Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kvantificering af coenzym A i celler og væv

Published: September 27, 2019 doi: 10.3791/60182
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Infectious Diseases, St. Jude Children's Research Hospital

Summary

Denne metode beskriver prøveforberedelse fra dyrkede celler og animalsk væv, ekstraktion og derivatisering af coenzym A i prøverne, efterfulgt af højtryksvæskekromatografi til rensning og kvantificering af det derivatiserede coenzym A ved absorbans eller fluorescens detektering.

Abstract

Ny forskning har afsløret, at den cellulære coenzym A (CoA) forsyning kan blive begrænsende med en skadelig indvirkning på vækst, metabolisme og overlevelse. Måling af cellulære CoA er en udfordring på grund af sin relativt lave overflod og den dynamiske omdannelse af gratis CoA til CoA thioesters at, til gengæld, deltage i talrige metaboliske reaktioner. En metode er beskrevet, der navigerer gennem potentielle faldgruber under prøveforberedelse til at give en analyse med et bredt lineært detekteringsområde, der er egnet til brug i mange biomedicinske laboratorier.

Introduction

Coenzym A (CoA) er en essentiel cofaktor i alle levende organismer og syntetiseres fra pantothensyre, også kaldet pantothenat (salt af Pantotensyre) eller vitamin B5. CoA er den største intracellulære bærer af organiske syrer, herunder kortkædede syrer såsom acetat og succinat, gren-kæde syrer såsom propionat og methylmalonat, langkædede fedtsyrer såsom palmitat og oleat, meget langkædede fedtsyrer såsom flerumættede fedtsyrer og xenobiotika såsom valproinsyre. Den organiske syre danner en thioester-forbindelse enzymatisk med CoA for at gøre det muligt at bruge det som substrat i over 100 reaktioner i intermediær metabolisme1. CoA-thiostere er også allosteriske regulatorer og transkriptionelle aktiverere. Det er nu værdsat2 , at den cellulære samlede COA-forsyning er reguleret3,4; således kan CoA tilgængelighed være begrænsende, og at ægthedsbeviset mangler kan være katastrofale, som eksemplificeret ved nedarvede genetiske lidelser, der påvirker CoA biosyntese5. Pantothenate kinase katalyserer det første trin i CoA-biosyntesen (figur 1) og Pantothenate kinase associeret neurodegeneration, kaldet pkan, er forårsaget af mutationer i PANK2 -genet6. CoA syntase, kodet af coasyn genet, katalyserer de sidste to trin i COA biosyntese (figur 1) og Coasy protein-associeret neurodegeneration, kaldet Copan, er forårsaget af en mutation i coasyn gen7. Både pkan og Copan er nedarvede neurodegenerative sygdomme forbundet med jernophobning i hjernen og COA mangler bagvedlig sygdoms patologier.

Cellulære niveauer af total CoA varierer blandt væv8 og total COA kan stige eller falde under en række fysiologiske, patologiske og farmakologiske tilstande. Leveren CoA stiger under brændstof skifte fra fed til fastende tilstand9, og lever COA niveauer er unormalt højt i leptin-mangel overvægtige mus10. Lever CoA falder som reaktion på kronisk ethanol indtagelse11. Hjernen CoA niveauer i Pank2 knockout musemodel er deprimeret i perinatal periode, men senere i voksen scenen hjernen COA indhold svarer til vild-type niveauer, hvilket indikerer en adaptiv COA respons under udvikling12. Manipulation af vævs COA-indhold ved transgenese eller genleveringsmetoder påvirker metaboliske og neurale funktioner13,14,15. Præklinisk udvikling af potentielle terapier for pkan eller Copan omfatter celle-eller vævs-COA-målinger som indikatorer for effekt16,17,18,19,20 . Evaluering af alle disse betingelser og deres metaboliske eller funktionelle konsekvenser kræver en kvantitativ metode til måling af det samlede ægthedsbevis.

En nøjagtig, pålidelig analyse til måling af CoA i biologiske prøver er en teknisk udfordring i mange laboratorier. Desværre er der ingen prøver til rådighed til at evaluere eller kvantificere CoA eller CoA thioesters i intakte celler, selv om analoner af naturlige CoA thioesters har været meget anvendt som mekaniske sonder i undersøgelser af CoA ester udnytter enzymer21. Omdannelsen af COA, med en fri sulfgidrile (-sh), til en COA thioester (eller omvendt) er hurtig i celler eller animalsk væv under overførsel til et andet miljø og under cellelyse. Talrige acyl-CoA-synthetaser og acyl-CoA-thioesteraser i celler formidler interkonverteringerne inden for CoA-puljen, og yderligere enzymer, der anvender CoA-thiostere som substrater, forbliver aktive i biologiske prøver, indtil de slukkes af kemiske eller fysiske Betyder. Den off-loading af acyl-grupper fra CoA til carnitin af acyl-transferaser er et eksempel inden for netværket af reaktioner, der kan ændre CoA/CoA thioester fordeling. Radioaktive røbestoffer kan bruges til at måle satserne for CoA syntese i celler. De nuværende metoder til måling af CoA-og CoA-derivater i biologiske prøver er blevet revideret22 og omfatter koblede enzymatiske spektrofotometriske analyser, højtryksvæskekromatografi og massespektrometri-baserede procedurer. Men disse metoder er ofte fokuseret på bestemte CoA molekyle arter og er blinde for variation af den samlede CoA pulje. De koblede enzymatiske analyser kræver generelt større mængder inputmateriale på grund af lav detekteringsfølsomhed og har et begrænset område af linearitet.

Vores laboratorium har udviklet en pålidelig procedure for kvantificering af total CoA i dyrkede celler og animalsk væv. Strategien omfatter hydrolyse af alle CoA thioesters at give kun gratis CoA under prøveforberedelse, snarere end at gøre en indsats for at vedligeholde og analysere hele spektret af CoA-arter. Proceduren er en samling af individuelle offentliggjorte metoder til Prøvetilberedning, ægthedsbevis, rensning og identifikation efter højtryksvæskekromatografi (HPLC) og kvantificering af det derivatiserede ægthedsbevis ved absorbans eller Fluorescens detektering23,24,25. De afgørelser om ægthedsbeviser, der er opnået ved hjælp af denne procedure, har gjort det muligt at forstå ægthedsbeviset og udvikle en terapeutisk tilgang til behandling af ægthedsbeviser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den i denne protokol omhandlede dyre procedure blev udført i overensstemmelse med protokollerne 323 og 556 og specielt godkendt af St. Jude children's Research Hospital institutionel dyrepleje-og Brugsudvalg.

1. forberedelse af løsninger

Bemærk: Brug ultrarent vand til alle opløsninger, og når det er angivet i procedurer.

  1. Forbered 1 mM kaliumhydroxid (KOH) i vand.
  2. Forbered 0,25 M KOH i vand.
  3. Forbered 1 M Trizma-HCl i vand og justér til pH 8,0.
  4. Forbered 100 mM monobromobiman (mBBr) i acetonitril (Optima grade). Stamopløsninger af mBBr er stabile ved-20 °C i mange måneder, forudsat at de holdes i mørke, da udsættelse for lys kan photolyze monobromobiman til bimane26.
  5. Forbered vaske buffer til fastfaseekstraktion (SPE) kolonne: 50% methanol (Optima grade) + 2% eddikesyre.
  6. Forbered Elueringsbuffer til SPE-kolonne: 95% ethanol (HPLC-kvalitet) indeholdende 50 mM ammonium format.

2. fremstilling af CoA-Biman standard

  1. Købe en høj kvalitet CoA standard fra en velrenommeret kilde (f. eks Avanti Polar lipider, Inc.).
  2. Forbered en høj koncentration stamopløsning af CoA i 20 mM Tris, pH 8. Mængden af ægthedsbevis i den høje koncentrations bestand bestemmes eller bekræftes ved spektrofotometrisk absorbans ved λ 260 nm (ɛ = 16.800 M-1∙ cm-1). Tilsæt 4-fold Molar overskydende mBBr; vortex på høj for 10 s. For eksempel, for 10 mM CoA i buffer, tilsæt 40 mM mBBr. MBBr er tilføjet i overskydende for at sikre, at alle ægthedsbeviset er derivatized.
  3. Inkubér ved stuetemperatur i 4 timer i mørket uden at ryste for at gøre ægthedsbeviset med mBBr. mBBr reagerer med thiol-gruppen af ægthedsbeviset, og det er pH og temperaturafhængig27. Tilsætning af mBBr omdanner ægthedsbeviset til et vandopløseligt fluorescerende (eller ultraviolet absorbant) CoA-Biman (CoA-Biman; Figur 2).
  4. Tilsæt 100 μL eddikesyre og vortex på høj for 10 s for at stoppe reaktionen.
  5. Centrifugeres ved 2.000 x g i 15 minutter for at fjerne bundfald.
  6. Rengør supernatanten med en SPE-Column for at fjerne den ureagerede mBBr (beskrevet nedenfor). Filtreringen og centrifugeringen af eluatet er ikke nødvendig efter oprydningen af SPE-søjlen (punkt 5,8).
  7. Eluatet fra SPE-søjlen, der indeholder CoA-Biman, opsamles i et forvejet rør, som er tørt under nitrogen gas, og som vejer og konstruerer en standard kalibreringskurve med kendte mængder CoA-Biman.
    1. Se ægthedsbeviset-bimane-standarden for HPLC (se nedenfor) med absorbans detektion ved både λ 260 (adenin-delen) og λ 393 (Biman-delen) og sammenfald af begge toppe i kromatogrammet.
    2. Bekræft mængden af CoA-Biman-standarden i den høje koncentrations bestand med λ 260 nm (ɛ = 16.800 M-1∙ cm-1).
  8. Registrer HPLC-retentionstiden til identifikation af CoA-Biman i eksperimentelle prøver ved hjælp af CoA-Biman-standarden.
  9. Der opbevares aliquoter af den høje koncentrations bestand af CoA-Biman-standarden, som er beskyttet mod lys og opbevares ved-20 °C i op til 2 år. Undgå gentagen optøning og genfrysning.

3. udvinding og derivatisering af CoA i dyrkede celler

  1. Høst tilhængere celler i kulturen, når de nærmer sent subconfluent tætheer. For eksempel er humane HepG2/C3A celler vokset til en tæthed på 6-8 x 106, eller hek 293T celler dyrkes til en tæthed på ~ 1,3 x 107 pr 100 mm skål.
    1. Brug duplikerede eller tredobbelte kulturer rutinemæssigt til CoA-bestemmelser. Inkuber separate kultur retter parallelt med prøve cellekulturer for at bestemme levedygtigt celle nummer. Beregn mængden af CoA pr. 106-107 celler efter HPLC rensning.
  2. Aspirere kulturmedium ud af skålen. Hurtigt vaske celler på skålen med iskold fosfat-Buffered saltvand (PBS) for at fjerne eventuelle resterende medium og aspirere PBS fra skålen. Hurtigt vaske celler med iskold vand for at fjerne resterende PBS og aspirere vandet fra skålen hurtigt. Undgå at forstyrre de vedlige celler, når du tilføjer PBS eller vand.
  3. Tilsæt 1 mL iskold vand til kultur skålen. Skrabe celler i det kolde vand i skålen og overføre cellesuspensionen til et glas test rør indeholdende 400 μL af 0,25 M KOH og 1,5 mL vand.
    1. Bland suspensionen kraftigt med vortex på høj for 10 s. Derefter dækkes tæt med paraffin film og Inkuber ved 55 °C i 1 time uden at ryste i et vandbad. Prøvens pH-værdi skal være ≥ 12. Den høje pH er vigtigt at hydrolysere COA thioesters og kan justeres med yderligere aliquoter af Koh hvis det er nødvendigt.
  4. Høst dyrkede celler, som vokser i suspension ved centrifugering ved lav hastighed: 136 x g i 6 minutter ved 4 °c. Vask en gang med iskold PBS, og vask derefter kortvarigt igen med koldt vand, og endelig resuspension i 2,5 mL koldt vand plus 400 μL 0,25 M KOH. Bland kraftigt og inkubatér ved 55 °C som beskrevet ovenfor.
  5. Tilsæt 160 μL af 1 M Trizma-HCl og 10 μL 100 mM mBBr og bland med vortex på høj i 10 s. Dette bringer pH til ca 8 at støtte mBBr reaktion med gratis CoA. Dæk og Inkubér prøver ved stuetemperatur i 2 timer i mørke for mBBr at reagere med thiol af CoA.
  6. Tilsæt 100 μL eddikesyre og bland med vortex på høj for 10 s for at standse reaktionen
  7. Centrifugeres ved 2.000 x g i 15 minutter for at fjerne udfældede cellerester.
  8. Fjern og Gem supernatanten i et glas testrør til den SPE-kolonne oprydning, der er beskrevet nedenfor.

4. udvinding og derivatisering af ægthedsbeviset i væv

  1. Dissekere dyrevæv stykker, omkring 0,5 cm diameter eller mindre, og blot kort (1-2 s) på absorberende papir og derefter flash fryse i flydende nitrogen og opbevares ved-80 °C indtil forarbejdning. CoA i væv hydrolyseres eller omdannes til en thioester, hvis det ikke blinker frosset. Dette trin er vigtigt for at opnå det maksimale udbytte af CoA i væv.
  2. Afvejes frosne Vævsstykker (5 – 60 mg) hurtigt, før analysen påbegyndes, og vægten for hver prøve registreres. Denne bestemmelse af våd vægt anvendes til beregning af ægthedsbeviset efter HPLC-rensning. Undgå fuldstændig optøning af vævs stykkerne.
  3. Der tilsættes 2 mL af 1 mM KOH til et glas testrør (f. eks. 13 mm x 100 mm engangs), som er beregnet til indsættelse af en sonde og vævs forstyrrelse med en rotor-stator-homogenisator. Hold røret på isen indtil brug. Dette gøres for at sikre, at prøverne homogeniseret ved en kold temperatur og ægthedsbeviset ikke ødelægges på grund af varmen genereret under homogenisering.
  4. Overfør og homogeniserer vævet (30 – 40 mg) i glas prøverøret (indeholdende kold 1 mM KOH) i 30 s. undgå fuldstændig optøning af vævet.
  5. Tilsæt 500 μL af 0,25 M KOH; vortex på høj for 10 s og holde på is, indtil alle prøver er homogeniseret. Dette vil bringe pH af prøven over 12 til at hydrolysere CoA thioesters at give total CoA (gratis CoA + hydrolyseret CoA thioesters).
  6. Inkuber prøver ved 55 °C i 2 timer i et vandbad uden at ryste for at understøtte hydrolyse.
  7. Tilsæt 150 μL af 1 M Trizma-HCl og 10 μL 100 mM mBBr; vortex på høj i 10 sekunder. Dette bringer pH til omkring 8 at støtte mBBr reaktion med gratis CoA.
  8. Inkubér prøver ved stuetemperatur i 2 timer i mørke for at sikre, at alle ægthedsbeviset er derivatiseret med mBBr.
  9. Tilsæt 100 μL eddikesyre og vortex på høj for 10 s for at standse reaktionen.
  10. Centrifuge ved 2.000 x g i 15 min til pellet udfældede cellerester.
  11. Fjern og Gem supernatanten i et glas testrør til SPE-søjlen oprydning (beskrevet nedenfor).

5. prøve oprydning med fastfaseekstraktion (SPE) kolonne

  1. Ved stuetemperatur skal hver engangs 2-(2-pyridyl)-ethyl-silicagel kolonne (1 mL størrelse) ækvibreres med 1 mL vaske buffer for at sikre, at den funktionelle pyridyl-gruppe er protoneret og vil fungere som en anion-veksler. 2-(2-pyridyl)-ethylsilicagel er en svag anionbytteren, som er ideel til CoA-Biman ved en grundlæggende pH. 2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel har en pKa af 6 og eluering er udført pH ≥ 7.
  2. Tilføj prøve supernatanten (trin 4,11) til kolonne og Indsaml eluatet.
  3. Vask søjlen to gange med 1 mL vaske buffer for at fjerne eventuelle ikke-tilbageholdte arter.
  4. Vask søjlen én gang med 1 mL vand.
  5. Vask søjlen to gange med 1 mL Elueringsbuffer i et separat glas testrør (12 mm x 75 mm) for at indsamle CoA-Biman.
  6. Tør CoA-bimane prøve i rør under nitrogen gas til tørhed. Den tørrede prøve er stabil ved stuetemperatur indtil videre anvendelse. Tætning og helt dække røret og opbevare.
  7. Når du er klar til HPLC-analyse, resuspension prøve i 300 μL vand og blandes kraftigt af vortex på høj for 10 s.
  8. Overfør resuspenderet prøve til et centrifugeglas filter (0,22 μm celluloseacetat, 2 mL størrelse) og centrifugeres ved 5.000 x g i 10 min for at fjerne eventuelle bundfald.
  9. Overfør filtreret prøve til et hætteglas, der egner sig til HPLC-injektion.

6. rensning og måling af HPLC af CoA-Biman

  1. Forbered buffere. Buffer A: 50 mM KH2po4, pH 4,6; Buffer B: acetonitril (Optima-kvalitet).
  2. Tænd for HPLC-systemet.
    Bemærk: HPLC-systemet i vores laboratorium er et vand e2695 separations modul udstyret med en 2489 ultraviolet-synlig (UV-Vis) absorbans detektor og en 2475 Fluorescensdetektor styret med styrke 3 software. Systemet har også en automatiseret prøve injektor.
  3. Hver prøve (f. eks. 20 μL) indsprøjtes for separation på en Gemini C18, 3 μm 100 Å, 4,6 mm x 150 mm kolonne ved hjælp af programmet i tabel 1 med en strømningshastighed på 0,5 ml/min. Kolonne temperaturen er 25 °C. Måling af UV/synlig detektor absorbans ved λ 393 nm og fluorescerende detektion ved λex = 393 nm, λem = 470 nm. Opbevaringstiden bestemmes ved at køre en CoA-bimane standardkurve før hvert sæt prøver.
  4. Arealet under CoA-bimane-toppen registreres for hver prøve og sammenlignes med Standardkurven for at beregne pmol af CoA-Biman, som injiceres på HPLC-søjlen. CoA-bimane absorbans standardkurven anvendes til vævsprøver, og CoA-bimane fluorescens standardkurve anvendes til vævskultur prøver.
  5. Da CoA-bimane-værdierne repræsenterer det totale ægthedsbevis for hver prøve, normaliseres antallet af levedygtige celler til kultur prøver eller mg våd vægt for vævsprøver (figur 6). Alternativt beregner du de totale CoA-værdier efter normalisering til DNA-eller proteinindhold for hver prøve. DNA-eller proteinindhold kan bestemmes separat ved hjælp af prøve-aliquoter, der fjernes under prøveforberedelse forud for KOH addition.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En relativt hurtig og pålidelig metode til påvisning af total CoA i dyrkede celler og væv er blevet udviklet ved at derivatizing thiol af CoA til et fluorescerende middel ved hjælp af mBBr, og derefter rense den derivatized CoA-Biman ved hjælp af reverse fase HPLC. Der genereres først en standardkurve, hvor kendte og stigende mængder af CoA-Biman-standarden injiceres enkeltvis, og arealerne under toppene i CoA-bimane-kromatogrammer afbildes som en funktion af input CoA-Biman (figur 4). CoA-bimane har en absorbans maksimum ved λ 393 nM, og en repræsentativ HPLC-profil viser retentionstiden for CoA-Biman-standarden på en C18 HPLC-kolonne (figur 3) ved hjælp af elueringsprogrammet i tabel 1. Repræsentative standardkurver for CoA-Biman, der påvises ved måling af absorbans eller fluorescens enheder, er vist i henholdsvis figur 4A og figur 4B. Standardkurven i figur 4A afspejler graden af absorbans af COA-biman ved λ 393 nm, og figur 4B repræsenterer fluorescensen af coa-Biman (λex = 393 nm og λem = 470 nm) afbildet i forhold til den input mængde CoA-bimane. Ægthedsbeviset-Biman-standarden kan påvises fra 0,01 til 12.000 pmol og dækker et 106-fold område, når påvisning ved hjælp af både absorbans og fluorescens kombineres. Mens den nedre grænse for påvisning af standarden er 0,01 pmol, er den nedre grænse af CoA-bimane-kvantitation i eksperimentelle prøver 0,2 pmol, som er ca. 5 gange større end baseline-eller baggrunds fluorescensen i kromatogrammet. Valget af påvisning ved absorbans eller fluorescens af CoA-Biman afhænger af den mængde ægthedsbevis, som normalt findes i væv eller celler, samt af, hvor praktisk det er at arbejde med større eller mindre stikprøvestørrelser. Absorbans er generelt nyttig for vævsprøver, fordi håndtering af 40-50 mg udgangsmateriale giver bedre genvinding end 5 mg vævsprøver, hvorimod fluorescens generelt er nyttig for dyrkede celleprøver, der er mindre i størrelse, og der er større tilliden til interpolation af værdier i den nedre ende af fluorescens standardkurve. Laboratorier med kun absorbans detektion kan overveje at forøge eller nedsætte start prøvens størrelse, øge HPLC-injektionsvolumenet eller nedsætte lydstyrken for prøve opblanding (punkt 5,9 ovenfor) til målinger i dyrkede celler.

Betingelserne for hydrolyserende acyl-CoAs fra væv og dyrkede celler blev optimeret ved at justere KOH koncentrationen, og tid og temperatur for efterfølgende inkubation (data ikke vist). Den optimale tilstand blev fundet at være 0,25 M ved 55 °C i 2 timer. Thiol-gruppen af gratis CoA plus ethvert ægthedsbevis, der er frigjort fra thioestere, blev derivatiseret ved reaktion med mBBr efter justering af pH. Efterfølgende HPLC-adskillelse og typiske detektionsprofiler for muselever eller menneskelige kultiverede C3A celler er angivet i figur 5 som røde toppe med en retentions tid på mellem 11 og 12 minutter ved hjælp af elueringsprogrammet, der er beskrevet i tabel 1. Typiske mængder af biologisk udgangsmateriale er 30-40 mg murine lever (våd vægt), 6-8 x 106 celler til humane "lever-lignende" C3A celler, eller ~ 1,3 x 107 celler til humane HEK293T celler. De C3A celler blev behandlet med et PanK eksperimentelt stof PZ-2891 ved 10 uM, som hæver CoA17 (figur 6). CoA-målingerne i HEK293T-celler, når PanK-isoformer er overudtrykt, viser CoA-målinger over en bred vifte (431-6925 pmoles/μL) (figur 6). De stikprøvestørrelser, der kræves til denne metode, er praktiske til anvendelse i mange eksperimentelle sammenhænge.

Området under CoA-bimane peak blev beregnet ved hjælp af software, der leveres med HPLC. Peak-grænserne kan bestemmes automatisk af HPLC-softwaren, indtil der foretages en korrekt justering af input værdier for baseline korrektion og Peak definition, men vores laboratorium foretrækker at manuelt udpege CoA-bimane Peak i hvert kromatogram, især for ukendte biologiske prøver.

Tid (min.) Strømningshastighed (mL/min) % A % B Kurve
0 0,5 90 10 0
2 0,5 90 10 6
6 0,5 85 15 6
18 0,5 60 40 6
23 0,5 60 40 6
25 0,5 90 10 6
30 0,5 90 10 66

Tabel 1: HPLC-program til separation af COA-Biman. Buffer A: 50 mM KH2po4, pH 4,6; Buffer B: acetonitril. Blandingen af buffer A og buffer B følger kurve 6, som er en lineær gradient, med en mellemliggende kurve 8, som er en medium konkave gradient.

Figure 1
Figur 1. Coenzym en biosyntese pathway. PABA kinase (Pank) katalyserer fosforylering af pantothenat (vitamin B5) til 4 ′-phosphopantothenat i det første trin af COA-biosyntesen. Dannelse af phosphopantothenat efterfølges af kondensation med cystein katalyseret af 4 ′-phosphopantothenoylcystein syntase og derefter decarboxylering at danne 4 ′-phosphopantetin af 4 ′-phosphopanthenoylcystein decarboxylase. 4 ′-phosphopantethein omdannes til coenzym A (CoA) i en to-trins proces katalyseret af CoA syntase. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. mBBr-reaktion med COA. Monobromobiman (mBBr) blandes med CoA-SH (gratis CoA) og inkuberet ved stuetemperatur i 2 timer i mørke. Ikke-fluorescerende mBBr bliver fluorescerende, når det bindes til ægthedsbeviset for at danne CoA-Biman. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: absorbans HPLC-spor af COA-Biman-standarden. CoA-bimane blev separeret på en Gemini C18-kolonne ved hjælp af HPLC-programmet i tabel 1. Typisk retentions tid (min.) angives med aborbans (AU). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: standardkurver af COA-Biman detekteret ved absorbans eller fluorescens. A) standardkurven målt ved hjælp af absorbans detektionsenheder for COA-Biman blev målt til λ 393 nm. Vævsprøverne evalueres normalt ved hjælp af absorbans standardkurven. B) standardkurven målt ved hjælp af fluorescens detekterings enheder for COA-Biman ved λex = 393 nm, λem = 470 nm. Dyrkede celler evalueres normalt for CoA-indhold ved hjælp af fluorescens standardkurve. Duplikerede standarder (og prøver) evalueres rutinemæssigt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: HPLC-spor af typiske lever-eller kultiverede celleprøver. A) ægthedsbeviset-bimane-identifikation og kvantificering af indholdet i musens leverekstrakt. Absorbans (AU) er indikeret. B) ægthedsbeviset-bimane-identifikation og kvantificering af indholdet i HEPG2/C3A dyrkede celler. Fluorescens emissionsenheder (EU) er angivet. CoA-bimane toppe er vist med rødt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6. CoA niveauer i mus lever, dyrkede C3A og HEK293T celler. A) COA-måling i muselever fra PABA kinase knockout (Pank1-/-) og matchede vildtype (WT) dyr. Pank1-/- dyr har lavere COA i leveren sammenlignet med WT dyr på grund af fraværet af Pank1 udtryk9. Dataene blev indhentet ved hjælp af 5 hanmus pr. genotype og er repræsenteret som middelværdien ± SEM.B) COA-niveauer i HEPG2/C3A celler behandlet med enten dimethylsulfoxid (køretøjets kontrol) eller PZ-2891, et eksperimentelt lægemiddel, der modulerer Pank aktivitet ved 10 uM 17. cellulær COA-niveauet er forhøjet efter 24-timers inkubation med PZ-2891. (C) COA-niveauer i HEK293T celler transficeret med enten Tom vektor pcdna 3.1, eller cdnas kodning humane Pank isoformer: PANK1β, PANK2m som er den modne, forarbejdet isoform af menneskelige PANK2, eller PANK3. CoA-niveauerne er forhøjet ved overekspression af alle aktive PANK isoformer. Dataene i litraB) ogC) er fra uafhængige triplicatprøver og er repræsenteret som middelværdien ± SEM. Den statistiske analyse blev udført ved hjælp af den uparrede t-test, og værdierne af betydning er vist med rødt. Dataene i panelerne (B) og (C) er tilpasset fra Sharma et al. 12Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her viser vi en pålidelig, trinvis procedure for kvantificering af total CoA i celler og animalsk væv med en bred vifte af lineær detektion, der er tilgængelig i mange laboratorier, der har en HPLC med enten en absorbans eller fluorescens udgang detektor. Alternativt, massespektrometri er en fælles teknik til evaluering af CoA og CoA thioesters, men er ikke almindeligt tilgængelige på grund af omkostningerne ved instrumentering og den specialiserede viden, der kræves for udvikling af metodologi og fortolkning af data. Et isotopisk mærket ægthedsbevis, der er egnet til brug som intern standard til kvantificering af frit ægthedsbevis i massespektrometri, er ikke kommercielt tilgængeligt, og det frie ægthedsbevis registreres ikke af instrumentet med samme følsomhed som CoA-thioestere såsom acetyl-CoA. Således er gratis CoA-niveauer ofte groft undervurderet af massespektrometri, medmindre output data sammenlignes med en CoA standard kalibreringskurve.

Vi sammenlignede den metode, der er beskrevet her med en anden metode tidligere anvendt i vores laboratorium og fundet større CoA Recovery fra mus leveren, 123,4 ± 7,9 pmol/mg våd vægt, med denne nuværende metode sammenlignet med ~ 80 pmol/mg våd vægt ved hjælp af en enzymatisk analyse, der derivatized gratis CoA med et radioaktivt tag28. Metoden til måling af total CoA, som er beskrevet her, er betydeligt mindre besværlig, hurtigere og nemmere at kontrollere sammenlignet med den metode, der tidligere blev anvendt i vores Lab28. Tidligere blev COA fastlagt efter hexan ekstraktion af celle lysatet og udsat for enzymatisk omdannelse til radioaktivt [14C] Lauryl-COA medieret af Escherichia coli acyl-COA-syntetase (fadd). Den syre opløselige kortkædede acyl-CoAs og den syre-uopløselige langkædede acyl-CoAs i celle lysatet blev hydrolyseret med KOH for at give gratis CoA og derefter udsat for hexan ekstraktion forud for enzymatisk omdannelse til gratis CoA29. Selv om denne tidligere procedure havde god specificitet og følsomhed, krævede opgaven i praksis 2 arbejdsdage til at fuldføre, og det rekombinante E. coli acyl-COA-syntetase skulle forberedes, renses og måles for enzymatisk specifik aktivitet før CoA-analysen. Det krævede også instrumentering, der kunne detektere og kvantificere radioaktive isotoper, som er langt mindre udbredt i biomedicinske laboratorier i nyere historie. Den nuværende metode, som beskrevet her, er mest egnet til vores forskningsinteresse i PABA kinase (Pank). PanK styrer flux gennem CoA biosyntetisk vej, og det totale CoA-niveau er derfor udlæningen for PanK-aktiviteten i biologiske prøver.

Quenching af metaboliske reaktioner i en biologisk prøve for at opretholde en sand mængde CoA kræver pleje og hurtighed og er afgørende for denne procedure. Hurtig deproteinisering med en syre eller organisk opløsningsmiddel, eller flash-frysning af prøver er to metoder, der er blevet anvendt i de sidste30,31. I den nuværende metode tilsættes iskold ultrarent vand hurtigt til iskold PBS-vaskede celler fra kulturer, og klærede celler plus vand skraber derefter af kultur skålen før overførsel til Koh. Frysning af den dyrkede cellesuspension i [KOH + vand] til opbevaring ved-80 °C før Prøvetilberedning er et acceptabelt stoppunkt. CoA-værdier fra frosne celleprøver bør dog sammenlignes med dem fra frisk tilberedte prøver for at afgøre, om der er betydeligt tab af ægthedsbeviset. Tab af ≤ 10% CoA har fundet sted i vores hænder efter celleprøve frysning og kan være relateret til den forlængede tid af prøven i KOH, som skal kontrolleres. Animalsk væv stykker er hurtigt frosset på en lille folie ' tømmerflåde ' flyder på LN2 umiddelbart efter excision af vævet fra et aflives dyr. Prøvestørrelser fra 5 mg til 60 mg frosset væv er passende for denne metode med lineære CoA udbytter. Når frosset, vævsprøver opbevares ved-80 °C er stabile i mindst 3 måneder, forudsat at intermitterende tø ikke forekommer.

Prøve præparatet forud for HPLC-analysen er ikke et højt gennemløb og kræver en fuld arbejds halv dag. Det anbefales, at operatøren håndterer maksimalt 30 prøver på én gang, begyndende med homogenisering af et sæt på 15 prøver efterfulgt af homogenisering af det andet sæt af 15 prøver under 2 h inkubation med KOH for det første sæt. Den KOH inkubationsperiode blev først optimeret ved hjælp af købte CoA thioesters med inkubationstider fra 30 min til 4 h, og derefter 2 h inkubation blev valgt til at rumme tid til komplet CoA thioester hydrolyse i en række vævsprøver, der spænder fra skeletmuskulatur til leveren8. Inkubation for COA forædling med mbbr er sat til 2 h ved ca pH 8 og en 20-dobling af mbbr tilsættes for fuldstændigt at konvertere ægthedsbeviset i de biologiske prøver. Sulhydryl-indhold af proteiner og metabolitter, bortset fra ægthedsbevis såsom carnitin eller glutathion i prøven, vil blive derivatiseret ud over ægthedsbeviset, og det 20-dobbelte overskud blev beregnet på grundlag af den forventede mængde af den totale CoA-lever, som har det højeste niveau blandt væv. PH-værdien reduceres før inkubation med mBBr, fordi bromobimanes generelt er mindre reaktive over for andre nukleophiler som aminer og carboxylater i mere neutrale vandige opløsninger. Tidspunktet for derivatisering bør ikke overstige 2 h for at undgå eller mindske reaktionen med protein thioler26. Man skal bruge nonnucleofile buffere til at reducere og vedligeholde pH, fordi tilstedeværelsen af buffer anioner ved høje koncentrationer kan forstyrre mbbr forædling af COA.

Prøve oprydning på SPE-søjlen sker manuelt i vores laboratorium og kan udføres ved hjælp af en vakuum manifold for at forkorte den tid, der kræves til dette trin. Det er rutinemæssigt opnåeligt at inddrive det derivatiserede ægthedsbevis fra SPE-søjlen, og dette blev fastlagt særskilt ved hjælp af radioaktive [13C] ægthedsbeviser, som også er bevaret i spe-søjlen. Inddrivelse af [13c] acetyl-CoA var 97,6% og inddrivelse af [13c] Palmitoyl-COA var 96,1%. Fordampning af SPE-kolonne eluatet udføres normalt under nitrogen gas natten over i vores laboratorium som et spørgsmål om bekvemmelighed, men tørring kan gennemføres inden for 4 timer under nitrogen gas eller ved hjælp af en speedvac koncentrator. De mest kritiske trin i metoden er relateret til pH-justering og kan kontrolleres med pH-papirstrimler undervejs. For KOH hydrolyse skal pH være ≥ 12 for at opnå fuldstændig frigivelse af thioester fra CoA. PH skal være 7,8 – 8,5 for at støtte reaktiviteten af mBBr-derivatiseringen, og efter derivatiseringen er færdig, bør pH justeres til at blive meget sure, om pH 1-2, for at CoA-Biman at binde til SPE kolonne. SPE-søjlen renser prøven for at eliminere overskydende ureageret mBBr og visse ikke-forretningsmæssigt forbundne biologiske stoffer.

HPLC-programmet er konstrueret således, at vask og re-ækvibrering af C18-søjlen er tilstrækkeligt til at eliminere baggrunds-og fremstillende signaler mellem prøverne. Vand blanke prøver indsættes efter hver 5 prøver i den eksperimentelle prøve, der er fastsat som en forholdsregel til at overvåge mulig overførsel mellem sæt og for at sikre kolonne renlighed. En lejlighedsvis fejl fra forkert prøve injektion kan forekomme, når der anvendes en automatiseret prøve injektor til HPLC, og dette kan let kontrolleres ved at sammenligne de resterende mængder i prøve hætteglassene efter injektion eller inspektion af de ikke-CoA-relaterede toppe i udgangs kromatogram. Hvis ægthedsbeviset overskrider det lineære interval af kalibreringskurven for detektion af fluorescens, vil værdierne højst sandsynligt være inden for intervallet for påvisning af ultraviolet absorbans. Hvis ikke, kan fortynding af prøven med en kendt mængde vand reducere signalet til at være i det lineære område, og beregningerne bør tage hensyn til enhver fortyndingsfaktor.

Ægthedsbeviset vil variere blandt indavlede muse stammer med forskellige genetiske baggrunde, selv om værdierne er reproducerbare, når biologiske prøver er opnået fra samme stamme under de samme betingelser. Vi har anslået COA i flere forskellige muse linjer i forskellige undersøgelser10,12,16,17. COA blev også målt i flere kulturperler cellelinjer16,17 ved hjælp af enten primære eller udødeliggjort celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

MWF, CS og SJ skrev papiret, MWF og CS forudsat data og tal, COR designet eksperimenter og kritisk gennemgået manuskriptet. SJ og cor er opfindere på en verserende patentansøgning (pct/US17/39037) "små molekyle modulatorer af PABA kinaser", som afholdes af St. Jude children's Research Hospital, der dækker den PZ-2891 sammensatte refereres til i denne artikel.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender finansiering til sponsoreret forskning leveret af CoA Therapeutics, Inc., et datterselskab af BridgeBio LLC, de nationale institutter for sundhed Grant GM34496, og den amerikanske libanesiske syriske associerede velgørende organisationer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column Millipore-Sigma 54127-U
coenzyme A Avanti Polar Lipids 870700
Gemini C18 3 μm 100 Å HPLC column Phenomenex 00F-4439-E0
monobromobimane ThermoFisher Scientific M-1378
Omni-Tip probe tissue disrupter Omni International 32750H
Parafilm Fisher S37440
PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer ThermoFisher Scientific NC0530997
Spin-X centrifuge tube filter CoStar 8161
Trizma-HCl Fisher T395-1
Waters 2475 fluorescence detector Waters 2475
Waters 2489 UV-Vis detector Waters 2489
Waters e2695 separations module Waters e2695

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abiko, Y. Metabolic Pathways. Greenburg, D. M. 7, Academic Press, Inc. Ch. 7 1-25 (1975).
  2. Leonardi, R., Zhang, Y. -M., Rock, C. O., Jackowski, S. Coenzyme A: Back in action. Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).
  3. Jackowski, S., Rock, C. O. Regulation of coenzyme A biosynthesis. Journal of Bacteriology. 148, 926-932 (1981).
  4. Robishaw, J. D., Berkich, D. A., Neely, J. R. Rate-limiting step and control of coenzyme A synthesis in cardiac muscle. Journal of Biological Chemistry. 257, 10967-10972 (1982).
  5. Di Meo, I., Carecchio, M., Tiranti, V. Inborn errors of coenzyme A metabolism and neurodegeneration. Journal of Inherited Metabolic Disease. 42, 49-56 (2019).
  6. Zhou, B., et al. A novel pantothenate kinase gene (PANK2) is defective in Hallervorden-Spatz syndrome. Nature Genetics. 28, 345-349 (2001).
  7. Dusi, S., et al. Exome sequence reveals mutations in CoA synthase as a cause of neurodegeneration with brain iron accumulation. American Journal of Human Genetics. 94, 11-22 (2014).
  8. Dansie, L. E., et al. Physiological roles of the pantothenate kinases. Biochemical Society Transactions. 42, 1033-1036 (2014).
  9. Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state. PLoS ONE. 5, 11107 (2015).
  10. Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance. Diabetologia. 57, 1466-1475 (2014).
  11. Israel, B. C., Smith, C. M. Effects of acute and chronic ethanol ingestion on pantothenate and CoA status of rats. The Journal of Nutrition. 117, 443-451 (1987).
  12. Garcia, M., Leonardi, R., Zhang, Y. M., Rehg, J. E., Jackowski, S. Germline deletion of pantothenate kinases 1 and 2 reveals the key roles for CoA in postnatal metabolism. PLoS One. 7, 40871 (2012).
  13. Corbin, D. R., et al. Excess coenzyme A reduces skeletal muscle performance and strength in mice overexpressing human PANK2. Molecular Genetics and Metabolism. 120, 350-362 (2017).
  14. Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver. Journal of Lipid Research. 60, 1005-1019 (2019).
  15. Shumar, S. A., et al. Induction of neuron-specific degradation of Coenzyme A models pantothenate kinase-associated neurodegeneration by reducing motor coordination in mice. PLoS ONE. 10, 0130013 (2015).
  16. Zano, S. P., Pate, C., Frank, M., Rock, C. O., Jackowski, S. Correction of a genetic deficiency in pantothenate kinase 1 using phosphopantothenate replacement therapy. Molecular Genetics and Metabolism. 16, 281-288 (2015).
  17. Sharma, L. K., et al. A therapeutic approach to pantothenate kinase associated neurodegeneration. Nature Communications. 9, 4399 (2018).
  18. Alvarez-Cordoba, M., et al. Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation. Molecular Neurobiology. 56, 3638-3656 (2019).
  19. Arber, C., et al. iPSC-derived neuronal models of PANK2-associated neurodegeneration reveal mitochondrial dysfunction contributing to early disease. PLoS One. 12, 0184104 (2017).
  20. Di Meo, I., et al. Acetyl-4'-phosphopantetheine is stable in serum and prevents phenotypes induced by pantothenate kinase deficiency. Scientific Reports. 7, 11260 (2017).
  21. Nishikawa, T., Edelstein, D., Brownlee, M. The missing link: a single unifying mechanism for diabetic complications. Kidney International Supplements. 77, 26-30 (2000).
  22. Tsuchiya, Y., Pham, U., Gout, I. Methods for measuring CoA and CoA derivatives in biological samples. Biochemical Society Transactions. 42, 1107-1111 (2014).
  23. Demoz, A., Netteland, B., Svardal, A., Mansoor, M. A., Berge, R. K. Separation and Detection of Tissue Coash and Long-Chain Acyl-Coa by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography after Precolumn Derivatization with Monobromobimane. Journal of Chromatography. 635, 251-256 (1993).
  24. Shimada, K., Mitamura, K. Derivatization of Thiol-Containing Compounds. Journal of Chromatography B. 659, 227-241 (1994).
  25. Minkler, P. E., Kerner, J., Ingalls, S. T., Hoppel, C. L. Novel isolation procedure for short-, medium-, and long-chain acyl-coenzyme A esters from tissue. Analytical Biochemistry. 376, 275-276 (2008).
  26. Newton, G. L., Fahey, R. C. Determination of biothiols by bromobimane labeling and high-performance liquid chromatography. Methods in Enzymology. 251, 148-166 (1995).
  27. Radkowsky, A. E., Kosower, E. M. Bimanes .17. (Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones (Halo-9,10-Dioxabimanes) - Reactivity toward the Tripeptide Thiol, Glutathione. Journal of the American Chemical Society. 108, 4527-4531 (1986).
  28. Zhang, Y. M., et al. Chemical knockout of pantothenate kinase reveals the metabolic and genetic program responsible for hepatic coenzyme A homeostasis. Chemistry & Biology. 14, 291-302 (2007).
  29. Tokutake, Y., Onizawa, N., Katoh, H. Toyoda A,Chohnan S. Coenzyme A and its thioester pools in fasted and fed rat tissues. Biochemical and Biophysical Research Communications. 402, 158-162 (2010).
  30. Shibata, K., Nakai, T., Fukuwatari, T. Simultaneous high-performance liquid chromatography determination of coenzyme A, dephospho-coenzyme A, and acetyl-coenzyme A in normal and pantothenic acid-deficient rats. Analytical Biochemistry. 430, 151-155 (2012).
  31. Chohnan, S., Takamura, Y. A simple micromethod for measurement of CoASH and its use in measuring the intracellular levles of CoASH and short chain acyl-CoAs in Escherichia coli K12 cells. Agricultural and Biological Chemistry. 55, 87-94 (1991).

Tags

Biokemi coenzym A kultiverede celler animalsk væv monobromobiman højtryksvæskekromatografi solid fase ekstraktion
Kvantificering af coenzym A i celler og væv
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Frank, M. W., Subramanian, C., Rock, … More

Frank, M. W., Subramanian, C., Rock, C. O., Jackowski, S. Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues. J. Vis. Exp. (151), e60182, doi:10.3791/60182 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter