Summary
この方法は、培養細胞および動物組織からのサンプル調製、試料中のコエンザイムAの抽出および誘導体化、続いて誘導体化されたコエンザイムAの精製および定量のための高圧液体クロマトグラフィーを記載する。吸光度または蛍光検出。
Abstract
新しい研究は、細胞補酵素A(CoA)供給が成長、代謝および生存に有害な影響で制限されることができることを明らかにしました。細胞CoAの測定は、その比較的低い存在量と、順番に、多数の代謝反応に関与するCoAチオエステルへの自由CoAの動的変換による課題です。サンプル調製中に潜在的な落とし穴をナビゲートし、多くの生物医学研究室での使用に適した幅広い線形検出でアッセイを得る方法が記載されています。
Introduction
コエンザイムA(CoA)は、すべての生物に不可欠な共因子であり、パントテン酸(パントテン酸の塩)またはビタミンB5とも呼ばれるパントテン酸から合成されます。CoAは、酢酸やコハク酸などの短鎖酸を含む有機酸の主要な細胞内担体であり、プロピオン酸やメチルマロン酸などの分岐鎖酸、パルミテートやオレエートなどの長鎖脂肪酸、非常に長鎖脂肪酸等多価不飽和脂肪酸、及びバルプロ酸などの異生物製剤。有機酸は、中間代謝1における100以上の反応における基質としての使用を可能にするために、CoAと酵素的にチオスターリンケージを形成する。CoAチオエステルはまた、アロステリックレギュレータおよび転写活性化剤である。細胞全体のCoA供給が3、4を規制されていることは今では2を評価されています。したがって、CoAの利用可能性は制限され、CoAの欠乏は、CoA生合成5に影響を与える遺伝的障害によって例示されるように、壊滅的なことができます。パントテナテキナーゼは、CoA生合成(図1)およびパントテナテキナーゼ関連神経変性、PKANと呼ばれる、PANK2遺伝子6の突然変異によって引き起こされる第一歩を触媒する。COASYN遺伝子によってコードされるCoA合成酵素は、CoA生合成(図1)およびCOASYタンパク質関連神経変性(CoPAN)の最後の2つのステップを触媒し、COASYN遺伝子7の突然変異によって引き起こされる。PKANとCoPANの両方は、脳内の鉄蓄積に関連する神経変性疾患とCoA欠乏症の下で疾患病理の下に継承されています。
全CoAの細胞レベルは組織8によって異なり、全CoAは様々な生理学的、病理学的および薬理学的状態の下で増加または減少することができる。肝臓CoAは、給餌状態から断食状態9への燃料切り替え中に増加し、レプチン欠損肥満マウス10では肝臓CoAレベルが異常に高い。肝臓CoAは、慢性エタノール摂取に応答して減少する 11.Pank2ノックアウトマウスモデルにおける脳CoAレベルは周産期中にうつ病化されるが、成人期の後の脳CoA含有量は野生型レベルと同等であり、開発12の間に適応的CoA応答を示す。トランスジェネシスまたは遺伝子送達法による組織CoA含有量の操作は、代謝および神経機能に影響を与える13,14,15.PKANまたはCoPANのための潜在的な治療法の前臨床開発は、有効性の指標として細胞または組織CoA測定を含む16,17,18,19,20.これらすべての条件とその代謝または機能的結果の評価には、CoA全体の測定のための定量的方法が必要です。
生物学的サンプル中のCoAを測定するための正確で信頼性の高いアッセイは、多くのラボで技術的な課題です。残念ながら、無傷の細胞におけるCoAまたはCoAチオエステルを評価または定量化するためのプローブはないが、天然CoAチオエステルの類似体は、酵素21を利用したCoAエステルの研究において機械的プローブとして広く用いられている。CoAの変換は、遊離スルフヒドリル(-SH)部分を用いて、CoAチオエステル(またはその逆)に対して、異なる環境への転移中および細胞リシス中に細胞または動物組織において急速である。多数のアシルCoA合成酵素およびアシル-CoAチオエステラーゼは、CoAプール内の相互変換を仲介し、CoAチオエステルを基質として利用する追加の酵素は、化学的または物理的に消毒されるまで生物学的サンプルにおいて活性を維持する。手段。アシルトランスフェラーゼによるCoAからカルニチンへのアシル基のオフロードは、CoA/CoAチオエステル分布を変化させることができる反応のネットワーク内の一例です。放射性トレーサーは、細胞内のCoA合成率を測定するために使用することができます。生体試料中のCoAおよびCoA誘導体を測定するための現在の方法は22を検討され、結合酵素分光光アッセイ、高圧液体クロマトグラフィーおよび質量分析ベースの手順が含まれる。しかし、これらの方法は、多くの場合、特定のCoA分子種に焦点を当てており、全CoAプールの変動に盲目である。結合された酵素アッセイは、一般に、検出感度が低いため、より大量の入力材料を必要とし、線形性の範囲が限られています。
当研究室では、培養細胞および動物組織におけるCoA全体の定量化に関する信頼性の高い手順を開発しました。この戦略には、CoA種のスペクトル全体を維持および分析する努力をするのではなく、サンプル調製中に無料のCoAのみを得るために、すべてのCoAチオエステルの加水分解が含まれます。この手順は、高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)に続くサンプル調製、CoA誘導体化、精製および同定、および吸収性による導出CoAの定量化のための個々の公開方法をまとめたものである。蛍光検出23,24,25.この手順を用いて得られたCoAの決定は、CoA規則の理解とCoA欠陥の治療のための治療アプローチの開発を可能にしました。
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Protocol
このプロトコルで言及された動物の手順は、プロトコル323および556に従って行われ、特にセントジュード小児研究病院機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. ソリューションの準備
注:すべての溶液に対して、および手順に記載されている場合は、超純水を使用してください。
- 水中に水酸化カリウム(KOH)1mを調調します。
- 水に0.25 M KOHを準備します。
- 水中で1 M Trizma-HClを準備し、pH 8.0に調整します。
- アセトニトリル(オプティマグレード)で100mMモノブロブロビマン(mBBr)を調調します。mBBrのストック溶液は、光への暴露がビマネ26にモノブロボビマンを光線化することができるので、暗闇の中で保たれれば、何ヶ月も-20°Cで安定している。
- 固相抽出(SPE)カラム用洗浄バッファーを調味する:50%メタノール(オプティマグレード)+2%酢酸。
- SPEカラム用溶出バッファーを調用:50mMアンモニウムを含む95%エタノール(HPLCグレード)。
2. CoA-ビマネ規格の作成
- 評判の良いソース(例えば、アバンティ極性脂質社)から高品質のCoA規格を購入します。
- 20 mMトリス、pH 8でCoAの高濃度ストック溶液を調調します。高濃度ストック中のCoAの量はλ260nm(μ=16,800 M-1∙cm-1)の分光光光度で決定または確認される。mBBrの4倍モル過剰を追加します。10sの高い渦。たとえば、バッファー内の 10 mM CoA の場合は、40 mM mBBr を追加します。mBBr は、すべての CoA が派生していることを確認するために過剰に追加されます。
- mBBrでCoAを誘導するために揺れることなく、暗闇の中で4時間室温でインキュベートする。mBBrはCoAのチオール基と反応し、pHおよび温度依存性27である。mBBrの添加は、CoAを水溶性蛍光(または紫外線吸収剤)CoA-ビマネ(CoA-ビマネ)に変換します。図 2)
- 100 μL 酢酸と渦を10sの高さで加えて反応を止める。
- 2,000 x gで15分間遠心分離機を使用して、沈殿物を除去します。
- SPEカラムを使用して上清をクリーンアップし、未反応のmBBrを除去する(後述)。SPEカラムクリーンアップ後の溶出物の濾過および遠心分離は必要ありません(セクション5.8)。
- 予め計量されたチューブにCoA-bimaneを含むSPEカラムから溶出液を収集し、窒素ガスの下で乾燥し、重量を量り、CoA-bimaneの既知の量で標準的な校正曲線を構築します。
- hPLCによる純度のCoA-bimane規格(下記参照)は、λ260(アデニン部分参照)とλ393(ビマネ部分)の両方で吸光度検出を行い、クロマトグラムの両方のピークの一致を確認してください。
- 高濃度ストックにおけるCoA-ビマネ規格の量を確認する (λ = 16,800 M-1∙cm-1)。
- CoA-ビマネ規格を使用して実験サンプルでCoA-bimaneを同定するためのHPLC保持時間を登録します。
- 光から保護され、最大2年間-20°Cで保存されたCoA-bimane規格の高濃度ストックのアリコートを保存します。解凍を繰り返し、凍結を繰り返さないようにしてください。
3. 培養細胞におけるCoAの抽出と誘導体化
- 後期サブコンフルエント密度に近づくと培養中の付着細胞を収穫する。例えば、ヒトHepG2/C3A細胞は、6-8 x 106の密度に成長するか、またはHEK 293T細胞は100mm皿当たり〜1.3 x 107の密度に成長する。
- CoA 判定には、重複カルチャまたは三部培養を日常的に使用します。サンプル細胞培養と並行して別々の培養皿をインキュベートし、生存可能な細胞数を決定する。HPLC精製後の106-107細胞当たりのCoA量を算出する。
- 料理から培養媒体を吸引する。冷たいリン酸緩衝生理食べ物(PBS)で皿の上の細胞を素早く洗い流し、残留培地を取り除き、皿からPBSを吸引します。氷冷水で細胞を素早く洗い、残留PBSを除去し、皿から水を素早く吸引します。PBSまたは水を添加する際に付着細胞を乱さないようにしてください。
- 培養皿に氷冷水1mLを加えます。皿の冷たい水に細胞をこすり、0.25 M KOHの400 μLおよび1.5 mLの水を含むガラス試験管に細胞懸濁液を移す。
- 10秒間、渦で激しく懸濁液を混ぜます。その後、パラフィンフィルムでしっかりと覆い、水風呂で振ることなく1時間55°Cでインキュベートします。試料のpHは≥12でなければなりません。高pHはCoAチオエステルを加水分解するために重要であり、必要に応じてKOHの追加のアリコートで調整することができる。
- 低速で遠心分離により懸濁液中で増殖する培養細胞:4°Cで6分間136xg。 氷冷PBSで一度洗い、冷たい水でもう一度洗い直し、最後に2.5 mLの冷たい水と400 μL 0.25 M KOHで再度再水を行います。上述したように、強く混合し、55 °Cでインキュベートします。
- 1 M Trizma-HCl の 160 μL と 100 mM mBBr の 10 μL を加え、高い渦で 10 s を混合します。これにより、pHは約8にをもたらし、自由CoAでmBBr反応を支持する。mBBrがCoAのチオールと反応するために、暗闇の中で2時間室温でサンプルをカバーし、インキュベートします。
- 酢酸の100 μLを追加し、反応を停止するために10sの高い渦で混合
- 2,000 x gで15分間遠心分離機を使用して、沈殿した細胞の破片を除去します。
- 以下に説明する SPE カラムクリーンアップ用のガラス試験管に上清を取り外して保存します。
4. 組織におけるCoAの抽出と誘導化
- 動物の組織片を直径約0.5cm以下で解剖し、吸収性紙上で一時的に(1-2秒)ブロットし、液体窒素中でフラッシュ凍結し、処理するまで-80°Cで保存します。組織内のCoAは、フラッシュ凍結しない場合、加水分解またはチオエステルに変換されます。このステップは、組織におけるCoAの最大収率を得るために重要である。
- 分析を開始する前に、凍結組織片(5~60mg)を素早く計量し、各サンプルの重量を記録します。この湿量決定は、HPLC精製後のCoA含有量の計算に使用されます。組織片の完全な解凍を避けてください。
- プローブの挿入とロータステータホモジナイザーによる組織破壊のために運命づけられたガラス試験管に1mM KOHの2 mLを追加します。使用するまでチューブを氷の上に置いてください。これは、サンプルが低温で均質化され、均質化時に発生する熱によってCoAが破壊されないようにするために行われます。
- 30 s.組織の完全な解凍を避けるために、ガラス試験管(冷たい1 mM KOHを含む)に組織(30 - 40 mg)を移送し、均質化します。
- 0.25 M KOHの500 μLを加えます。渦は10sの高さにあり、すべてのサンプルが均質化されるまで氷の上に保つ。これは、12以上のサンプルのpHをもたらし、CoAチオエステルを加水分解して合計CoA(無料CoA+加水分解CoAチオエステスター)を得る。
- 加水分解をサポートするために振ることなく、水浴中で55°Cで2時間サンプルをインキュベートします。
- 1 M Trizma-HCl の 150 μL と 100 mM mBBr の 10 μL を追加します。渦は10秒間高く上がった。これにより、pHを約8にし、遊自由CoAでmBBr反応を支持する。
- すべてのCoAがmBBrで導出されることを保障するために暗闇の中で2時間の室温でサンプルをインキュベートする。
- 100 μL の酢酸と渦を10sの高さで加えて反応を止める。
- ペレット沈殿細胞破片に15分間2,000 x gで遠心分離機。
- SPEカラムクリーンアップ用のガラス試験管に上清を取り外して保存します(後述)。
5. 固相抽出(SPE)カラムを使用したサンプルクリーンアップ
- 室温で、各使い捨て2-ピリジル-エチルシリカゲルカラム(1mLサイズ)を1mLのウォッシュバッファーで平衡化し、ピリジル機能基がプロトン化され、アニオン交換器として機能することを確認します。2-(2-ピリジル)-エチルシリカゲルは、塩基pHでCoA-ビマネに最適な弱いアニオン交換器です。2-(2-ピリジル)-エチルシリカゲルは6のpKaを有し、溶出はpH≥7を行う。
- カラムにサンプル上清(ステップ4.11)を追加し、溶出物を収集します。
- 1 mLの洗浄バッファーでカラムを2回洗浄し、保持されていない種を除去します。
- 1mLの水でコラムを1回洗います。
- 1 mLの溶出バッファーでカラムを別のガラス試験管(12mm x 75mm)に2回洗浄し、CoA-bimaneを回収します。
- 窒素ガス下のチューブ中のCoA-bimaneサンプルを乾燥させます。乾燥した試料は、さらに使用するまで室温で安定しています。シールし、チューブとストアを完全にカバーします。
- HPLC分析の準備ができたら、300 μLの水でサンプルを再中断し、10秒間高い渦で激しく混合します。
- 再懸濁サンプルを遠心管フィルター(0.22 μmセルロース酢酸塩、2 mLサイズ)に移し、遠心分離機を10分間5,000 x gで10分間取り除き、沈殿物を除去します。
- HPLC注入に適したガラスバイアルに濾過されたサンプルを移す。
6. CoA-ビマネのHPLC精製と測定
- バッファーを準備します。バッファ A: 50 mM KH2PO4,pH 4.6;バッファB:アセトニトリル(オプティマグレード)。
- HPLC システムの電源を入れします。
注:私たちの実験室のHPLCシステムは2489紫外線可視(UV-Vis)吸光器およびEmpower 3ソフトウェアによって制御される2475蛍光検出器が装備されているウォーターズe2695分離モジュールである。システムに自動化されたサンプル注入器がある。 - Gemini C18、3 μm 100 Å、4.6 mm x 150 mm カラムの各サンプルを0.5 mL/minの流量で表1に注入します。カラム温度は25°Cです。λ393 nmでのUV/可視検出器の吸光度を測定し、λex = 393 nm、λem = 470 nmで蛍光検出を測定します。保持時間は、サンプルの各セットの前にCoA-bimane標準曲線を実行することによって決定されます。
- 各サンプルの CoA-ビマネピークの下の領域を記録し、標準曲線と比較して、HPLC カラムに注入された CoA-ビマネの pmol を計算します。CoA-ビマネ吸光度標準曲線は組織サンプルに使用され、CoA-ビマネ蛍光標準曲線は組織培養サンプルに使用されます。
- CoA-ビマネ値は各サンプルのCoAの合計を表すので、培養サンプルの生存細胞数を正規化するか、組織試料に対してmg湿潤重量を測定する(図6)。または、各サンプルの DNA またはタンパク質含有量に正規化した後の CoA 値の合計を計算します。DNAまたはタンパク質含有量は、KOH添加前に試料調製中に除去されるサンプルアリコートを用いて別々に決定することができる。
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Representative Results
培養細胞および組織における全CoAの検出のための比較的高速かつ信頼性の高い方法は、mBBrを用いてCoAのチオールを蛍光剤に誘導し、その後、逆相HPLCを用いて誘導体化CoA-バイマンを精製することによって開発された。標準曲線が最初に生成され、CoA-bimane標準の既知および増加量が個別に注入され、CoA-bimaneクロマトグラムのピーク下の領域が入力CoA-bimaneの関数としてプロットされます(図4)。CoA-bimaneはλ393 nMで吸光度最大を有し、代表的なHPLCプロファイルは、表1の溶出プログラムを使用してC18 HPLCカラム(図3)上のCoA-bimane規格の保持時間を示しています。吸光度または蛍光単位を測定することによって検出されたCoA-bimaneの代表的な標準曲線を、それぞれ図4Aおよび図4Bに示す。図4Aの標準曲線は、393nmでのCoA-bimaneの吸光度の大きさを反映し、図4BはCoA-ビマネの蛍光を表す(λex = 393 nmおよびλem = 470 nm)プロットされた入力量に対してCoA-ビマネCoA-bimaneの標準は0.01から12,000 pmolまで検出することができ、吸光度および蛍光の両方を使用して検出される場合、106倍の範囲をカバーする。標準の検出の下限は0.01 pmolですが、実験サンプルにおけるCoA-ビマネ定量の下限は0.2pmolで、クロマトグラムのベースラインまたは背景蛍光よりも約5倍大きい。CoA-bimaneの吸光度または蛍光による検出の選択は、組織または細胞に通常存在するCoAの量に依存し、より大きいまたはより小さいサンプルサイズで働くことの実用性と共に。吸光度は、開始物質の40-50 mgを処理すると5mgの組織サンプルよりも良好な回復をもたらすのに対し、蛍光は一般的にサイズが小さく、より大きい培養細胞サンプルに有用であるため、組織サンプルに有用である。蛍光標準曲線の下端における値の補間に対する信頼。吸光度検出のみを行うラボでは、開始サンプルサイズの増加または減少、HPLC注入量の増加、または培養細胞での測定のためのサンプル再懸濁量の体積の減少(上記セクション5.9)を検討する場合があります。
組織および培養細胞からのアシルCoAを加水分解する条件は、KOH濃度、およびその後のインキュベーションの時間と温度を調整することによって最適化された(データは示さない)。最適な状態は、2時間55°Cで0.25Mであることが判明した。チオエステルから解放された任意のCoAのチオール群と、pHの調整後にmBBrとの反応により誘導化した。その後のHPLC分離およびヒト培養C3A細胞に対する典型的な検出プロファイルは、図5に赤いピークとして示され、表1に記載の溶出プログラムを用いて11〜12分間の保持時間を有する。生物学的開始物質の典型的な量は、マウス肝臓(湿った重量)の30〜40mg、ヒトの「肝臓様」C3A細胞のための6-8 x 106細胞、またはヒトHEK293T細胞のための〜1.3 x 107細胞である。C3A細胞を、CoA17を上昇させる10uMでPanK実験薬PZ-2891で処理した(図6)。PanKアイソフォームが過剰発現した場合のHEK293T細胞におけるCoA測定は、広い範囲におけるCoA測定値を示しています(431-6925 pmoles/μL)(図6)。この方法論に必要なサンプルサイズは、多くの実験コンテキストへの応用に実用的です。
CoA-ビマネピークの下の領域は、HPLCで提供されるソフトウェアを使用して計算された。ピーク限界は、ベースライン補正とピーク定義のための入力値の適切な調整を保留中のHPLCソフトウェアによって自動的に決定することができますが、私たちの研究室は、特に各クロマトグラムでCoA-バイマンピークを手動で指定することを好みます。不慣れな生物学的サンプルのために。
| 時間 (分) | 流量(mL/分) | % A | % B | 曲線 |
| 0 | 0.5 | 90 | 10 | 0 |
| 2 | 0.5 | 90 | 10 | 6 |
| 6 | 0.5 | 85 | 15 | 6 |
| 18 | 0.5 | 60 | 40 | 6 |
| 23 | 0.5 | 60 | 40 | 6 |
| 25 | 0.5 | 90 | 10 | 6 |
| 30 | 0.5 | 90 | 10 | 66 |
表1:CoA-ビマネ分離のためのHPLCプログラムバッファ A: 50 mM KH2PO4,pH 4.6;バッファーB:アセトニトリル。バッファ A とバッファー B の混合は、線形グラデーションであるカーブ 6 に続き、中程度の凹面グラデーションであるカーブ 8 が介在します。
図 1.コエンザイムA生合成経路。パントテネートキナーゼ(PanK)は、CoA生合成の第一段階でパントテネート(ビタミンB5)から4'-ホスホパンテネートのリン酸化を触媒する。ホスホパントテン酸塩の形成は、4'-ホスファントノニルシステインシンターゼで触媒されたシステインとの凝縮に続き、次いで4'ホスホファンテノイルシテインデカルボキシラーゼによって4'ホスホパンテインシテインを形成する脱カルボキシル化する。4'-ホスホパンテインは、CoAシンターゼによって触媒された2段階のプロセスでコエンザイムA(CoA)に変換される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2. coAとのmBBr反応モノブロブロビマネ(mBBr)をCoA-SH(フリーCoA)と混合し、暗闇の中で室温で2時間インキュベートした。非蛍光mBBrはCoAに結合すると蛍光となり、CoA-ビマネを形成する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:CoA-ビマネ標準の吸光度HPLCトレース。CoA-bimane は、表 1の HPLC プログラムを使用してジェミニ C18 カラム上で分離されました。一般的な保持時間(分)は、退化単位(AU)で示されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:吸光度または蛍光によって検出されたCoA-bimane標準曲線。(A)CoA-ビマネの吸光度検出ユニットを用いて測定した標準曲線をλ393nmで測定した。組織サンプルは通常、吸光度標準曲線を使用して評価されます。(B)λex = 393 nm、λem = 470 nm で CoA-ビマネの蛍光検出単位を用いて測定した標準曲線。培養細胞は、通常、蛍光標準曲線を用いてCoA含有量について評価される。重複規格(およびサンプル)は定期的に評価されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:典型的な肝臓または培養細胞試料のHPLC痕跡。(A)マウス肝抽出物中の含有量のCoA-bimane同定および定量化。吸光度単位 (AU) が示されます。(B)HepG2/C3A培養細胞における含有量のCoA-bimane同定および定量化蛍光発光単位(EU)が示される。CoA-ビマネのピークは赤で表示されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6.マウス肝臓におけるCoAレベルは、培養C3AおよびHEK293T細胞である。(A)パントテネートキナーゼノックアウト(Pank1-/-)および一致した野生型(WT)動物からのマウス肝臓におけるCoA測定。Pank1-/-動物は、Pank1式9の不在によるWT動物と比較して肝臓のCoAが低い。このデータは、遺伝子型当たり5匹の雄マウスを用いて得られ、ジメチルスルホキシド(車両対照)またはPZ-2891のいずれかで処理されたHepG2/C3A細胞における平均±SEM.(B)CoAレベルとして表され、10uMでPanK活性を調節する実験薬であるPZ-289117.セルラーCoAレベルはPZ-2891との24時間インキュベーションの後に上昇する。(C)HEK293T細胞におけるCoAレベルは、空のベクターpcDNA3.1、またはヒトPANKアイソフォームをコードするcDNAのいずれかでトランスフェクトされた:PANK1β、PANK2mの成熟した、処理されたイソフォームであるPANK2m、またはPANK3。CoA レベルは、すべてのアクティブな PANK アイソフォームの過剰発現によって上昇します。(B)および (C) のデータは、独立した三元酸サンプルから得られたもので、平均±SEMとして表されます。統計分析は、ペアでないt検定を使用して行われ、有意性の値は赤で示されます。パネル(B)および (C) のデータは、シャルマらから適合しています。12この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、吸光度または蛍光出力検出器を備えたHPLCを持つ多くのラボでアクセス可能な幅広い線形検出を持つ細胞および動物組織の全CoAを定量するための信頼性の高いステップバイステップの手順を示します。あるいは、質量分析はCoAおよびCoAチオエステルを評価するための一般的な技術であるが、計測器のコストとデータの方法論および解釈の開発に必要な専門知識のために広く利用できない。質量分析における自由CoAの定量化のための内部標準として使用するのに適した同位体標識CoAは市販されていない、と自由CoAは、アセチルCoAなどのCoAチオエステルと同じ感度を持つ器具によって検出されません。したがって、自由なCoAレベルは、出力データがCoA標準キャリブレーション曲線と比較されない限り、質量分析によって大きく過小評価されることがよくあります。
我々は、以前に私たちの研究室で使用された別の方法でここに記載された方法を比較し、マウス肝臓からのより大きなCoA回復を発見しました, 123.4 ± 7.9 pmol/mg湿式重量, この現在の方法は、酵素アッセイを使用して〜80 pmol/mg湿式重量と比較して.放射性タグ28を持つ自由CoAを導出した。ここで説明する CoA の合計を測定する方法は、以前にラボ28で使用した方法と比較して、かなり面倒ではなく、より速く、制御しやすい方法です。以前、CoAは細胞リサートのヘキサン抽出後に決定され、エシェリヒア大腸菌アシルCoA合成酵素(FadD)によって媒介される放射性[14C]ラウリル-CoAへの酵素変換を行った。酸溶性短鎖acyl-CoAおよび細胞溶解物中の酸不溶性長鎖acyl-CoAを、KOHで加水分解して自由CoAを得て、次いで遊気変換前にヘキサン抽出を自由CoA29に行った。この前の手順は、良好な特異性と感度を持っていましたが、実際には、タスクが完了するために2営業日を必要とし、組換え大腸菌acyl-CoA合成酵素は、酵素的な特定の活動のために準備、精製し、測定する必要がありましたCoA 分析の前に。また、最近の歴史の中で生物医学の実験室ではあまり一般的ではない放射性同位元素を検出し、定量することができる器械使用も必要でした。ここで説明する現在の方法は、パントテネートキナーゼ(PanK)に対する我々の研究関心に最も適している。PanKはCoA生合成経路を通してフラックスを制御するので、合計CoAレベルは生物学的サンプルにおけるPanK活性の読み出しです。
CoAの真の量を維持するために生体試料中の代謝反応のクエンチングは、ケアと迅速性を必要とし、この手順のために重要です。酸または有機溶媒を用いた急速な脱タンパク化、またはサンプルのフラッシュ凍結は、過去30、31で使用されている2つの方法である。本方法では、培養物から氷冷PBS洗浄細胞に氷冷超純水を迅速に添加し、付着細胞と水を加えて、KOHに移す前に培養皿から削り取る。試料調製前に-80°Cで貯蔵するための「KOH+水」中の培養細胞懸濁液の凍結は許容可能な停止点である。ただし、凍結セルサンプルからのCoA値は、CoA信号の実質的な損失があるかどうかを判断するために、新たに調製されたサンプルの値と比較する必要があります。≤10%CoAの損失は、細胞サンプル凍結後に私たちの手で発生しており、制御する必要があるKOH内のサンプルの延長時間に関連している可能性があります。動物の組織片は、安楽死動物からの組織の切除直後にLN2に浮かぶ小さな箔「いかだ」ですぐに凍結される。凍結組織の5mgから60mgまでのサンプルサイズは、線形CoA収率を有するこの方法に適しています。一旦凍結すると、-80°Cで保存された組織試料は少なくとも3ヶ月間安定しており、断続的な融解が起こらないことを提供する。
HPLC分析の前のサンプル調製は高いスループットではなく、半日完全に動作する必要があります。オペレータは、15個のサンプルのセットの均質化から始まり、最初のセットのKOHとの2時間インキュベーション中に15サンプルの2番目のセットの均質化から始めて、一度に最大30個のサンプルを処理することをお勧めします。KOHインキュベーション期間は、最初に30分から4時間の潜伏時間を持つ購入したCoAチオエステルを使用して最適化され、その後、2時間のインキュベーションは、様々な組織サンプルで完全なCoAチオエステル加水分解の時間を収容するために選択されました。骨格筋から肝臓8へ.mBBrを用したCoA誘導体化のためのインキュベーションは、約pH8で2時間に設定され、生体試料中のCoAを完全に変換するために20倍のmBBrを添加する。サンプル中のカルニチンやグルタチオンなどのCoA以外のタンパク質や代謝産物のスルヒドリル部分は、CoAに加えて誘導され、20倍の過剰は、最高レベルのCoA肝臓の予想量に基づいて計算された。組織の間で。ブロモビマンスは一般的に、より中性の水溶液中のアミンやカルボキシレートのような他の核球に対して反応が少ないため、pHはmBBrを使用してインキュベーションする前に減少します。誘導性化の時間は、タンパク質チオール26との反応を避けるか、または減少させるために2時間を超えてはならない。高濃度での緩衝陰イオンの存在がCoAのmBBr誘導体化を妨げる可能性があるため、pHを減らし維持するために非核性バッファーを使用する必要があります。
SPEカラムのサンプルクリーンアップは、当社の研究室で手動で行われ、このステップに必要な時間を短縮するために真空マニホールドの助けを借りて行うことができます。SPEカラムからの導出CoAの良好な回復は日常的に達成可能であり、これはまたSPEカラムに保持されている放射性[13C]CoAチオエステスターを用いて別々に決定された。[13C]アセチル-CoAの回収率は97.6%、パルミトイルCoAの回収率は96.1%であった。SPEカラム溶出液の蒸発は、通常、利便性の問題として、当社の研究室で一晩窒素ガスの下で行われますが、窒素ガスの下で、またはスピードバックコンセントレータを使用して4時間以内に乾燥を完了することができます。この方法で最も重要な手順はpH調整に関連しており、途中でpH用紙ストリップで確認できます。KOH加水分解のために、pHはCoAからのチオエステルの完全な放出を達成するために≥12である必要があります。pHは、mBBr-誘導性化の反応性をサポートするために7.8~8.5である必要があり、誘導由来が完了した後、CoA-bimaneがSPEカラムに結合するためには、pHを非常に酸性になるように調整する必要があります。SPEカラムは、過剰な未反応mBBrおよびいくつかの無関係な生物学的物質を除去するためにサンプルをクリーンアップします。
HPLCプログラムはC18カラムの洗浄および再平衡化がサンプル間の背景および持ち越し信号を除去するのに十分であることを設計されている。水ブランクサンプルは、セット間の可能な持ち越しを監視し、カラムの清潔さを確保するための予防措置として、実験サンプルセット内の5つのサンプルごとに挿入されます。HPLCに自動サンプルインジェクタを使用すると、不適切なサンプル注入による誤りが発生する可能性があり、非CoA関連ピークの注入または検査後にサンプルバイアルに残っている体積を比較することで簡単に確認できます。出力クロマトグラム。CoA値が蛍光検出用のキャリブレーション曲線の線形範囲を超える場合、その値は紫外線吸光度検出の範囲にある可能性が高くなります。そうでない場合は、既知の量の水を含むサンプルの希釈は、線形範囲にある信号を減らすことができるし、計算は、任意の希釈係数を考慮する必要があります。
CoAレベルは、異なる遺伝的背景を持つ生まれつきのマウス株間で異なりますが、生物学的サンプルが同じ条件下で同じ株から得られる場合、値は再現可能です。我々は、様々な研究10、12、16、17のいくつかの異なるマウスラインでCoAを推定した。CoAはまた、一次または不死化細胞のいずれかを用いて、いくつかの培養細胞株16、17で測定した。
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Disclosures
MWF、CS、SJは論文を書き、MWFとCSはデータと数字を提供し、CORは実験を設計し、原稿を批判的にレビューしました。SJとCORは、この記事で参照されているPZ-2891化合物をカバーするセントジュード小児研究病院が保有する特許出願中の特許出願(PCT/US17/39037)「パントテネートキナーゼの小分子変調器」の発明者です。
Acknowledgments
著者らは、BridgeBio LLCの子会社であるCoAセラピューティクス社、国立衛生研究所補助金GM34496、およびアメリカのレバノン・シリア関連慈善団体が提供する研究に対する資金提供を認めている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column | Millipore-Sigma | 54127-U | |
| coenzyme A | Avanti Polar Lipids | 870700 | |
| Gemini C18 3 μm 100 Å HPLC column | Phenomenex | 00F-4439-E0 | |
| monobromobimane | ThermoFisher Scientific | M-1378 | |
| Omni-Tip probe tissue disrupter | Omni International | 32750H | |
| Parafilm | Fisher | S37440 | |
| PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer | ThermoFisher Scientific | NC0530997 | |
| Spin-X centrifuge tube filter | CoStar | 8161 | |
| Trizma-HCl | Fisher | T395-1 | |
| Waters 2475 fluorescence detector | Waters | 2475 | |
| Waters 2489 UV-Vis detector | Waters | 2489 | |
| Waters e2695 separations module | Waters | e2695 |
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