Summary
이 방법은 배양 된 세포 및 동물 조직에서 샘플 준비를 설명하고, 샘플에서 코엔자임 A의 추출 및 유도체화를 설명하고, 유도된 코엔자임 A의 정제 및 정량화를 위한 고압 액체 크로마토그래피를 흡광도 또는 형광 검출.
Abstract
신흥 연구는 세포 코엔자임 A (CoA) 공급이 성장, 신진 대사 및 생존에 해로운 영향을 미치는 제한될 수 있음을 밝혔습니다. 세포 CoA의 측정은 상대적으로 낮은 풍부함과 무료 CoA를 CoA 티에스테르로의 동적 변환으로 인해 도전이며, 차례로 수많은 대사 반응에 참여합니다. 많은 생물 의학 실험실에서 사용하기에 적합한 검출의 넓은 선형 범위와 분석법을 산출하기 위해 샘플 준비 동안 잠재적 인 함정을 탐색하는 방법이 설명된다.
Introduction
코엔자임 A (CoA)는 모든 살아있는 유기체의 필수 보조 인자이며 판토테네이트 (판토테닉 산의 소금) 또는 비타민 B5라고도하는 판토테산산에서 합성됩니다. CoA는 아세테이트와 숙시네이트와 같은 짧은 사슬 산, 프로피오네이트 및 메틸말로네이트와 같은 분기 사슬 산, 팔미테이트 및 올레테이트와 같은 긴 사슬 지방산, 매우 긴 사슬 지방산과 같은 유기산의 주요 세포 내 담체입니다. 고도 불포화 지방산, 및 valproic 산과 같은 xenobiotics. 유기산은 CoA와 동위적으로 티오에스테르 연계를 형성하여 중간 물질 대사에서 100개 이상의 반응에서 기질로서의 사용을 가능하게 한다1. CoA 티에스터는 또한 알로스테릭 조절제 및 전사 활성제입니다. 그것은 지금 평가2 셀룰러 총 CoA 공급규제3,4; 따라서, CoA 가용성은 제한될 수 있고, CoA 결핍은 CoA생합성5에영향을 미치는 유전적 무질서에 의해 예시된 바와 같이 치명적일 수 있다. 판토테네이트 키나아제는 CoA 생합성의 첫 번째단계(도 1)와판토테네이트 키나아제 관련 신경변성, PKAN이라고 불리며, PANK2 유전자6의돌연변이에 의해 유발된다. COASYN 유전자에 의해 인코딩된 CoA 신타제는 CoASYN 유전자의 마지막 두 단계를촉매(그림 1)및 COASY 단백질 관련 신경 변성이라고 하며, COASYN 유전자7의돌연변이에 의해 유발된다. PKAN과 CoPAN 은 모두 뇌의 철분 축적과 관련된 신경 퇴행성 질환과 CoA 결핍이 질병 병리의 밑에 유전됩니다.
총 CoA의 세포 수준은조직 8및 총 CoA가 다양한 생리학적, 병리학적 및 약리학적 상태 하에서 증가 또는 감소할 수 있다. 간 CoA는 공급 상태에서 급식 상태9로연료 전환 시 증가하고, 간 CoA 수준은 렙틴 결핍 비만 마우스10에서비정상적으로 높다. 간 CoA는 만성 에탄올 섭취에 반응하여감소11. Pank2 녹아웃 마우스 모델에서뇌 CoA 수준은 주산기 동안 우울하지만, 이후 성인 단계에서 뇌 CoA 함량은 야생형 수준과 동일하며, 개발 시 적응형 CoA 반응을 나타낸다12. 유전자 발생 또는 유전자 전달 방법에 의한 조직 CoA 함량의 조작은 대사 및 신경 기능에 영향을 미치는13,14,15. PKAN 또는 CoPAN에 대한 잠재적 치료법의 전임상 개발은 효능16,17,18,19,20의 지표로서 세포 또는 조직 CoA 측정을 포함한다. . 이러한 모든 조건및 이들의 대사 또는 기능적 결과에 대한 평가는 총 CoA의 측정을 위한 정량적 방법을 요구한다.
생물학적 시료에서 CoA를 측정하기 위한 정확하고 신뢰할 수 있는 분석방법은 많은 실험실에서 기술적 과제입니다. 불행하게도, 천연 CoA 티에스테르의 유사체가 효소21을활용하는 CoA 에스테르의 연구에서 기계론적 프로브로 널리 사용되어 왔지만, 손상되지 않은 세포에서 CoA 또는 CoA 티에스테르를 평가하거나 정량화하는 데 사용할 수 있는 프로브는 없습니다. CoA의 변환, 자유 설피 드릴 (-SH) moiety, CoA 티오 에스터 (또는 그 반대의 경우도 마찬가지)는 다른 환경으로 전송하는 동안 세포 또는 동물 조직에서 신속하고 세포 용해 동안. 세포에 있는 수많은 acyl-CoA 합성및 아실 CoA 티에스테르아제는 CoA 풀 내의 상호 변환을 중재하고, 기질로 CoA 티에스테르를 이용하는 추가 효소는 화학적 또는 물리적으로 담금질될 때까지 생물학 견본에서 활성 상태로 남아 있습니다 의미. 아실 트랜스퍼라제에 의한 CoA에서 카르니틴으로의 아실-그룹의 오프로딩은 CoA/CoA 티오에스테르 분포를 변경할 수 있는 반응 네트워크 내의 한 예입니다. 방사성 추적자는 세포에서 CoA 합성의 속도를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 생물학적 샘플에서 CoA 및 CoA 유도체를 측정하는 현재 의 방법은22를 검토되었으며 결합된 효소 분광광도 분석법, 고압 액체 크로마토그래피 및 질량 분광법 기반 절차를 포함합니다. 그러나, 이러한 방법은 종종 특정 CoA 분자 종에 초점을 맞추고 전체 CoA 풀의 변화에 장님입니다. 결합된 효소 해석은 일반적으로 낮은 검출 감도로 인해 더 많은 양의 입력 물질을 필요로 하며 선형성이 제한적입니다.
우리의 실험실은 배양 된 세포와 동물 조직에서 총 CoA를 정량화하기위한 신뢰할 수있는 절차를 개발했습니다. 이 전략에는 CoA 종의 전체 스펙트럼을 유지하고 분석하기 위한 노력을 하기보다는 시료 준비 중에 무료 CoA만 을 산출하는 모든 CoA 티에스테르의 가수분해가 포함됩니다. 이 절차는 샘플 준비, CoA 유도화, 고압 액체 크로마그래피(HPLC) 및 흡광도에 의한 유도된 CoA의 정량화에 따른 개별 공표 방법의 편집입니다. 형광 검출23,24,25. 이 절차를 사용하여 얻은 CoA 결정은 CoA 규정의 우리의 이해와 CoA 결핍의 처리를 위한 치료 접근의 발달을 가능하게 했습니다.
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Protocol
이 프로토콜에 언급 된 동물 절차는 프로토콜 323 및 556에 따라 수행되었으며 세인트 주드 어린이 연구 병원 기관 동물 관리 및 사용위원회에서 특별히 승인했습니다.
1. 솔루션 준비
참고: 모든 용액과 절차에 명시된 경우 초순수를 사용하십시오.
- 물에 1 mMM 수산화 칼륨 (KOH)을 준비합니다.
- 0.25 M KOH를 물에 준비하십시오.
- 물에 1 M Trizma-HCl을 준비하고 pH 8.0으로 조정합니다.
- 아세토니트릴(옵티마 그레이드)에서 100mMMMM모노브로모비마네(mBBr)를 준비합니다. mBBr의 스톡 솔루션은 빛에 노출되면 모노브로모비만을 바이마네26으로포토이즈할 수 있기 때문에 어둠 속에서 유지되는 경우 수개월 동안 -20°C에서 안정적이다.
- 고체 상 추출 (SPE) 컬럼을위한 세척 버퍼를 준비하십시오 : 50 % 메탄올 (옵티마 등급) + 2 % 아세트산.
- SPE 컬럼용 용출 완충제를 준비하십시오: 50 mM 암모늄 포메이트를 함유하는 95% 에탄올(HPLC 등급).
2. 코아-바이마네 표준의 준비
- 평판 좋은 소스 (예 : Avanti 극지 지질, Inc.)에서 고품질의 CoA 표준을 구입하십시오.
- 20 mM Tris, pH 8에서 CoA의 고농도 재고 용액을 준비하십시오. 고농도 스톡에서의 CoA의 양은 λ260 nm에서 분광광도 흡광도에 의해 결정또는 확인된다(Θ = 16,800M-1∙cm-1). mBBr의 4 배 어금니 초과를 추가; 10 초 동안 높은 에 소용돌이. 예를 들어 버퍼에서 10mM CoA의 경우 40mMMBBr을 추가합니다. mBBr은 모든 CoA가 유도되도록 초과하여 추가됩니다.
- mBBr로 CoA를 유도하기 위해 흔들리지 않고 어둠 속에서 4 시간 동안 실온에서 배양하십시오. mBBr은 CoA의 티올 기와 반응하며, pH 및 온도의존도27이다. mBBr의 첨가는 CoA를 수용성 형광(또는 자외선 흡수제) CoA-bimane(CoA-bimane)으로 변환한다; 그림 2).
- 100 μL 아세트산과 와류를 10s의 높은 위에 추가하여 반응을 멈추십시오.
- 2,000 x g에서 15 분 동안 원심 분리기를 사용하여 침전제를 제거합니다.
- SPE 컬럼을 사용하여 상급체를 정리하여 미반응 mBBr을 제거하였다(아래에 설명). 용출액의 여과 및 원심분리는 SPE 컬럼 정리 후 필요하지 않습니다(섹션 5.8).
- 미리 계량 된 튜브에 CoA-bimane을 포함하는 SPE 컬럼에서 용출액을 수집하고 질소 가스에서 건조하고 CoA-bimane의 알려진 수량으로 표준 교정 곡선을 계량하고 구성합니다.
- HPLC에 의한 순도에 대한 CoA-bimane 표준을 확인하십시오(아래 참조) λ260(아데닌 모에티) 및 λ393(bimane moiety) 및 크로마토그램의 두 피크의 우연의 일치모두에서 흡광도 검출을 확인합니다.
- λ260 nm(+= 16,800M-1∙cm-1)를사용하여 고농도 스톡에서 CoA-bimane 표준의 양을 확인한다.
- CoA-bimane 표준을 사용하여 실험 샘플에서 CoA-bimane식별을 위해 HPLC 보존 시간을 등록합니다.
- CoA-bimane 표준의 고농도 스톡의 알리쿼트(aliquots)를 빛으로부터 보호하고 -20°C에서 최대 2년 동안 보관하였다. 반복된 해동 및 다시 동결을 피하십시오.
3. 배양 된 세포에서 CoA의 추출 및 유도
- 늦은 하위 밀도에 접근 할 때 배양에서 부착 세포를 수확. 예를 들어, 인간 HepG2/C3A 세포는 6-8 x 106의밀도로 성장하거나 HEK 293T 세포는 100 mm 접시당 ~1.3 x 107의 밀도로 성장한다.
- CoA 결정에 중복 또는 삼중 문화권을 정기적으로 사용합니다. 실행 가능한 세포 수를 결정하기 위해 샘플 세포 배양과 병행하여 별도의 배양 접시를 배양합니다. HPLC 정제 후 106 -107 셀 당 CoA의 양을 계산합니다.
- 접시 떨어져 흡인 배양 매체. 얼음처럼 차가운 인산완식염수(PBS)로 접시에 있는 세포를 빠르게 세척하여 잔류 배지를 제거하고 PBS를 접시에서 흡인합니다. 얼음처럼 차가운 물로 세포를 빠르게 씻어 잔류 PBS를 제거하고 접시에서 물을 빠르게 흡인하십시오. PBS 또는 물을 추가 할 때 부착 세포를 방해하지 마십시오.
- 문화 요리에 얼음 차가운 물 1 mL을 추가합니다. 접시에 차가운 물에 세포를 긁어 0.25 M KOH 및 물 1.5 mL의 400 μL을 포함하는 유리 시험관으로 세포 현탁액을 전송합니다.
- 10초 동안 높은 와류에 의해 현탁액을 격렬하게 섞습니다. 그런 다음 파라핀 필름으로 단단히 덮고 수조에서 흔들리지 않고 55 °C에서 1 시간 동안 배양하십시오. 샘플의 pH는 ≥ 12이어야 한다. 높은 pH는 CoA 티에스테르를 가수분해하는 데 중요하며 필요한 경우 KOH의 추가 aliquots로 조정할 수 있습니다.
- 수확 배양 세포는 낮은 속도로 원심분리에 의해 현탁액에서 성장: 4°C에서 6 분 동안 136 x g. 얼음으로 차가운 PBS로 한 번 씻은 다음 찬물로 다시 잠시 씻은 다음, 마침내 2.5 mL의 차가운 물과 400 μL 0.25 M KOH로 다시 일시 중단하십시오. 전술한 바와 같이 55°C에서 격렬하게 혼합하고 배양한다.
- 1M Trizma-HCl 160 μL과 100 mMMBBr의 10 μL을 추가하고 10초 동안 높은 와류로 섞습니다. 이것은 자유 CoA를 가진 mBBr 반응을 지원하기 위하여 대략 8에 pH를 가져옵니다. mBBr이 CoA의 티올과 반응하도록 암흑에서 2시간 동안 실온에서 샘플을 덮고 배양한다.
- 아세트산 100 μL을 추가하고 반응을 멈추기 위해 10s의 높은 와류로 혼합하십시오.
- 침전된 세포 파편을 제거하기 위해 15 분 동안 2,000 x g의 원심 분리기.
- 아래에 설명된 SPE 컬럼 정리를 위해 유리 시험관에서 상급자를 제거하고 저장합니다.
4. 조직에서 CoA의 추출 및 유도
- 동물 조직 조각을 약 0.5 cm 직경 이하의 해부하고 흡수성 종이에 짧게 (1-2 s)를 얼룩을 한 다음 액체 질소에 얼린 다음 처리 될 때까지 -80 °C에서 보관하십시오. 조직의 CoA는 가수 분해되거나 동결되지 않을 경우 티오에스테르로 변환됩니다. 이 단계는 조직에서 CoA의 최대 수율을 얻는 것이 중요하다.
- 분석을 시작하기 전에 냉동 조직 조각 (5 - 60 mg)을 신속하게 계량하고 각 샘플의 무게를 기록하십시오. 이 습식 중량 측정은 HPLC 정제 다음의 CoA 함량 계산에 사용됩니다. 조직 조각의 완전한 해동을 피하십시오.
- 로터-스테이터 균질화기로 프로브 및 조직 파괴를 삽입하기 위해 향하는 유리 시험관(예: 13 mm x 100mm 일회용)에 2 mL의 1 mL을 추가합니다. 튜브를 얼음 위에 보관하여 사용할 때까지 보관하십시오. 이것은 샘플이 차가운 온도에서 균질화되고 CoA가 균질화 중에 발생하는 열로 인해 파괴되지 않도록하기 위해 수행됩니다.
- 30s에 대한 유리 시험관 (차가운 1 mM KOH 함유)에서 조직 (30 – 40 mg)을 전달 및 균질화하십시오.
- 0.25 M KOH의 500 μL을 추가; 10 초 동안 높은 에 소용돌이 모든 샘플균질화 될 때까지 얼음에 유지. 이것은 총 CoA (무료 CoA + 가수 분해 CoA 티에스테르)를 산출하기 위해 CoA 티에스테르를 가수 분해하기 위해 12 이상의 샘플의 pH를 가져올 것이다.
- 가수 분해를 지원하기 위해 흔들리지 않고 수조에서 55 °C에서 2 시간 동안 샘플을 배양하십시오.
- 150 μL의 1M Trizma-HCl 및 10 0 mMMBr의 10 μL를 추가하십시오; 10초 동안 높은 소용돌이. 이것은 자유 CoA를 가진 mBBr 반응을 지원하기 위하여 대략 8에 pH를 가져옵니다.
- 모든 CoA가 mBBr로 유도되도록 어둠 속에서 2 시간 동안 실온에서 샘플을 인큐베이션합니다.
- 100 μL의 아세트산과 와류를 높은 위에 넣고 10s를 첨가하여 반응을 멈추십시오.
- 2,000 x g에서 15 분 동안 펠릿 침전 세포 파편.
- SPE 컬럼 정리를 위해 유리 시험관에서 상급자를 제거하고 저장하십시오(아래에 설명됨).
5. 고체 상 추출 (SPE) 열을 가진 견본 정리
- 실온에서, 각 일회용 2-(2-pyridyl)-에틸 실리카 겔 컬럼(1 mL 크기)을 세척 완충액 1mL로 평형화하여 피리딜 작용제가 양성자화되고 음이온 교환기로서 기능할 수 있도록 합니다. 2-(2-피리딜)-에틸 실리카 겔은 기본 pH에서 CoA-바이마네에 이상적인 약한 음이온 교환기이다. 2-(2-피리딜)-에틸 실리카 겔은 pKa를 6이고 용출은 pH ≥7을 수행한다.
- 샘플 상급자(4.11단계)를 컬럼에 추가하고 용리액을 수집합니다.
- 1 mL의 워시 버퍼로 컬럼을 두 번 씻어 보유되지 않은 종을 제거하십시오.
- 1 mL의 물로 컬럼을 한 번 씻으시고.
- 1 mL의 용출 완충액으로 컬럼을 별도의 유리 시험관(12 mm x 75 mm)으로 2회 세척하여 CoA-bimane을 수집하였다.
- 건조 건조 질소 가스 에서 튜브에서 건조 CoA-bimane 샘플. 건조된 시료는 추가 사용 시까지 실온에서 안정적입니다. 밀봉 하 고 튜브를 완전히 덮고 보관 하십시오.
- HPLC 분석을 위해 준비되면 300 μL의 물에 시료를 다시 일시 중단하고 10초 동안 높은 와류로 격렬하게 혼합합니다.
- 재중단된 샘플을 원심분리기 튜브 필터(0.22 μm 셀룰로오스 아세테이트, 2 mL 크기)로 옮기고, 10분 동안 5,000 x g에서 원심분리기를 사용하여 침전제를 제거합니다.
- 여과된 샘플을 HPLC 주입에 적합한 유리 병으로 이송합니다.
6. CoA-bimane의 HPLC 정제 및 측정
- 버퍼를 준비합니다. 완충A: 50 mMKH2PO4,pH 4.6; 버퍼 B: 아세토니트릴(옵티마 그레이드).
- HPLC 시스템의 전원을 켜는 것입니다.
참고: 당사 실험실의 HPLC 시스템은 2489 자외선 가시(UV-Vis) 흡광도 검출기와 Empower 3 소프트웨어로 제어되는 2475 형광 검출기가 장착된 Waters e2695 분리 모듈입니다. 이 시스템에는 자동 샘플 인젝터도 있습니다. - 제미니 C18, 3 μm 100 Å, 4.6 mm x 150 mm 컬럼을 0.5 mL/min의 유량으로 사용하여 각 샘플(예를 들어, 20 μL)을 주입합니다. 기둥 온도는 25°C입니다. λ393 nm에서 UV/가시 검출기 흡광도를 측정하고 λex = 393 nm, λem = 470 nm에서 형광 검출을 측정합니다. 보존 시간은 각 샘플 세트 앞에 CoA-bimane 표준 곡선을 실행하여 결정됩니다.
- 각 샘플에 대한 CoA-bimane 피크 아래 의 면적을 기록하고 표준 곡선과 비교하여 HPLC 컬럼에 주입된 CoA-bimane의 pmol을 계산합니다. CoA-bimane 흡광도 표준 곡선은 조직 샘플에 사용되며, CoA-bimane 형광 표준 곡선은 조직 배양 샘플에 사용됩니다.
- CoA-bimane 값이 각 샘플에 대한 총 CoA를 나타내므로, 배양 시료에 대한 생존 가능한 세포의 수로 정규화하거나, 조직 샘플에 대한 mg 습식중량(그림 6). 또는, 각 샘플에 대한 DNA 또는 단백질 함량에 대한 정규화 다음 총 CoA 값을 계산합니다. DNA 또는 단백질 함량은 KOH 첨가 전에 시료 제제 동안 제거되는 샘플 aliquots를 사용하여 별도로 결정될 수 있다.
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Representative Results
배양 된 세포 및 조직에서 총 CoA의 검출을위한 비교적 빠르고 신뢰할 수있는 방법은 mBBr을 사용하여 형광제에 CoA의 티올을 유도한 다음 역상 HPLC를 사용하여 유도 된 CoA-bimane을 정제함으로써 개발되었습니다. 표준 곡선이 먼저 생성되고, 여기서 CoA-bimane 표준의 알려진 양이 개별적으로 주입되고 CoA-bimane 크로마토그램의 피크 아래 영역이 입력 CoA-bimane의 함수로서 플롯됩니다(그림4). CoA-bimane은 λ393 nM에서 흡수 최대를 가지며 대표적인 HPLC 프로파일은 표 1의용출 프로그램을 사용하여 C18 HPLC 컬럼상에서 CoA-bimane 표준의 유지 시간을 나타낸다(그림3). 흡광도 또는 형광 단위를 측정하여 검출된 CoA-bimane의 대표적인 표준 곡선은 그림 4A 및 그림 4B에각각 나와 있습니다. 그림4A의 표준 곡선은 λ393 nm에서 CoA-bimane의 흡광도 크기를 반영하고 그림 4B는 CoA-bimane의 형광을 나타냅니다 (λex = 393 nm 및 λem = 470 nm) 플롯된 코아-비마네. CoA-bimane 표준은 0.01에서 12,000 pmol까지 검출될 수 있으며 흡광성과 형광을 모두 사용하여 검출될 때 106배범위를 커버합니다. 표준의 검출의 하한은 0.01 pmol인 반면, 실험 샘플에서 CoA-bimane 정량의 하한은 크로마토그램의 기준선 또는 배경 형광보다 약 5배 더 큰 0.2 pmol입니다. CoA-bimane의 흡광도 또는 형광에 의한 검출의 선택은 더 크거나 더 작은 견본 크기로 일의 실용성과 더불어 조직 또는 세포에서 일반적으로 존재하는 CoA의 양에 달려 있습니다. 흡광도는 일반적으로 40-50 mg의 시작 물질을 취급하면 5 mg 조직 샘플보다 더 나은 회복을 얻을 수 있기 때문에 조직 샘플에 유용하지만 형광은 일반적으로 크기가 작고 배양 된 세포 샘플에 유용합니다. 형광 표준 곡선의 하단에 있는 값의 보간에 대한 신뢰도를 나타냅니다. 흡광도 검출만 을 가진 실험실은 배양 된 세포에서 측정을 위해 시작 샘플 크기를 늘리거나 감소시키거나 HPLC 주입 볼륨을 높이거나 시료 재서스펜션 (섹션 5.9 위의)에 대한 부피를 줄이는 것을 고려할 수 있습니다.
조직 및 배양 된 세포로부터 의 가수 분해 아실 CoAs에 대한 조건은 KOH 농도 및 후속 배양 시간 및 온도를 조정함으로써 최적화되었다 (데이터는 도시되지 않음). 최적 상태는 2시간 동안 55°C에서 0.25 M인 것으로 나타났다. 티올 군과 티에스터로부터 해방된 임의의 CoA는 pH의 조정 후 mBBr과의 반응에 의해 유도되었다. 마우스 간 또는 인간 배양 된 C3A 세포에 대한 후속 HPLC 분리 및 전형적인 검출 프로파일은 표1에 기재된 용출 프로그램을 사용하여 11 및 12 분 사이의 체류 시간과 함께 적색 피크로 도 5에 나타내어. 생물학적 개시 물질의 전형적인 양은 인간 "간같은" C3A세포에 대한 뮤린 간(젖은 무게) 30-40 mg, 또는 인간 HEK293T 세포에 대한 ~1.3 x 107 세포이다. C3A 세포를 CoA17을 상승시키는 10 uM에서 PanK 실험 약물 PZ-2891로 처리하였다(도6). PanK 이소폼이 과발현될 때 HEK293T 셀에서의 CoA 측정은 넓은 범위(431-6925 pmoles/μL)에 대한 CoA 측정을보여줍니다(그림 6). 이 방법론에 필요한 샘플 크기는 많은 실험 컨텍스트에 적용하기에 실용적입니다.
CoA-bimane 피크 아래의 영역은 HPLC와 함께 제공되는 소프트웨어를 사용하여 계산되었습니다. 피크 한계는 기준 선 보정 및 피크 정의에 대한 입력 값의 적절한 조정을 보류 중인 HPLC 소프트웨어에 의해 자동으로 결정될 수 있지만, 당사의 실험실은 각 크로마토그램에서 CoA-bimane 피크를 수동으로 지정하는 것을 선호합니다. 생소한 생물학적 시료를 위해.
| 시간(최소) | 유량(mL/min) | % A | % B | 곡선 |
| 0 | 0.5 | 90 | 10 | 0 |
| 2 | 0.5 | 90 | 10 | 6 |
| 6 | 0.5 | 85 | 15 | 6 |
| 18 | 0.5 | 60 | 40 | 6 |
| 23 | 0.5 | 60 | 40 | 6 |
| 25 | 0.5 | 90 | 10 | 6 |
| 30 | 0.5 | 90 | 10 | 66 |
표 1: CoA-바이마네 분리를 위한 HPLC 프로그램. 완충A: 50 mMKH2PO4,pH 4.6; 버퍼 B: 아세토니트릴. 버퍼 A와 버퍼 B의 혼합은 중간 오목 그라데이션인 중간 오목 한 구배인 중간 곡선 8과 함께 선형 그라데이션인 곡선 6을 따릅니다.
그림 1. 코엔자임 생합성 경로. 판토타네이트 키나아제(PanK)는 CoA 생합성의 첫 번째 단계에서 판토타산(비타민 B5)에서4′-포스포판토탈산의 인산화를 촉매한다. 인산토탈산의 형성은 4′-포스포판토테인시스테인 신타스테인에 의해 촉매된 시스테인으로 응결되고, 그 다음에 4′-포스포판테인테인 에 의한 4′-포스포판테인을 형성하는 탈카르복실란. 4′-포스포판테인은 코아신타제에 의해 촉매제를 투하하는 2단계 공정에서 코엔자임 A(CoA)로 전환됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. coA와의 mBBr 반응. 모노브로모비마네(mBBr)를 CoA-SH(free CoA)와 혼합하고 어둠 속에서 2시간 동안 실온에서 배양한다. 비형광 mBBr은 CoA에 결합될 때 형광성이 되어 CoA-바이마네를 형성한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: CoA-bimane 표준의 흡광도 HPLC 트레이스. CoA-bimane은 표 1의HPLC 프로그램을 사용하여 쌍둥이 자리 C18 열상에서 분리되었습니다. 일반적인 보존 시간(min)은 중단 단위(AU)로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 흡광도 또는 형광에 의해 검출된 CoA-bimane 표준 곡선. (A)CoA-bimane에 대한 흡광도 검출 유닛을 사용하여 측정된 표준 곡선은 λ393 nm에서 측정하였다. 조직 샘플은 일반적으로 흡광도 표준 곡선을 사용하여 평가됩니다. (B)λex = 393 nm, λem = 470 nm에서 CoA-bimane에 대한 형광 검출 단위를 사용하여 측정된 표준 곡선입니다. 배양된 세포는 일반적으로 형광 표준 곡선을 사용하여 CoA 함량에 대해 평가된다. 중복 표준(및 샘플)은 정기적으로 평가됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 전형적인 간 또는 배양된 세포 샘플의 HPLC 흔적. (A)마우스 간 추출물에서 의 컨텐티내물의 CoA-바이마네 식별 및 정량화. 흡광도 단위(AU)가 표시됩니다. (B)HepG2/C3A 배양 세포에서의 CoA-바이마네 식별 및 함량 정량화. 형광 방출 단위(EU)가 표시됩니다. CoA-바이마네 피크는 빨간색으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 마우스 간에서 CoA 수준, 배양 된 C3A 및 HEK293T 세포. (A)마우스 간에서 CoA 측정판토테네이트 키나아제녹아웃(Pank1-/-)및 일치하는 야생형(WT) 동물. Pank1-/- 동물은 Pank1발현9의부재로 인해 WT 동물에 비해 간에서 CoA가 낮다. 데이터는 유전자형 당 5 마리의 수컷 마우스를 사용하여 수득되었으며 평균 ± SEM.(B)HepG2/C3A 세포에서 CoA 수준으로 나타내었으며, 10 uM에서 PanK 활성을 조절하는 실험 약물인 디메틸설폭사이드(비히코)또는 PZ-2891로 처리된 세포에서 17. 세포 CoA 수준은 PZ-2891로 24 시간 배양 후 상승됩니다. (C)HEK293T 세포에서 CoA 수준은 빈 벡터 pcDNA3.1, 또는 cDNAs 인코딩 인간 PANK 이소폼: PANK1β, PANK2m 인간 PANK2의 성숙하고 처리된 이소폼, 또는 PANK3. CoA 수준은 모든 활성 PANK 이소폼의 과발현에 의해 상승된다. (B)및(C)의데이터는 독립적인 삼중항 샘플로부터 이고 평균 ±SEM으로 표현된다. 통계 분석은 페어링되지 않은 t 검정을 사용하여 수행되었으며 유의값은 빨간색으로 표시됩니다. 패널(B)및(C)의데이터는 샤르마 외에서적응된다. 12이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서 우리는 흡수 또는 형광 출력 검출기를 가진 HPLC가 있는 많은 실험실에서 접근할 수 있는 광범위한 선형 검출을 가진 세포 및 동물 조직에서 총 CoA를 정량화하기 위한 신뢰할 수 있는 단계별 절차를 보여줍니다. 양자택일로, 질량 분석법은 CoA와 CoA 티에스테르를 평가하기 위한 일반적인 기술입니다, 그러나 계측의 비용 및 방법론의 발달 및 데이터의 해석을 위해 요구된 전문화한 지식 때문에 널리 이용되지 않습니다. 질량 분석법에서 자유 CoA의 정량화를 위한 내부 표준으로 사용하기에 적합한 동위원소 표지 CoA는 상업적으로 사용할 수 없으며, 무료 CoA는 아세틸-CoA와 같은 CoA 티에스테르와 동일한 감도를 가진 기기에 의해 검출되지 않습니다. 따라서 출력 데이터를 CoA 표준 교정 곡선과 비교하지 않는 한 자유 CoA 수준은 질량 분석법에 의해 과소 평가되는 경우가 많습니다.
우리는 우리의 실험실에서 이전에 사용 된 다른 방법으로 여기에 설명 된 방법을 비교하고 마우스 간에서 더 큰 CoA 회복을 발견, 123.4 ± 7.9 pmol / mg 젖은 무게, 효소 분석법을 사용하여 ~ 80 pmol / mg 젖은 무게에 비해이 현재의 방법 방사성 태그28와무료 CoA를 유도. 여기서 설명된 총 CoA를 측정하는 방법은 이전에 실험실28에서사용했던 방법에 비해 상당히 덜 번거롭고 빠르며 제어하기 쉽습니다. 이전, CoA는 세포 용해물의 헥산 추출 후 결정되었고, 대장균 아실-코아 합성효소(FadD)에 의해 매개된 방사성[14C]lauryl-CoA로 효소 변환을 행하였다. 상기 산-용해성 단사슬 아실-CoAs 및 세포 용해물 내의 산-불용성 긴 사슬 아실-CoAs를 KOH와 함께 가수분해하여 자유 CoA를 산출한 다음, 효소 전환 전에 헥산 추출을 실시한 후 자유 CoA29로전환하였다. 이 이전 절차는 좋은 특이성과 감도를 가지고 있지만, 실제로 작업을 완료하는 데 2 작업 일이 필요하고 재조합 대장균 아실 -CoA 합성효소는 효소 특정 활성을 위해 준비, 정제 및 측정되어야했습니다. CoA 분석 에 앞서. 또한 최근 역사에서 생물 의학 실험실에서 훨씬 덜 흔한 방사성 동위원소를 감지하고 정량화 할 수있는 계측이 필요했습니다. 여기서 설명한 바와 같은 현재의 방법은 판토테네이트 키나아제(PanK)에 대한 당사의 연구에 가장 적합하다. PanK는 CoA 생합성 경로를 통해 플럭스를 제어하므로 총 CoA 수준은 생물학적 샘플에서 PanK 활성에 대한 판독입니다.
CoA의 실제 양을 유지하기 위해 생물학적 샘플에서 대사 반응을 담금질하는 것은 주의와 신속성을 필요로하며이 절차에 중요합니다. 산 또는 유기 용매로 의 급속한 탈단백질화, 또는 시료의 플래시 동결은 지난30,31에서사용된 두 가지 방법이다. 본 방법에서, 얼음-차가운 초순수물은 배양으로부터 얼음 차가운 PBS 세척 세포에 빠르게 첨가되고, 부착세포와 물을 첨가한 후 KOH로 이송하기 전에 배양접시를 긁어낸다. 시료 제조 전에 -80°C에서 저장하기 위해 [KOH+ 물]에서 배양된 세포 현탁액을 동결하는 것은 허용가능한 정지점이다. 그러나 동결된 세포 샘플의 CoA 값을 새로 제조된 샘플의 값과 비교하여 CoA 신호의 실질적인 손실이 있는지 확인해야 합니다. ≤ 10% CoA의 손실은 세포 샘플 동결 다음 우리의 손에서 발생하고 제어 될 필요가 KOH에서 샘플의 연장 된 시간과 관련이있을 수있다. 동물 조직 조각은 안락사 된 동물로부터 조직을 절제 한 직후 LN2에 떠있는 작은 호일 '뗏목'에 신속하게 동결됩니다. 5 mg에서 60 mg의 냉동 조직의 샘플 크기는 선형 CoA 수율로이 방법에 적합합니다. 일단 동결되면, -80°C에 저장된 조직 샘플은 적어도 3개월 동안 안정되어, 간헐적인 해동이 일어나지 않는다는 것을 제공한다.
HPLC 분석 이전의 시료 준비는 처리량이 높지 않으며 전체 작업 반나절이 필요합니다. 작업자는 첫 번째 세트에 대한 KOH와 2 시간 배양 동안 15 샘플의 두 번째 세트의 균질화 다음 15 샘플 세트의 균질화로 시작, 한 번에 최대 30 샘플을 처리하는 것이 좋습니다. KOH 배양기간은 30분에서 4시간까지의 인큐베이션 시간으로 구입한 CoA 티에스테르를 사용하여 먼저 최적화된 후, 2시간 배양후 다양한 조직 샘플에서 완전한 CoA 티에스테르 가수분해시간을 수용하기 위해 선택되었다. 골격 근에서 간8. mBBr을 사용한 CoA 유도체화를 위한 인큐베이션은 약 pH 8에서 2시간으로 설정되고 20배 의 mBBr 초과가 생물학적 샘플에서 CoA를 완전히 변환하도록 첨가된다. 샘플에서 카르니틴 이나 글루타티온과 같은 CoA 이외의 단백질 및 대사 산물의 설히드릴 모이티는 CoA 이외에 도출될 것이며, 20배 초과는 가장 높은 수준을 가지는 총 CoA 간량에 기초하여 계산되었다. 조직 중. 일반적으로 브롬산염은 더 중립적인 수성 해액에 있는 아민 및 carboxylates 같이 그밖 핵약으로 보다 적게 반응하기 때문에 pH는 mBBr를 가진 배양의 앞에 감소됩니다. 유도체화 시간은 단백질 티올26과의반응을 피하거나 감소시키기 위해 2 시간을 초과해서는 안됩니다. 고농도에서 버퍼 음이온의 존재가 CoA의 mBBr 유도체화를 방해할 수 있기 때문에 pH를 감소시키고 유지하기 위해 비핵필성 완충장치를 사용해야 한다.
SPE 컬럼의 시료 정리는 실험실에서 수동으로 수행되며 진공 매니폴드의 도움으로 이 단계에 필요한 시간을 단축할 수 있습니다. SPE 컬럼에서 유도된 CoA의 양호한 회수는 일상적으로 달성가능하며 이것은 또한 SPE 컬럼에 유지되는 방사성[13C]CoA 티에스테르를 사용하여 별도로 결정되었다. [13C]아세틸-CoA의 회수는 97.6%였고[13C]팔미토일-CoA의 회복은 96.1%였다. SPE 컬럼 용리액의 증발은 일반적으로 편의의 문제로 우리의 실험실에서 하룻밤 질소 가스에서 수행되지만, 건조는 질소 가스 또는 speedvac 농축물을 사용하여 4 시간 이내에 완료 될 수있다. 이 방법의 가장 중요한 단계는 pH 조정과 관련이 있으며 길을 따라 pH 용지 스트립으로 검사 할 수 있습니다. KOH 가수분해의 경우, pH는 CoA로부터 티오에스테르의 완전한 방출을 달성하기 위해 ≥12이어야 한다. pH는 mBBr-유도체화의 반응성을 지지하기 위해 7.8 – 8.5이어야 하며, 유도체 화가 완료된 후, CoA-bimane이 SPE 컬럼에 결합하기 위해서는 pH가 매우 산성화되도록 조정되어야 합니다. SPE 컬럼은 샘플을 정리하여 과도한 미반응 mBBr 및 일부 관련없는 생물학적 물질을 제거합니다.
HPLC 프로그램은 C18 컬럼의 세척 및 재보정이 시료 간의 배경 및 이월 신호를 제거하기에 충분하도록 설계되었습니다. 물 빈 샘플은 세트 사이의 가능한 이월을 모니터링하고 컬럼 청결을 보장하기 위한 예방 조치로 실험 샘플 세트의 5개 샘플마다 삽입됩니다. HPLC에 대한 자동화된 샘플 인젝터를 사용할 때 부적절한 시료 주입으로 인한 간헐적인 오류가 발생할 수 있으며, 이는 시료 바이알에 남아 있는 부피를 주입 또는 비CoA 관련 피크의 검사 후 비교하여 쉽게 확인할 수 있습니다. 출력 크로마토그램. CoA 값이 형광 검출을 위한 교정 곡선의 선형 범위를 초과하는 경우 이 값은 자외선 흡광도 검출의 범위에 있을 가능성이 높습니다. 그렇지 않은 경우, 공지된 양의 물을 가진 시료의 희석은 선형 범위에 있는 신호를 감소시킬 수 있으며 계산은 임의의 희석 계수를 고려해야 한다.
CoA 수준은 생물학적 샘플이 동일한 조건하에서 동일한 균주에서 얻을 때 값이 재현 가능하지만, 다른 유전 적 배경을 가진 근친 마우스 균주 사이에서 변화할 것입니다. 우리는 다양한 연구10,12,16,17에서여러 가지 마우스 라인에서 CoA를 추정했다. CoA는 또한 1차 또는 불멸화된 세포를 사용하여 여러 배양된 세포주16,17에서 측정하였다.
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Disclosures
MWF, CS 및 SJ는 논문을 썼고, MWF 및 CS는 데이터와 수치를 제공했으며, COR는 실험을 설계하고 원고를 비판적으로 검토했습니다. SJ와 COR는 이 문서에서 언급한 PZ-2891 화합물을 다루는 세인트 주드 어린이 연구 병원이 보유한 "판토테네이트 키나아제의 소분자 변조기"(PCT/US17/39037) 출원 중인 특허 출원에 대한 발명자입니다.
Acknowledgments
저자는 CoA 치료, Inc., BridgeBio LLC의 자회사, 건강 보조금 GM34496의 국립 연구소, 그리고 미국 레바논 시리아 관련 자선 단체에 의해 제공되는 후원 연구에 대한 자금을 인정.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column | Millipore-Sigma | 54127-U | |
| coenzyme A | Avanti Polar Lipids | 870700 | |
| Gemini C18 3 μm 100 Å HPLC column | Phenomenex | 00F-4439-E0 | |
| monobromobimane | ThermoFisher Scientific | M-1378 | |
| Omni-Tip probe tissue disrupter | Omni International | 32750H | |
| Parafilm | Fisher | S37440 | |
| PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer | ThermoFisher Scientific | NC0530997 | |
| Spin-X centrifuge tube filter | CoStar | 8161 | |
| Trizma-HCl | Fisher | T395-1 | |
| Waters 2475 fluorescence detector | Waters | 2475 | |
| Waters 2489 UV-Vis detector | Waters | 2489 | |
| Waters e2695 separations module | Waters | e2695 |
References
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