Summary
Deze methode beschrijft de monstervoorbereiding uit gekweekte cellen en dierlijk weefsel, extractie en derivatisering van coenzym A in de monsters, gevolgd door hogedrukvloeistofchromatografie voor zuivering en kwantificering van het guarderivaten coenzym a door absorptie of fluorescentiedetectie.
Abstract
Opkomende onderzoek is gebleken dat het cellulaire co-enzym A (CoA) levering kan worden beperkt met een nadelig effect op de groei, metabolisme en overleving. Meting van cellulaire CoA is een uitdaging vanwege de relatief lage overvloed en de dynamische omzetting van gratis CoA naar CoA thioesters die, op zijn beurt, deelnemen aan talrijke metabole reacties. Een methode wordt beschreven die tijdens de monstervoorbereiding door potentiële valkuilen navigeert om een assay te leveren met een breed lineair detectiebereik dat geschikt is voor gebruik in vele biomedische laboratoria.
Introduction
Co-enzym A (CoA) is een essentiële cofactor in alle levende organismen en wordt gesynthetiseerd uit pantotheenzuur, ook wel pantothenaat (het zout van pantotheenzuur) of vitamine B5. CoA is de belangrijkste intracellulaire drager van organische zuren, met inbegrip van korte-keten-zuren zoals acetaat en succinaat, tak-keten zuren zoals propionaat en methylmalonaat, lange-keten vetzuren zoals palmitaat en OLEAAT, zeer lange-keten vetzuren zoals meervoudig onverzadigde vetzuren en xenobiotica zoals valproïnezuur. Het organisch zuur vormt een thio ester binding enzymatisch met CoA om het gebruik ervan als substraat in meer dan 100 reacties in intermediair metabolisme1mogelijk te maken. CoA thioesters zijn ook allosterische regelgevers en transcriptionele activatoren. Het wordt nu gewaardeerd2 dat de cellulaire totale COA-levering is gereguleerd3,4; de beschikbaarheid van CoA kan dus worden beperkt en dat CoA-tekortkomingen catastrofaal kunnen zijn, zoals blijkt uit erfelijke genetische aandoeningen die van invloed zijn op CoA-biosynthese5. Pantothenate kinase katalyseert de eerste stap in CoA biosynthese (Figuur 1) en pantothenaat kinase geassocieerde neurodegeneratie, genaamd pkan, wordt veroorzaakt door mutaties in het PANK2 gen6. CoA-synthase, gecodeerd door het Coasyn -gen, katalyseert de laatste twee stappen in COA-biosynthese (Figuur 1) en Coasy eiwit-geassocieerde neurodegeneratie, genaamd Copan, wordt veroorzaakt door een mutatie in het coasyn Gene7. Zowel PKAN als CoPAN zijn erfelijke neurodegeneratieve ziekten geassocieerd met ijzer ophoping in de hersenen en CoA-tekortkomingen ten ondermeer de pathologieën van de ziekte.
Cellulaire niveaus van totaal CoA variëren tussen de weefsels8 en het totale COA kan verhogen of verlagen onder een verscheidenheid van fysiologische, pathologische en farmacologische toestanden. Lever CoA stijgt tijdens brandstof overschakelen van de Fed naar de nuchtere staat9, en lever COA niveaus zijn abnormaal hoog in leptine-deficiënte zwaarlijvige muizen10. Lever CoA afneemt in reactie op chronische ethanol inname11. Hersenen CoA-niveaus in de Pank2 Knockout muismodel zijn depressief tijdens de perinatale periode, maar later in de volwassen fase hersenen COA-inhoud is gelijkwaardig aan wild-type niveaus, wat duidt op een adaptieve COA reactie tijdens ontwikkeling12. Manipulatie van weefsel-COA-inhoud door Transgenese of genafgifte methoden beïnvloedt metabole en neurale functies13,14,15. De preklinische ontwikkeling van mogelijke therapieën voor pkan of Copan omvat de COA-metingen van cellen of weefsels als indicatoren voor de werkzaamheid16,17,18,19,20 . Evaluatie van al deze voorwaarden en hun metabole of functionele gevolgen vereist een kwantitatieve methode voor het meten van het totale CoA.
Een nauwkeurige, betrouwbare assay voor het meten van CoA in biologische monsters is een technische uitdaging in veel laboratoria. Helaas zijn er geen sondes beschikbaar om CoA-of CoA-thioesters in intacte cellen te evalueren of te kwantificeren, hoewel analogen van natuurlijke CoA-thioesters op grote schaal zijn gebruikt als mechanistische sondes in studies van CoA-ester met behulp van enzymen21. De omzetting van CoA, met een vrije sulfhydrylgroep (-sh) groep, naar een CoA thio ester (of omgekeerd) is snel in cellen of dierlijk weefsel tijdens overdracht naar een andere omgeving en tijdens cel lysis. Talrijke acyl-CoA-synthetases en acyl-CoA-thioesterasen in cellen bemiddel de interconversies binnen de CoA-groep en aanvullende enzymen die gebruikmaken van CoA thioesters als substraten blijven actief in biologische monsters totdat ze worden geblust door chemische of fysische Betekent. De off-loading van acyl-groepen van CoA naar carnitine door acyl-transferases is een voorbeeld binnen het netwerk van reacties dat de CoA/CoA thio ester distributie kan veranderen. Radioactieve tracers kunnen worden gebruikt om de frequenties van de CoA-synthese in cellen te meten. De huidige methoden voor het meten van CoA-en CoA-derivaten in biologische monsters zijn22 beoordeeld en omvatten gekoppelde enzymatische spectrofotometrische assays, hogedrukvloeistofchromatografie en op massaspectrometrie gebaseerde procedures. Deze methoden zijn echter vaak gericht op specifieke CoA-moleculaire soorten en zijn blind voor variatie van het totale CoA-zwembad. De gekoppelde enzymatische assays vereisen over het algemeen grotere hoeveelheden input materiaal als gevolg van lage detectie gevoeligheden en hebben een beperkt bereik van lineariteit.
Ons laboratorium heeft een betrouwbare procedure ontwikkeld voor de kwantificering van totaal CoA in gekweekte cellen en dierlijke weefsels. De strategie omvat de hydrolyse van alle CoA-thioesters om alleen gratis CoA te leveren tijdens de monstervoorbereiding, in plaats van inspanningen te leveren om het gehele spectrum van CoA-soorten te behouden en te analyseren. De procedure is een compilatie van afzonderlijke gepubliceerde methoden voor monstervoorbereiding, COA-derivatisering, zuivering en identificatie na hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) en kwantificering van het guarderivaten CoA door absorptie of fluorescentiedetectie23,24,25. De door deze procedure verkregen CoA-bepalingen hebben ons inzicht in de CoA-regulatie en de ontwikkeling van een therapeutische aanpak voor de behandeling van CoA-tekortkomingen mogelijk gemaakt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De in dit protocol bedoelde dier procedure is uitgevoerd volgens de protocollen 323 en 556 en is specifiek goedgekeurd door het St. Jude Children's Research Hospital institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité.
1. voorbereiding van de oplossingen
Opmerking: gebruik ultrapuur water voor alle oplossingen en indien aangegeven in procedures.
- Bereid 1 mM kaliumhydroxide (KOH) in water.
- Bereid 0,25 M KOH in water.
- Bereid 1 M Trizma-HCl in water en breng aan op pH 8,0.
- Bereid 100 mM monobromobimane (mBBr) in acetonitril (Optima grade). Stock oplossingen van mBBr zijn stabiel bij-20 °C gedurende vele maanden op voorwaarde dat ze in het donker worden bewaard omdat blootstelling aan licht de monobromobimane kan fotolyseren tot bimane26.
- Voorbereiding van de reinigings buffer voor de kolom van de Solid phase-extractie (SPE): 50% methanol (Optima-kwaliteit) + 2% azijnzuur.
- Elutie buffer voorbereiden voor SPE-kolom: 95% ethanol (HPLC-kwaliteit) met 50 mM ammonium formaat.
2. bereiding van het CoA-bimane-standaard
- Koop een hoogwaardige CoA-standaard van een betrouwbare bron (bijv. Avanti Polar lipids, Inc.).
- Bereid een hoge concentratie voorraadoplossing van CoA in 20 mM Tris, pH 8. De hoeveelheid CoA in de hoge concentratie kolf wordt bepaald of bevestigd door de spectrofotometrische extinctie bij λ 260 nm (Vogele = 16.800 M-1∙ cm-1). Voeg 4-voudige molaire overmaat mBBr toe; Vortex op hoog voor 10 s. Bijvoorbeeld, voor 10 mM CoA in buffer, toevoegen 40 mM mBBr. De mBBr wordt extra toegevoegd om ervoor te zorgen dat al het CoA wordt afgeleid.
- Inincuberen bij kamertemperatuur gedurende 4 uur in het donker zonder te schudden om het CoA te derivatiseren met mBBr. mBBr reageert met de thiol groep van het CoA, en het is pH en temperatuur afhankelijk27. Toevoeging van de mBBr zet CoA om in een in water oplosbaar fluorescerende (of ultraviolette absorbant) CoA-bimane (CoA-bimane; Figuur 2).
- Voeg 100 μL azijnzuur toe en Vortex op hoog voor 10 s om de reactie te stoppen.
- Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 2.000 x g om eventuele precipiterende stof te verwijderen.
- Reinig het supernatant met behulp van een SPE-kolom om de niet-gereageerd mBBr (hieronder beschreven) te verwijderen. Filtratie en centrifugeren van het eluaat is niet nodig na het opruimen van de SPE-kolom (punt 5,8).
- Verzamel het eluaat uit de SPE-kolom met de CoA-bimanen in een vooraf gewogen buis, droog onder stikstofgas, weeg en bouw een standaard kalibratiekromme met bekende hoeveelheden CoA-bimanen.
- Controleer de CoA-bimane-standaard voor zuiverheid door HPLC (zie hieronder) met extinctie detectie bij zowel λ 260 (adenine moiety) als λ 393 (bimane groep) en toeval van beide pieken in het chromatogram.
- Bevestig de hoeveelheid van de CoA-bimane-standaard in de hoge concentratie kolf met behulp van λ 260 nm (Vogele = 16.800 M-1∙ cm-1).
- Registreer de HPLC-retentietijd voor de identificatie van CoA-bimanen in experimentele monsters met behulp van de CoA-bimane-standaard.
- Bewaar aliquots van de hoge concentratie voorraad van de CoA-bimane-standaard beschermd tegen licht en bewaard bij-20 °C gedurende maximaal 2 jaar. Vermijd herhaald ontdooien en opnieuw invriezen.
3. extractie en derivatisering van CoA in gekweekte cellen
- Oogst aanhandige cellen in cultuur bij het naderen van late subconfluente dichtheden. Bijvoorbeeld, menselijke HepG2/C3A cellen worden gekweekt tot een dichtheid van 6-8 x 106, of HEK 293t cellen worden gekweekt tot een dichtheid van ~ 1,3 x 107 per 100 mm schotel.
- Gebruik routinematig dubbele of drievoud culturen voor COA-bepalingen. Incuberen afzonderlijke cultuur gerechten parallel met de monster celculturen om het levensvatbare celgetal te bepalen. Bereken de hoeveelheid CoA per 106-107 cellen na HPLC-zuivering.
- Aspirate cultuurmedium van het gerecht. Spoel cellen snel op de schaal met ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om eventueel rest medium te verwijderen en de PBS van het gerecht te halen. Spoel cellen snel met ijskoud water om de resterende PBS te verwijderen en het water snel van het gerecht te zuigen. Vermijd het verstoren van de aanhankelijke cellen bij het toevoegen van de PBS of water.
- Voeg 1 mL ijskoud water toe aan het kweek gerecht. Schrael cellen in het koude water in de schaal en breng de celsuspensie over in een glazen reageerbuis met 400 μL 0,25 M KOH en 1,5 mL water.
- Meng de suspensie krachtig door Vortex op hoog voor 10 s. Bedek vervolgens strak met paraffine folie en inbroed bij 55 °C gedurende 1 uur zonder te schudden in een waterbad. De pH van het monster moet ≥ 12 zijn. De hoge pH is belangrijk voor het hydrolyseren van het CoA thioesters en kan indien nodig worden aangepast met extra aliquots van KOH.
- Oogst gekweekte cellen die in suspensie groeien door centrifugeren bij lage snelheid: 136 x g gedurende 6 minuten bij 4 °c. Was een keer met ijskoude PBS, spoel vervolgens kort opnieuw met koud water en breng uiteindelijk in 2,5 mL koud water en 400 μL 0,25 M KOH. Meng krachtig en inincuberen bij 55 °C zoals hierboven beschreven.
- Voeg 160 μL van 1 M Trizma-HCl en 10 μL 100 mM mBBr toe en meng door Vortex op hoog voor 10 s. Dit brengt de pH tot ongeveer 8 ter ondersteuning van de mBBr-reactie met gratis CoA. Bedek en inbroed monsters bij kamertemperatuur gedurende 2 uur in het donker voor de mBBr om te reageren met het thiol van CoA.
- Voeg 100 μL azijnzuur toe en meng door Vortex op hoog voor 10 s om de reactie te stoppen
- Centrifugeer bij 2.000 x g gedurende 15 minuten om neergeprecipiteerd celafval te verwijderen.
- Verwijder en bewaar supernatant in een glazen reageerbuis voor de clean-up van de SPE-kolom die hieronder wordt beschreven.
4. extractie en derivatisering van CoA in weefsels
- Afwijkende dierlijke weefsel stukken, ongeveer 0,5 cm doorsnede of kleiner, en DEP kort (1-2 s) op absorberend papier en vervolgens vlam in vloeibare stikstof en bewaar bij-80 °C tot de verwerking. CoA in weefsels wordt gehydrolyseerd of omgezet in een thio ester indien niet ingevroren. Deze stap is belangrijk voor het verkrijgen van de maximale opbrengst van CoA in weefsels.
- Weeg bevroren weefsel stukken (5 – 60 mg) snel af voordat u de analyse start en noteer het gewicht voor elk monster. Deze bepaling van het natte gewicht wordt gebruikt voor de berekening van het CoA-gehalte na HPLC-zuivering. Vermijd volledige ontdooien van de weefsel stukken.
- Voeg 2 mL van 1 mM KOH toe aan een glazen reageerbuis (bijv. 13 mm x 100 mm wegwerp) bestemd voor het inbrengen van een sonde en weefsel verstoring met een rotor-stator homogenisator. Houd de buis op ijs tot het gebruik. Dit wordt gedaan om ervoor te zorgen dat de monsters worden gehomogeniseerd bij een koude temperatuur en CoA wordt niet vernietigd als gevolg van de warmte die wordt gegenereerd tijdens de homogenisatie.
- Overdracht en homogeniseren van weefsel (30 – 40 mg) in de glazen reageerbuis (met koude 1 mM KOH) voor 30 s. Vermijd het volledig ontdooien van het weefsel.
- Voeg 500 μL van 0,25 M KOH; Vortex op hoog voor 10 s en blijf op ijs totdat alle monsters zijn gehomogeniseerd. Dit zal de pH van het monster boven 12 brengen om het CoA thioesters te hydrolyseren tot een totaal CoA (gratis CoA + gehydrolyseerd CoA thioesters).
- Inincuberen monsters bij 55 °C gedurende 2 uur in een waterbad zonder schudden om hydrolyse te ondersteunen.
- Voeg 150 μL van 1 M Trizma-HCl en 10 μL 100 mM mBBr toe; Vortex op hoog voor 10 seconden. Dit brengt de pH naar ongeveer 8 om de mBBr-reactie te ondersteunen met gratis CoA.
- Inincuberen monsters bij kamertemperatuur gedurende 2 uur in het donker om te waarborgen dat alle CoA-derivaten met mBBr worden afgeleid.
- Voeg 100 μL azijnzuur toe en Vortex op hoog voor 10 s om de reactie te stoppen.
- Centrifugeer bij 2.000 x g gedurende 15 minuten tot pellet neergeprecipiteerd celpuin.
- Verwijder en bewaar supernatant in een glazen reageerbuis voor de clean-up van de SPE-kolom (hieronder beschreven).
5. voorbeeld opschonen met de kolom vaste fase extractie (SPE)
- Bij kamertemperatuur, elke wegwerp 2-(2-pyridyl)-ethyl silicagel kolom (1 mL grootte) met 1 mL van de reinigings buffer om ervoor te zorgen dat de pyridyl functionele groep is geprotoneerd en zal fungeren als een anionenwisselaar. 2-(2-pyridyl)-ethyl silicagel is een zwakke anionenwisselaar die ideaal is voor CoA-bimanen bij een basis pH. 2-(2-pyridyl)-ethyl silicagel heeft een pKa van 6 en de elutie wordt gedaan pH ≥ 7.
- Voeg een monster supernatant (stap 4,11) toe aan de kolom en verzamel eluaat.
- Spoel de kolom tweemaal met 1 mL reinigings buffer om onbewaarde soorten te verwijderen.
- Reinig de kolom eenmaal met 1 mL water.
- Spoel de kolom tweemaal met 1 mL elutie buffer in een aparte glazen reageerbuis (12 mm x 75 mm) om het CoA-bimane te verzamelen.
- Droge CoA-bimane monster in buis onder stikstof gas te droogheid. Het gedroogde monster is stabiel bij kamertemperatuur tot verder gebruik. Afdichting en volledig bedekken de buis en de winkel.
- Als u klaar bent voor HPLC-analyse, hervat u het monster in 300 μL water en meng u krachtig door Vortex op hoog voor 10 s.
- Breng het resuspendeerde monster over in een centrifugebuis filter (0,22 μm cellulose acetaat, 2 mL) en Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 5.000 x g om eventuele precipitaat te verwijderen.
- Breng gefilterd monster over naar een glazen injectieflacon die geschikt is voor HPLC-injectie.
6. HPLC-zuivering en-meting van CoA-bimane
- Buffers voorbereiden. Buffer A: 50 mM KH2po4, pH 4,6; Buffer B: acetonitril (Optima-kwaliteit).
- Schakel het HPLC-systeem in.
Opmerking: het HPLC-systeem in ons laboratorium is een watere2695 Scheidingsmodule die is uitgerust met een 2489 ultraviolette (UV-VIS) extinctie detector en een 2475 fluorescentiedetector die wordt aangestuurd met de Empower 3-software. Het systeem heeft ook een geautomatiseerde monster injector. - Injecteer elk monster (bv. 20 μL) voor scheiding op een Gemini C18, 3 μm 100 Å, 4,6 mm x 150 mm kolom met behulp van het programma in tabel 1 met een debiet van 0,5 ml/min. De kolomtemperatuur is 25 °C. Meet de extinctie van de UV/zichtbare detector bij λ 393 nm en de fluorescentiedetectie bij λex = 393 nm, λem = 470 nm. De retentietijd wordt bepaald door een CoA-bimane-standaard curve uit te voeren voor elke set samples.
- Noteer het gebied onder de CoA-bimane piek voor elk monster en vergelijk met de standaard curve om pmol van CoA-bimane geïnjecteerd op de HPLC-kolom te berekenen. De CoA-bimane extinctie standaard curve wordt gebruikt voor weefselmonsters, en de CoA-bimane fluorescentie standaard curve wordt gebruikt voor weefselcultuur monsters.
- Aangezien de waarden van het CoA-bimane het totale CoA voor elk monster vertegenwoordigen, normaliseert u het aantal levensvatbare cellen voor kweek monsters of mg nat gewicht voor weefselmonsters (Figuur 6). Als alternatief berekent u de totale CoA-waarden na normalisering naar DNA of eiwitgehalte voor elk monster. DNA-of eiwitgehalte kan afzonderlijk worden bepaald met behulp van monster aliquots die worden verwijderd tijdens de monstervoorbereiding voorafgaand aan KOH addition.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een relatief snelle en betrouwbare methode voor de detectie van totaal CoA in gekweekte cellen en weefsels is ontwikkeld door het thiol van CoA te derivatiseren tot een fluorescerende stof met behulp van mBBr, en vervolgens de afgeleide CoA-bimane te zuiveren met behulp van omgekeerde fase HPLC. Een standaard curve wordt eerst gegenereerd, waar bekend en toenemende hoeveelheden van de CoA-bimane standaard worden individueel geïnjecteerd en de gebieden onder de pieken in de CoA-bimane chromatogrammen worden uitgezet als een functie van de input CoA-bimane (Figuur 4). COA-bimane heeft een absorptiemaximum van λ 393 nm en een representatief HPLC-profiel toont de retentietijd van de COA-bimane-standaard op een C18 HPLC-kolom (Figuur 3) met behulp van het elutie-programma in tabel 1. Representatieve standaard curven van CoA-bimanen, gedetecteerd door meting van de absorptie-of fluorescentie-eenheden, worden weergegeven in Figuur 4A en Figuur 4B, respectievelijk. De standaard curve in Figuur 4A weerspiegelt de grootte van de extinctie van COA-bimanen bij λ 393 nm en Figuur 4B staat voor de fluorescentie van coa-bimane (λex = 393 nm en λem = 470 nm) uitgezet versus de ingangs hoeveelheid van CoA-bimane. De CoA-bimane-standaard kan worden gedetecteerd van 0,01 tot 12.000 pmol en beslaat een bereik van 106-voudige wanneer detectie met zowel absorptie als fluorescentie wordt gecombineerd. Hoewel de ondergrens voor de detectie van de norm 0,01 pmol is, is de ondergrens van de kwantificering van CoA-bimane in experimentele monsters 0,2 pmol die ongeveer 5-voudig groter is dan de baseline-of achtergrond fluorescentie in het chromatogram. De keuze van de detectie door absorptie of fluorescentie van CoA-bimanen is afhankelijk van de hoeveelheid CoA die normaal aanwezig is in weefsels of cellen, samen met de bruikbaarheid van het werken met grotere of kleinere steekproefgrootten. Absorptie is over het algemeen nuttig voor weefselmonsters omdat het hanteren van 40-50 mg startmateriaal een beter herstel dan 5 mg weefselmonsters oplevert, terwijl fluorescentie over het algemeen nuttig is voor gekweekte celmonsters die kleiner zijn en er meer vertrouwen in interpolatie van waarden aan het onderste uiteinde van de fluorescentie-standaard curve. Laboratoria met alleen absorptie detectie kunnen overwegen de start steekproefgrootte te verhogen of te verlagen, het HPLC-injectievolume te verhogen of het volume voor monster resuspensie (punt 5,9 hierboven) te verlagen voor metingen in gekweekte cellen.
De voorwaarden voor het hydrolyseren van acyl-Coa's uit weefsels en gekweekte cellen werden geoptimaliseerd door aanpassing van de KOH-concentratie, en de tijd en temperatuur van de daaropvolgende incubatie (gegevens niet weergegeven). De optimale conditie bleek 0,25 M bij 55 °C gedurende 2 uur. De thiol groep van het vrije CoA plus elk uit thioesters bevrijd CoA werd gederivatiseerd door reactie met mBBr na aanpassing van de pH. Daaropvolgende HPLC-scheiding en typische detectie profielen voor muizen lever of menselijke gekweekte C3A cellen worden in Figuur 5 aangegeven als rode pieken, met een retentietijd tussen 11 en 12 minuten met behulp van het elutie-programma zoals beschreven in tabel 1. Typische hoeveelheden biologisch uitgangsmateriaal zijn 30-40 mg Murine lever (vochtig gewicht), 6-8 x 106 cellen voor menselijke "lever-ACHTIGE" C3A cellen, of ~ 1,3 x 107 cellen voor menselijke HEK293T cellen. De C3A cellen werden behandeld met een PanK experimentele drug PZ-2891 op 10 uM dat verhekert CoA17 (Figuur 6). De COA-metingen in HEK293T cellen bij overexpressie van Pank-isovormen tonen COA-metingen over een breed bereik (431-6925 pmoles/μL) (Figuur 6). De steekproefgrootten die nodig zijn voor deze methodologie zijn praktisch voor toepassing op vele experimentele contexten.
Het gebied onder de CoA-bimane piek werd berekend met behulp van software meegeleverd met de HPLC. De piek limieten kunnen automatisch worden bepaald door de HPLC-software in afwachting van de juiste aanpassing van de invoerwaarden voor Baseline correctie en piek definitie, maar ons laboratorium verkiest de CoA-bimane piek in elk chromatogram handmatig aan te duiden, in het bijzonder voor onbekende biologische monsters.
| Tijd (min) | Debiet (mL/min) | % A | % B | Curve |
| 0 | 0,5 | 90 | 10 | 0 |
| 2 | 0,5 | 90 | 10 | 6 |
| 6 | 0,5 | 85 | 15 | 6 |
| 18 | 0,5 | 60 | 40 | 6 |
| 23 | 0,5 | 60 | 40 | 6 |
| 25 | 0,5 | 90 | 10 | 6 |
| 30 | 0,5 | 90 | 10 | 66 |
Tabel 1: HPLC-programma voor COA-bimane scheiding. Buffer A: 50 mM KH2po4, pH 4,6; Buffer B: acetonitril. Het mengen van buffer A en buffer B volgt curve 6, een lineair verloop, met een tussenliggende kromme 8, een medium holle gradiënt.
Figuur 1. Co-enzym een biosynthese traject. Pantothenaatkinase (PanK) katalyseert de fosforylering van pantothenaat (vitamine B5) naar 4 ′-fosfohopantothenaat in de eerste stap van COA-biosynthese. Vorming van foshopantothenaat wordt gevolgd door condensatie met cysteïne gekatalyseerd door 4 ′-fosforantothenoylcysteïne synthase en vervolgens decarboxylatie te vormen 4 ′-fosforinetheïne door 4 ′-phosphopanthenoylcysteïne decarboxylase. 4 ′-fosfonantetheïne wordt omgezet in coenzym A (CoA) in een proces in twee stappen gekatalyseerd door CoA-synthase. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2. mBBr-reactie met COA. Monobromobimane (mBBr) wordt gemengd met CoA-SH (gratis CoA) en gedurende 2 uur in het donker geïnineerd bij kamertemperatuur. Niet-fluorescerende mBBr wordt tl-licht wanneer gebonden aan CoA te vormen CoA-bimane. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: absorptie HPLC-trace van COA-bimane-standaard. CoA-bimane werd gescheiden op een Gemini C18-kolom met behulp van het HPLC-programma in tabel 1. De typische retentietijd (min) wordt aangegeven door aborctie-eenheden (AU). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: COA-bimane standaard curven gedetecteerd door absorptie of fluorescentie. A) de standaard curve gemeten met behulp van absorptie-eenheden voor COA-bimanen werd gemeten bij λ 393 nm. Weefselmonsters worden gewoonlijk geëvalueerd aan de hand van de extinctie standaard curve. B) de standaard curve gemeten met fluorescentiedetectie-eenheden voor COA-bimane bij λex = 393 nm, λem = 470 nm. Gekweekte cellen worden meestal geëvalueerd voor CoA-inhoud met behulp van de fluorescentie standaard curve. Dubbele standaarden (en samples) worden routinematig geëvalueerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: HPLC-sporen van typische lever-of gekweekte celmonsters. A) COA-bimane identificatie en kwantificering van inhoud in muis lever extract. De extinctie-eenheden (AU) worden aangegeven. B) COA-bimane identificatie en kwantificering van inhoud in HEPG2/C3A gekweekte cellen. Fluorescentie-emissie-eenheden (EU) worden aangegeven. De CoA-bimane pieken worden rood weergegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6. CoA-niveaus in muis lever, gekweekte C3A en HEK293T cellen. A) COA-meting in muis lever van pantothenaatkinase Knockout (Pank1-/-) en matched wild-type (WT) dieren. Pank1-/- dieren hebben lagere COA in de lever in vergelijking met WT dieren als gevolg van de afwezigheid van Pank1 expressie9. De gegevens werden verkregen met behulp van 5 mannelijke muizen per genotype en worden weergegeven als de gemiddelde ± SEM. (B) COA-niveaus in HEPG2/C3A cellen behandeld met ofwel dimethylsulfoxide (voertuigcontrole) of PZ-2891, een experimenteel geneesmiddel dat Pank-activiteit op 10 uM moduleert 17. het cellulaire COA-niveau is verhoogd na 24-uurs incubatie met PZ-2891. C) het COA-gehalte in HEK293T cellen, getransffecteerd met ofwel lege Vector pcDNA 3.1, ofwel cDNAs-codering humane Pank-isoforms: PANK1β, PANK2m de volwassen, verwerkte isovorm van menselijke PANK2 of PANK3. De CoA-niveaus worden verhoogd door overexpressie van alle actieve PANK-isoforms. De gegevens in (B) en (C) zijn afkomstig van onafhankelijke drievat monsters en worden weergegeven als de gemiddelde ± SEM. De statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van de ongepaarde t-toets en de waarden van significantie worden in rood weergegeven. De gegevens in de panelen (B) en (C) zijn aangepast van Sharma et al. 12Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier tonen we een betrouwbare, stapsgewijze procedure voor het kwantificeren van totaal CoA in cellen en dierlijke weefsels met een breed scala aan lineaire detectie die toegankelijk is in veel laboratoria met een HPLC met een absorptie-of fluorescentie-uitgangs detector. Als alternatief is massaspectrometrie een veelgebruikte techniek voor het evalueren van CoA-en CoA-thioesters, maar is niet algemeen beschikbaar vanwege de kosten van de instrumentatie en de gespecialiseerde kennis die nodig is voor de ontwikkeling van de methodologie en interpretatie van gegevens. Isotopisch gelabeld CoA dat geschikt is voor gebruik als een interne standaard voor de kwantificering van het vrije CoA in massaspectrometrie is niet commercieel beschikbaar, en gratis CoA wordt niet gedetecteerd door het instrument met dezelfde gevoeligheid als CoA thioesters zoals acetyl-CoA. Zo worden gratis CoA-niveaus vaak zwaar onderschat door massaspectrometrie, tenzij de output gegevens worden vergeleken met een CoA-standaard kalibratiecurve.
We hebben de hier beschreven methode vergeleken met een andere methode die eerder in ons laboratorium werd gebruikt en vonden een groter CoA-herstel van de muis lever, 123,4 ± 7,9 pmol/mg vochtig gewicht, met deze huidige methode vergeleken met ~ 80 pmol/mg nat gewicht met behulp van een enzymatische assay die gederivatiseerd gratis CoA met een radioactieve tag28. De methode voor het meten van het totale CoA dat hier wordt beschreven, is aanzienlijk minder omslachtig, sneller en gemakkelijker te controleren in vergelijking met de methode die eerder in ons lab28werd gebruikt. Voorheen werd COA vastgesteld na hexaan extractie van het cellysaat en onderworpen aan enzymatische conversie naar radioactieve [14C] Lauryl-COA gemedieerd door de Escherichia coli acyl-CoA stikstofoxidesynthetase (Fadd). De zuur-oplosbare korte-keten acyl-CoAs en de zuur-onoplosbare lange-keten acyl-CoAs in het cellysaat werden gehydrolyseerd met KOH om vrij CoA te leveren en vervolgens onderworpen aan hexaan extractie voorafgaand aan de enzymatische omzetting naar gratis CoA29. Hoewel deze vorige procedure had goede specificiteit en gevoeligheid, in de praktijk de taak vereist 2 werkdagen te voltooien en de recombinant E. coli acyl-CoA stikstofoxidesynthetase moest worden voorbereid, gezuiverd en gemeten voor enzymatische specifieke activiteit voorafgaand aan de CoA-analyse. Het vereiste ook instrumentatie die in staat is om radioactieve isotopen te detecteren en te kwantificeren die veel minder vaak voorkomen in biomedische laboratoria in meer recente geschiedenis. De huidige methode zoals hier beschreven is het meest geschikt voor ons onderzoek belang in pantothenaat kinase (Pank). PanK regelt de flux via de CoA biosynthetic-route en dus is het totale CoA-niveau de uitlezen voor de PanK-activiteit in biologische monsters.
Het bluchen van metabole reacties in een biologisch monster om een ware hoeveelheid CoA te handhaven vereist zorg en snelheid en is van cruciaal belang voor deze procedure. Snelle deproteïnisatie met een zuur of organisch oplosmiddel, of het invriezen van monsters zijn twee methoden die zijn gebruikt in de afgelopen30,31. In de huidige methode wordt ijskoud ultrapuur water snel toegevoegd aan ijskoude PBS-gewassen cellen uit culturen, en aanhandige cellen plus water worden vervolgens van het cultuur gerecht geschuurd voordat het wordt overgedragen naar KOH. Bevriezing van de gekweekte celsuspensie in [KOH + water] voor opslag bij-80 °C voorafgaand aan de monstervoorbereiding is een aanvaardbaar stoppunt. De CoA-waarden van diepgevroren celmonsters moeten echter worden vergeleken met die van vers bereide monsters om te bepalen of het CoA-signaal aanzienlijk is verloren. Verlies van ≤ 10% CoA heeft zich in onze handen voorgedaan na het bevriezen van de celmonsters en kan verband houden met de verlengde tijd van het monster in de KOH die moet worden gecontroleerd. Dierlijke weefsel stukken worden snel bevroren op een klein folie ' vlot ' zwevend op LN2 onmiddellijk na excisie van het weefsel van een geëeuthanaliseerd dier. Monster groottes van 5 mg tot 60 mg bevroren weefsel zijn geschikt voor deze methode met lineaire CoA-opbrengsten. Eenmaal bevroren, weefselmonsters opgeslagen bij-80 ° c zijn stabiel gedurende ten minste 3 maanden, mits intermitterende ontdooien niet optreedt.
De monstervoorbereiding voorafgaand aan de HPLC-analyse is geen hoge doorvoer en vereist een volledige werkende halve dag. Het wordt aanbevolen dat de operator in één keer maximaal 30 monsters verwerkt, te beginnen met homogenisatie van een set van 15 monsters gevolgd door homogenisatie van de tweede set van 15 monsters tijdens de incubatie van 2 uur met KOH voor de eerste set. De KOH incubatieperiode werd voor het eerst geoptimaliseerd met behulp van gekochte CoA thioesters met incubatie tijden variërend van 30 min tot 4 h, en vervolgens werd de 2 h incubatie gekozen om de tijd voor volledige CoA thio ester hydrolyse in een verscheidenheid van weefselmonsters, variërend van skeletspieren tot lever8. Incubatie voor CoA-derivatisatie met mBBr wordt ingesteld op 2 uur bij ongeveer pH 8 en een 20-voudige overmaat van mBBr wordt toegevoegd om het CoA volledig in de biologische monsters te converteren. Sulhydryl-delen van eiwitten en andere metabolieten dan COA, zoals carnitine of glutathion in het monster, worden naast het COA gederivatiseerd en het 20-voudige overschot werd berekend op basis van de verwachte hoeveelheid van de totale COA-lever die het hoogste niveau heeft onder de weefsels. De pH wordt vóór incubatie met mBBr verlaagd omdat bromobimanes in het algemeen minder reactief zijn ten opzichte van andere nucleofielen zoals amines en carboxylaten in neutrale waterige oplossingen. De tijd van derivatisatie mag niet groter zijn dan 2 uur om de reactie met proteïne thiolen26te vermijden of te verminderen. Men moet niet-nucleofiele buffers gebruiken om de pH te verminderen en te behouden, omdat de aanwezigheid van buffer-anionen bij hoge concentraties de mBBr-derivatisering van CoA kan verstoren.
Het schoonmaken van het monster op de SPE-kolom gebeurt handmatig in ons laboratorium en kan worden uitgevoerd met behulp van een vacuüm spruitstuk om de tijd die nodig is voor deze stap te verkorten. Goed herstel van het guarderivaten COA uit de SPE-kolom is routinematig haalbaar en dit werd afzonderlijk bepaald met behulp van radioactieve [13C] COA thioesters die ook op de SPE-kolom worden bewaard. Herstel van [13c] acetyl-coa was 97,6% en herstel van [13c] palmitoyl-CoA was 96,1%. Verdamping van het SPE-kolom-eluaat wordt gewoonlijk onder stikstofgas 's nachts in ons laboratorium uitgevoerd als een kwestie van gemak, maar drogen kan worden voltooid binnen 4 uur onder stikstofgas of met behulp van een SpeedVac-concentrator. De meest kritische stappen in de methode zijn gerelateerd aan pH-aanpassing en kunnen langs de weg worden gecontroleerd met pH-papier stroken. Voor de KOH hydrolyse moet de pH ≥ 12 zijn om de volledige afgifte van de thio ester van het CoA te bereiken. De pH moet 7,8 – 8,5 zijn om de reactiviteit van de mBBr-derivatisatie te ondersteunen, en nadat de derivatisatie is voltooid, moet de pH worden aangepast om zeer zuur te worden, ongeveer pH 1-2, zodat de CoA-bimane kan binden aan de SPE-kolom. De SPE-kolom ruimt het monster op om overtollige ongereageerde mBBr en sommige niet-gerelateerde biologische stoffen te elimineren.
Het HPLC-programma is zo ontworpen dat het wassen en opnieuw equilibratie van de C18-kolom voldoende is om achtergrond-en overdracht signalen tussen monsters te elimineren. Water blanco monsters worden na elke 5 monsters in het experimentele monster geplaatst als voorzorgsmaatregel om de mogelijke overdracht tussen de verzamelingen te bewaken en de netheid van de kolom te garanderen. Een incidentele fout van een onjuiste monster injectie kan optreden bij gebruik van een geautomatiseerde monster injector voor de HPLC, en dit kan gemakkelijk worden gecontroleerd door de resterende volumes in de monsterflacons te vergelijken na de injectie of inspectie van de niet-CoA-gerelateerde pieken in de uitvoer chromatogram. Als de CoA-waarden het lineaire bereik van de ijkcurve voor fluorescentiedetectie overschrijden, zullen de waarden hoogstwaarschijnlijk in bereik zijn voor de detectie van ultraviolette absorptie. Zo niet, dan kan verdunning van het monster met een bekend volume water het signaal in het lineaire bereik verminderen en moeten de berekeningen rekening houden met elke verdunningsfactor.
De CoA-niveaus zullen variëren tussen ingeteelde muis stammen met verschillende genetische achtergronden, hoewel de waarden reproduceerbaar zijn wanneer biologische monsters uit dezelfde stam onder dezelfde omstandigheden worden verkregen. We hebben geschat COA in verschillende verschillende muis lijnen in verschillende studies10,12,16,17. COA werd ook gemeten in verschillende gekweekte cellijnen16,17 met behulp van primaire of vereeuwigd cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MWF, CS en SJ schreven de krant, MWF en CS verstrekte de gegevens en de cijfers, COR ontwierp de experimenten en heeft het manuscript kritisch bekeken. SJ en Cor zijn uitvinders op een octrooiaanvraag in behandeling (PCT/US17/39037) "kleine molecuul modulatoren van pantothenaat kinases" gehouden door St. Jude children's Research Hospital die betrekking heeft op de PZ-2891 compound waarnaar wordt verwezen in dit artikel.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de financiering van gesponsord onderzoek dat wordt aangeboden door CoA Therapeutics, Inc., een dochteronderneming van BridgeBio LLC, de National Institutes of Health Grant GM34496, en de Amerikaanse Libanese Syrische geassocieerde liefdadigheidsinstellingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column | Millipore-Sigma | 54127-U | |
| coenzyme A | Avanti Polar Lipids | 870700 | |
| Gemini C18 3 μm 100 Å HPLC column | Phenomenex | 00F-4439-E0 | |
| monobromobimane | ThermoFisher Scientific | M-1378 | |
| Omni-Tip probe tissue disrupter | Omni International | 32750H | |
| Parafilm | Fisher | S37440 | |
| PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer | ThermoFisher Scientific | NC0530997 | |
| Spin-X centrifuge tube filter | CoStar | 8161 | |
| Trizma-HCl | Fisher | T395-1 | |
| Waters 2475 fluorescence detector | Waters | 2475 | |
| Waters 2489 UV-Vis detector | Waters | 2489 | |
| Waters e2695 separations module | Waters | e2695 |
References
- Abiko, Y. Metabolic Pathways. Greenburg, D. M. 7, Academic Press, Inc. Ch. 7 1-25 (1975).
- Leonardi, R., Zhang, Y. -M., Rock, C. O., Jackowski, S.
- Jackowski, S., Rock, C. O.
- Robishaw, J. D., Berkich, D. A., Neely, J. R. Rate-limiting step and control of coenzyme A synthesis in cardiac muscle. Journal of Biological Chemistry. 257, 10967-10972 (1982).
- Di Meo, I., Carecchio, M., Tiranti, V. Inborn errors of coenzyme A metabolism and neurodegeneration. Journal of Inherited Metabolic Disease. 42, 49-56 (2019).
- Zhou, B., et al. A novel pantothenate kinase gene (PANK2) is defective in Hallervorden-Spatz syndrome. Nature Genetics. 28, 345-349 (2001).
- Dusi, S., et al. Exome sequence reveals mutations in CoA synthase as a cause of neurodegeneration with brain iron accumulation. American Journal of Human Genetics. 94, 11-22 (2014).
- Dansie, L. E., et al.
- Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state. PLoS ONE. 5, 11107 (2015).
- Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance. Diabetologia. 57, 1466-1475 (2014).
- Israel, B. C., Smith, C. M. Effects of acute and chronic ethanol ingestion on pantothenate and CoA status of rats. The Journal of Nutrition. 117, 443-451 (1987).
- Garcia, M., Leonardi, R., Zhang, Y. M., Rehg, J. E., Jackowski, S. Germline deletion of pantothenate kinases 1 and 2 reveals the key roles for CoA in postnatal metabolism. PLoS One. 7, 40871 (2012).
- Corbin, D. R., et al. Excess coenzyme A reduces skeletal muscle performance and strength in mice overexpressing human PANK2. Molecular Genetics and Metabolism. 120, 350-362 (2017).
- Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver. Journal of Lipid Research. 60, 1005-1019 (2019).
- Shumar, S. A., et al. Induction of neuron-specific degradation of Coenzyme A models pantothenate kinase-associated neurodegeneration by reducing motor coordination in mice. PLoS ONE. 10, 0130013 (2015).
- Zano, S. P., Pate, C., Frank, M., Rock, C. O., Jackowski, S. Correction of a genetic deficiency in pantothenate kinase 1 using phosphopantothenate replacement therapy. Molecular Genetics and Metabolism. 16, 281-288 (2015).
- Sharma, L. K., et al. A therapeutic approach to pantothenate kinase associated neurodegeneration. Nature Communications. 9, 4399 (2018).
- Alvarez-Cordoba, M., et al. Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation. Molecular Neurobiology. 56, 3638-3656 (2019).
- Arber, C., et al. iPSC-derived neuronal models of PANK2-associated neurodegeneration reveal mitochondrial dysfunction contributing to early disease. PLoS One. 12, 0184104 (2017).
- Di Meo, I., et al. Acetyl-4'-phosphopantetheine is stable in serum and prevents phenotypes induced by pantothenate kinase deficiency. Scientific Reports. 7, 11260 (2017).
- Nishikawa, T., Edelstein, D., Brownlee, M. The missing link: a single unifying mechanism for diabetic complications. Kidney International Supplements. 77, 26-30 (2000).
- Tsuchiya, Y., Pham, U., Gout, I. Methods for measuring CoA and CoA derivatives in biological samples. Biochemical Society Transactions. 42, 1107-1111 (2014).
- Demoz, A., Netteland, B., Svardal, A., Mansoor, M. A., Berge, R. K. Separation and Detection of Tissue Coash and Long-Chain Acyl-Coa by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography after Precolumn Derivatization with Monobromobimane. Journal of Chromatography. 635, 251-256 (1993).
- Shimada, K., Mitamura, K.
- Minkler, P. E., Kerner, J., Ingalls, S. T., Hoppel, C. L. Novel isolation procedure for short-, medium-, and long-chain acyl-coenzyme A esters from tissue. Analytical Biochemistry. 376, 275-276 (2008).
- Newton, G. L., Fahey, R. C. Determination of biothiols by bromobimane labeling and high-performance liquid chromatography. Methods in Enzymology. 251, 148-166 (1995).
- Radkowsky, A. E., Kosower, E. M. Bimanes .17. (Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones (Halo-9,10-Dioxabimanes) - Reactivity toward the Tripeptide Thiol, Glutathione. Journal of the American Chemical Society. 108, 4527-4531 (1986).
- Zhang, Y. M., et al. Chemical knockout of pantothenate kinase reveals the metabolic and genetic program responsible for hepatic coenzyme A homeostasis. Chemistry & Biology. 14, 291-302 (2007).
- Tokutake, Y., Onizawa, N., Katoh, H. Toyoda A,Chohnan S. Coenzyme A and its thioester pools in fasted and fed rat tissues. Biochemical and Biophysical Research Communications. 402, 158-162 (2010).
- Shibata, K., Nakai, T., Fukuwatari, T. Simultaneous high-performance liquid chromatography determination of coenzyme A, dephospho-coenzyme A, and acetyl-coenzyme A in normal and pantothenic acid-deficient rats. Analytical Biochemistry. 430, 151-155 (2012).
- Chohnan, S., Takamura, Y. A simple micromethod for measurement of CoASH and its use in measuring the intracellular levles of CoASH and short chain acyl-CoAs in Escherichia coli K12 cells. Agricultural and Biological Chemistry. 55, 87-94 (1991).
