Summary
Questo metodo descrive la preparazione del campione da cellule coltivate e tessuti animali, l'estrazione e la derivazione del coenzima A nei campioni, seguita dalla cromatografia liquida ad alta pressione per la purificazione e la quantificazione del coenzima derivato A da rilevamento dell'assorbimento o della fluorescenza.
Abstract
La ricerca emergente ha rivelato che l'offerta di coenzenzima cellulare A (CoA) può diventare limitante con un impatto negativo sulla crescita, il metabolismo e la sopravvivenza. La misurazione del CoA cellulare è una sfida per la sua relativamente bassa abbondanza e la conversione dinamica di CoA gratuita a CoA thioesters che, a sua volta, partecipano a numerose reazioni metaboliche. Viene descritto un metodo che naviga attraverso potenziali insidie durante la preparazione del campione per produrre un saggio con un'ampia gamma lineare di rilevamento che è adatto per l'uso in molti laboratori biomedici.
Introduction
Il coenzima A (CoA) è un cofattore essenziale in tutti gli organismi viventi ed è sintetizzato dall'acido panttheico, chiamato anche panttheanato (il sale dell'acido pantonico) o vitamina B5. Il CoA è il principale vettore intracellulare di acidi organici, compresi gli acidi a catena corta come acetato e succinato, acidi a catena di rami come propionato e metilmalo, acidi grassi a catena lunga come palmitato e oleato, acidi grassi a catena molto lunga come acidi grassi polinsaturi e xenobiotici come l'acido valproico. L'acido organico forma un collegamento tioester enzimaticamente con CoA per consentire il suo uso come substrato in oltre 100 reazioni nel metabolismo intermedio1. I tioesteri coA sono anche regolatori allosterici e attivatori trascrizionali. Ora è apprezzato2 che la fornitura totale cellulare di CoA è regolata3,4; pertanto, la disponibilità di CoA può essere limitante e le carenze di CoA possono essere catastrofiche, come esemplificato da disturbi genetici ereditari che hanno un impatto sulla biosintesi coa5. Pantothenate chinaase catalizza il primo passo nella biosintesi coa (Figura 1) e Pantothenate Kinase Associated Neurodegeneration, chiamato PKAN, è causata da mutazioni nel gene PANK2 6. La sintesi della CoA, codificata dal gene COASYN, catalizza gli ultimi due passaggi nella biosintesi CoA (Figura 1) e nella Neurodegenerazione associata alle proteine COASY, chiamata CoPAN, è causata da una mutazione nel gene COASYN 7. Sia PKAN che CoPAN sono malattie neurodegenerative ereditarie associate all'accumulo di ferro nel cervello e alle carenze di CoA in modo inferiore alle patologie.
I livelli cellulari di CoA totale variano tra i tessuti8 e CoA totale può aumentare o diminuire sotto una varietà di stati fisiologici, patologici e farmacologici. Il CoA del fegato aumenta durante il passaggio del combustibile dallo stato di alimentazione allo stato digiunato9e i livelli di CoA epatica sono anormalmente elevati nei topi obesi carenti di leptina10. Fegato CoA diminuisce in risposta all'ingestione cronica di etanolo11. I livelli di CoA cerebrale nel modello di topo knockout Pank2 sono depressi durante il periodo perinatale, ma più tardi nella fase adulta il contenuto di CoA del cervello è equivalente ai livelli di tipo selvaggio, indicando una risposta CoA adattiva durante lo sviluppo12. Manipolazione del contenuto di CoA dei tessuti mediante transgenesi o metodi di somministrazione genica influisce sulle funzioni metaboliche e neurali13,14,15. Lo sviluppo preclinico di potenziali terapie per PKAN o CoPAN include misurazioni CoA cellulari o tissutali come indicatori di efficacia16,17,18,19,20 . La valutazione di tutte queste condizioni e delle loro conseguenze metaboliche o funzionali richiede un metodo quantitativo per la misurazione del CoA totale.
Un test accurato e affidabile per misurare CoA in campioni biologici è una sfida tecnica in molti laboratori. Purtroppo, non ci sono sonde disponibili per valutare o quantificare i tioesteri CoA o CoA in cellule intatte, anche se analoghi di tioesters CoA naturali sono stati ampiamente utilizzati come sonde meccanicistiche negli studi di CoA ester utilizzando enzimi21. La conversione di CoA, con un solfuro libero (-SH), in un tifoso di CoA (o viceversa) è rapida nelle cellule o nei tessuti animali durante il trasferimento in un ambiente diverso e durante la lisi cellulare. Numerosi sintetasi acyl-CoA e tioesterai di CoA nelle cellule mediano le interconversioni all'interno del pool di CoA, e ulteriori enzimi che utilizzano il tioestro coa come substrati rimangono attivi in campioni biologici fino a quando non vengono spenti da prodotti chimici o fisici mezzo. L'off-loading dei gruppi acili dal CoA alla carnitina da parte dei transferasi di acyl è un esempio all'interno della rete di reazioni che possono alterare la distribuzione di coA/CoA thioester. I traccianti radioattivi possono essere utilizzati per misurare i tassi di sintesi CoA nelle cellule. Gli attuali metodi per misurare i derivati di CoA e CoA in campioni biologici sono stati esaminati22 e includono saggi spettrofotometrici enzimatici accoppiati, cromatografia liquida ad alta pressione e procedure basate sulla spettrometria di massa. Tuttavia, questi metodi sono spesso focalizzati su particolari specie molecolari di CoA e sono ciechi alla variazione della piscina totale di CoA. I saggi enzimatici accoppiati generalmente richiedono grandi quantità di materiale di input a causa di basse sensibilità di rilevamento e hanno una gamma limitata di linearità.
Il nostro laboratorio ha sviluppato una procedura affidabile per la quantificazione del CoA totale nelle cellule coltivate e nei tessuti animali. La strategia include l'idrolisi di tutti i tioesteri CoA per produrre solo CoA gratuito durante la preparazione del campione, piuttosto che fare sforzi per mantenere e analizzare l'intero spettro delle specie CoA. La procedura è una compilazione di singoli metodi pubblicati per la preparazione dei campioni, la derivazione del CoA, la purificazione e l'identificazione a seguito della cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) e la quantificazione della CoA derivata mediante assorbimento o rilevamento della fluorescenza23,24,25. Le determinazioni CoA ottenute utilizzando questa procedura hanno permesso la nostra comprensione della regolazione CoA e lo sviluppo di un approccio terapeutico per il trattamento delle carenze di CoA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
La procedura animale di cui al presente protocollo è stata eseguita secondo i protocolli 323 e 556 e specificamente approvata dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del St. Jude Children's Research Hospital.
1. Preparazione delle soluzioni
NOTA: Utilizzare acqua ultrapura per tutte le soluzioni e quando indicato nelle procedure.
- Preparare 1 mM di idrossido di potassio (KOH) in acqua.
- Preparare 0,25 M KOH in acqua.
- Preparare 1 M Trizma-HCl in acqua e regolare al pH 8.0.
- Preparare 100 mM monobromobimane (mBBr) in acetonitrile (Optima Grade). Le soluzioni stock di mBBr sono stabili a -20 gradi centigradi per molti mesi, a condizione che siano tenute al buio, poiché l'esposizione alla luce può fotolizzare il monobromobimane a bimane26.
- Preparare il buffer di lavaggio per l'estrazione di fase solida (SPE) colonna: 50% metanolo (Optima Grade) - 2% acido acetico.
- Preparare il buffer di elusione per la colonna SPE: 95% di etanolo (HPLC Grade) contenente 50 mM di formato di ammonio.
2. Preparazione dello standard CoA-bimane
- Acquistare uno standard CoA di alta qualità da una fonte affidabile (ad esempio, Polar Lipids, Inc.).
- Preparare una soluzione di stock ad alta concentrazione di CoA in 20 mM Tris, pH 8. La quantità di CoA nello stock ad alta concentrazione è determinata o confermata dall'assorbimento spettrofotometrico a 260 nm (16.800 M-1cm). Aggiungere un eccesso molare 4 volte superiore di mBBr; vortice in alto per 10 s. Ad esempio, per 10 mM CoA nel buffer, aggiungere 40 mM mBBr. L'mBBr viene aggiunto in eccesso per garantire che tutto il CoA sia derivato.
- Incubare a temperatura ambiente per 4 h al buio senza agitare per derivare il CoA con mBBr. mBBr reagisce con il gruppo thiol del CoA, ed è pH e temperatura dipendente27. L'aggiunta del mBBr converte CoA in un fluorescente solubile in acqua (o assorbitore ultravioletto) CoA-bimane (CoA-bimane; figura 2).
- Aggiungere 100 l'acido acetico e il vortice in alto per 10 s per fermare la reazione.
- Centrifuga a 2.000 x g per 15 minuti per rimuovere qualsiasi precipitante.
- Pulire il supernatante utilizzando una colonna SPE per rimuovere il mBBr non reagito (descritto di seguito). La filtrazione e la centrifugazione dell'eluato non sono necessarie dopo la pulizia della colonna SPE (Sezione 5.8).
- Raccogliere l'eluato dalla colonna SPE contenente la CoA-bimane in un tubo pre-pesato, asciugare sotto gas di azoto, pesare e costruire una curva di calibrazione standard con quantità note di CoA-bimane.
- Controllare lo standard CoA-bimane per la purezza da HPLC (vedi sotto) con rilevamento di assorbimento sia a 260 (moiety adenina) che a 393 (moiety bimane) e coincidenza di entrambi i picchi nel cromatogramma.
- Confermare la quantità dello standard CoA-bimane nello stock ad alta concentrazione utilizzando 260 nm (16.800 M-1cm-1).
- Registrare il tempo di conservazione HPLC per l'identificazione di CoA-bimane in campioni sperimentali utilizzando lo standard CoA-bimane.
- Conservare le aliquote dello stock ad alta concentrazione dello standard CoA-bimane protetto dalla luce e conservato a -20 gradi centigradi per un massimo di 2 anni. Evitare lo scongelamento ripetuto e il nuovo congelamento.
3. Estrazione e derivazione del CoA nelle cellule coltivate
- Raccogliere cellule aderenti nella coltura quando si avvicina nolate densità subconfluenti. Ad esempio, le cellule umane HepG2/C3A vengono cresciute fino a una densità di 6-8 x 106o le cellule HEK 293T vengono cresciute fino a una densità di 1,3 x 107 per 100 mm piatto.
- Utilizzare regolarmente colture duplicate o triplicate per le determinazioni CoA. Incubare piatti di coltura separati in parallelo con le colture di cellule campione per determinare il numero di cellule vitali. Calcolare la quantità di CoA per 106-107 cellule dopo la purificazione HPLC.
- Cultura aspirata mezzo fuori dal piatto. Lavare rapidamente le cellule sul piatto con la salina (PBS) con fosfato freddo ghiaccio per rimuovere qualsiasi mezzo residuo e aspirare il PBS dal piatto. Lavare rapidamente le cellule con acqua ghiacciata per rimuovere il PBS residuo e aspirare rapidamente l'acqua dal piatto. Evitare di disturbare le cellule aderenti quando si aggiunge il PBS o l'acqua.
- Aggiungere 1 mL di acqua ghiacciata al piatto di coltura. Raschiare le cellule nell'acqua fredda del piatto e trasferire la sospensione cellulare in una provetta di vetro contenente 400 -L di 0,25 M KOH e 1,5 mL di acqua.
- Mescolare vigorosamente la sospensione con vortice alto per 10 s. Quindi coprite con pellicola a paraffina e incubate a 55 gradi centigradi per 1 h senza agitare in un bagno d'acqua. Il pH del campione deve essere di 12. L'elevato pH è importante per idrolizzare i tioetri CoA e può essere regolato con aliquote aggiuntive di KOH se necessario.
- Raccogliere cellule coltivate che crescono in sospensione per centrifugazione a bassa velocità: 136 x g per 6 min a 4 gradi centigradi. Lavare una volta con PBS ghiacciato, quindi lavare brevemente di nuovo con acqua fredda, e infine risospendere in 2,5 mL di acqua fredda più 400 .L 0.25 M KOH. Mescolare vigorosamente e incubare a 55 gradi centigradi come descritto sopra.
- Aggiungete 160 luna di 1 M Trizma-HCl e 10-L di 100 mM mBBr e mescolate ad alta la piu' a vortice per 10 s. Questo porta il pH a circa 8 per sostenere la reazione mBBr con CoA gratuito. Coprire e incubare campioni a temperatura ambiente per 2 h al buio affinché il mBBr reagisca con il thiol di CoA.
- Aggiungere 100 l di acido acetico e mescolare con vortice in alto per 10 s per fermare la reazione
- Centrifuga a 2.000 x g per 15 min per rimuovere i detriti delle cellule precipitate.
- Rimuovere e salvare il supernatante in una provetta di vetro per la pulizia della colonna SPE descritta di seguito.
4. Estrazione e derivazione del CoA nei tessuti
- Dissezionare pezzi di tessuto animale, di circa 0,5 cm di diametro o più piccoli, e macchiare brevemente (1-2 s) su carta assorbente e poi lampeggiare congelare in azoto liquido e conservare a -80 gradi centigradi fino alla lavorazione. Il CoA nei tessuti è idrolizzato o convertito in un tioestro se non flash congelato. Questo passaggio è importante per ottenere la resa massima di CoA nei tessuti.
- Pesare i pezzi di tessuto congelato (5 – 60 mg) rapidamente prima di iniziare l'analisi, e registrare il peso per ogni campione. Questa determinazione del peso umido viene utilizzata per il calcolo del contenuto di CoA dopo la purificazione di HPLC. Evitare lo scongelo completo dei pezzi di tessuto.
- Aggiungere 2 mL di 1 mM KOH a una provetta di vetro (ad esempio, 13 mm x 100 mm usa e getta) destinata all'inserimento di una sonda e un'interruzione dei tessuti con un omogeneizzatore dello statore. Tenere il tubo sul ghiaccio fino all'uso. Questo viene fatto per garantire che i campioni siano omogeneizzati a temperatura fredda e che il CoA non venga distrutto a causa del calore generato durante l'omogeneizzazione.
- Trasferire e omogeneizzare il tessuto (30 – 40 mg) nella provetta di vetro (contenente freddo 1 mM KOH) per 30 s. Evitare lo scongelamento completo del tessuto.
- Aggiungere 500 -L di 0,25 M KOH; vortice in alto per 10 s e tenere sul ghiaccio fino a quando tutti i campioni sono omogeneizzati. Questo porterà il pH del campione sopra 12 per idrolizzare i tioetri CoA per produrre CoA totale (libero CoA - thioesters CoA idrolizzato).
- Incubare campioni a 55 gradi centigradi per 2 h in un bagno d'acqua senza agitare per sostenere l'idrolisi.
- Aggiungere 150 luna di 1 M Trizma-HCl e 10 -L di 100 mM mBBr; vortice in alto per 10 secondi. Questo porta il pH a circa 8 per sostenere la reazione mBBr con CoA libero.
- Incubare campioni a temperatura ambiente per 2 h al buio per garantire che tutto il CoA sia derivato da mBBr.
- Aggiungere 100 l di acido acetico e vortice in alto per 10 s per fermare la reazione.
- Centrifuga a 2.000 x g per 15 min a pellet precipitati detriti cellulari.
- Rimuovere e salvare il supernatante in una provetta di vetro per la pulizia della colonna SPE (descritta di seguito).
5. Esempio di pulizia con colonna di estrazione di fase solida (SPE)
- A temperatura ambiente, eclacazione ogni colonna di gel di silice etimali monouso 2-(2-pyridyl)-ethyl (1 mL di dimensione) con 1 mL di Wash Buffer per garantire che il gruppo funzionale pyridyl sia protonato e funzioni come scambiatore di anion. Il gel di silice in etilice 2-(2-pyridyl) è uno scambiatore di anion debole che è ideale per CoA-bimane in un pH di base. 2-(2-pyridyl)-ethyl silice gel ha un pKa di 6 e l'elusione è fatto pH 7.
- Aggiungere il supernatante campione (passaggio 4.11) alla colonna e raccogliere l'eluate.
- Lavare la colonna due volte con 1 mL di Wash Buffer per rimuovere eventuali specie non trattenute.
- Lavare la colonna una volta con 1 mL di acqua.
- Lavare la colonna due volte con 1 mL di Elution Buffer in una provetta di vetro separata (12 mm x 75 mm) per raccogliere la CoA-bimane.
- Campione di CoA-bimane a secco nel tubo sotto gas di azoto a secco. Il campione essiccato è stabile a temperatura ambiente fino all'ulteriore utilizzo. Sigillare e coprire completamente il tubo e conservare.
- Quando è pronto per l'analisi HPLC, risospendere il campione in 300 gradi di acqua e mescolare vigorosamente con vortice in alto per 10 s.
- Trasferire il campione risospeso in un filtro del tubo di centrifuga (acetato di cellulosa 0,22 m, 2 mL di dimensione) e centrifugare a 5.000 x g per 10 min per rimuovere eventuali precipitazioni.
- Trasferire il campione filtrato su una fiala di vetro adatta per l'iniezione HPLC.
6. Depurazione e misurazione HPLC di CoA-bimane
- Preparare i buffer. Buffer A: 50 mM KH2PO4, pH 4.6; Buffer B: Acetonitrile (Optima Grade).
- Alimentare il sistema HPLC.
NOTA: Il sistema HPLC nel nostro laboratorio è un modulo di separazione Waters e2695 dotato di un rilevatore di assorbimento 2489 Ultraviolet-Visible (UV-Vis) e di un rilevatore di fluorescenza 2475 controllato con il software Empower 3. Il sistema ha anche un iniettore di campioni automatizzato. - Iniettare ogni campione (ad es., 20 l) per la separazione su una colonna Gemini C18, 3 m 100, 4,6 mm x 150 mm utilizzando il programma nella tabella 1 con una portata di 0,5 mL/min. La temperatura della colonna è di 25 gradi centigradi. Misura l'assorbimento del rivelatore UV/Visibile a 393 nm, e il rilevamento fluorescente a 393 nm, ovvero 470 nm. Il tempo di ritenzione viene determinato eseguendo una curva standard CoA-bimane prima di ogni set di campioni.
- Registrare l'area sotto il picco di CoA-bimane per ogni campione e confrontarla con la curva standard per calcolare il pmol di CoA-bimane iniettato sulla colonna HPLC. La curva standard di assorbimento CoA-bimane viene utilizzata per i campioni di tessuto e la curva standard di fluorescenza CoA-bimane viene utilizzata per i campioni di coltura dei tessuti.
- Poiché i valori di CoA-bimane rappresentano coA totale per ogni campione, normalizzare al numero di cellule vitali per i campioni di coltura, o peso umido mg per i campioni di tessuto (Figura 6). In alternativa, calcolare i valori coa totali dopo la normalizzazione del DNA o del contenuto proteico per ogni campione. Il DNA o il contenuto proteico possono essere determinati separatamente utilizzando campioni che vengono rimossi durante la preparazione del campione prima dell'aggiunta dell'aliquota.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Un metodo relativamente veloce e affidabile per il rilevamento del CoA totale nelle cellule e nei tessuti coltivati è stato sviluppato derivando il thiol di CoA a un agente fluorescente utilizzando mBBr, e quindi purificando il CoA-bimane derivata utilizzando la fase inversa HPLC. Viene generata per la prima volta una curva standard, in cui quantità note e crescenti dello standard CoA-bimane vengono iniettate singolarmente e le aree sotto i picchi nei cromatogrammi CoA-bimane vengono tracciate in funzione dell'input CoA-bimane (Figura 4). CoA-bimane ha un massimo di assorbimento a 393 nM e un profilo HPLC rappresentativo mostra il tempo di ritenzione dello standard CoA-bimane su una colonna C18 HPLC (Figura 3) utilizzando il programma di elusione nella tabella 1. Le curve standard rappresentative di CoA-bimane, rilevate misurando le unità di assorbimento o a fluorescenza, sono mostrate rispettivamente nella Figura 4A e nella Figura 4B. La curva standard nella figura 4A riflette l'entità dell'assorbimento di CoA-bimane a 393 nm e la figura 4B rappresenta la fluorescenza di CoA-bimane (sezione 393 nm e 470 nm) tracciata rispetto alla quantità di input di CoA-bimane. Lo standard CoA-bimane può essere rilevato da 0,01 a 12.000 pmol e copre un intervallo di 106volte quando il rilevamento utilizzando sia l'assorbimento che la fluorescenza è combinato. Mentre il limite inferiore di rilevamento dello standard è 0,01 pmol, il limite inferiore della quantitazione CoA-bimane nei campioni sperimentali è di 0,2 pmol, che è di circa 5 volte maggiore rispetto alla linea di base o alla fluorescenza di fondo nel cromatogramma. La scelta del rilevamento per assorbimento o fluorescenza di CoA-bimane dipende dalla quantità di CoA normalmente presente nei tessuti o nelle cellule, insieme alla praticità di lavorare con campioni di dimensioni più grandi o più piccole. L'assorbimento è generalmente utile per i campioni di tessuto perché la manipolazione di 40-50 mg di materiale iniziale produce un recupero migliore rispetto a 5 campioni di tessuto mg, mentre la fluorescenza è generalmente utile per i campioni di cellule coltivate che sono di dimensioni inferiori e c'è maggiore l'interpolazione dei valori all'estremità inferiore della curva standard di fluorescenza. I laboratori con rilevamento solo assorbente possono prendere in considerazione l'aumento o la diminuzione della dimensione iniziale del campione, aumentando il volume di iniezione HPLC o diminuendo il volume per la sospensione del campione (Sezione 5.9 sopra) per le misurazioni nelle cellule coltivate.
Le condizioni per l'idroliting acillo-CoA dai tessuti e dalle cellule coltivate sono state ottimizzate regolando la concentrazione di KOH e il tempo e la temperatura della successiva incubazione (dati non mostrati). La condizione ottimale è risultata essere 0,25 M a 55 gradi centigradi per 2 ore. Il gruppo di Thiol di CoA libero più qualsiasi CoA liberato da tioetri sono stati derivati dalla reazione con mBBr dopo la regolazione del pH. La successiva separazione HPLC e i profili di rilevamento tipici per il fegato di topo o le cellule C3A coltivate umane sono indicati nella Figura 5 come picchi rossi, con un tempo di ritenzione compreso tra 11 e 12 minuti utilizzando il programma di elusione descritto nella Tabella 1. Quantità tipiche di materiale di partenza biologico sono 30-40 mg di fegato murino (peso umido), 6-8 x 106 cellule per le cellule umane "fegato" C3A, o 1,3 x 107 cellule per le cellule umane HEK293T. Le cellule C3A sono state trattate con un farmaco sperimentale PanK P-2891 a 10 uM che eleva CoA17 (Figura 6). Le misurazioni CoA nelle celle HEK293T quando gli isoformi PanK sono sovraespressi mostrano le misurazioni CoA su un'ampia gamma (431-6925 pmoles/L) (Figura 6). Le dimensioni dei campioni necessarie per questa metodologia sono pratiche per l'applicazione in molti contesti sperimentali.
L'area sotto il picco Di CoA-bimane è stata calcolata utilizzando un software fornito con HPLC. I limiti di picco possono essere determinati automaticamente dal software HPLC in attesa di una corretta regolazione dei valori di input per la correzione della linea di base e la definizione del picco, ma il nostro laboratorio preferisce designare manualmente il picco CoA-bimane in ogni cromatogramma, in particolare per campioni biologici sconosciuti.
| Tempo (min) | Velocità di flusso (mL/min) | % A | % B | curva |
| 0 | 0.5 | 90 | 10 | 0 |
| 2 | 0.5 | 90 | 10 | 6 |
| 6 | 0.5 | 85 | 15 | 6 |
| 18 | 0.5 | 60 | 40 | 6 |
| 23 | 0.5 | 60 | 40 | 6 |
| 25 | 0.5 | 90 | 10 | 6 |
| 30 | 0.5 | 90 | 10 | 66 |
Tabella 1: Programma HPLC per la separazione CoA-bimane. Buffer A: 50 mM KH2PO4, pH 4.6; Buffer B: Acetonitrile. La miscelazione del Buffer A e del Buffer B segue la curva 6 che è un gradiente lineare, con una curva 8 che interviene che è un gradiente concavo medio.
come illustrato nella Figura 1. Coenzyme Un percorso di biosintesi. La pantontenata chinasi (PanK) catalizza il fosforilo del pantoterato (vitamina B5)a 4 anniofanto nella prima fase della biosintesi coa. La formazione di fosforopantthenato è seguita dalla condensazione con cisteina catalizzata da sinteassi 4-phospholcysteine 4-phosphotheylcysteine e poi decarboxylation per formare 4o-foshopanteina da 4 sfofenoylcysteine decarboxylase. La fossphopanteina 4 viene convertita in Coenzyme A (CoA) in un processo in due fasi catalizzato da CoA Synthase. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. reazione mBBr con CoA. Monobromobimane (mBBr) viene mescolato con CoA-SH (CoA gratuito) e incubato a temperatura ambiente per 2 ore al buio. MBBr non fluorescente diventa fluorescente quando è legato a CoA per formare CoA-bimane. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Traccia HPLC assorbente di CoA-bimane Standard. CoA-bimane è stato separato su una colonna Gemini C18 utilizzando il programma HPLC nella tabella 1. Il tempo di ritenzione tipico (min) è indicato da unità di aborbance (AU). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Curve standard CoA-bimane rilevate da assorbimento o fluorescenza. (A) La curva standard misurata utilizzando unità di rilevamento dell'assorbimento per CoA-bimane è stata misurata a 393 nm. I campioni di tessuto sono di solito valutati utilizzando la curva standard di assorbimento. (B) La curva standard misurata utilizzando le unità di rilevamento della fluorescenza per CoA-bimane a 393 nm, ovvero 470 nm. Le cellule coltivate vengono solitamente valutate per il contenuto di CoA utilizzando la curva standard a fluorescenza. Gli standard (e i campioni) duplicati vengono valutati regolarmente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: tracce HPLC di fegato tipico o campioni di cellule coltivate. (A) Identificazione e quantificazione CoA-bimane del contenuto nell'estratto di fegato di topo. Sono indicate le unità di assorbimento (AU). ((B)Identificazione e quantificazione coA-bimane del contenuto nelle cellule coltivate HepG2/C3A. Sono indicate le unità di emissione di fluorescenza (UE). I picchi CoA-bimane sono mostrati in rosso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
come illustrato nella Figura 6. Livelli di CoA in fegato di topo, cellule c3A e HEK293T coltivate. (A) Misurazione CoA nel fegato di topo da pantotenata cinetra (Pank1-/-) e animali selvatici corrispondenti (WT). Pank1-/- gli animali hanno una CoA inferiore nel fegato rispetto agli animali WT a causa dell'assenza dell'espressione Pank1 9. I dati sono stati ottenuti utilizzando 5 topi maschi per genotipo e sono rappresentati come livelli coA medi (B) nelle cellule HepG2/C3A trattati con dimetilsulfoxide (controllo del veicolo) o P-2891, un farmaco sperimentale che modula l'attività PanK a 10 uM 17. Il livello di CoA cellulare è elevato dopo l'incubazione di 24 ore con la P-2891. (C) Livelli di CoA nelle cellule HEK293T trascate con il vettore vuoto pcDNA3.1, o cDNA che codificano isoforme panK umane: PANK1, PANK2m, che è l'isoforma matura, elaborata di PANK2 umana, o PANK3. I livelli di CoA sono elevati dalla sovraespressione di tutte le isoforme PANK attive. I dati in (B) e (C) provengono da campioni triplicati indipendenti e sono rappresentati come la media di SEM. L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando il test t non accoppiato e i valori di significatività sono mostrati in rosso. I dati nei pannelli (B) e (C) sono adattati da Sharma et al. 12Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Qui dimostriamo una procedura affidabile e graduale per quantificare il CoA totale nelle cellule e nei tessuti animali con un'ampia gamma di rilevamenti lineari accessibili in molti laboratori che hanno un HPLC con un rilevatore di uscita di assorbimento o fluorescenza. In alternativa, la spettrometria di massa è una tecnica comune per la valutazione dei tioesteri CoA e CoA, ma non è ampiamente disponibile a causa del costo della strumentazione e delle conoscenze specialistiche necessarie per lo sviluppo della metodologia e l'interpretazione dei dati. Il CoA con etichetta isotopica mente che è adatto per l'uso come standard interno per la quantificazione della CoA gratuita nella spettrometria di massa non è disponibile in commercio, e la CoA gratuita non viene rilevata dallo strumento con la stessa sensibilità dei tioetri CoA come l'acetil-CoA. Pertanto, i livelli liberi di CoA sono spesso grossolanamente sottovalutati dalla spettrometria di massa, a meno che i dati di output non vengano confrontati con una curva di calibrazione standard CoA.
Abbiamo confrontato il metodo descritto qui con un metodo diverso precedentemente utilizzato nel nostro laboratorio e abbiamo trovato un maggiore recupero co-coa dal fegato del topo, 123.4 7.9 pmol/mg peso umido, con questo metodo attuale rispetto a 80 pmol/mg peso bagnato utilizzando un saggio ezimatico che derivatized CoA libera con un tag radioattivo28. Il metodo per misurare il CoA totale descritto qui è notevolmente meno ingombrante, più veloce e più facile da controllare rispetto al metodo precedentemente utilizzato nel nostro laboratorio28. Precedentemente, il CoA era determinato in seguito all'estrazione exana esimana del lisato cellulare e sottoposto a conversione enzimatica in radioattiva [14C]lauryl-CoA mediata dalla sintetasi Escherichia coli acyl-CoA (FadD). Gli acyl-CoA a catena corta a catena acida-solubile e gli acyl-CoA a catena lunga a catena acida nella lesica cellulare erano idrolizzati con KOH per produrre CoA libero e quindi sottoposti all'estrazione esagonale prima della conversione enzimatica in CoA libero29. Anche se questa procedura precedente aveva una buona specificità e sensibilità, in pratica il compito richiedeva 2 giorni lavorativi per essere completato e il ricombinante Sintetasi E. coli acyl-CoA doveva essere preparato, purificato e misurato per attività specifiche ezimatiche prima dell'analisi del CoA. Richiedeva anche una strumentazione in grado di rilevare e quantificare gli isotopi radioattivi, che è molto meno comune nei laboratori biomedici nella storia più recente. Il metodo attuale come descritto qui è più adatto per il nostro interesse di ricerca in pantothenate chinase (PanK). PanK controlla il flusso attraverso la via biosintetica coa e quindi il livello totale di CoA è la lettura per l'attività PanK nei campioni biologici.
Il placamento delle reazioni metaboliche in un campione biologico per mantenere una vera quantità di CoA richiede cura e rapidità ed è fondamentale per questa procedura. La deproteinezzazione rapida con un solvente acido o organico, o flash-congelamento di campioni sono due metodi che sono stati utilizzati negli ultimi30,31. Nel metodo attuale, l'acqua ultrapura ghiacciata viene rapidamente aggiunta alle cellule lavate PBS ghiacciate dalle colture, e le cellule aderenti più l'acqua vengono poi raschiate dal piatto di coltura prima del trasferimento al KOH. Il congelamento della sospensione cellulare coltivata in [KOH - acqua] per lo stoccaggio a -80 gradi centigradi prima della preparazione del campione è un punto di arresto accettabile. Tuttavia, i valori di CoA da campioni di cellule congelate devono essere confrontati con quelli di campioni appena preparati per determinare se c'è una sostanziale perdita del segnale CoA. La perdita di - 10% CoA si è verificata nelle nostre mani dopo il congelamento del campione cellulare e può essere correlata al tempo prolungato del campione nel KOH che deve essere controllato. I pezzi di tessuto animale vengono rapidamente congelati su un piccolo 'raft' di lamina galleggiante su LN2 immediatamente dopo l'escissione del tessuto da un animale eutanasia. Le dimensioni dei campioni da 5 mg a 60 mg di tessuto congelato sono appropriate per questo metodo con rese CoA lineari. Una volta congelati, i campioni di tessuto conservati a -80 gradi centigradi sono stabili per almeno 3 mesi, a condizione che il disgelo intermittente non si verifichi.
La preparazione del campione prima dell'analisi HPLC non è elevata e richiede una mezza giornata lavorativa completa. Si raccomanda all'operatore di gestire un massimo di 30 campioni contemporaneamente, a partire dall'omogeneizzazione di una serie di 15 campioni seguita dall'omogeneizzazione del secondo set di 15 campioni durante l'incubazione di 2 h con KOH per il primo set. Il periodo di incubazione KOH è stato inizialmente ottimizzato utilizzando i tioesteri CoA acquistati con tempi di incubazione che vanno da 30 min a 4 h, e poi il 2 h incubazione è stato scelto per ospitare il tempo per l'idrolisi completa CoA in una varietà di campioni di tessuto, che vanno dal muscolo scheletrico al fegato8. L'incubazione per la derivazione coA con mBBr è impostata a 2 h a circa pH 8 e un eccesso di 20 volte di mBBr viene aggiunto per convertire completamente il CoA nei campioni biologici. Le moietà del sulipdryl di proteine e metaboliti diversi dal CoA come la carnitina o il glutathione nel campione saranno derivate in aggiunta al CoA, e l'eccesso di 20 volte è stato calcolato sulla base della quantità prevista di fegato totale di CoA che ha il più alto livello tra i tessuti. Il pH viene ridotto prima dell'incubazione con mBBr perché i bromobimani in generale sono meno reattivi verso altri nucleofili come ammine e carboxylati in soluzioni acquose più neutre. Il tempo di derivazione non deve superare 2 h per evitare o ridurre la reazione con proteine thiols26. È necessario utilizzare buffer non nucleofili per ridurre e mantenere il pH perché la presenza di anioni tamponanti ad alte concentrazioni può interferire con la derivazione mBBr di CoA.
La pulizia del campione sulla colonna SPE viene eseguita manualmente nel nostro laboratorio e può essere eseguita con l'aiuto di un collettore a vuoto per ridurre il tempo necessario per questo passaggio. Un buon recupero della CoA derivatizzata dalla colonna SPE è regolarmente raggiungibile e questo è stato determinato separatamente utilizzando thioesters radioattivi [13C]CoA che sono conservati anche sulla colonna SPE. Il recupero di[13C]acetyl-CoA è stato del 97,6% e il recupero di[13C] palmitoyl-CoA è stato del 96,1%. L'evaporazione dell'eluato della colonna SPE viene di solito eseguita con gas di azoto durante la notte nel nostro laboratorio per comodità, ma l'essiccazione può essere completata entro 4 ore sotto gas di azoto o utilizzando un concentratore speedvac. I passaggi più critici del metodo sono correlati alla regolazione del pH e possono essere controllati con strisce di carta pH lungo la strada. Per l'idrolisi kOH, il pH deve essere di 12 dollari per ottenere il rilascio completo del tioster da CoA. Il pH deve essere 7,8 – 8,5 per supportare la reattività della derivazione mBBr e, una volta completata la derivazione, il pH deve essere regolato per diventare molto acido, circa pH 1-2, affinché il CoA-bimane si leghi alla colonna SPE. La colonna SPE pulisce il campione per eliminare l'eccesso di mBBr non reagito e alcune sostanze biologiche non correlate.
Il programma HPLC è progettato in modo che il lavaggio e il riequilitacchio della colonna C18 sia sufficiente per eliminare i segnali di sfondo e di riporto tra i campioni. I campioni vuoti d'acqua vengono inseriti dopo ogni 5 campioni nel set di campioni sperimentali come precauzione per monitorare il possibile riporto tra i set e per garantire la pulizia delle colonne. Un errore occasionale da iniezione di campione improprio può verificarsi quando si utilizza un iniettore di campioni automatizzato per l'HPLC, e questo può essere facilmente controllato confrontando i volumi rimanenti nelle fiale del campione dopo l'iniezione o l'ispezione dei picchi non correlati al CoA cromatogramma di uscita. Se i valori coA superano l'intervallo lineare della curva di calibrazione per il rilevamento della fluorescenza, i valori saranno molto probabilmente nel raggio d'azione per il rilevamento dell'assorbimento ultravioletto. In caso contrario, la diluizione del campione con un volume noto di acqua può ridurre il segnale di essere nella gamma lineare e calcoli dovrebbero prendere in considerazione qualsiasi fattore di diluizione.
I livelli di CoA varieranno tra ceppi di topi inbred con diversi background genetici, anche se i valori sono riproducibili quando i campioni biologici sono ottenuti dallo stesso ceppo nelle stesse condizioni. Abbiamo stimato CoA in diverse linee del mouse in vari studi10,12,16,17. Il CoA è stato misurato anche in diverse linee cellulari coltivate16,17 utilizzando cellule primarie o immortalate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MWF, CS e SJ hanno scritto il documento, MWF e CS hanno fornito i dati e le figure, COR ha progettato gli esperimenti e ha esaminato criticamente il manoscritto. SJ e COR sono inventori di una domanda di brevetto in sospeso (PCT/US17/39037) "Small molecule modulators of pantothenate kinases" detenuta dal St. Jude Children's Research Hospital che copre il composto di P-2891 a cui si fa riferimento in questo articolo.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono i finanziamenti per la ricerca sponsorizzata fornita da CoA Therapeutics, Inc., una filiale di BridgeBio LLC, la sovvenzione national Institutes of Health GM34496 e gli American Lebanese Syrian Associated Charities.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column | Millipore-Sigma | 54127-U | |
| coenzyme A | Avanti Polar Lipids | 870700 | |
| Gemini C18 3 μm 100 Å HPLC column | Phenomenex | 00F-4439-E0 | |
| monobromobimane | ThermoFisher Scientific | M-1378 | |
| Omni-Tip probe tissue disrupter | Omni International | 32750H | |
| Parafilm | Fisher | S37440 | |
| PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer | ThermoFisher Scientific | NC0530997 | |
| Spin-X centrifuge tube filter | CoStar | 8161 | |
| Trizma-HCl | Fisher | T395-1 | |
| Waters 2475 fluorescence detector | Waters | 2475 | |
| Waters 2489 UV-Vis detector | Waters | 2489 | |
| Waters e2695 separations module | Waters | e2695 |
References
- Abiko, Y. Metabolic Pathways. Greenburg, D. M. 7, Academic Press, Inc. Ch. 7 1-25 (1975).
- Leonardi, R., Zhang, Y. -M., Rock, C. O., Jackowski, S.
- Jackowski, S., Rock, C. O.
- Robishaw, J. D., Berkich, D. A., Neely, J. R. Rate-limiting step and control of coenzyme A synthesis in cardiac muscle. Journal of Biological Chemistry. 257, 10967-10972 (1982).
- Di Meo, I., Carecchio, M., Tiranti, V. Inborn errors of coenzyme A metabolism and neurodegeneration. Journal of Inherited Metabolic Disease. 42, 49-56 (2019).
- Zhou, B., et al. A novel pantothenate kinase gene (PANK2) is defective in Hallervorden-Spatz syndrome. Nature Genetics. 28, 345-349 (2001).
- Dusi, S., et al. Exome sequence reveals mutations in CoA synthase as a cause of neurodegeneration with brain iron accumulation. American Journal of Human Genetics. 94, 11-22 (2014).
- Dansie, L. E., et al.
- Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state. PLoS ONE. 5, 11107 (2015).
- Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance. Diabetologia. 57, 1466-1475 (2014).
- Israel, B. C., Smith, C. M. Effects of acute and chronic ethanol ingestion on pantothenate and CoA status of rats. The Journal of Nutrition. 117, 443-451 (1987).
- Garcia, M., Leonardi, R., Zhang, Y. M., Rehg, J. E., Jackowski, S. Germline deletion of pantothenate kinases 1 and 2 reveals the key roles for CoA in postnatal metabolism. PLoS One. 7, 40871 (2012).
- Corbin, D. R., et al. Excess coenzyme A reduces skeletal muscle performance and strength in mice overexpressing human PANK2. Molecular Genetics and Metabolism. 120, 350-362 (2017).
- Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver. Journal of Lipid Research. 60, 1005-1019 (2019).
- Shumar, S. A., et al. Induction of neuron-specific degradation of Coenzyme A models pantothenate kinase-associated neurodegeneration by reducing motor coordination in mice. PLoS ONE. 10, 0130013 (2015).
- Zano, S. P., Pate, C., Frank, M., Rock, C. O., Jackowski, S. Correction of a genetic deficiency in pantothenate kinase 1 using phosphopantothenate replacement therapy. Molecular Genetics and Metabolism. 16, 281-288 (2015).
- Sharma, L. K., et al. A therapeutic approach to pantothenate kinase associated neurodegeneration. Nature Communications. 9, 4399 (2018).
- Alvarez-Cordoba, M., et al. Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation. Molecular Neurobiology. 56, 3638-3656 (2019).
- Arber, C., et al. iPSC-derived neuronal models of PANK2-associated neurodegeneration reveal mitochondrial dysfunction contributing to early disease. PLoS One. 12, 0184104 (2017).
- Di Meo, I., et al. Acetyl-4'-phosphopantetheine is stable in serum and prevents phenotypes induced by pantothenate kinase deficiency. Scientific Reports. 7, 11260 (2017).
- Nishikawa, T., Edelstein, D., Brownlee, M. The missing link: a single unifying mechanism for diabetic complications. Kidney International Supplements. 77, 26-30 (2000).
- Tsuchiya, Y., Pham, U., Gout, I. Methods for measuring CoA and CoA derivatives in biological samples. Biochemical Society Transactions. 42, 1107-1111 (2014).
- Demoz, A., Netteland, B., Svardal, A., Mansoor, M. A., Berge, R. K. Separation and Detection of Tissue Coash and Long-Chain Acyl-Coa by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography after Precolumn Derivatization with Monobromobimane. Journal of Chromatography. 635, 251-256 (1993).
- Shimada, K., Mitamura, K.
- Minkler, P. E., Kerner, J., Ingalls, S. T., Hoppel, C. L. Novel isolation procedure for short-, medium-, and long-chain acyl-coenzyme A esters from tissue. Analytical Biochemistry. 376, 275-276 (2008).
- Newton, G. L., Fahey, R. C. Determination of biothiols by bromobimane labeling and high-performance liquid chromatography. Methods in Enzymology. 251, 148-166 (1995).
- Radkowsky, A. E., Kosower, E. M. Bimanes .17. (Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones (Halo-9,10-Dioxabimanes) - Reactivity toward the Tripeptide Thiol, Glutathione. Journal of the American Chemical Society. 108, 4527-4531 (1986).
- Zhang, Y. M., et al. Chemical knockout of pantothenate kinase reveals the metabolic and genetic program responsible for hepatic coenzyme A homeostasis. Chemistry & Biology. 14, 291-302 (2007).
- Tokutake, Y., Onizawa, N., Katoh, H. Toyoda A,Chohnan S. Coenzyme A and its thioester pools in fasted and fed rat tissues. Biochemical and Biophysical Research Communications. 402, 158-162 (2010).
- Shibata, K., Nakai, T., Fukuwatari, T. Simultaneous high-performance liquid chromatography determination of coenzyme A, dephospho-coenzyme A, and acetyl-coenzyme A in normal and pantothenic acid-deficient rats. Analytical Biochemistry. 430, 151-155 (2012).
- Chohnan, S., Takamura, Y. A simple micromethod for measurement of CoASH and its use in measuring the intracellular levles of CoASH and short chain acyl-CoAs in Escherichia coli K12 cells. Agricultural and Biological Chemistry. 55, 87-94 (1991).
