thioester. يمكن استخدام المتعقبات المشعة لقياس معدلات توليف CoA في الخلايا. وقد تم استعراض الأساليب الحالية لقياس مشتقات CoA و CoA في العينات البيولوجية22 وتشمل المقايسات الطيفية الانزيميه المقترنة ، والفصل اللوني السائل عالي الضغط والإجراءات القائمة علي الطيف الكتلي. ومع ذلك ، غالبا ما تتركز هذه الأساليب علي الأنواع الجزيئية الخاصة CoA وهي عمياء إلى الاختلاف من تجمع CoA الكلي. الاختبارات الانزيميه المقترنة تتطلب عموما كميات أكبر من مواد الإدخال بسبب الحساسيات الكشف المنخفضة ولها مجموعه محدوده من الخطي.

وقد وضعت لدينا مختبر اجراء موثوق بها للقياس الكمي لمجموع CoA في الخلايا المستزرعة والانسجه الحيوانية. وتشمل الاستراتيجية التحلل المائي لجميع ثيوترات CoA لإنتاج CoA الحرة فقط خلال اعداد العينة ، بدلا من بذل الجهود للحفاظ علي وتحليل الطيف بأكمله من الأنواع CoA. هذا الاجراء هو تجميع للأساليب المنشورة الفردية لاعداد العينة ، CoA اشتقاق ، تنقيه وتحديد بعد اللوني السائل عاليه الضغط (HPLC) ، والتقدير الكمي لديريفاتيزيد CoA عن طريق الامتصاص أو الكشف عن الفلورية23،24،25. وقد مكنت القرارات CoA التي تم الحصول عليها باستخدام هذا الاجراء فهمنا لتنظيم CoA وتطوير نهج علاجي لعلاج نقص CoA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أجريت الإجراءات الحيوانية المشار اليها في هذا البروتوكول وفقا للبروتوكولات 323 و 556 والتي وافقت علي وجه التحديد من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانية واستخدامها في مستشفي سانت جود للأطفال.

1-اعداد الحلول

ملاحظه: استخدام المياه نقاء لجميع الحلول وعندما ذكر في الإجراءات.

  1. اعداد 1 ملم هيدروكسيد البوتاسيوم (كوة) في الماء.
  2. اعداد 0.25 M كوة في الماء.
  3. اعداد 1 م Trizma-HCl في الماء وضبط لدرجه الحموضة 8.0.
  4. اعداد 100 mM monobromobimane (mBBr) في اسيتلونيتريل (اوبتيما الصف). حلول الأسهم من mBBr مستقره في-20 درجه مئوية لعده أشهر شريطه ان يتم الاحتفاظ بها في الظلام كما يمكن التعرض للضوء photöobimane إلى bimane26.
  5. اعداد المخزن المؤقت لغسل المرحلة الصلبة (مهندس) العمود: 50 ٪ الميثانول (اوبتيما الصف) + 2 ٪ حمض الخليك.
  6. اعداد العازلة لعمود مهندس البترول المصري: 95 ٪ الايثانول (HPLC الصف) التي تحتوي علي 50 mM formate الأمونيوم.

2. اعداد معيار CoA-bimane

  1. شراء معيار CoA عاليه الجودة من مصدر السمعة (علي سبيل المثال ، Avanti القطبية الدهون ، وشركه).
  2. اعداد حل الأسهم عاليه التركيز من CoA في تريس 20 مم ، pH 8. يتم تحديد كميه CoA في المخزون عاليه التركيز أو تاكيدها من قبل الامتصاص الطيفي في λ 260 nm (Ɛˈli = 16,800 M-1-سم-1). أضافه 4 اضعاف المولي الزائدة من mBBr; دوامه علي ارتفاع لمده 10 ليالي. علي سبيل المثال ، للحصول علي 10 مم CoA في المخزن المؤقت ، أضافه 40 mM mBBr. يتم أضافه mBBr الزائدة للتاكد من ان جميع CoA هو ديريفاتيزيد.
  3. احتضان في درجه حرارة الغرفة ل 4 ح في الظلام دون اهتزاز لديريفاتيزي CoA مع mBBr. يتفاعل mbbr مع مجموعه ثيول من CoA ، وهو الأس الهيدروجيني ودرجه الحرارة تعتمد27. بالاضافه إلى تحويل mBBr CoA إلى فلوري للذوبان في الماء (أو الاشعه فوق البنفسجية الماصة) CoA-bimane (CoA-bimane; الشكل 2).
  4. أضافه 100 μL حمض الخليك ودوامه علي ارتفاع ل 10 ثانيه لوقف رد الفعل.
  5. الطرد المركزي في 2,000 x g لمده 15 دقيقه لأزاله اي اندفاع.
  6. تنظيف ماده طافي باستخدام عمود مهندسي البترول لأزاله mbbr غير المتفاعلة (الموصوفة أدناه). الترشيح والطرد من المراوغة ليست ضرورية بعد تنظيف عمود مهندس البترول الخاص (القسم 5.8).
  7. جمع الشطف من العمود الذي يحتوي علي coa-bimane في أنبوب قبل وزنه ، والجافة تحت غاز النيتروجين ، وتزن وبناء منحني المعايرة القياسية مع كميات معروفه من CoA-bimane.
    1. تحقق من معيار CoA-bimane للنقاء من قبل HPLC (انظر أدناه) مع الكشف عن الامتصاص في كل من λ 260 (adenine moiety) و λ 393 (bimane moiety) وصدفه من كلا القمم في الكروماتوجرام.
    2. تاكيد كميه من معيار CoA-bimane في المخزون عاليه التركيز باستخدام λ 260 nm (Ɛˈli = 16,800 M-1-سم-1).
  8. تسجيل الاحتفاظ HPLC الوقت للتعرف علي CoA-bimane في عينات تجريبية باستخدام معيار CoA-bimane.
  9. تخزين الارصفه من المخزون عاليه التركيز من معيار CoA-bimane محمية من الضوء وتخزينها في-20 درجه مئوية لمده تصل إلى 2 سنوات. تجنب الذوبان المتكرر وأعاده التجميد.

3. استخراج واشتقاق من CoA في الخلايا المستزرعة

  1. حصاد الخلايا الملتصقة في الثقافة عند الاقتراب من الكثافات سوبكونفلوينت المتاخره. علي سبيل المثال ، نمت الخلايا HepG2/C3A البشرية إلى كثافة 6-8 x 106، أو الخلايا يشيك 293t نمت إلى كثافة من ~ 1.3 x 107 لكل 100 مم طبق.
    1. استخدم الثقافات المكررة أو ثلاثية النسخ بشكل روتيني لتحديدات CoA. احتضان الاطباق الثقافية منفصلة بالتوازي مع الثقافات خليه عينه لتحديد رقم الخلية قابله للحياة. حساب كميه CoA لكل 106-107 خلايا بعد تنقيه hplc.
  2. الاسبرين الثقافة المتوسطة قباله الطبق. بسرعة غسل الخلايا علي الطبق مع الجليد الباردة الفوسفات-مخزنه المالحة (تلفزيوني) لأزاله اي المتوسطة المتبقية ويستنشق التلفزيونية قباله الطبق. بسرعة غسل الخلايا مع الماء البارد الجليد لأزاله المتبقية تلفزيوني ويستنشق الماء قباله الطبق بسرعة. تجنب إزعاج الخلايا الملتصقة عند أضافه تلفزيوني أو الماء.
  3. أضف 1 مل من الماء المثلج إلى طبق الثقافة. كشط الخلايا في الماء البارد في الطبق ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب اختبار الزجاج التي تحتوي علي 400 μL من 0.25 M كوة و 1.5 mL من الماء.
    1. تخلط التعليق بقوة بواسطة الدوامة علي ارتفاع لمده 10 ليالي. ثم تغطي باحكام مع الفيلم البارافين واحتضان في 55 درجه مئوية ل 1 ح دون اهتزاز في حمام مائي. يجب ان يكون pH العينة ≥ 12. درجه الحموضة العالية من المهم ان التحلل ثيوترات CoA ويمكن تعديلها مع قسامات اضافيه من كوة إذا لزم الأمر.
  4. حصاد الخلايا المستزرعة المتزايدة في التعليق من قبل طرد بسرعة منخفضه: 136 x g لمده 6 دقائق في 4 °c. يغسل مره واحده مع الجليد الباردة تلفزيوني ، ثم يغسل لفتره وجيزة مره أخرى مع الماء البارد ، وأخيرا أعاده التعليق في 2.5 مل من الماء البارد بالاضافه إلى 400 μL 0.25 M كوة. تخلط بقوة واحتضان في 55 درجه مئوية كما هو موضح أعلاه.
  5. أضافه 160 μL من 1 M Trizma-HCl و 10 μL من 100 mM mBBr ومزيج من دوامه علي ارتفاع لمده 10 ليالي. هذا يجلب درجه الحموضة إلى ما يقرب من 8 لدعم رد فعل mBBr مع CoA الحرة. تغطيه واحتضان عينات في درجه حرارة الغرفة ل 2 ح في الظلام لل mbbr للرد مع ثيول من CoA.
  6. أضافه 100 μL من حمض الخليك وتخلط بواسطة دوامه علي ارتفاع لمده 10 ليالي لوقف رد الفعل
  7. أجهزه الطرد المركزي في 2,000 x g لمده 15 دقيقه لأزاله الحطام الخلية عجلت.
  8. أزاله وحفظ ماده طافي في أنبوب اختبار الزجاج لتنظيف العمود مهندس البترول المصري التي يرد وصفها أدناه.

4. استخراج واشتقاق من CoA في الانسجه

  1. تشريح قطع الانسجه الحيوانية ، حوالي 0.5 سم قطرها أو أصغر ، ولطخه لفتره وجيزة (1-2 s) علي ورقه ماصه ومن ثم تجميد فلاش في النيتروجين السائل وتخزين في-80 درجه مئوية حتى المعالجة. CoA في الانسجه هو تحلل أو تحويلها إلى ثيوستر إذا لم فلاش المجمدة. هذه الخطوة مهمة للحصول علي الحد الأقصى لمحصول CoA في الانسجه.
  2. تزن قطع الانسجه المجمدة (5-60 ملغ) بسرعة قبل بدء التحليل ، وتسجيل الوزن لكل عينه. يتم استخدام هذا التحديد الوزن الرطب لحساب محتوي CoA بعد تنقيه HPLC. تجنب الذوبان الكامل لقطع الانسجه.
  3. أضافه 2 مل من 1 مم كوة إلى أنبوب اختبار الزجاج (علي سبيل المثال ، 13 مم × 100 مم القابل للتصرف) الموجهة لادراج التحقيق واضطراب الانسجه مع الخالط الدوار الموالي. إبقاء الأنبوب علي الجليد حتى الاستخدام. ويتم ذلك للتاكد من ان العينات متجانسة في درجه حرارة بارده ولا يتم تدمير CoA بسبب الحرارة المتولدة اثناء التجانس.
  4. نقل وتجانس الانسجه (30-40 ملغ) في أنبوب اختبار الزجاج (التي تحتوي علي الباردة 1 مم كوة) لمده 30 ثانيه. تجنب الذوبان الكامل للانسجه.
  5. أضافه 500 μL من 0.25 M KOH; دوامه علي ارتفاع لمده 10 ليالي والحفاظ علي الجليد حتى يتم تجانس جميع العينات. وهذا سيجلب درجه الحموضة من العينة أعلاه 12 إلى حلعوترات CoA لإنتاج CoA الكلي (CoA الحرة + تحلل CoA ثيوترات).
  6. احتضان عينات في 55 درجه مئوية لمده 2 ح في حمام المياه دون اهتزاز لدعم التحلل المائي.
  7. أضافه 150 μL من 1 M Trizma-HCl و 10 μL من 100 mM mBBr; دوامه علي ارتفاع لمده 10 ثانيه. هذا يجلب درجه الحموضة إلى حوالي 8 لدعم رد فعل mBBr مع CoA الحرة.
  8. احتضان العينات في درجه حرارة الغرفة لمده 2 ساعة في الظلام لضمان ديريفاتيزيد جميع CoA مع mBBr.
  9. أضافه 100 μL من حمض الخليك ودوامه علي ارتفاع ل 10 ثانيه لوقف رد الفعل.
  10. أجهزه الطرد المركزي في 2,000 x g لمده 15 دقيقه إلى بيليه الحطام الخلية عجلت.
  11. أزاله وحفظ ماده طافي في أنبوب اختبار الزجاج لتنظيف العمود مهندس البترول المصري (الموصوفة أدناه).

5. عينه تنظيف مع المرحلة الصلبة استخراج العمود (مهندس)

  1. في درجه حرارة الغرفة ، تتوازن كل المتاح 2-(2-بيريديل)-ايثيل هلام السيليكا العمود (1 مل حجم) مع 1 مل من غسل العازلة لضمان ان المجموعة الوظيفية بيريول هو بروتيني وسوف تعمل باعتبارها المبادلة انيون. 2-(2-بيريديل)-ايثيل هلام السيليكا هو مبادل انيون ضعيفه التي هي مثاليه ل CoA-bimane في درجه الحموضة الاساسيه. 2-(2-بيريديل)-ايثيل هلام السيليكا لديه pKa من 6 ويتم التملص الحموضة ≥ 7.
  2. أضافه نموذج ماده طافي (الخطوة 4.11) إلى العمود وجمع التملص.
  3. غسل العمود مرتين مع 1 مل من غسل العازلة لأزاله اي الأنواع غير المحتفظ بها.
  4. غسل العمود مره واحده مع 1 مل من الماء.
  5. غسل العمود مرتين مع 1 مل من العازلة في أنبوب اختبار الزجاج منفصلة (12 مم × 75 مم) لجمع CoA-bimane.
  6. الجافة CoA-bimane عينه في أنبوب تحت غاز النيتروجين إلى جفاف. العينة المجففة مستقره في درجه حرارة الغرفة حتى مزيد من الاستخدام. ختم وتغطيه تماما الأنبوب ومخزن.
  7. عندما تكون جاهزه للتحليل HPLC ، أعاده التعليق عينه في 300 μL من الماء وتخلط بقوة بواسطة دوامه علي ارتفاع لمده 10 ليالي.
  8. نقل عينه أعاده تعليق إلى فلتر أنبوب الطرد المركزي (0.22 μm خلات السليلوز ، 2 مل حجم) وأجهزه الطرد المركزي في 5,000 x ز لمده 10 دقيقه لأزاله اي اندفاع.
  9. نقل عينه تصفيتها إلى قارورة زجاجيه مناسبه للحقن HPLC.

6. HPLC تنقيه وقياس CoA-bimane

  1. اعداد المخازن المؤقتة. العازلة A: 50 mM KH2PO4، pH 4.6 ؛ العازلة B: اسيتلونيتريل (اوبتيما الصف).
  2. السلطة حتى نظام HPLC.
    ملاحظه: نظام HPLC في المختبر لدينا هو e2695 المياه الفصل وحده مجهزه 2489 الاشعه فوق البنفسجية مرئية (UV-فيس) كاشف الامتصاص وكاشف الفلورية 2475 التي تسيطر عليها تمكين 3 البرمجيات. النظام لديه أيضا حاقن عينه الألى.
  3. حقن كل عينه (علي سبيل المثال ، 20 μL) للفصل علي الجوزاء C18 ، 3 μm 100 Å ، 4.6 مم × 150 مم العمود باستخدام البرنامج في الجدول 1 مع معدل تدفق 0.5 mL/min. درجه حرارة العمود هي 25 درجه مئوية. قياس الامتصاص للاشعه فوق البنفسجية/المرئية كاشف في λ 393 nm ، والكشف عن الفلورسنت في المستوي = 393 nm ، الاسم = 470 nm. يتم تحديد وقت الاستبقاء عن طريق تشغيل منحني القياسية CoA bimane قبل كل مجموعه من العينات.
  4. تسجيل المنطقة تحت قمة CoA-bimane لكل عينه وقارن مع المنحني القياسي لحساب بمول من CoA-bimane حقن علي العمود hplc. ويستخدم المنحني القياسي لامتصاص CoA-bimane لعينات الانسجه ، ويستخدم المنحني المعياري لزراعه النسيج بالنسبة لعينات الانسجه.
  5. وبما ان قيم CoA-bimane تمثل إجمالي CoA لكل عينه ، فانها تطبع إلى عدد الخلايا القابلة للحياة لعينات الثقافة ، أو الوزن الرطب mg لعينات الانسجه (الشكل 6). بدلا من ذلك ، احسب إجمالي قيم CoA بعد التطبيع إلى الحمض النووي أو محتوي البروتين لكل عينه. يمكن تحديد محتوي الحمض النووي أو البروتين بشكل منفصل باستخدام عينه من المكونات التي تتم ازالتها اثناء اعداد العينة قبل أضافه KOH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد تم تطوير طريقه سريعة وموثوق بها نسبيا للكشف عن مجموع coa في الخلايا والانسجه مثقف من قبل نظر ثيول من coa إلى وكيل الفلورسنت باستخدام mbbr ، ومن ثم تنقيه ديريفاتيزيد coa-bimane باستخدام المرحلة العكسية hplc. يتم إنشاء منحني قياسي لأول مره ، حيث يتم حقن كميات معروفه ومتزايدة من معيار CoA-bimane بشكل فردي ويتم رسم المناطق تحت القمم في اللونية CoA-bimane كداله للمدخلات CoA-bimane (الشكل 4). CoA-bimane لديه اقصي امتصاص في λ 393 nM ويظهر الملف الشخصي HPLC ممثل الوقت الاحتفاظ من معيار CoA-bimane علي عمود HPLC C18 (الشكل 3) باستخدام برنامج التملص في الجدول 1. ويبين الشكل 4(ا ) والشكل 4(ب) علي التوالي المنحنيات القياسية التمثيلية لشهادة CoA-bimane ، التي يكتشفها قياس الامتصاص أو الوحدات الفلورية. المنحني القياسي في الشكل 4ا يعكس حجم الامتصاص من coa-bimane في λ 393 Nm ويمثل الشكل 4ب الفلورية من coa-bimane (السابقة = 393 nm والاسم = 470 nm) تامر مقابل كميه المدخلات من CoA-bimane. ويمكن الكشف عن معيار CoA-bimane من 0.01 إلى 12,000 بمول ويغطي 106اضعاف النطاق عندما يتم الجمع بين الكشف باستخدام كل من الامتصاص والفلورية. في حين ان الحد الأدنى من الكشف عن معيار هو 0.01 بمول ، والحد الأدنى من كميه CoA-bimane في عينات تجريبية هو 0.2 بمول الذي هو حوالي 5 اضعاف أكبر من خط الأساس أو الخلفية في الكروماتوجرام. يعتمد اختيار الكشف عن طريق الامتصاص أو الفلورية من CoA-bimane علي كميه CoA الموجودة عاده في الانسجه أو الخلايا ، إلى جانب التطبيق العملي للعمل مع احجام العينات الأكبر أو الأصغر. الامتصاص مفيد عموما لعينات الانسجه لان التعامل مع 40-50 ملغ من المواد بدءا الانتعاش أفضل من 5 عينات الانسجه ملغ ، في حين فلوري مفيد عموما لعينات الخلايا المستزرعة التي هي أصغر حجما وهناك أكبر الثقة في الاستيفاء من القيم في الطرف السفلي من منحني القياسية مضان. قد المختبرات مع الكشف الامتصاص فقط النظر في زيادة أو خفض حجم عينه البداية ، وزيادة حجم حقن HPLC أو خفض حجم لأعاده التعليق عينه (القسم 5.9 أعلاه) للقياسات في الخلايا المستزرعة.

وقد تم تحسين ظروف التحلل من الانسجه والخلايا المستزرعة من خلال ضبط تركيز كوة ، والوقت ودرجه الحرارة للحضانة اللاحقة (البيانات لم تظهر). تم العثور علي الحالة المثلي لتكون 0.25 M في 55 درجه مئوية لمده 2 ساعة. تم ديريفاتيزيد مجموعه ثيول من coa الحرة بالاضافه إلى اي coa المحررة من ثيوترات من قبل رد فعل مع mbbr بعد تعديل درجه الحموضة. ويشار إلى فصل HPLC اللاحقة والتشكيلات النمطية للكشف النموذجي للكبد الفار أو خلايا C3A مثقف الإنسان في الشكل 5 كقمم حمراء ، مع الاحتفاظ بالوقت بين 11 و 12 دقيقه باستخدام برنامج التملص الموصوفة في الجدول 1. كميات نموذجيه من مواد البداية البيولوجية هي 30-40 ملغ من الكبد murine (الوزن الرطب) ، 6-8 x 106 خلايا للإنسان "مثل الكبد" خلايا C3A ، أو ~ 1.3 × 107 خلايا للخلايا HEK293T الإنسان. تم التعامل مع الخلايا C3A مع المخدرات PanK التجريبية PZ-2891 في 10 ام الذي يرفع CoA17 (الشكل 6). القياسات CoA في خلايا HEK293T عندما يتم التعبير عنها بالمبالغة PanK القياسات CoA عرض علي مجموعه واسعه (431-6925 الشامات/μL) (الشكل 6). وتكون احجام العينات المطلوبة لهذه المنهجية عمليه لتطبيقها علي العديد من السياقات التجريبية.

وقد تم حساب المساحة التي كانت تحت قمة CoA-bimane باستخدام البرامج المتوفرة مع HPLC. ويمكن تحديد حدود الذروة تلقائيا بواسطة برنامج HPLC في انتظار التعديل المناسب لقيم الإدخال لتصحيح خط الأساس وتعريف الذروة ، ولكن المختبر لدينا يفضل تعيين قمة CoA-bimane يدويا في كل كروماتوجرام ، وخاصه للعينات البيولوجية غير مالوفه.

الوقت (دقيقه) معدل التدفق (مل/دقيقه) % A % B منحني
0 0.5 90 10 0
2 0.5 90 10 6
6 0.5 85 15 6
18 0.5 60 40 6
23 0.5 60 40 6
25 0.5 90 10 6
30 0.5 90 10 66

الجدول 1: برنامج HPLC للفصل بين CoA وبيميني. العازلة A: 50 mM KH2PO4، pH 4.6 ؛ العازلة B: اسيتلونيتريل. الخلط بين المخزن المؤقت A و B المخزن المؤقت يتبع المنحني 6 وهو التدرج الخطي ، مع منحني المتداخلة 8 وهو التدرج مقعره متوسطه.

Figure 1
الشكل 1 الانزيم المساعد A مسار التخليق الحيوي. بانتوثينات كيناز (PanK) يحفز فوسفونات من بانتوثينات (فيتامين ب5) إلى 4 ′-فوسفوبوانتونات في الخطوة الاولي من التخليق الحيوي CoA. يتم اتباعها تشكيل فوسفوبوانتونات بالتكثيف مع السيستين المحفز بواسطة 4 ′-فوسفوبيوانتوثيلسيستين synthase ومن ثم نزع الكربوكسيل لتشكيل 4 ′-فوسفبيوانتيثيني بواسطة 4 ′-فوسفوبوانثونويلسيستين decarboxylase. يتم تحويل 4 ′-فوسفبيوانتيثيني إلى انزيم A (CoA) في عمليه من خطوتين تحفزها CoA Synthase. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2-رد فعل mBBr مع CoA. Monobromobimane (mBBr) مختلطة مع CoA-SH (CoA الحرة) وحضنت في درجه حرارة الغرفة لمده 2 ساعة في الظلام. غير فلوري mBBr يصبح الفلورسنت عند منضم إلى CoA لتشكيل CoA-bimane. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تتبع HPLC الامتصاص من CoA-bimane القياسية. تم فصل CoA بيميني علي عمود الجوزاء C18 باستخدام برنامج HPLC في الجدول 1. يتم الاشاره إلى وقت الاستبقاء النموذجي (الحد الأدنى) من قبل وحدات الإجهاض (AU). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: المنحنيات القياسية من CoA-bimane المكتشفة بواسطة الامتصاص أو الفلورية. (ا) قيس المنحني المعياري المقيس باستخدام وحدات الكشف عن الامتصاص لشهادة CoA-bimane عند λ 393 نانومتر. وعاده ما يتم تقييم عينات الانسجه باستخدام منحني الامتصاص القياسي. (ب) المنحني القياسي يقاس باستخدام وحدات الكشف عن الفلورية لشركه CoA-bimane في الشكل = 393 نانومتر ، الاسم = 470 نانومتر. عاده ما يتم تقييم الخلايا المستزرعة لمحتوي CoA باستخدام المنحني القياسي الفلوري. يتم تقييم المعايير المكررة (والعينات) بشكل روتيني. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: اثار HPLC من الكبد النموذجي أو عينات الخلايا المستزرعة. (ا) التعرف علي المحتوي في استخراج كبد الفئران وتحديده كميا. ويشار إلى وحدات الامتصاص (الاتحاد الافريقي). (ب) تحديد المحتوي في الخلايا المستزرعة HEPG2/C3A وتقديره كميا. ويشار إلى وحدات الانبعاثات الفلورية (الاتحاد الأوروبي). وتظهر قمم CoA-bimane باللون الأحمر. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6 مستويات CoA في الكبد الفار ، مثقف C3A و HEK293T الخلايا. (ا) CoA القياس في الكبد الفار من بانتوثينات كيناز المغلوب (Pank1-/-) ومطابقه البرية من نوع (WT) الحيوانية. Pank1-/-الحيوانية لديها اقل CoA في الكبد مقارنه بالوزن الحيوانية نظرا لغياب Pank1 التعبير9. تم الحصول علي البيانات باستخدام 5 الفئران الذكور لكل النمط الجيني ويتم تمثيلها باعتبارها متوسط ± SEM. (ب) مستويات CoA في خلايا HEPG2/C3A المعالجة اما ثنائي ميثيل سولفوكسيد (مراقبه المركبات) أو PZ-2891 ، وهو دواء تجريبي ينظم نشاط pank في 10 uM 17. يتم رفع مستوي CoA الخلوية بعد حضانة 24 ساعة مع PZ-2891. (C) مستويات CoA في خلايا HEK293T المنقولة اما مع ناقل فارغ pcdna 3.1 ، أو cdnas ترميز الإنسان الاشكال isoforms: PANK1β ، PANK2m وهو النضج ، ومعالجتها ايزوفورم PANK2 الإنسان ، أو PANK3. مستويات CoA مرتفعه بواسطة التعبير الفوقي لجميع الاشكال النشطة PANK isoforms. والبيانات الموجودة في (ب) و (ج) ماخوذه من عينات ثلاثية النسخ المستقلة وهي ممثله بوصفها المتوسط ± SEM. تم اجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار t غير المقترن وتظهر قيم الاهميه باللون الأحمر. والبيانات الموجودة في اللوحتين (ب) و (ج) مقتبسه من شارما وآخرين. 12الرجاء انقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا نظهر اجراء موثوق به ، خطوه بخطوه لقياس إجمالي CoA في الخلايا والانسجه الحيوانية مع مجموعه واسعه من الكشف الخطي التي يمكن الوصول اليها في العديد من المختبرات التي لديها HPLC مع اما الامتصاص أو فلوري كاشف الإنتاج. وبدلا من ذلك ، فان قياس الطيف الكتلي هو أسلوب شائع لتقييم شهادة الاصاله والتوثيق ، ولكنه ليس متاحا علي نطاق واسع بسبب تكلفه الاجهزه والمعارف المتخصصة اللازمة لتطوير المنهجية وتفسير البيانات. المسمية بالنظائر CoA التي هي مناسبه للاستخدام كمعيار داخلي للقياس الكمي من CoA الحرة في الطيف الكتلي ليست متاحه تجاريا ، ولم يتم الكشف عن CoA الحرة من قبل الصك مع نفس حساسية CoA ثيوترات مثل اسيتيل-CoA. وهكذا ، فان مستويات CoA الحرة غالبا ما يتم الاستهانة بها بشكل فاضح من خلال قياس الطيف الكتلي ما لم تتم مقارنه بيانات المخرجات بمنحني معايره معيار CoA.

قارننا طريقه وصفها هنا مع طريقه مختلفه المستخدمة سابقا في المختبر لدينا وجدت أكبر الانتعاش CoA من الكبد الفار ، 123.4 ± 7.9 pmol/ملغ الوزن الرطب ، مع هذا الأسلوب الحالي بالمقارنة مع ~ 80 pmol/ملغ الوزن الرطب باستخدام المقايسة الانزيميه التي ديريفاتيزيد الحرة CoA مع العلامة المشعة28. طريقه قياس مجموع CoA الموصوف هنا اقل تعقيدا بكثير ، وأسرع وأسهل للسيطرة مقارنه بالطريقة المستخدمة سابقا في مختبرنا28. سابقا ، تم تحديد CoA بعد استخراج الهكسان من الخلية محلله وأخضعت لتحويل الانزيميه إلى المشعة [14ج] لوريل-coa توسطت فيها القولونية اسيسيكيا كولاي -coa سينثاتيز (fadd). وتحللت سلسله قصيرة للذوبان في الحمض acyl-coas وحمض-غير قابله للذوبان طويلة السلسلة acyl-coas في الخلية محلله مع كوة لإنتاج coa الحرة ثم اخضع لاستخراج الهكسين قبل التحويل الانزيميه إلى الحرة coa29. علي الرغم من ان هذا الاجراء السابق كان له خصوصية جيده وحساسية ، في الممارسة العملية المطلوبة 2 أيام عمل لإكمال والمؤتلف e. كولاي acyl-CoA سينثاتيز كان لا بد من اعداد وتنقيه وقياس للنشاط الانزيمي محدده قبل تحليل CoA. كما انه يتطلب أجهزه قادره علي كشف وقياس النظائر المشعة التي هي اقل شيوعا بكثير في المختبرات الطبية الحيوية في التاريخ الحديث. الطريقة الحالية كما هو موضح هنا هو الأكثر ملاءمة لاهتمامنا البحوث في بانتوثينات كيناز (PanK). PanK يتحكم في تدفق من خلال المسار الاصطناعي CoA التالي فان مستوي CoA الإجمالي هو قراءات للنشاط PanK في العينات البيولوجية.

تبريد التفاعلات الايضيه في عينه بيولوجية للحفاظ علي كميه حقيقية من CoA يتطلب الرعاية والسرعة وهو أمر بالغ الاهميه لهذا الاجراء. أزاله البروتين السريع مع حمض أو المذيبات العضوية ، أو فلاش تجميد العينات هي طريقتين التي تم استخدامها في30،31الماضية. في الطريقة الحالية ، يتم أضافه المياه فائقه البرودة الجليد بسرعة إلى الجليد الباردة الخلايا التي تغسل من الثقافات ، والخلايا الملتصقة بالاضافه إلى الماء ثم كشط قباله طبق الثقافة قبل نقلها إلى كوة. تجميد تعليق الخلية المستزرعة في [كوة + المياه] للتخزين في-80 درجه مئوية قبل اعداد العينة هو نقطه توقف مقبوله. ومع ذلك ، ينبغي مقارنه قيم CoA من عينات الخلايا المجمدة بتلك الماخوذه من العينات المعدة حديثا لتحديد ما إذا كان هناك فقدان كبير لاشاره CoA. وقد وقعت خسارة ≤ 10 ٪ CoA في ايدينا التالية تجميد عينه الخلية ، ويمكن ان تكون ذات صله لفتره طويلة من العينة في كوة التي تحتاج إلى السيطرة عليها. يتم تجميد قطع الانسجه الحيوانية بسرعة علي رقاقه صغيره ' طوف ' تطفو علي LN2 مباشره بعد استئصال الانسجه من الرحيم الحيوانية. احجام العينات من 5 مغ إلى 60 ملغ من الانسجه المجمدة المناسبة لهذا الأسلوب مع عوائد CoA الخطية. مره واحده المجمدة ، عينات الانسجه المخزنة في-80 درجه مئوية مستقره لمده 3 أشهر علي الأقل ، شريطه ان لا يحدث ذوبان متقطعه.

اعداد العينة قبل تحليل HPLC ليست عاليه الانتاجيه ويتطلب كامل العمل نصف يوم. من المستحسن ان المشغل يعالج بحد اقصي 30 عينات في وقت واحد ، بدءا من تجانس مجموعه من 15 عينات تليها تجانس المجموعة الثانية من 15 عينات خلال الحضانة 2 ح مع كوة لمجموعه الاولي. كانت فتره حضانة كوة الأمثل لأول مره باستخدام التي تم شراؤها CoA ثيوترات مع أوقات الحضانة تتراوح بين 30 دقيقه إلى 4 ساعة ، ومن ثم تم اختيار حضانة 2 ح لاستيعاب الوقت لكامل CoA ثيويستر التحلل في مجموعه متنوعة من عينات الانسجه ، تتراوح من الهيكل العظمي العضلات إلى الكبد8. يتم تعيين حضانة لاشتقاق CoA مع mBBr في 2 ح في الأس الهيدروجيني تقريبا 8 ويضاف 20 اضعاف الزائدة mBBr لتحويل تماما CoA في العينات البيولوجية. سيتم ديريفاتيزيد الجماليات سولهيدراريل من البروتينات والأيض غير CoA مثل كارنيتين أو الجلوتاثيون في العينة بالاضافه إلى CoA ، وتم حساب الفائض 20 اضعاف علي أساس المبلغ المتوقع من إجمالي الكبد CoA التي لديها اعلي مستوي بين الانسجه. يتم تقليل درجه الحموضة قبل الاحتضان مع mBBr لان بروموبيوم بشكل عام اقل تفاعلا تجاه الشواذ الآخرين مثل الأمينات والكربوكسيلات في المحاليل المائية الأكثر حياديه. يجب ان لا يتجاوز وقت اشتقاق 2 ح لتجنب أو تقليل رد الفعل مع ثيولس البروتين26. يحتاج المرء إلى استخدام المخازن المؤقتة غير النونويه لتقليل والحفاظ علي درجه الحموضة لان وجود الانيونات العازلة في تركيزات عاليه يمكن ان تتداخل مع اشتقاق mBBr من CoA.

ويتم تنظيف العينات علي عمود مهندسي البناء يدويا في مختبرنا ويمكن تنفيذها بمساعده مشعب الفراغ لتقصير الوقت المطلوب لهذه الخطوة. استعاده جيده من ديريفاتيزيد CoA من العمود مهندس البناء والتوثيق يمكن التوصل اليها بشكل روتيني ، وهذا تم تحديده علي حده باستخدام المشعة [13C] coa ثيوترات التي يتم الاحتفاظ بها أيضا علي عمود مهندس البترول الخاص. وكان الانتعاش من [13ج] اسيتيل-coa 97.6 ٪ والانتعاش من [13c] بالميتويل-coa كان 96.1 ٪. وعاده ما يتم تنفيذ تبخر العمود الخاص بالنيتروجين تحت غاز النتروجين بين عشيه وضحيها في المختبر الخاص بنا علي سبيل الراحة ، ولكن يمكن الانتهاء من التجفيف في غضون 4 ساعات تحت غاز النيتروجين أو باستخدام مكثف speedvac. وترتبط الخطوات الأكثر اهميه في الأسلوب لتعديل درجه الحموضة ويمكن التحقق مع شرائط ورقه الأس الهيدروجيني علي طول الطريق. بالنسبة للتحلل المائي KOH ، يجب ان يكون الأس الهيدروجيني ≥ 12 لتحقيق الإفراج الكامل عن ثيوستر من CoA. الأس الهيدروجيني يحتاج إلى ان يكون 7.8 – 8.5 لدعم التفاعل من اشتقاق, وبعد اكتمال اشتقاق, وينبغي تعديل درجه الحموضة لتصبح حمضيه جدا, حول الأس الهيدروجيني 1-2, من أجل CoA-bimane لربط العمود مهندس البترول العام. وينظف العمود العينة لأزاله الفائض من المخدرات غير المتفاعلة وبعض المواد البيولوجية غير المرتبطة بها.

تم تصميم برنامج HPLC بحيث غسل وأعاده تاخيرمن من عمود C18 كافيه للقضاء علي الخلفية والمرحل إشارات بين العينات. يتم إدخال عينات فارغه المياه بعد كل 5 عينات في عينه التجريبية تعيين كاجراء وقائي لرصد المرحل ممكن بين مجموعات وضمان نظافة العمود. يمكن ان يحدث خطا عرضيه من حقن عينه غير صحيح عند استخدام حاقن عينه مؤتمتة ل HPLC ، وهذا يمكن بسهوله التحقق من خلال مقارنه وحدات التخزين المتبقية في قارورة عينه بعد الحقن أو التفتيش من القمم غير ذات الصلة CoA في الناتج الكروماتوجرام. إذا تجاوزت قيم CoA النطاق الخطي لمنحني المعايرة للكشف عن الفلورية ، فمن المرجح ان تكون القيم في النطاق للكشف عن امتصاص الاشعه فوق البنفسجية. وإذا لم يكن الأمر كذلك ، فان تخفيف العينة بحجم معروف من المياه يمكن ان يقلل من الاشاره إلى ان تكون في النطاق الخطي وان الحسابات ينبغي ان تاخذ اي عامل تخفيف في الاعتبار.

وسوف تختلف مستويات CoA بين سلالات الماوس الفطرية مع الخلفيات الوراثية المختلفة ، علي الرغم من ان القيم قابله للتكرار عندما يتم الحصول علي عينات بيولوجية من نفس السلالة في ظل نفس الظروف. وقد قدرنا CoA في عده خطوط الماوس مختلفهفي دراساتمختلفه 10 ،12،16،17. كما تم قياس CoA في العديد من خطوط الخلايا المستزرعة16،17 باستخدام اما الخلايا الاوليه أو الخلد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

كتبت MWF ، CS و SJ الورقة ، MWF و CS قدمت البيانات والأرقام ، كور تصميم التجارب ومراجعتها بشكل نقدي المخطوطة. SJ و COR هي المخترعين علي طلب براءات الاختراع المعلقة (PCT/US17/39037) "جزيئات جزيء صغيره من المكورات بانتوثينات" التي عقدتها مستشفي سانت جود للبحوث الأطفال التي تغطي المجمع 2891 المشار اليها في هذه المقالة.

Acknowledgments

ويقر المؤلفون بتمويل البحوث التي ترعاها شركه CoA Therapeutics, Inc. ، وهي شركه تابعه لبريدجبيو LLC ، والمعاهد الوطنية للمنح الصحية GM34496 ، والجمعيات الخيرية السورية اللبنانية المرتبطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column Millipore-Sigma 54127-U
coenzyme A Avanti Polar Lipids 870700
Gemini C18 3 μm 100 Å HPLC column Phenomenex 00F-4439-E0
monobromobimane ThermoFisher Scientific M-1378
Omni-Tip probe tissue disrupter Omni International 32750H
Parafilm Fisher S37440
PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer ThermoFisher Scientific NC0530997
Spin-X centrifuge tube filter CoStar 8161
Trizma-HCl Fisher T395-1
Waters 2475 fluorescence detector Waters 2475
Waters 2489 UV-Vis detector Waters 2489
Waters e2695 separations module Waters e2695

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abiko, Y. Metabolic Pathways. Greenburg, D. M. 7, Academic Press, Inc. Ch. 7 1-25 (1975).
  2. Leonardi, R., Zhang, Y. -M., Rock, C. O., Jackowski, S. Coenzyme A: Back in action. Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).
  3. Jackowski, S., Rock, C. O. Regulation of coenzyme A biosynthesis. Journal of Bacteriology. 148, 926-932 (1981).
  4. Robishaw, J. D., Berkich, D. A., Neely, J. R. Rate-limiting step and control of coenzyme A synthesis in cardiac muscle. Journal of Biological Chemistry. 257, 10967-10972 (1982).
  5. Di Meo, I., Carecchio, M., Tiranti, V. Inborn errors of coenzyme A metabolism and neurodegeneration. Journal of Inherited Metabolic Disease. 42, 49-56 (2019).
  6. Zhou, B., et al. A novel pantothenate kinase gene (PANK2) is defective in Hallervorden-Spatz syndrome. Nature Genetics. 28, 345-349 (2001).
  7. Dusi, S., et al. Exome sequence reveals mutations in CoA synthase as a cause of neurodegeneration with brain iron accumulation. American Journal of Human Genetics. 94, 11-22 (2014).
  8. Dansie, L. E., et al. Physiological roles of the pantothenate kinases. Biochemical Society Transactions. 42, 1033-1036 (2014).
  9. Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state. PLoS ONE. 5, 11107 (2015).
  10. Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance. Diabetologia. 57, 1466-1475 (2014).
  11. Israel, B. C., Smith, C. M. Effects of acute and chronic ethanol ingestion on pantothenate and CoA status of rats. The Journal of Nutrition. 117, 443-451 (1987).
  12. Garcia, M., Leonardi, R., Zhang, Y. M., Rehg, J. E., Jackowski, S. Germline deletion of pantothenate kinases 1 and 2 reveals the key roles for CoA in postnatal metabolism. PLoS One. 7, 40871 (2012).
  13. Corbin, D. R., et al. Excess coenzyme A reduces skeletal muscle performance and strength in mice overexpressing human PANK2. Molecular Genetics and Metabolism. 120, 350-362 (2017).
  14. Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver. Journal of Lipid Research. 60, 1005-1019 (2019).
  15. Shumar, S. A., et al. Induction of neuron-specific degradation of Coenzyme A models pantothenate kinase-associated neurodegeneration by reducing motor coordination in mice. PLoS ONE. 10, 0130013 (2015).
  16. Zano, S. P., Pate, C., Frank, M., Rock, C. O., Jackowski, S. Correction of a genetic deficiency in pantothenate kinase 1 using phosphopantothenate replacement therapy. Molecular Genetics and Metabolism. 16, 281-288 (2015).
  17. Sharma, L. K., et al. A therapeutic approach to pantothenate kinase associated neurodegeneration. Nature Communications. 9, 4399 (2018).
  18. Alvarez-Cordoba, M., et al. Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation. Molecular Neurobiology. 56, 3638-3656 (2019).
  19. Arber, C., et al. iPSC-derived neuronal models of PANK2-associated neurodegeneration reveal mitochondrial dysfunction contributing to early disease. PLoS One. 12, 0184104 (2017).
  20. Di Meo, I., et al. Acetyl-4'-phosphopantetheine is stable in serum and prevents phenotypes induced by pantothenate kinase deficiency. Scientific Reports. 7, 11260 (2017).
  21. Nishikawa, T., Edelstein, D., Brownlee, M. The missing link: a single unifying mechanism for diabetic complications. Kidney International Supplements. 77, 26-30 (2000).
  22. Tsuchiya, Y., Pham, U., Gout, I. Methods for measuring CoA and CoA derivatives in biological samples. Biochemical Society Transactions. 42, 1107-1111 (2014).
  23. Demoz, A., Netteland, B., Svardal, A., Mansoor, M. A., Berge, R. K. Separation and Detection of Tissue Coash and Long-Chain Acyl-Coa by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography after Precolumn Derivatization with Monobromobimane. Journal of Chromatography. 635, 251-256 (1993).
  24. Shimada, K., Mitamura, K. Derivatization of Thiol-Containing Compounds. Journal of Chromatography B. 659, 227-241 (1994).
  25. Minkler, P. E., Kerner, J., Ingalls, S. T., Hoppel, C. L. Novel isolation procedure for short-, medium-, and long-chain acyl-coenzyme A esters from tissue. Analytical Biochemistry. 376, 275-276 (2008).
  26. Newton, G. L., Fahey, R. C. Determination of biothiols by bromobimane labeling and high-performance liquid chromatography. Methods in Enzymology. 251, 148-166 (1995).
  27. Radkowsky, A. E., Kosower, E. M. Bimanes .17. (Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones (Halo-9,10-Dioxabimanes) - Reactivity toward the Tripeptide Thiol, Glutathione. Journal of the American Chemical Society. 108, 4527-4531 (1986).
  28. Zhang, Y. M., et al. Chemical knockout of pantothenate kinase reveals the metabolic and genetic program responsible for hepatic coenzyme A homeostasis. Chemistry & Biology. 14, 291-302 (2007).
  29. Tokutake, Y., Onizawa, N., Katoh, H. Toyoda A,Chohnan S. Coenzyme A and its thioester pools in fasted and fed rat tissues. Biochemical and Biophysical Research Communications. 402, 158-162 (2010).
  30. Shibata, K., Nakai, T., Fukuwatari, T. Simultaneous high-performance liquid chromatography determination of coenzyme A, dephospho-coenzyme A, and acetyl-coenzyme A in normal and pantothenic acid-deficient rats. Analytical Biochemistry. 430, 151-155 (2012).
  31. Chohnan, S., Takamura, Y. A simple micromethod for measurement of CoASH and its use in measuring the intracellular levles of CoASH and short chain acyl-CoAs in Escherichia coli K12 cells. Agricultural and Biological Chemistry. 55, 87-94 (1991).

Tags

الكيمياء الحيوية ، العدد 151 ، الانزيم المساعد A ، الخلايا المستزرعة ، الانسجه الحيوانية ، monobromimane ، اللوني السائل عالي الضغط ، استخراج المرحلة الصلبة
القياس الكمي لانزيم A في الخلايا والانسجه
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Frank, M. W., Subramanian, C., Rock, … More

Frank, M. W., Subramanian, C., Rock, C. O., Jackowski, S. Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues. J. Vis. Exp. (151), e60182, doi:10.3791/60182 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter