Summary
Cette méthode décrit la préparation d'échantillons à partir de cellules cultivées et de tissus animaux, l'extraction et la dérivatisation de la coenzyme A dans les échantillons, suivie s'il y a une chromatographie liquide à haute pression pour la purification et la quantification de la coenzyme Dérivée A par détection de l'absorption ou de la fluorescence.
Abstract
La recherche émergente a indiqué que l'approvisionnement en coenzyme a (CoA) cellulaire peut devenir limitant avec un impact préjudiciable sur la croissance, le métabolisme et la survie. La mesure du CoA cellulaire est un défi en raison de son abondance relativement faible et de la conversion dynamique de CoA libre en thioesters CoA qui, à leur tour, participent à de nombreuses réactions métaboliques. Une méthode est décrite qui navigue à travers les pièges potentiels pendant la préparation de l'échantillon pour produire un essai avec une large gamme linéaire de détection qui convient à une utilisation dans de nombreux laboratoires biomédicaux.
Introduction
Coenzyme A (CoA) est un cofacteur essentiel dans tous les organismes vivants et est synthétisé à partir d'acide pantothénique, également appelé pantothénate (le sel d'acide pantothénique) ou vitamine B5. Le CdA est le principal vecteur intracellulaire d'acides organiques, y compris les acides à chaîne courte comme l'acétate et le succinate, les acides à chaîne comme le propionate et le méthylmalonate, les acides gras à longue chaîne comme le palmitate et l'oleat, les acides gras à très longue chaîne tels que les acides gras à très longue chaîne tels que acides gras polyinsaturés, et les xénobiotiques tels que l'acide valproïque. L'acide organique forme un lien de thioester enzymatiquement avec CoA pour permettre son utilisation comme substrat dans plus de 100 réactions dans le métabolisme intermédiaire1. Les thioesters CoA sont également des régulateurs allostériques et des activateurs transcriptionnels. Il est maintenant apprécié2 que l'offre totale cellulaire DeA est réglementée3,4; ainsi, la disponibilité de CoA peut être limitante, et que les insuffisances de CoA peuvent être catastrophiques, comme illustré par les désordres génétiques hérités qui ont un impact coadsynthèse5. Pantothenate kinase catalyse la première étape de la biosynthèse CoA (Figure 1) et Pantothenate Kinase Associated Neurodegeneration, appelé PKAN, est causée par des mutations dans le gène PANK2 6. La synthase CoA, codée par le gène COASYN, catalyse les deux dernières étapes de la biosynthèse coA (Figure 1) et de la neurodégénérescence associée aux protéines COASY, appelée CoPAN, est causée par une mutation du gène COASYN 7. Les deux PKAN et CoPAN sont des maladies neurodégénératives héréditaires associées à l'accumulation de fer dans le cerveau et les carences de CoA sous-en-plan les pathologies de la maladie.
Les niveaux cellulaires de CoA total varient entre les tissus8 et le CoA total peut augmenter ou diminuer sous une variété d'états physiologiques, pathologiques et pharmacologiques. Liver CoA augmente lors du passage du carburant de l'état nourri à l'état à jeun9, et les niveaux de CoA du foie sont anormalement élevés chez les souris obèses déficientes en leptine10. Le CoA du foie diminue en réponse à l'ingestion chronique d'éthanol11. Les niveaux de CoA du cerveau dans le modèle de souris Kok2 Pank2 sont déprimés pendant la période périnatale, mais plus tard dans le stade adulte, la teneur en CoA du cerveau est équivalente aux niveaux de type sauvage, ce qui indique une réponse adaptative de CoA pendant le développement12. La manipulation de la teneur en CoA tissulaire par la transgenèse ou les méthodes d'administration de gènes a un impact sur les fonctions métaboliques et neuronales13,14,15. Le développement préclinique de thérapies potentielles pour PKAN ou CoPAN inclut des mesures de CoA de cellules ou de tissu comme indicateurs de l'efficacité16,17,18,19,20 . L'évaluation de toutes ces conditions et de leurs conséquences métaboliques ou fonctionnelles exige une méthode quantitative pour mesurer le CoA total.
Un analyse précis et fiable pour mesurer le CoA dans les échantillons biologiques est un défi technique dans de nombreux laboratoires. Malheureusement, il n'y a pas de sondes disponibles pour évaluer ou quantifier les thioesters CoA ou CoA dans les cellules intactes, bien que les analogues des thioesters naturels de CoA aient été largement utilisés comme sondes mécanistes dans les études de l'ester de CoA utilisant des enzymes21. La conversion de CoA, avec un masydryle libre (-SH) moiety, à un thioester CoA (ou vice versa) est rapide dans les cellules ou les tissus animaux lors du transfert vers un environnement différent et pendant la lyse cellulaire. De nombreuses synthétases acyl-CoA et thioestérases acyl-CoA dans les cellules servent de médiateur sa part aux interconversions au sein du pool CoA, et d'autres enzymes qui utilisent des thioesters CoA comme substrats restent actifs dans les échantillons biologiques jusqu'à ce qu'ils soient éteints par des produits chimiques ou physiques. moyen de. Le déchargement des groupes d'acyl de CoA à carnitine par acyl-transferases est un exemple dans le réseau de réactions qui peuvent modifier la distribution de thioester CoA/CoA. Les traceurs radioactifs peuvent être utilisés pour mesurer les taux de synthèse du CoA dans les cellules. Les méthodes actuelles de mesure des dérivés du CoA et du CoA dans les échantillons biologiques ont été examinées22 et comprennent des essais spectrophotométriques enzymatiques couplés, une chromatographie liquide à haute pression et des procédures basées sur la spectrométrie de masse. Cependant, ces méthodes sont souvent axées sur des espèces moléculaires de CoA particulières et sont aveugles à la variation du pool total de CoA. Les essais enzymatiques couplés nécessitent généralement de plus grandes quantités de matériel d'entrée en raison de sensibilités de détection faibles et ont une gamme limitée de linéarité.
Notre laboratoire a développé une procédure fiable pour la quantification du Total des ACo dans les cellules cultivées et les tissus animaux. La stratégie comprend l'hydrolyse de tous les thioesters CoA pour ne produire que des ACo gratuits pendant la préparation de l'échantillon, plutôt que de faire des efforts pour maintenir et analyser l'ensemble du spectre des espèces de CoA. La procédure est une compilation de méthodes individuelles publiées pour la préparation de l'échantillon, la dérivation du CDA, la purification et l'identification après chromatographie liquide à haute pression (HPLC), et la quantification du CDA dérivé par absorption ou détection de fluorescence23,24,25. Les déterminations de la CDA obtenues à l'aide de cette procédure ont permis de comprendre la réglementation de la CDA et de développer une approche thérapeutique pour le traitement des carences en CaD.
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Protocol
La procédure animale mentionnée dans ce protocole a été effectuée selon les protocoles 323 et 556 et spécifiquement approuvée par le St. Jude Children's Research Hospital Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Préparation des solutions
REMARQUE : Utilisez de l'eau ultrapure pour toutes les solutions et lorsqu'elle est indiquée dans les procédures.
- Préparer 1 mM d'hydroxyde de potassium (KOH) dans l'eau.
- Préparer 0,25 M KOH dans l'eau.
- Préparer 1 M Trizma-HCl dans l'eau et ajuster au pH 8.0.
- Préparer 100 mM monobromobimane (mBBr) en acetonitrile (Optima Grade). Les solutions de stock de mBBr sont stables à -20 oC pendant de nombreux mois à condition qu'elles soient maintenues dans l'obscurité car l'exposition à la lumière peut photolyser le monobromobimane au bimane26.
- Préparer le tampon de lavage pour l'extraction de phase solide (SPE) colonne : 50% de méthanol (Grade Optima) - 2% d'acide acétique.
- Préparer le tampon d'élution pour la colonne SPE : 95 % d'éthanol (catégorie HPLC) contenant 50 mM de formatdi d'ammonium.
2. Préparation de la norme CoA-bimane
- Achetez une norme CoA de haute qualité auprès d'une source réputée (p. ex., Avanti Polar Lipids, Inc.).
- Préparer une solution de stock à haute concentration de CoA en 20 mM Tris, pH 8. La quantité de CoA dans le stock de haute concentration est déterminée ou confirmée par absorption spectrophotométrique à 260 nm (16 800 M- 1cm-1). Ajouter 4 fois l'excès molaire de mBBr; vortex en hauteur pendant 10 s. Par exemple, pour 10 mM CoA en tampon, ajouter 40 mM mBBr. Le mBBr est ajouté en excès pour s'assurer que tous les CoA est dérivé.
- Incuber à température ambiante pendant 4 h dans l'obscurité sans trembler pour dériver le CoA avec du mBBr. mBBr réagit avec le groupe de thiol du CoA, et il est pH et la température dépendante27. L'ajout du mBBr convertit le CoA en coA fluorescent soluble dans l'eau (ou absorbant ultraviolet) CoA-bimane (CoA-bimane; Figure 2).
- Ajouter de l'acide acétique de 100 l et du vortex à feu vif pendant 10 s pour arrêter la réaction.
- Centrifugeàeur à 2 000 x g pendant 15 minutes pour enlever tout précipité.
- Nettoyer le supernatant à l'aide d'une colonne SPE pour enlever le mBBr non réagi (décrit ci-dessous). La filtration et la centrifugation de l'éluate ne sont pas nécessaires après le nettoyage de la colonne SPE (section 5.8).
- Recueillir l'éluate de la colonne SPE contenant le CoA-bimane dans un tube pré-pesé, sécher sous le gaz azoté, peser et construire une courbe d'étalonnage standard avec des quantités connues de CoA-bimane.
- Vérifiez la norme CoA-bimane pour la pureté par HPLC (voir ci-dessous) avec la détection d'absorption à la fois à 260 euros (moiety adénine) et 393 (bimane moiety) et la coïncidence des deux pics dans le chromatogramme.
- Confirmer la quantité de la norme CoA-bimane dans le stock à haute concentration à l'aide de 260 nm (16 800 M- 1cm-1).
- Enregistrez le temps de rétention hPLC pour l'identification de CoA-bimane dans des échantillons expérimentaux à l'aide de la norme CoA-bimane.
- Entreposer les aliquots du stock à haute concentration de la norme CoA-bimane, protégé de la lumière et entreposé à -20 oC pendant 2 ans. Évitez le dégel et le regel répétés.
3. Extraction et dérivatisation du CDA dans les cellules cultivées
- Récoltez les cellules adhérentes en culture à l'approche des densités de sous-confluents tardives. Par exemple, les cellules humaines HepG2/C3A sont cultivées à une densité de 6-8 x 106, ou heK 293T cellules sont cultivées à une densité de 1,3 x 107 par 100 mm plat.
- Utilisez régulièrement des cultures en double ou triplicates pour les déterminations du CoA. Incuber des plats de culture distincts en parallèle avec les cultures de cellules d'échantillon pour déterminer le nombre viable de cellules. Calculer la quantité de CoA par 106-107 cellules après la purification HPLC.
- Aspirer la culture moyen hors du plat. Lavez rapidement les cellules sur le plat avec de la saline tamponnée par le phosphate glacé (PBS) pour enlever tout milieu résiduel et aspirer le PBS du plat. Lavez rapidement les cellules avec de l'eau glacée pour enlever les PBS résiduels et aspirer rapidement l'eau du plat. Évitez de déranger les cellules adhérentes lors de l'ajout du PBS ou de l'eau.
- Ajouter 1 ml d'eau glacée au plat de culture. Gratter les cellules dans l'eau froide dans le plat et transférer la suspension cellulaire dans un tube à essai en verre contenant 400 L de 0,25 M KOH et 1,5 ml d'eau.
- Mélanger la suspension vigoureusement par vortex à haute teneur pendant 10 s. Ensuite, couvrir étroitement avec du film de paraffine et couver à 55 oC pendant 1 h sans trembler dans un bain d'eau. Le pH de l'échantillon doit être de 12. Le pH élevé est important pour hydrolyser les thioesters CoA et peut être ajusté avec des aliquots supplémentaires de KOH si nécessaire.
- Récolte des cellules cultivées en suspension par centrifugation à basse vitesse : 136 x g pendant 6 min à 4 oC. Laver une fois avec du PBS glacé, puis laver brièvement à nouveau avec de l'eau froide, et enfin resuspendre dans 2,5 ml d'eau froide plus 400 L 0,25 M KOH. Mélanger vigoureusement et incuber à 55 oC comme décrit ci-dessus.
- Ajouter 160 l de 1 M Trizma-HCl et 10 oL de 100 mBBr et mélanger par vortex à hauteur pendant 10 s. Cela porte le pH à environ 8 pour soutenir la réaction mBBr avec CoA gratuit. Couvrir et incuber des échantillons à température ambiante pendant 2 h dans l'obscurité pour que le mBBr réagisse avec le thiol de CoA.
- Ajouter 100 l d'acide acétique et mélanger par vortex à haute teneur pendant 10 s pour arrêter la réaction
- Centrifugeuse à 2 000 x g pendant 15 min pour enlever les débris cellulaires précipités.
- Retirez et enregistrez le supernatant dans un tube à essai en verre pour le nettoyage de la colonne SPE qui est décrit ci-dessous.
4. Extraction et dérivatisation du CoA dans les tissus
- Disséquer les morceaux de tissu animal, d'environ 0,5 cm de diamètre ou moins, et effacer brièvement (1-2 s) sur du papier absorbant, puis geler le flash dans l'azote liquide et les stocker à -80 oC jusqu'au traitement. CoA dans les tissus est hydrolysé ou converti en un thioester si ce n'est flash congelé. Cette étape est importante pour obtenir le rendement maximal de CoA dans les tissus.
- Pesez rapidement les morceaux de tissu congelés (5 à 60 mg) avant de commencer l'analyse et enregistrez le poids de chaque échantillon. Cette détermination du poids humide est utilisée pour le calcul de la teneur en CoA après la purification HPLC. Éviter le dégel complet des morceaux de tissu.
- Ajouter 2 ml de 1 mM DE KOH à un tube à essai en verre (p. ex., 13 mm x 100 mm jetable) destiné à l'insertion d'une sonde et à une perturbation tissulaire à l'homogénéisateur rotor-stator. Garder le tube sur la glace jusqu'à l'utilisation. Ceci est fait pour s'assurer que les échantillons sont homogénéisés à une température froide et CoA n'est pas détruit en raison de la chaleur générée lors de l'homogénéisation.
- Transférer et homogénéiser les tissus (30 à 40 mg) dans le tube à essai en verre (contenant du froid de 1 mM DE K.-O.) pendant 30 s. Éviter la décongélation complète du tissu.
- Ajouter 500 oL de 0,25 M KOH; vortex à haute teneur de 10 s et conserver sur la glace jusqu'à ce que tous les échantillons soient homogénéisés. Cela amènera le pH de l'échantillon au-dessus de 12 à hydrolyser les thioesters CoA pour produire coA total (libre CoA - hydrolysé salincissements AC thioesters).
- Incuber les échantillons à 55 oC pendant 2 h dans un bain d'eau sans trembler pour soutenir l'hydrolyse.
- Ajouter 150 oL de 1 M Trizma-HCl et 10 oL de 100 mM mBBr; vortex en hauteur pendant 10 secondes. Cela porte le pH à environ 8 pour soutenir la réaction mBBr avec CoA gratuit.
- Incuber des échantillons à température ambiante pendant 2 h dans l'obscurité pour s'assurer que tous les CoA sont dérivés de mBBr.
- Ajouter 100 l'acide acétique et le vortex à feu vif pendant 10 s pour arrêter la réaction.
- Centrifugeuse à 2 000 x g pendant 15 min jusqu'aux débris de cellules précipités.
- Retirez et enregistrez le supernatant dans un tube à essai en verre pour le nettoyage de la colonne SPE (décrit ci-dessous).
5. Nettoyage d'échantillon avec la colonne d'extraction de phase solide (SPE)
- À température ambiante, équilibrez chaque colonne jetable de gel de silice éthylique de 2-(2-pyridyl) (1 ml) avec 1 ml de tampon de lavage pour s'assurer que le groupe fonctionnel de pyridyle est protoné et fonctionnera comme un échangeur d'anions. Le gel de silice éthylique de 2-(2-pyridyl)-est un échangeur d'anion faible qui est idéal pour CoA-bimane à un pH de base. 2-(2-pyridyl)-gel de silice éthylique a un pKa de 6 et l'élution est fait pH 7.
- Ajouter l'échantillon de supernatant (étape 4.11) à la colonne et recueillir eluate.
- Laver la colonne deux fois avec 1 ml de tampon de lavage pour éliminer toute espèce non conservée.
- Laver la colonne une fois avec 1 ml d'eau.
- Laver la colonne deux fois avec 1 ml de tampon d'élution dans un tube à essai en verre séparé (12 mm x 75 mm) pour recueillir le CoA-bimane.
- Échantillon de CoA-bimane sec dans le tube sous le gaz azoté à la sécheresse. L'échantillon séché est stable à température ambiante jusqu'à une utilisation ultérieure. Sceller et couvrir complètement le tube et le stocker.
- Une fois prêt pour l'analyse hPLC, suspendre l'échantillon dans 300 l d'eau et mélanger vigoureusement par vortex à haute température pendant 10 s.
- Transférer l'échantillon suspendu dans un filtre à tube de centrifugeuse (0,22 m d'acétate de cellulose, taille de 2 ml) et une centrifugeuse à 5 000 x g pendant 10 min pour enlever tout précipité.
- Transférer l'échantillon filtré dans un flacon de verre adapté à l'injection de HPLC.
6. Purification et mesure HPLC de CoA-bimane
- Préparer les tampons. Tampon A: 50 mM KH2PO4, pH 4.6; Tampon B: Acetonitrile (Optima Grade).
- Alimentez le système HPLC.
REMARQUE : Le système HPLC de notre laboratoire est un module de séparation Waters e2695 équipé d'un détecteur d'absorption 2489 Ultraviolet-Visible (UV-Vis) et d'un détecteur de fluorescence 2475 contrôlé par le logiciel Empower 3. Le système dispose également d'un injecteur d'échantillon automatisé. - Injecter chaque échantillon (p. ex., 20 l) pour la séparation sur une colonne Gemini C18, 3 m 100, 4,6 mm x 150 mm à l'aide du programme dans le tableau 1 avec un débit de 0,5 ml/min. La température de la colonne est de 25 oC. Mesurer l'absorption des UV/Visible à 393 nm, et la détection fluorescente à 393 nm, 470 nm. Le temps de rétention est déterminé par l'exécution d'une courbe standard CoA-bimane avant chaque ensemble d'échantillons.
- Enregistrez la zone sous le pic CoA-bimane pour chaque échantillon et comparez avec la courbe standard pour calculer le pmol de CoA-bimane injecté sur la colonne HPLC. La courbe standard d'absorption de CoA-bimane est utilisée pour les échantillons de tissus, et la courbe standard de fluorescence CoA-bimane est utilisée pour les échantillons de culture tissulaire.
- Comme les valeurs du CoA-bimane représentent un ACo total pour chaque échantillon, normalisez le nombre de cellules viables pour les échantillons de culture, ou le poids mg humide pour les échantillons de tissus (figure 6). Alternativement, calculez les valeurs totales de CoA après normalisation à la teneur en ADN ou en protéines pour chaque échantillon. La teneur en ADN ou en protéines peut être déterminée séparément à l'aide d'aliquots échantillon qui sont enlevés lors de la préparation de l'échantillon avant l'ajout de KOH.
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Representative Results
Une méthode relativement rapide et fiable pour la détection du CoA total dans les cellules et les tissus cultivés a été développée en dérivant le thiol de CoA à un agent fluorescent utilisant mBBr, puis en purifiant le CoA-bimane dérivé en utilisant la phase inverse HPLC. Une courbe standard est d'abord générée, où des quantités connues et croissantes de la norme CoA-bimane sont injectées individuellement et les zones sous les pics dans les chromatogrammes CoA-bimane sont tracées en fonction de l'entrée CoA-bimane (Figure 4). CoA-bimane a un maximum d'absorption à 393 nM et un profil HPLC représentatif montre le temps de rétention de la norme CoA-bimane sur une colonne C18 HPLC (figure 3) en utilisant le programme d'élution dans le tableau 1. Les courbes standard représentatives de CoA-bimane, détectées en mesurant les unités d'absorption ou de fluorescence, sont indiquées respectivement dans la figure 4A et la figure 4B. La courbe standard de la figure 4A reflète l'ampleur de l'absorption du CoA-bimane à 393 nm et la figure 4B représente la fluorescence de CoA-bimane (ex - 393 nm et 'em ' 470 nm) tracée par rapport à la quantité d'entrée de Le CoA-bimane. La norme CoA-bimane peut être détectée de 0,01 à 12 000 pmol et couvre une plage de 106plis lorsque la détection à l'aide de l'absorption et de la fluorescence est combinée. Alors que la limite inférieure de détection de la norme est de 0,01 pmol, la limite inférieure de quanti ation de CoA-bimane dans les échantillons expérimentaux est de 0,2 pmol, soit environ 5 fois plus que la fluorescence de base ou de fond dans le chromatogramme. Le choix de la détection par absorption ou fluorescence de CoA-bimane dépend de la quantité de CoA normalement présente dans les tissus ou les cellules, ainsi que de l'aspect pratique de travailler avec des tailles d'échantillon plus ou moins grandes. L'absorption est généralement utile pour les échantillons de tissus parce que la manipulation de 40-50 mg de matériau de départ donne une meilleure récupération que les échantillons de tissus de 5 mg, tandis que la fluorescence est généralement utile pour les échantillons de cellules cultivées qui sont plus petits en taille et il ya plus de l'interpolation des valeurs à l'extrémité inférieure de la courbe standard de fluorescence. Les laboratoires qui ne détectent que l'absorption peuvent envisager d'augmenter ou de diminuer la taille de l'échantillon de départ, d'augmenter le volume d'injection de HPLC ou de diminuer le volume pour la résuspension de l'échantillon (section 5.9 ci-dessus) pour les mesures dans les cellules cultivées.
Les conditions d'hydrolysme des acyl-CoAs à partir de tissus et de cellules cultivées ont été optimisées en ajustant la concentration de KOH, ainsi que le temps et la température de l'incubation ultérieure (données non montrées). L'état optimal s'est avéré être de 0,25 M à 55 oC pendant 2 heures. Le groupe de thiol de CoA libre plus n'importe quel CoA libéré des thioesters ont été dérivés par la réaction avec mBBr suivant l'ajustement du pH. La séparation subséquente du HPLC et les profils de détection typiques du foie de souris ou des cellules C3A cultivées par l'homme sont indiqués à la figure 5 sous forme de pics rouges, avec un temps de rétention entre 11 et 12 minutes à l'aide du programme d'élution décrit dans le tableau 1. Les quantités typiques de matériel de départ biologique sont 30-40 mg de foie murine (poids humide), 6-8 x 106 cellules pour les cellules C3A humaines "foie-like", ou 1,3 x 107 cellules pour les cellules humaines HEK293T. Les cellules C3A ont été traitées avec un médicament expérimental PanK PZ-2891 à 10 uM qui élève CoA17 (Figure 6). Les mesures de CoA dans les cellules HEK293T lorsque les isoformes PanK sont surexprimés montrent des mesures de CoA sur un large éventail (431-6925 pmoles/L) (Figure 6). Les tailles d'échantillon requises pour cette méthodologie sont pratiques pour l'application à de nombreux contextes expérimentaux.
La zone sous le pic CoA-bimane a été calculée à l'aide d'un logiciel fourni avec le HPLC. Les limites de pointe peuvent être déterminées automatiquement par le logiciel HPLC en attendant l'ajustement approprié des valeurs d'entrée pour la correction de base et la définition de pointe, mais notre laboratoire préfère désigner manuellement le pic CoA-bimane dans chaque chromatogramme, en particulier pour des échantillons biologiques inconnus.
| Temps (min) | Taux de débit (mL/min) | % A | % B | courbe |
| 0 | 0.5 | 90 | 10 | 0 |
| 2 | 0.5 | 90 | 10 | 6 |
| 6 | 0.5 | 85 | 15 | 6 |
| 18 | 0.5 | 60 | 40 | 6 |
| 23 | 0.5 | 60 | 40 | 6 |
| 25 | 0.5 | 90 | 10 | 6 |
| 30 | 0.5 | 90 | 10 | 66 |
Tableau 1 : Programme HPLC pour la séparation CoA-bimane. Tampon A: 50 mM KH2PO4, pH 4.6; Tampon B: Acetonitrile. Le mélange de la mémoire tampon A et du tampon B suit la courbe 6 qui est un gradient linéaire, avec une courbe intermédiaire 8 qui est un gradient concave moyen.
Figure 1. Coenzyme Une voie de biosynthèse. Pantothenate kinase (PanK) catalyse la phosphorylation du pantothénate (vitamine B5) à 4-phosphopantothenate dans la première étape de la biosynthèse coA. La formation de phosphopantothenate est suivie par la condensation avec la cystéine catalysée par la synthase de 4-phosphopantothenoylcysteine et puis la decarboxylation pour former 4-phosphopantetheine par 4-phosphopanthenoylcysteine decarboxylase. 4-Phosphopantetheine est convertie en Coenzyme A (CoA) dans un processus en deux étapes catalysé par CoA Synthase. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. mBBr Réaction avec CoA. Monobromobimane (mBBr) est mélangé avec CoA-SH (CoA gratuit) et incubé à température ambiante pendant 2 heures dans l'obscurité. MBBr non fluorescent devient fluorescent lorsqu'il est lié à CoA pour former CoA-bimane. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Absorbance HPLC Trace of CoA-bimane Standard. CoA-bimane a été séparé sur une colonne Gemini C18 en utilisant le programme HPLC dans le tableau 1. Le temps de rétention typique (min) est indiqué par les unités d'aborbance (AU). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Courbes standard CoA-bimane détectées par absorption ou fluorescence. (A) La courbe standard mesurée à l'aide d'unités de détection d'absorption pour CoA-bimane a été mesurée à 393 nm. Les échantillons de tissus sont habituellement évalués à l'aide de la courbe standard d'absorption. (B) La courbe standard mesurée à l'aide d'unités de détection de fluorescence pour CoA-bimane à 393 nm, 470 nm. Les cellules cultivées sont généralement évaluées pour le contenu de CoA en utilisant la courbe standard de fluorescence. Les normes (et les échantillons) sont régulièrement évalués. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Traces de HPLC d'échantillons typiques de foie ou de cellules cultivées. (A) Identification coA-bimane et quantification du contenu dans l'extrait de foie de souris. Les unités d'absorption (AU) sont indiquées. (B) Identification et quantification du contenu du CoA-bimane dans les cellules cultivées HepG2/C3A. Les unités d'émission de fluorescence (UE) sont indiquées. Les pics CoA-bimane sont représentés en rouge. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6. Niveaux de CoA dans le foie de souris, les cellules cultivées de C3A et de HEK293T. (A) Mesure de CoA dans le foie de souris de pantothénate kinase knock(Pank1-/-) et assorti sauvage-type (WT) animaux. Pank1-/- les animaux ont un CoA plus faible dans le foie par rapport aux animaux WT en raison de l'absence de Pank1 expression9. Les données ont été obtenues à l'aide de 5 souris mâles par génotype et sont représentées comme la moyenne des niveaux de SEM. (B) CoA dans les cellules HepG2/C3A traitées par diméthylsulfoxide (contrôle du véhicule) ou PZ-2891, un médicament expérimental qui module l'activité pank à 10 uM 17. Le niveau cellulaire de CoA est élevé après l'incubation de 24 heures avec PZ-2891. (C) Niveaux de CoA dans les cellules HEK293T transfectées avec soit un vecteur vide pcDNA3.1, ou des cDNA codant les isoformes PANK humains : PANK1, PANK2m qui est l'isoforme mature et traité de PANK2 humain, ou PANK3. Les niveaux de CoA sont élevés par la surexpression de tous les isoformes PANK actifs. Les données dans (B) et (C) proviennent d'échantillons de triplicate indépendants et sont représentées comme la moyenne - SEM. L'analyse statistique a été effectuée à l'aide du test t non apparié et les valeurs d'importance sont indiquées en rouge. Les données en panneaux (B) et (C) sont adaptées de Sharma et al. 12Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Ici, nous démontrons une procédure fiable, étape par étape pour quantifier le Total CoA dans les cellules et les tissus animaux avec un large éventail de détection linéaire qui est accessible dans de nombreux laboratoires qui ont un HPLC avec soit un détecteur de sortie d'absorption ou de fluorescence. Alternativement, la spectrométrie de masse est une technique courante pour évaluer les thioesters CoA et CoA, mais n'est pas largement disponible en raison du coût de l'instrumentation et des connaissances spécialisées requises pour le développement de la méthodologie et l'interprétation des données. Isotopically labeled CoA that is suitable for use as an internal standard for quantification of free CoA in mass spectrometry is not commercially available, and free CoA is not detected by the instrument with the same sensitivity as CoA thioesters such as acetyl-CoA. Ainsi, les niveaux de CoA libres sont souvent largement sous-estimés par la spectrométrie de masse à moins que les données de sortie ne soient comparées à une courbe d'étalonnage standard CoA.
Nous avons comparé la méthode décrite ici avec une méthode différente précédemment utilisée dans notre laboratoire et avons trouvé une plus grande récupération de CoA du foie de souris, 123.4 - 7.9 pmol/mg poids humide, avec cette méthode courante comparée au poids humide de mg 80 utilisant un assay enzymatique qui dérivé libre CoA avec une étiquette radioactive28. La méthode de mesure du Total CoA qui est décrite ici est beaucoup moins lourde, plus rapide et plus facile à contrôler par rapport à la méthode précédemment utilisée dans notre laboratoire28. Auparavant, le CdA a été déterminé après l'extraction de l'hexane du lysate cellulaire et soumis à la conversion enzymatique en radioactif [14C]lauryl-CoA médié par la synthétase Escherichia coli acyl-CoA (FadD). Les acyl-CoA à chaîne courte solubles dans l'acide et les acyl-CoAs à longue chaîne acide-insolubles dans le lysate cellulaire ont été hydrolysés avec KOH pour produire du CoA libre, puis soumis à l'extraction d'hexane avant la conversion enzymatique au CoA29libre. Bien que cette procédure précédente ait eu une bonne spécificité et sensibilité, dans la pratique la tâche a exigé 2 jours ouvrables pour accomplir et la synthetase recombinante d'A. coli acyl-CoA a dû être préparée, purifiée et mesurée pour l'activité spécifique enzymatique avant l'analyse du CDA. Il fallait aussi une instrumentation capable de détecter et de quantifier les isotopes radioactifs, ce qui est beaucoup moins courant dans les laboratoires biomédicaux de l'histoire plus récente. La méthode actuelle telle que décrite ici est la plus appropriée pour notre intérêt de recherche dans la kinase pantothénate (PanK). PanK contrôle le flux à travers la voie biosynthétique CoA et donc le niveau total de CoA est la lecture de l'activité PanK dans les échantillons biologiques.
L'étanchéité des réactions métaboliques dans un échantillon biologique pour maintenir une quantité réelle de CoA exige le soin et la rapidité et est critique pour cette procédure. La déprotéinisation rapide avec un solvant acide ou organique, ou la congélation éclair d'échantillons sont deux méthodes qui ont été utilisées au cours des30,31dernières . Dans la méthode actuelle, l'eau ultrapure glacée est rapidement ajoutée aux cellules lavées au PBS à froid des cultures, et les cellules adhérentes plus l'eau sont ensuite grattées du plat de culture avant le transfert à KOH. Le gel de la suspension des cellules cultivées dans [KOH et eau] pour le stockage à -80 oC avant la préparation de l'échantillon est un point d'arrêt acceptable. Cependant, les valeurs de CoA des échantillons de cellules congelées devraient être comparées à celles des échantillons fraîchement préparés pour déterminer s'il y a perte substantielle du signal de CoA. La perte de 10 % de L'ACo s'est produite dans nos mains après la congélation de l'échantillon cellulaire et peut être liée à la durée prolongée de l'échantillon dans le KOH qui doit être contrôlée. Les morceaux de tissu animal sont rapidement congelés sur un petit « radeau » de papier d'aluminium flottant sur LN2 immédiatement après l'excision du tissu d'un animal euthanasié. Des tailles d'échantillon de 5 mg à 60 mg de tissu congelé sont appropriées pour cette méthode avec des rendements linéaires de CoA. Une fois congelés, les échantillons de tissus stockés à -80 oC sont stables pendant au moins 3 mois, à condition qu'il n'y ait pas de dégel intermittent.
La préparation de l'échantillon avant l'analyse HPLC n'est pas un débit élevé et nécessite une demi-journée de travail complète. Il est recommandé que l'opérateur traite un maximum de 30 échantillons à la fois, en commençant par l'homogénéisation d'un ensemble de 15 échantillons suivi s'homogénéisant de la deuxième ensemble de 15 échantillons au cours de l'incubation de 2 h avec KOH pour la première partie. La période d'incubation KOH a d'abord été optimisée à l'aide de thioesters CoA achetés avec des temps d'incubation allant de 30 min à 4 h, puis l'incubation de 2 h a été choisie pour accueillir le temps pour l'hydrolyse complète de thioester de CoA dans une série d'échantillons de tissu, s'étendant du muscle squelettique au foie8. L'incubation pour la dérivation de CoA avec mBBr est fixée à 2 h à environ 8 pH et un excédent de 20 fois de mBBr est ajouté pour convertir complètement le CoA dans les échantillons biologiques. Les moieties sulhydryl des protéines et des métabolites autres que CoA tels que la carnitine ou le glutathion dans l'échantillon seront dérivés en plus de CoA, et l'excédent de 20 fois a été calculé sur la base de la quantité prévue de foie Total CoA qui a le niveau le plus élevé parmi les tissus. Le pH est réduit avant l'incubation avec mBBr parce que les bromobimanes en général sont moins réactifs envers d'autres nucléophiles comme les amines et les carboxylates dans des solutions aqueuses plus neutres. Le temps de dérivation ne doit pas dépasser 2 h pour éviter ou diminuer la réaction avec des thiols protéiques26. Il faut utiliser des tampons non nucléophiles pour réduire et maintenir le pH parce que la présence d'anions tampon à des concentrations élevées peut interférer avec la dérivation mBBr de CoA.
Le nettoyage de l'échantillon sur la colonne SPE se fait manuellement dans notre laboratoire et peut être effectué à l'aide d'un collecteur sous vide pour raccourcir le temps requis pour cette étape. Une bonne récupération du CoA dérivé de la colonne SPE est systématiquement réalisable et cela a été déterminé séparément à l'aide de thioesters radioactifs[13C]CoA qui sont également conservés sur la colonne SPE. La récupération de [13C]acetyl-CoA a été de 97,6 % et la récupération de [13C] palmitoyl-CoA était de 96,1 %. L'évaporation de l'éluate de la colonne SPE est habituellement effectuée sous gaz azoté pendant la nuit dans notre laboratoire comme une question de commodité, mais le séchage peut être effectué dans les 4 heures sous le gaz d'azote ou à l'aide d'un concentrateur speedvac. Les étapes les plus critiques de la méthode sont liées à l'ajustement du pH et peuvent être vérifiées avec des bandes de papier pH le long du chemin. Pour l'hydrolyse KOH, le pH doit être de 12 euros pour obtenir la libération complète du thioester de CoA. Le pH doit être de 7,8 à 8,5 pour soutenir la réactivité de la dérivation mBBr, et une fois la dérivation terminée, le pH doit être ajusté pour devenir très acide, environ pH 1-2, afin que le CoA-bimane se lie à la colonne SPE. La colonne SPE nettoie l'échantillon pour éliminer l'excès de MBBr non réagi et certaines substances biologiques non apparentées.
Le programme HPLC est conçu de façon à ce que le lavage et la rééquilibrage de la colonne C18 soient suffisants pour éliminer les signaux de fond et de report entre les échantillons. Des échantillons d'eau vierge sont insérés après tous les 5 échantillons de l'ensemble d'échantillons expérimentaux par mesure de précaution afin de surveiller les éventuels reports entre les ensembles et d'assurer la propreté des colonnes. Une erreur occasionnelle due à une injection d'échantillon inappropriée peut se produire lors de l'utilisation d'un injecteur d'échantillon automatisé pour le HPLC, et cela peut facilement être vérifié en comparant les volumes restants dans les flacons d'échantillon après injection ou inspection des pics non liés à la CoA dans le chromatogramme de sortie. Si les valeurs de CoA dépassent la plage linéaire de la courbe d'étalonnage pour la détection de fluorescence, les valeurs seront très probablement à portée pour la détection de l'absorption ultraviolette. Si ce n'est pas le cas, la dilution de l'échantillon avec un volume d'eau connu peut réduire le signal à être dans la plage linéaire et les calculs devraient prendre en compte tout facteur de dilution.
Les niveaux de CoA varient entre les souches de souris consanguines ayant des origines génétiques différentes, bien que les valeurs soient reproductibles lorsque des échantillons biologiques sont obtenus à partir de la même souche dans les mêmes conditions. Nous avons estimé CoA dans plusieurs lignes de souris différentes dans diverses études10,12,16,17. Le CoA a également été mesuré dans plusieurs lignées cellulaires cultivées16,17 en utilisant des cellules primaires ou immortalisées.
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Disclosures
MWF, CS et SJ ont écrit le document, MWF et CS ont fourni les données et les chiffres, COR a conçu les expériences et a examiné le manuscrit de façon critique. SJ et COR sont des inventeurs sur une demande de brevet en instance (PCT/US17/39037) "Small molecule modulators of pantothenate kinases" détenue par St. Jude Children's Research Hospital qui couvre le composé PZ-2891 référencé dans cet article.
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent le financement de la recherche parrainée fournie par CoA Therapeutics, Inc., une filiale de BridgeBio LLC, les National Institutes of Health subvention GM34496, et l'American Lebanese Syrian Associated Charities.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column | Millipore-Sigma | 54127-U | |
| coenzyme A | Avanti Polar Lipids | 870700 | |
| Gemini C18 3 μm 100 Å HPLC column | Phenomenex | 00F-4439-E0 | |
| monobromobimane | ThermoFisher Scientific | M-1378 | |
| Omni-Tip probe tissue disrupter | Omni International | 32750H | |
| Parafilm | Fisher | S37440 | |
| PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer | ThermoFisher Scientific | NC0530997 | |
| Spin-X centrifuge tube filter | CoStar | 8161 | |
| Trizma-HCl | Fisher | T395-1 | |
| Waters 2475 fluorescence detector | Waters | 2475 | |
| Waters 2489 UV-Vis detector | Waters | 2489 | |
| Waters e2695 separations module | Waters | e2695 |
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