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Biochemistry

Quantifizierung von Coenzym A in Zellen und Geweben

Published: September 27, 2019 doi: 10.3791/60182
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Infectious Diseases, St. Jude Children's Research Hospital

Summary

Diese Methode beschreibt die Probenvorbereitung aus kultivierten Zellen und tierischen Geweben, die Extraktion und Derivatisierung von Coenzym A in den Proben, gefolgt von einer Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie zur Reinigung und Quantifizierung des derivatisierten Coenzyms A durch Absorptions- oder Fluoreszenzdetektion.

Abstract

Neue Forschungen haben gezeigt, dass die zelluläre Coenzym A (CoA) Versorgung mit nachteiligen Auswirkungen auf Wachstum, Stoffwechsel und Überleben einschränkenkann. Die Messung von zellulärem CoA ist eine Herausforderung aufgrund seiner relativ geringen Häufigkeit und der dynamischen Umwandlung von freiem CoA in CoA-Thioester, die wiederum an zahlreichen Stoffwechselreaktionen teilnehmen. Es wird eine Methode beschrieben, die während der Probenvorbereitung durch mögliche Fallstricke navigiert, um einen Assay mit einem breiten linearen Nachweisbereich zu ergeben, der für den Einsatz in vielen biomedizinischen Laboratorien geeignet ist.

Introduction

Coenzym A (CoA) ist ein wesentlicher Cofaktor in allen lebenden Organismen und wird aus Pantothensäure, auch Pantothenat (das Salz der Pantothensäure) oder Vitamin B5 genannt, synthetisiert. CoA ist der wichtigste intrazelluläre Träger organischer Säuren, einschließlich kurzkettiger Säuren wie Acetat und Succinat, verzweigtkettige Säuren wie Propionat und Methylmalonat, langkettige Fettsäuren wie Palmitat und Oleat, sehr langkettige Fettsäuren wie mehrfach ungesättigten Fettsäuren und Xenobiotika wie Valproinsäure. Die organische Säure bildet eine Thioester-Verbindung enzymatisch mit CoA, um ihre Verwendung als Substrat bei über 100 Reaktionen im Zwischenstoffwechsel zu ermöglichen1. CoA-Thioester sind auch allosterische Regulatoren und Transkriptionsaktivatoren. Es wird nungeschätzt 2, dass die zelluläre Gesamt-CoA-Versorgung reguliert ist3,4; Daher kann die CoA-Verfügbarkeit begrenzt sein, und dass CoA-Mängel katastrophal sein können, wie vererbte genetische Störungen zeigen, die sich auf die CoA-Biosyntheseauswirken 5. Pantothenatkinase katalysiert den ersten Schritt in der CoA-Biosynthese (Abbildung 1) und Pantothenate Kinase Associated Neurodegeneration, genannt PKAN, wird durch Mutationen im PANK2-Gen 6verursacht. CoA-Synthase, kodiert durch das COASYN-Gen, katalysiert die letzten beiden Schritte in der CoA-Biosynthese (Abbildung 1) und COASY Protein-Associated Neurodegeneration, genannt CoPAN, wird durch eine Mutation im COASYN-Gen verursacht 7. Sowohl PKAN als auch CoPAN sind vererbte neurodegenerative Erkrankungen, die mit der Eisenakkumulation im Gehirn verbunden sind, und CoA-Mangel unterbewertet die Krankheitspathologien.

Die Zellulären Konzentrationen der gesamten CoA variieren zwischenGeweben 8 und Gesamt-CoA kann unter einer Vielzahl von physiologischen, pathologischen und pharmakologischen Zuständen erhöhen oder abnehmen. Leber CoA erhöht während kraftstoffumstellung von der Fütterung in den gefasteten Zustand9, und Leber CoA-Spiegel sind ungewöhnlich hoch bei Leptin-mangelhafte fettleibige Mäuse10. Leber CoA nimmt als Reaktion auf chronische Ethanol-Aufnahme11ab. Gehirn CoA-Spiegel im Pank2 Knockout-Maus-Modell sind während der perinatalen Periode depressiv, aber später im Erwachsenenstadium Gehirn CoA-Gehalt ist gleich wilde-Typ-Ebenen, was auf eine adaptive CoA-Antwort während der Entwicklung12. Die Manipulation des CoA-Gehalts des Gewebes durch Transgenese oder Genabgabemethoden wirkt sich auf metabolische und neuronale Funktionenaus 13,14,15. Die präklinische Entwicklung potenzieller Therapien für PKAN oder CoPAN umfasst Zell- oder Gewebe-CoA-Messungen als Indikatoren für die Wirksamkeit16,17,18,19,20 . Die Bewertung all dieser Bedingungen und ihrer metabolischen oder funktionellen Folgen erfordert eine quantitative Methode zur Messung der gesamten CoA.

Ein genauer, zuverlässiger Test zur Messung von CoA in biologischen Proben ist in vielen Labors eine technische Herausforderung. Leider gibt es keine Sonden zur Bewertung oder Quantifizierung von CoA- oder CoA-Thioestern in intakten Zellen, obwohl Analoga natürlicher CoA-Thioester weit verbreitet als mechanistische Sonden in Studien mit CoA-Ester unter Verwendung von Enzymen21verwendet wurden. Die Umwandlung von CoA, mit einem freien Sulfhydryl (-SH) Moiety, zu einem CoA-Thioester (oder umgekehrt) ist schnell in Zellen oder tierischen Geweben während der Übertragung in eine andere Umgebung und während der Zelllyse. Zahlreiche Acyl-CoA-Synthetasen und Acyl-CoA-Thioesterasen in Zellen vermitteln die Interkonversionen innerhalb des CoA-Pools, und zusätzliche Enzyme, die CoA-Thioester als Substrate nutzen, bleiben in biologischen Proben aktiv, bis sie durch chemische oder physikalische mittel. Die Auslagerung von Acylgruppen von CoA zu Carnitin durch Acyltransferasen ist ein Beispiel innerhalb des Netzwerks von Reaktionen, die die CoA/CoA-Thioester-Verteilung verändern können. Radioaktive Tracer können verwendet werden, um die CoA-Syntheseraten in Zellen zu messen. Die aktuellen Methoden zur Messung von CoA- und CoA-Derivaten in biologischen Proben wurden22 überprüft und umfassen gekoppelte enzymatische spektrophotometrische Assays, Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie und massenspektrometriebasierte Verfahren. Diese Methoden konzentrieren sich jedoch häufig auf bestimmte CoA-Molekulararten und sind blind für Variationen des gesamten CoA-Pools. Die gekoppelten enzymatischen Assays erfordern aufgrund geringer Detektionsempfindlichkeiten in der Regel größere Mengen an Eingangsmaterial und weisen einen begrenzten Linearitätsbereich auf.

Unser Labor hat ein zuverlässiges Verfahren zur Quantifizierung des gesamten CoA in kultivierten Zellen und tierischen Geweben entwickelt. Die Strategie umfasst die Hydrolyse aller CoA-Thioester, um während der Probenvorbereitung nur freies CoA zu liefern, anstatt sich um die Erhaltung und Analyse des gesamten Spektrums der CoA-Arten zu bemühen. Das Verfahren ist eine Zusammenstellung einzelner veröffentlichter Methoden zur Probenvorbereitung, CoA-Ableitung, Reinigung und Identifizierung nach Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und Quantifizierung des derivatisierten CoA durch Absorption oder Fluoreszenzdetektion23,24,25. Die mit diesem Verfahren gewonnenen CoA-Bestimmungen haben unser Verständnis der CoA-Regulierung und die Entwicklung eines therapeutischen Ansatzes zur Behandlung von CoA-Mängeln ermöglicht.

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Protocol

Das in diesem Protokoll erwähnte Tierverfahren wurde gemäß den Protokollen 323 und 556 durchgeführt und vom St. Jude Children es Research Hospital Institutional Animal Care and Use Committee speziell genehmigt.

1. Vorbereitung von Lösungen

HINWEIS: Verwenden Sie Reinstwasser für alle Lösungen und wenn in verfahren angegeben.

  1. 1 mM Kaliumhydroxid (KOH) in Wasser vorbereiten.
  2. 0.25 M KOH in Wasser vorbereiten.
  3. 1 M Trizma-HCl in Wasser vorbereiten und auf pH 8,0 einstellen.
  4. 100 mM Monobromobiman (mBBr) in Acetonitril (Optima Grade) vorbereiten. Stocklösungen von mBBr sind viele Monate bei -20 °C stabil, sofern sie im Dunkeln gehalten werden, da die Lichteinwirkung das Monobromobiman zu Bimane26photolyseisieren kann.
  5. Bereiten Sie Wash Buffer für die Festphasenextraktion (SPE) Spalte vor: 50% Methanol (Optima Grade) + 2% Essigsäure.
  6. Elution Buffer für SPE-Säule vorbereiten: 95% Ethanol (HPLC-Grade) mit 50 mM Ammoniumformat.

2. Vorbereitung des CoA-Bimane-Standards

  1. Kaufen Sie einen hochwertigen CoA-Standard aus einer seriösen Quelle (z.B. Avanti Polar Lipids, Inc.).
  2. Bereiten Sie eine hochkonzentrierte Lagerlösung von CoA in 20 mM Tris, pH 8 vor. Die CoA-Menge im hochkonzentrierten Bestand wird durch spektrophotometrische Absorption bei 260 nm bestimmt oderbestätigt . 4-fach molareüberschuss von mBBr hinzufügen; Wirbel auf hoch für 10 s. Zum Beispiel, für 10 mM CoA im Puffer, fügen Sie 40 mM mBBr. Das mBBr wird überzählend hinzugefügt, um sicherzustellen, dass alle CoA ableitung.
  3. Inkubieren Bei Raumtemperatur für 4 h im Dunkeln ohne schütteln, um die CoA mit mBBr abzuleiten. mBBr reagiert mit der Thiolgruppe der CoA, und es ist pH- und temperaturabhängig27. Die Zugabe des mBBr wandelt CoA in ein wasserlösliches fluoreszierendes (oder ultraviolettes Absorptionsmittel) CoA-Bimane (CoA-Bimane; Abbildung 2).
  4. Fügen Sie 100 l Essigsäure und Wirbel auf hoch für 10 s, um die Reaktion zu stoppen.
  5. Zentrifuge bei 2.000 x g für 15 Minuten, um alle Niederschlagsmittel zu entfernen.
  6. Bereinigen Sie den Überstand mit einer SPE-Säule, um das unreagierte mBBr (siehe unten) zu entfernen. Eine Filtration und Zentrifugierung des Eluats ist nach der SPE-Säulenreinigung (Abschnitt 5.8) nicht erforderlich.
  7. Sammeln Sie das Eluat aus der SPE-Säule, die das CoA-Bimane enthält, in einem vorgewogenen Rohr, trocknen Sie unter Stickstoffgas, wiegen Sie und konstruieren Sie eine Standardkalibrierungskurve mit bekannten CoA-Bimanenmengen.
    1. Prüfen Sie den CoA-Bimane-Standard auf Reinheit durch HPLC (siehe unten) mit Absorptionsdetektion sowohl bei 260 (Adenin-Moiety) als auch bei 393 (bimane moiety) und Beifall beider Spitzen im Chromatogramm.
    2. Bestätigen Sie die Menge des CoA-Bimane-Standards im Hochkonzentrationsbestand mit 260 nm (n = 16.800 M-1cm-1).
  8. Registrieren Sie die HPLC-Retentionszeit für die Identifizierung von CoA-Bimane in experimentellen Proben mit dem CoA-Bimane-Standard.
  9. Lagern Sie Aliquots des hochkonzentrierten Lagerbestands des CoA-Bimane-Standards, der bis zu 2 Jahre lang vor Licht geschützt und bei -20 °C gelagert wird. Vermeiden Sie wiederholtes Auftauen und erneutes Einfrieren.

3. Extraktion und Ableitung von CoA in kultivierten Zellen

  1. Ernten Sie anhimante Zellen in der Kultur, wenn sie sich der späten subkonfluenten Dichte nähern. Zum Beispiel werden menschliche HepG2/C3A-Zellen auf eine Dichte von 6-8 x 106angebaut, oder HEK 293T-Zellen werden auf eine Dichte von 1,3 x 107 pro 100 mm Schale angebaut.
    1. Verwenden Sie für CoA-Bestimmungen routinemäßig doppelte oder dreifache Kulturen. Inkubieren Sie separate Kulturgerichte parallel zu den Probenzellkulturen, um die lebensfähige Zellzahl zu bestimmen. Berechnen Sie die CoA-Menge pro 106-107 Zellen nach HPLC-Reinigung.
  2. Aspirieren Kultur Medium aus dem Teller. Waschen Sie zellen schnell auf der Schale mit eiskalter Phosphat-gepufferter Saline (PBS), um restliche Mittel zu entfernen und das PBS von der Schale abzusaugen. Waschen Sie Zellen schnell mit eiskaltem Wasser, um Rest-PBS zu entfernen und das Wasser schnell von der Schale abzusaugen. Vermeiden Sie es, die anhaftenden Zellen beim Hinzufügen des PBS oder Wassers zu stören.
  3. Fügen Sie 1 ml eiskaltes Wasser in das Kulturgericht. Die Zellen in das kalte Wasser in der Schale gießen und die Zellsuspension in ein Glasreageröhrchen mit 400 l 0,25 M KOH und 1,5 ml Wasser übertragen.
    1. Mischen Sie die Suspension kräftig durch Wirbel auf hoch für 10 s. Dann mit Paraffinfolie fest abdecken und bei 55 °C 1 h bebrüten, ohne im Wasserbad zu schütteln. Der pH-Wert der Probe sollte 12 betragen. Der hohe pH-Wert ist wichtig, um die CoA-Thioester zu hydrolysieren und kann bei Bedarf mit zusätzlichen Aliquots von KOH eingestellt werden.
  4. Ernten kultivierte Zellen, die in Suspension durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit wachsen: 136 x g für 6 min bei 4 °C. Einmal mit eiskaltem PBS waschen, dann kurz wieder mit kaltem Wasser waschen und schließlich in 2,5 ml kaltem Wasser plus 400 l 0,25 M KOH wieder aufhängen. kräftig mischen und bei 55 °C inkubieren, wie oben beschrieben.
  5. 160 l von 1 M Trizma-HCl und 10 l von 100 mM mBBr hinzufügen und mit Wirbel auf hoch für 10 s mischen. Dadurch erhöht sich der pH-Wert auf ca. 8, um die mBBr-Reaktion mit freiem CoA zu unterstützen. Bedecken und bebrüten Proben bei Raumtemperatur für 2 h im Dunkeln, damit der mBBr mit dem Thiol von CoA reagiert.
  6. Fügen Sie 100 l Essigsäure hinzu und mischen Sie mit Wirbel auf hoch für 10 s, um die Reaktion zu stoppen
  7. Zentrifuge bei 2.000 x g für 15 min, um gefällte Zellablagerungen zu entfernen.
  8. Entfernen und speichern Sie Überstand in einem Glas-Reagenzglas für die SPE-Säulenreinigung, die unten beschrieben wird.

4. Extraktion und Ableitung von CoA in Geweben

  1. Sezieren Sie tierische Gewebestücke, etwa 0,5 cm Durchmesser oder kleiner, und bappen Sie kurz (1-2 s) auf saugfähigem Papier und blitzen sie dann in flüssigem Stickstoff einfrieren und lagern Sie bei -80 °C bis zur Verarbeitung. CoA im Gewebe wird hydrolysiert oder in ein Thioester umgewandelt, wenn nicht blitzgefroren. Dieser Schritt ist wichtig, um die maximale Ausbeute von CoA in Geweben zu erhalten.
  2. Wiegen Sie gefrorene Gewebestücke (5 – 60 mg) schnell vor Beginn der Analyse und erfassen Sie das Gewicht für jede Probe. Diese Nassgewichtsbestimmung wird zur Berechnung des CoA-Gehalts nach HPLC-Reinigung verwendet. Vermeiden Sie ein vollständiges Tauen der Gewebestücke.
  3. Fügen Sie 2 ml 1 mM KOH in ein Glas-Reagenzglas (z. B. 13 mm x 100 mm Einweg) zum Einsetzen einer Sonde und Gewebestörung mit einem Rotor-Stator-Homogenisator. Halten Sie die Röhre auf Eis, bis sie verwendet wird. Dadurch wird sichergestellt, dass die Proben bei kalter Temperatur homogenisiert werden und CoA nicht durch die während der Homogenisierung erzeugte Wärme zerstört wird.
  4. Gewebe (30 – 40 mg) im Glas-Reagenzglas (mit kalt 1 mM KOH) 30 s übertragen und homogenisieren. Vollständiges Auftauen des Gewebes vermeiden.
  5. Fügen Sie 500 l von 0,25 M KOH hinzu; Wirbel auf hoch für 10 s und auf Eis halten, bis alle Proben homogenisiert sind. Dadurch wird der pH-Wert der Probe über 12 dazu gebracht, die CoA-Thioester zu hydrolysieren, um insgesamt CoA (freie CoA + hydrolysierte CoA-Thioester) zu ergeben.
  6. Inkubieren Sie Proben bei 55 °C für 2 h in einem Wasserbad ohne Schütteln, um die Hydrolyse zu unterstützen.
  7. 150 l von 1 M Trizma-HCl und 10 l von 100 mM mBBr hinzufügen; Wirbel auf hoch für 10 Sekunden. Dies bringt den pH-Wert auf etwa 8, um die mBBr-Reaktion mit freiem CoA zu unterstützen.
  8. Inkubieren Sie Proben bei Raumtemperatur für 2 h im Dunkeln, um sicherzustellen, dass alle CoA mit mBBr ableitet werden.
  9. Fügen Sie 100 l Essigsäure und Wirbel auf hoch für 10 s, um die Reaktion zu stoppen.
  10. Zentrifuge bei 2.000 x g für 15 min, um ausgefällten Zellschutt zu pellet.
  11. Entfernen und speichern Sie Überstand in einem Glas-Reagenzglas für die SPE-Säulenreinigung (siehe unten).

5. Probenreinigung mit Festphasenextraktionssäule (SPE)

  1. Bei Raumtemperatur jede Einweg-2-(2-Pyridyl)-Ethyl-Kieselgelsäule (1 ml Größe) mit 1 ml Waschpuffer ausdemieren, um sicherzustellen, dass die Pyridylfunktionsgruppe protoniert ist und als Anionenaustauscher fungiert. 2-(2-pyridyl)-ethyl kieselsäuregel ist ein schwacher Anionenaustauscher, der ideal für CoA-Bimane bei einem grundlegenden pH-Wert ist. 2-(2-pyridyl)-ethyl-silgeligel hat eine pKa von 6 und die Elution erfolgt pH-Wert 7.
  2. Fügen Sie Probe überstand (Schritt 4.11) zur Spalte hinzu und sammeln Sie Eluat.
  3. Waschen Sie die Säule zweimal mit 1 ml Waschpuffer, um alle nicht zurückgehaltenen Arten zu entfernen.
  4. Säule einmal mit 1 ml Wasser waschen.
  5. Säule zweimal mit 1 ml Elution Buffer in ein separates Glas-Reagenzglas (12 mm x 75 mm) waschen, um den CoA-Bimane zu sammeln.
  6. Trockene CoA-Bimane Probe in Rohr unter Stickstoffgas bis trocken. Die getrocknete Probe ist bei Raumtemperatur bis zur weiteren Verwendung stabil. Versiegeln und vollständig abdecken das Rohr und speichern.
  7. Wenn Sie für die HPLC-Analyse bereit sind, setzen Sie die Probe in 300 l Wasser wieder auf und mischen Sie sie kräftig durch Wirbel auf hoch für 10 s.
  8. Resuspendierte Probe in einen Zentrifugenrohrfilter (0,22 m Celluloseacetat, 2 ml Größe) und Zentrifuge bei 5.000 x g für 10 min übertragen, um jeglichen Niederschlag zu entfernen.
  9. Gefilterte Probe in eine Glasdurchstechflasche für die HPLC-Injektion geben.

6. HPLC-Reinigung und Messung von CoA-Bimane

  1. Bereiten Sie Puffer vor. Puffer A: 50 mM KH2PO4, pH 4.6; Puffer B: Acetonitril (Optima Grade).
  2. Schalten Sie das HPLC-System ein.
    HINWEIS: Das HPLC-System in unserem Labor ist ein Waters e2695 Separations Modul, das mit einem 2489 Ultraviolet-Visible (UV-Vis) Absorptionsdetektor und einem 2475 Fluoreszenzdetektor ausgestattet ist, der mit der Empower 3 Software gesteuert wird. Das System verfügt auch über einen automatisierten Probeninjektor.
  3. Injizieren Sie jede Probe (z.B. 20 l) zur Trennung an einer Gemini C18, 3 m 100 , 4,6 mm x 150 mm Säule mit dem Programm in Tabelle 1 mit einer Durchflussrate von 0,5 ml/min. Die Säulentemperatur beträgt 25 °C. Messen Sie die UV/Sichtbare Detektorabsorption bei 393 nm und die Fluoreszenzdetektion bei 393 nm, die - mit 470 nm. Die Retentionszeit wird durch Ausführen einer CoA-Bimane-Standardkurve vor jedem Satz von Samples bestimmt.
  4. Zeichnen Sie die Fläche unter dem CoA-Bimane-Peak für jede Probe auf und vergleichen Sie sie mit der Standardkurve, um Pmol von CoA-Bimane zu berechnen, das in die HPLC-Säule injiziert wurde. Die CoA-Bimane Absorptionsstandardkurve wird für Gewebeproben und die CoA-Bimane-Fluoreszenz-Standardkurve für Gewebekulturproben verwendet.
  5. Da die CoA-Bimane-Werte die gesamte CoA für jede Probe darstellen, normalisieren Sie sich auf die Anzahl der lebensfähigen Zellen für Kulturproben oder mg-Nassgewicht für Gewebeproben(Abbildung 6). Berechnen Sie alternativ die gesamten CoA-Werte nach normalisierter DNA- oder Proteingehalt für jede Probe. Der DNA- oder Proteingehalt kann separat anhand von Proben-Aliquots bestimmt werden, die während der Probenvorbereitung vor der KOH-Zugabe entfernt werden.

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Representative Results

Eine relativ schnelle und zuverlässige Methode zum Nachweis von CoA-Gesamtinkulturzellen und Geweben wurde entwickelt, indem das Thiol von CoA mit mBBr zu einem Fluoreszenzmittel ableitet und dann das derivatisierte CoA-Bimane mit Reverse-Phase-HPLC gereinigt wird. Zunächst wird eine Standardkurve erzeugt, bei der bekannte und steigende Mengen des CoA-Bimane-Standards einzeln injiziert werden und die Bereiche unter den Spitzen in den CoA-Bimane-Chromatogrammen in Abhängigkeit vom Eingang CoA-bimane(Abbildung 4) dargestellt werden. CoA-Bimane hat ein Absorptionsmaximum von 393 nM und ein repräsentatives HPLC-Profil zeigt die Retentionszeit des CoA-Bimane-Standards auf einer C18 HPLC-Säule (Abbildung 3) unter Verwendung des Elutionsprogramms in Tabelle 1an. Repräsentative Standardkurven von CoA-Bimane, die durch Messung von Absorptions- oder Fluoreszenzeinheiten nachgewiesen werden, sind in Abbildung 4A bzw. Abbildung 4Bdargestellt. Die Standardkurve in Abbildung 4A spiegelt die Größe der Absorption von CoA-Bimane bei 393 nm wider, und Abbildung 4B stellt die Fluoreszenz von CoA-Bimane (ex = 393 nm und CoA-Bimane. Der CoA-Bimane-Standard kann von 0,01 bis 12.000 pmol nachgewiesen werden und deckt einen 106-fachenBereich ab, wenn die Detektion sowohl mit Absorption als auch fluoreszenz kombiniert wird. Während die untere Nachweisgrenze der Norm 0,01 pmol beträgt, liegt die untere Grenze der CoA-Bimane-Quantifizierung in versuchsproben bei 0,2 pmol, was etwa 5-mal größer ist als die Grund- oder Hintergrundfluoreszenz im Chromatogramm. Die Wahl der Detektion durch Absorption oder Fluoreszenz von CoA-Bimane hängt von der Menge an CoA ab, die normalerweise in Geweben oder Zellen vorhanden ist, zusammen mit der Praktikabilität der Arbeit mit größeren oder kleineren Probengrößen. Absorption ist im Allgemeinen nützlich für Gewebeproben, da die Handhabung von 40-50 mg Ausgangsmaterial eine bessere Erholung als 5 mg Gewebeproben ergibt, während Fluoreszenz im Allgemeinen für kultivierte Zellproben nützlich ist, die kleiner sind und es größere Vertrauen in die Interpolation von Werten am unteren Ende der Fluoreszenz-Standardkurve. Laboratorien mit nur Absorptionsnachweis können erwägen, den Anfangsstichprobenumfang zu erhöhen oder zu verringern, das HPLC-Injektionsvolumen zu erhöhen oder das Volumen für die Probenresuspension zu verringern (Abschnitt 5.9 oben) für Messungen in kultivierten Zellen.

Die Bedingungen für die Hydrolyse von Acyl-CoAs aus Geweben und kultivierten Zellen wurden durch Anpassung der KOH-Konzentration und der Zeit und Temperatur der nachfolgenden Inkubation optimiert (Daten nicht dargestellt). Der optimale Zustand wurde für 2 Stunden bei 55 °C mit 0,25 M ermittelt. Die Thiolgruppe der freien CoA plus alle von Thiostern befreiten CoA wurden durch Reaktion mit mBBr nach Anpassung des pH-Werts abgeleitet. Nachfolgende HPLC-Trennung und typische Detektionsprofile für Mausleber oder humankultivierte C3A-Zellen sind in Abbildung 5 als rote Spitzen angegeben, mit einer Retentionszeit zwischen 11 und 12 Minuten mit dem in Tabelle 1beschriebenen Elutionsprogramm. Typische Mengen an biologischem Ausgangsmaterial sind 30-40 mg murine Leber (Nassgewicht), 6-8 x 106 Zellen für menschliche "leberähnliche" C3A-Zellen oder 1,3 x 107 Zellen für menschliche HEK293T-Zellen. Die C3A-Zellen wurden mit einem PanK-Experimentalmedikament PZ-2891 bei 10 uM behandelt, das CoA17 erhöht (Abbildung 6). Die CoA-Messungen in HEK293T-Zellen, wenn PanK-Isoformen überexprimiert sind, zeigen CoA-Messungen über einen weiten Bereich (431-6925 pmoles/l) (Abbildung 6). Die für diese Methodik erforderlichen Stichprobengrößen sind praktisch für die Anwendung in vielen experimentellen Kontexten.

Die Fläche unter dem CoA-Bimane-Peak wurde mit Hilfe einer Software berechnet, die mit dem HPLC geliefert wurde. Die Peak-Grenzwerte können automatisch durch die HPLC-Software bis zur richtigen Anpassung der Eingangswerte für die Basiswertkorrektur und Peak-Definition bestimmt werden, aber unser Labor bevorzugt es, den CoA-Bimane-Peak in jedem Chromatogramm manuell zu bestimmen, insbesondere für unbekannte biologische Proben.

Zeit (min) Durchfluss (mL/min) % A % B kurve
0 0.5 90 10 0
2 0.5 90 10 6
6 0.5 85 15 6
18 0.5 60 40 6
23 0.5 60 40 6
25 0.5 90 10 6
30 0.5 90 10 66

Tabelle 1: HPLC-Programm zur CoA-Bimane-Trennung. Puffer A: 50 mM KH2PO4, pH 4.6; Puffer B: Acetonitril. Das Mischen von Puffer A und Puffer B folgt Kurve 6, einem linearen Gradienten, mit einer dazwischenliegenden Kurve 8, die einen mittleren konkaven Gradienten ist.

Figure 1
Abbildung 1. Coenzym A Biosyntheseweg. Pantothenatkinase (PanK) katalysiert die Phosphorylierung von Pantothenat (Vitamin B5)zu 4-Phosphopantothen im ersten Schritt der CoA-Biosynthese. Auf die Bildung von Phosphopantothenat folgt eine Kondensation mit Cystein, das durch 4-Phosphopantothenoylcystein-Synthase katalysiert wird, und dann Decarboxylierung, um 4-Phosphopantethein durch 4-Phosphopanthenoylcystein-Decarboxylase zu bilden. 4-Phosphopantethein wird in einem zweistufigen Prozess, der von CoA Synthase katalysiert wird, in Coenzym A (CoA) umgewandelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2. mBBr-Reaktion mit CoA. Monobromobiman (mBBr) wird mit CoA-SH (free CoA) gemischt und bei Raumtemperatur für 2 Stunden im Dunkeln inkubiert. Nicht fluoreszierend wird mBBr fluoreszierend, wenn es an CoA gebunden wird, um CoA-Bimane zu bilden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Absorptions-HPLC-Spur des CoA-Bimane-Standards. CoA-bimane wurde auf einer Gemini C18-Säule mit dem HPLC-Programm in Tabelle 1getrennt. Typische Retentionszeit (min) wird durch Aborbance Units (AU) angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: CoA-Bimane-Standardkurven, die durch Absorption oder Fluoreszenz erfasst werden. (A) Die Mit Hilfe von Absorptionsdetektionseinheiten für CoA-Bimane gemessene Standardkurve wurde mit 393 nm gemessen. Gewebeproben werden in der Regel mit der Absorptionsstandardkurve ausgewertet. (B) Die Standardkurve, die mit Fluoreszenzdetektionseinheiten für CoA-Bimane bei 393 nm gemessen wird, ist 470 nm. Kultivierte Zellen werden in der Regel mit Hilfe der Fluoreszenz-Standardkurve auf CoA-Gehalt ausgewertet. Doppelte Standards (und Proben) werden routinemäßig ausgewertet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: HPLC-Spuren typischer Leber- oder kultivierter Zellproben. (A) CoA-Bimane Identifizierung und Quantifizierung des Inhalts in Mausleberextrakt. Absorptionseinheiten (AU) sind angegeben. (B) CoA-bimane Identifizierung und Quantifizierung von Inhalten in HepG2/C3A-kultivierten Zellen. Fluoreszenz-Emissionseinheiten (EU) sind angegeben. Die CoA-Bimane-Spitzen sind rot dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6. CoA-Spiegel in Mausleber, kultivierten C3A- und HEK293T-Zellen. (A) CoA-Messung in der Mausleber von Pantothenat-Kinase-Knockout (Pank1-/-) und übereinstimmenden Wildtiertieren (WT). Pank1-/- Tiere haben niedrigere CoA in der Leber im Vergleich zu WT-Tieren aufgrund des Fehlens von Pank1-Expression 9. Die Daten wurden mit 5 männlichen Mäusen pro Genotyp gewonnen und werden als Mittelwert dargestellt. (B) CoA-Werte in HepG2/C3A-Zellen, die entweder mit Dimethylsulfoxid (Fahrzeugkontrolle) oder PZ-2891 behandelt wurden, einem experimentellen Medikament, das die PanK-Aktivität bei 10 uM moduliert. 17. Der zelluläre CoA-Spiegel wird nach einer 24-Stunden-Inkubation mit PZ-2891 erhöht. (C) CoA-Werte in HEK293T-Zellen, die entweder mit leerem Vektor pcDNA3.1 transfiziert werden, oder cDNAs, die menschliche PANK-Isoformen kodieren: PANK1, PANK2m, die ausgereifte, verarbeitete Isoform des menschlichen PANK2 oder PANK3. Die CoA-Werte werden durch Überexpression aller aktiven PANK-Isoformen erhöht. Die Daten in (B) und (C) stammen aus unabhängigen Dreifachproben und werden als Mittelwert SEM dargestellt. Die statistische Analyse erfolgte mit dem ungepaarten t-Test und die Signifikanzwerte sind rot dargestellt. Die Daten in den Panels (B) und (C) sind von Sharma et al. 12Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Hier zeigen wir ein zuverlässiges, schrittweises Verfahren zur Quantifizierung von CoA-GesamtcoA in Zellen und tierischen Geweben mit einer breiten Palette linearer Detektion, die in vielen Laboratorien zugänglich ist, die über einen HPLC mit einem Absorptions- oder Fluoreszenz-Ausgangsdetektor verfügen. Alternativ ist die Massenspektrometrie eine gängige Technik zur Bewertung von CoA- und CoA-Thioestern, ist aber aufgrund der Kosten der Instrumentierung und des für die Entwicklung der Methodik und der Interpretation von Daten erforderlichen Fachwissens nicht allgemein verfügbar. Isotopisch gekennzeichnete CoA, die für die Verwendung als interner Standard für die Quantifizierung von freiem CoA in der Massenspektrometrie geeignet ist, ist nicht kommerziell erhältlich, und freies CoA wird vom Instrument nicht mit der gleichen Empfindlichkeit wie CoA-Thioester wie Acetyl-CoA erkannt. Daher werden freie CoA-Werte durch die Massenspektrometrie oft grob unterschätzt, es sei denn, die Ausgabedaten werden mit einer CoA-Standardkalibrierungskurve verglichen.

Wir verglichen die hier beschriebene Methode mit einer anderen Methode, die zuvor in unserem Labor verwendet wurde, und fanden eine größere CoA-Erholung von der Mausleber, 123,4 x 7,9 pmol/mg Nassgewicht, mit dieser aktuellen Methode im Vergleich zu 80 pmol/mg Nassgewicht mit einem enzymatischen Assay, der derivatisierte freie CoA mit einem radioaktiven Tag28. Das hier beschriebene Verfahren zur Messung der gesamten CoA ist wesentlich weniger umständlich, schneller und einfacher zu kontrollieren als die bisher in unserem Labor verwendete Methode28. Früher wurde CoA nach Hexanextraktion des Zelllysats bestimmt und einer enzymatischen Umwandlung in radioaktive [14C]lauryl-CoA unterzogen, die durch die Escherichia coli acyl-CoA Synthetase (FadD) vermittelt wurde. Die säurelöslichen Kurzketten-Acyl-CoAs und die säureunlöslichen Langkett-Acyl-CoAs im Zelllysat wurden mit KOH hydrolysiert, um freies CoA zu liefern, und anschließend vor der enzymatischen Umwandlung in freies CoA29der Hexanextraktion unterzogen. Obwohl dieses vorherige Verfahren eine gute Spezifität und Empfindlichkeit aufwies, dauerte die Aufgabe in der Praxis 2 Arbeitstage und die rekombinante E. coli acyl-CoA-Synthetase musste auf enzymatische spezifische Aktivität vorbereitet, gereinigt und gemessen werden. vor der CoA-Analyse. Es erforderte auch eine Instrumentierung, die in der Lage ist, radioaktive Isotope zu erkennen und zu quantifizieren, was in biomedizinischen Laboratorien in jüngerer Geschichte viel seltener vorkommt. Die hier beschriebene aktuelle Methode eignet sich am besten für unser Forschungsinteresse an Pantothenatkinase (PanK). PanK steuert den Fluss durch den Biosynthetischen CoA-Signalweg und so ist der gesamte CoA-Wert die Auslesung der PanK-Aktivität in biologischen Proben.

Das Abschrecken von Stoffwechselreaktionen in einer biologischen Probe, um eine echte Menge an CoA aufrechtzuerhalten, erfordert Sorgfalt und Schnelligkeit und ist für dieses Verfahren von entscheidender Bedeutung. Schnelle Deproteinisierung mit einem sauren oder organischen Lösungsmittel oder Flash-Freezing von Proben sind zwei Methoden, die in der Vergangenheit verwendet wurden30,31. Bei der vorliegenden Methode wird eiskaltes Reinstwasser schnell zu eiskalten PBS-gewaschenen Zellen aus Kulturen hinzugefügt, und anhaftende Zellen plus Wasser werden dann vor dem Transfer nach KOH von der Kulturschale abgekratzt. Das Einfrieren der kultivierten Zellsuspension in [KOH + Wasser] zur Lagerung bei -80 °C vor der Probenvorbereitung ist ein akzeptabler Haltepunkt. Allerdings sollten CoA-Werte aus gefrorenen Zellproben mit denen aus frisch zubereiteten Proben verglichen werden, um festzustellen, ob das CoA-Signal erheblich verloren geht. Der Verlust von 10 % CoA ist in unseren Händen nach dem Einfrieren der Zellprobe aufgetreten und kann mit der längeren Zeit der Probe im KOH zusammenhängen, die kontrolliert werden muss. Tierische Gewebestücke werden schnell auf einer kleinen Folie "Raft" auf LN2 schwimmen drücke unmittelbar nach der Exzision des Gewebes von einem eingeschläferten Tier eingefroren. Probengrößen von 5 mg bis 60 mg gefrorenes Gewebe eignen sich für diese Methode mit linearen CoA-Ausbeuten. Nach dem Einfrieren sind Gewebeproben, die bei -80 °C gelagert werden, mindestens 3 Monate lang stabil, sofern kein intermittierendes Tauwetter auftritt.

Die Probenvorbereitung vor der HPLC-Analyse ist nicht hoch durchstöbet und erfordert einen vollen Arbeitshalbtag. Es wird empfohlen, dass der Bediener maximal 30 Proben gleichzeitig handhabt, beginnend mit der Homogenisierung eines Satzes von 15 Proben, gefolgt von der Homogenisierung des zweiten Satzes von 15 Proben während der 2 h Inkubation mit KOH für den ersten Satz. Die KOH-Inkubationszeit wurde zunächst mit gekauften CoA-Thioestern mit Inkubationszeiten von 30 min bis 4 h optimiert, und dann wurde die 2 h Inkubation gewählt, um die Zeit für die vollständige CoA-Thioesterhydrolyse in einer Vielzahl von Gewebeproben, die von vom Skelettmuskel bis zur Leber8. Die Inkubation zur CoA-Ableitung mit mBBr wird auf 2 h bei ca. pH 8 eingestellt und ein 20-facher Überschuss an mBBr wird hinzugefügt, um das CoA in den biologischen Proben vollständig umzuwandeln. Sulhydryl-Moieties von Proteinen und Metaboliten außer CoA wie Carnitin oder Glutathion in der Probe werden zusätzlich zu CoA delegiert, und der 20-fache Überschuss wurde auf der Grundlage der erwarteten Menge der gesamten CoA-Leber berechnet, die den höchsten Gehalt hat. unter Geweben. Der pH-Wert wird vor der Inkubation mit mBBr reduziert, da Bromobimane im Allgemeinen weniger reaktiv gegenüber anderen Nucleoten wie Adophilen und Carboxylaten in neutraleren wässrigen Lösungen sind. Die Zeit der Derivatisierung sollte 2 h nicht überschreiten, um eine Reaktion mit Proteinthiolen zu vermeiden oder zu mindern26. Man muss nichtnukleophile Puffer verwenden, um den pH-Wert zu reduzieren und aufrechtzuerhalten, da das Vorhandensein von Pufferanionen in hohen Konzentrationen die mBBr-Ableitung von CoA stören kann.

Die Probenreinigung an der SPE-Säule erfolgt manuell in unserem Labor und kann mit Hilfe eines Vakuumkrümmers durchgeführt werden, um die für diesen Schritt erforderliche Zeit zu verkürzen. Eine gute Rückgewinnung des derivatisierten CoA aus der SPE-Säule ist routinemäßig erreichbar und wurde separat mit radioaktiven[13C]CoA-Thiostern bestimmt, die auch auf der SPE-Säule zurückgehalten werden. Die Erholung von [13C]acetyl-CoA betrug 97,6% und die Erholung von [13C] Palmitoyl-CoA 96,1%. Die Verdunstung des SPE-Säuleneluats erfolgt in der Regel über Nacht in unserem Labor unter Stickstoffgas, aber die Trocknung kann innerhalb von 4 Stunden unter Stickstoffgas oder mit einem Speedvac-Konzentrator abgeschlossen werden. Die wichtigsten Schritte der Methode beziehen sich auf die pH-Einstellung und können unterwegs mit pH-Papierstreifen überprüft werden. Für die KOH-Hydrolyse muss der pH-Wert 12 betragen, um eine vollständige Freisetzung des Thioesters von CoA zu erreichen. Der pH-Wert muss 7,8 – 8,5 betragen, um die Reaktivität der mBBr-Derivatisierung zu unterstützen, und nach Abschluss der Derivatisierung sollte der pH-Wert sehr sauer, etwa pH 1-2, angepasst werden, damit das CoA-Bimane an die Säule SPE bindet. Die SPE-Säule reinigt die Probe, um überschüssiges unreagiertes mBBr und einige nicht verwandte biologische Substanzen zu beseitigen.

Das HPLC-Programm ist so konzipiert, dass das Waschen und Requilibration der C18-Säule ausreicht, um Hintergrund- und Übertragssignale zwischen den Proben zu eliminieren. Wasser-Rohlingsproben werden nach jeder 5 Probe in den Versuchsprobensatz als Vorsichtsmaßnahme eingesetzt, um eine mögliche Übertragung zwischen den Sätzen zu überwachen und die Sauberkeit der Säule zu gewährleisten. Bei verwendung eines automatisierten Probeninjektors für den HPLC kann ein gelegentlicher Fehler durch unsachgemäße Probeninjektion auftreten, und dies kann leicht durch einen Vergleich der in den Probenfläschchen verbleibenden Volumina nach der Injektion oder Inspektion der nicht-CoA-bezogenen Spitzen in der Ausgabechromatogramm. Wenn die CoA-Werte den linearen Bereich der Kalibrierkurve für die Fluoreszenzdetektion überschreiten, liegen die Werte höchstwahrscheinlich im Bereich für die UV-Absorptionserkennung. Ist dies nicht der Fall, kann die Verdünnung der Probe mit einem bekannten Wasservolumen das Signal im linearen Bereich reduzieren, und Berechnungen sollten jeden Verdünnungsfaktor berücksichtigen.

Die CoA-Werte variieren zwischen inzuchtfarbenen Mausstämmen mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund, obwohl die Werte reproduzierbar sind, wenn biologische Proben aus demselben Stamm unter den gleichen Bedingungen gewonnen werden. Wir haben CoA in mehreren verschiedenen Mauslinien in verschiedenen Studiengeschätzt 10,12,16,17. CoA wurde auch in mehreren kultivierten Zelllinien16,17 mit primären oder verewigten Zellen gemessen.

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Disclosures

MWF, CS und SJ schrieben das Papier, MWF und CS stellten die Daten und Zahlen zur Verfügung, COR entwarf die Experimente und überprüfte das Manuskript kritisch. SJ und COR sind Erfinder einer anhängigen Patentanmeldung (PCT/US17/39037) "Kleine Molekülmodulatoren von Pantothenat-Kinasen" des St. Jude Children es Research Hospital, die die in diesem Artikel genannte PZ-2891-Verbindung abdeckt.

Acknowledgments

Die Autoren würdigen die Finanzierung von gesponserter Forschung, die von CoA Therapeutics, Inc., einer Tochtergesellschaft von BridgeBio LLC, dem National Institutes of Health Grant GM34496 und den American Lebanese Syrian Associated Charities bereitgestellt wird.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column Millipore-Sigma 54127-U
coenzyme A Avanti Polar Lipids 870700
Gemini C18 3 μm 100 Å HPLC column Phenomenex 00F-4439-E0
monobromobimane ThermoFisher Scientific M-1378
Omni-Tip probe tissue disrupter Omni International 32750H
Parafilm Fisher S37440
PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer ThermoFisher Scientific NC0530997
Spin-X centrifuge tube filter CoStar 8161
Trizma-HCl Fisher T395-1
Waters 2475 fluorescence detector Waters 2475
Waters 2489 UV-Vis detector Waters 2489
Waters e2695 separations module Waters e2695

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Biochemie Ausgabe 151 Coenzym A kultivierte Zellen tierische Gewebe Monobromobiman Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie Festphasenextraktion
Quantifizierung von Coenzym A in Zellen und Geweben
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Frank, M. W., Subramanian, C., Rock, … More

Frank, M. W., Subramanian, C., Rock, C. O., Jackowski, S. Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues. J. Vis. Exp. (151), e60182, doi:10.3791/60182 (2019).

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