Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Количественная оценка коэнзима А в клетках и тканях

Published: September 27, 2019 doi: 10.3791/60182
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Infectious Diseases, St. Jude Children's Research Hospital

Summary

Этот метод описывает подготовку образца из культивированных клеток и тканей животных, экстракции и произвлечения коэнзима А в образцах, а затем жидкой хроматографии высокого давления для очистки и количественной оценки производного коэнзима А абсорбции или обнаружения флуоресценции.

Abstract

Новые исследования показали, что клеточный коэнзим A (CoA) питания может стать ограниченным с пагубным воздействием на рост, обмен веществ и выживание. Измерение клеточного КоАп является сложной задачей из-за его относительно низкого изобилия и динамического преобразования свободного КоАП в КоАП, которые, в свою очередь, участвуют в многочисленных метаболических реакциях. Описан метод, который проходит через потенциальные ловушки во время подготовки образца, чтобы дать анализ с широким линейным диапазоном обнаружения, который подходит для использования во многих биомедицинских лабораториях.

Introduction

Коэнзим А (CoA) является незаменимым кофактором во всех живых организмах и синтезируется из пантотеновой кислоты, также называемой пантотенатом (соль пантотеновой кислоты) или витамина В5. КоА является основным внутриклеточным носителем органических кислот, включая короткоцепочечные кислоты, такие как ацетат и суччатый, ветвяные кислоты, такие как пропионат и метилмалонат, длинноцепочечные жирные кислоты, такие как пальмитат и олеат, очень длинноцепочечные жирные кислоты, такие как полиненасыщенные жирные кислоты и ксенобиотики, такие как вальпроевая кислота. Органическая кислота образует тиоэстер связи ферментативно с КоАп, чтобы его использование в качестве субстрата в более чем 100 реакций в промежуточныхметаболизм1. CoA thioesters также аллостерические регуляторы и транскрипционные активаторы. В настоящее времяоценили 2, что сотовый общий объем поставок КоАП регулируется3,4; таким образом, доступность КоАп может быть ограничена, и что недостатки КоАП могут быть катастрофическими, о чем служат наследственные генетические расстройства, которые влияют на биосинтез CoA5. Пантотенат киназы катализирует первый шаг в биосинтезе CoA (Рисунок 1) и Pantothenate Киназы Ассоциированные нейродегенерации, называется PKAN, вызвано мутациями в гене PANK2 6. CoA synthase, кодируется геном COASYN, катализирует последние два шага в биосинтезе CoA(Рисунок 1)и COASY Protein-Associated Neurodegeneration, называемой CoPAN, вызвана мутацией в гене COASYN 7. Оба PKAN и CoPAN являются наследственные нейродегенеративные заболевания, связанные с накоплением железа в головном мозге и Недостатки КоАП недостаточно патологии болезни.

Клеточные уровни общего КоА варьируются между тканями8 и общего КоА может увеличиваться или уменьшаться при различных физиологических, патологических и фармакологических состояний. Печень Коа увеличивается во время переключения топлива из корма в постное состояние9, и печени CoA уровни аномально высока в лептин-дефицитных тучных мышей10. Печень КоА уменьшается в ответ на хроническое проглатывание этанола11. Мозг CoA уровни в модели Pank2 нокаут мыши депрессии в течение перинатального периода, но позже на взрослой стадии мозга содержание мозга CoA эквивалентно диким типа уровней, что свидетельствует о адаптивной реакции КоАп во время развития12. Манипуляция содержанием коэнзии с помощью трансгенеза или методов доставки генов влияет на метаболические и нервные функции13,14,15. Доклиническое развитие потенциальных методов лечения PKAN или CoPAN включает измерения КоАп клеток или тканей в качестве показателей эффективности16,17,18,19,20 . Оценка всех этих состояний и их метаболических или функциональных последствий требует количественного метода измерения общего КоАп.

Точный, надежный анализ для измерения КоАп в биологических образцах является технической проблемой во многих лабораториях. К сожалению, Есть нет зондов, доступных для оценки или количественно CoA или CoA thioesters в нетронутых клеток, хотя аналоги природных CoA тиесты были широко использованы в качестве механистических зондов в исследованиях CoA эфира с использованием ферментов21. Преобразование КоАп, с помощью свободного сульфидрила (-SH) муэти, в коап thioester (или наоборот) является быстрым в клетках или тканях животных во время передачи в другую среду и во время лизиса клеток. Многочисленные синтезаторы acyl-CoA и ацил-КоА тиостасесы в клетках посредничают интерконверсии в пуле КоАП, а также дополнительные ферменты, которые используют коап тиестеры в качестве субстратов, остаются активными в биологических образцах до утопленного химическими или физическими Означает. Разгрузка ацил-групп от КоАп до карнитина ацил-трансферазами является одним из примеров в рамках сети реакций, которые могут изменить распределение тиоэстера CoA/CoA. Радиоактивные трассы могут быть использованы для измерения темпов синтеза КоАП в клетках. Текущие методы измерения производных КоАп и КоА в биологических образцах были рассмотрены22 и включают в себя соединенные энзиматические спектромеметрические анализы, жидкой хроматографии высокого давления и процедуры, основанные на масс-спектрометрии. Тем не менее, эти методы часто сосредоточены на конкретных молекулярных видов КоАП и слепы к изменению общего пула КоАП. Соединенные ферментативные анализы обычно требуют большего количества входного материала из-за низкой чувствительности обнаружения и имеют ограниченный диапазон линейности.

Наша лаборатория разработала надежную процедуру количественной оценки общего объема КоАП в культивированных клетках и тканях животных. Стратегия включает в себя гидролиз всех КоАП тиоэстеров, чтобы дать только бесплатно CoA во время подготовки образцов, а не прилагать усилия для поддержания и анализа всего спектра видов КоАП. Процедура представляет собой компиляцию отдельных опубликованных методов подготовки образцов, деиватации КоА, очистки и идентификации после жидкой хроматографии высокого давления (HPLC), а также количественной оценки производного КоА путем абсорбции или флуоресценция23,24,25. Определения КоАП, полученные с помощью этой процедуры, позволили нам понять регулирование КоАП и разработку терапевтического подхода к лечению недостатков КоАП.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Процедура животных, упомянутая в этом протоколе, была выполнена в соответствии с протоколами 323 и 556 и специально одобрена Комитетом по институциональному уходу и использованию животных в Санкт-Джудской детской больнице.

1. Подготовка решений

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ультрачистую воду для всех решений и при указании в процедурах.

  1. Приготовьте 1 мМ гидроксид калия (KOH) в воде.
  2. Приготовьте 0,25 М кНв в воде.
  3. Приготовьте 1 M Trizma-HCl в воде и приспособите к рН 8.0.
  4. Подготовка 100 мМ монобробиман (mBBr) в ацетонитриле (Optima Grade). Фондовые растворы mBBr стабильны при -20 градусов по Цельсию в течение многих месяцев при условии, что они хранятся в темноте, как воздействие света может фотолизцировать монобромобиман до бимэн26.
  5. Подготовка мыть буфер для твердой фазы извлечения (SPE) колонки: 50% метанола (Optima Grade) и 2% уксусной кислоты.
  6. Подготовка Elution Buffer для колонки SPE: 95% этанола (HPLC Grade), содержащего 50 мМ аммония formate.

2. Подготовка стандарта КоАП-биман

  1. Приобретите высококачественный стандарт CoA у авторитетного источника (например, Avanti Polar Lipids, Inc.).
  2. Подготовка высококонцентрационного стокового раствора КоАП в 20 мм трис, рН 8. Количество КоАП в высококонцентрационном запасе определяется или подтверждается спектрофотометрическим абсорбцией на уровне 260 нм (- 16 800 М-1см-1). Добавить 4-кратный молярный избыток мБр; вихрь на высоте 10 с. Например, для 10 мм КоАп в буфере добавьте 40 мМ мББр. MBBr добавляется в избытке, чтобы гарантировать, что все КоАп производные.
  3. Инкубировать при комнатной температуре 4 ч в темноте, не встряхивая, чтобы произвать КоАП с mBBr. mBBr реагирует с тиол группы КоАП, и это рН и температура зависит27. Добавление mBBr преобразует КоАп в водорастворимый флуоресцентный (или ультрафиолетовый абсорбант) CoA-bimane (CoA-bimane; Рисунок 2).
  4. Добавьте 100 acetic кислоты и вихря на высоком в течение 10 с, чтобы остановить реакцию.
  5. Центрифуга при 2000 х г в течение 15 минут, чтобы удалить любой осадок.
  6. Очистка супернатанта с помощью SPE-колонки для удаления неотреагированных mBBr (описано ниже). Фильтрация и центроугирование элуата не требуется после очистки столбца SPE (раздел 5.8).
  7. Соберите eluate из колонны SPE, содержащей КоАП-биман в предварительно взвешенной трубке, сухой под азотным газом, взвесьте и постройте стандартную кривую калибровки с известными количествами CoA-bimane.
    1. Проверьте стандарт CoA-bimane для чистоты HPLC (см. ниже) с обнаружением абсорбции на обоих 260 (аденина moiety) и No393 (bimane moiety) и совпадение обоих пиков в хроматограмме.
    2. Подтвердите количество стандарта CoA-bimane в высокой концентрации, используя 260 нм (- 16,800 М-1см-1).
  8. Зарегистрируйте время хранения HPLC для идентификации КоАП-бимэ в экспериментальных образцах с использованием стандарта CoA-bimane.
  9. Храните аликвоты высокой концентрации стандарта CoA-bimane, защищенные от света и хранящиеся при -20 градусов по Цельсию в течение 2 лет. Избегайте повторного оттаивания и повторного замораживания.

3. Добыча и вывод КоАП в культивированных клетках

  1. Урожай адептов клеток в культуре при приближении позднего субсонслифнатного плотности. Например, клетки hepG2/C3A человека выращиваются до плотности 6-8 x 106,или клетки HEK 293T выращиваются до плотности 1,3 х 107 на 100 мм.
    1. Используйте дубликат или тройной культуры обычно для определений КоАп. Инкубировать отдельные блюда культуры параллельно с образцом клеточных культур для определения жизнеспособного числа клеток. Рассчитайте количество КоАП на 106-107 ячеек после очистки HPLC.
  2. Аспирная культура среды от блюда. Быстро мыть клетки на блюдо с ледяной фосфат-буферный солен (PBS), чтобы удалить любые остаточные среды и аспирировать PBS от блюда. Быстро мыть клетки с ледяной водой, чтобы удалить остаточные PBS и аспирировать воду с блюда быстро. Избегайте нарушения адепта клеток при добавлении PBS или воды.
  3. Добавьте в культурное блюдо 1 мл ледяной воды. Очистите клетки в холодную воду в тарелке и перенесите суспензию клетки в стеклянную пробирку, содержащую 400 л 0,25 М кНи и 1,5 мл воды.
    1. Смешайте подвеску энергично вихрем на высоте 10 с. Затем плотно накройте парафинапленком и инкубировать при 55 градусах по Цельсию в течение 1 ч, не встряхивая в водяной бане. РН образца должен быть 12. Высокий рН имеет важное значение для гидролизова циферблатов CoA и может быть скорректирован с дополнительными аликвотами KOH при необходимости.
  4. Урожай культивированных клеток, растущих в подвеске центрифугированием на низкой скорости: 136 х г в течение 6 мин при 4 градусах Цельсия. Вымойте один раз с ледяной PBS, затем кратко промыть снова с холодной водой, и, наконец, resuspend в 2,5 мл холодной воды плюс 400 л 0,25 М КН. Смешайте энергично и инкубировать при 55 градусах по Цельсию, как описано выше.
  5. Добавьте 160 л из 1 M Trizma-HCl и 10 л 100 мМ мБр и смешайте вихрем на высоте 10 с. Это приносит pH до приблизительно 8 для того чтобы поддержать реакцию mBBr с свободно CoA. Накройте и инкубировать образцы при комнатной температуре 2 ч в темноте для mBBr реагировать с тиол КоАП.
  6. Добавить 100 кл тетической кислоты и перемешать вихрем на высоком уровне в течение 10 с, чтобы остановить реакцию
  7. Центрифуга при 2000 х г в течение 15 мин для удаления осажденного клеточного мусора.
  8. Удалите и сохраните супернатант в стеклянной пробирке для очистки столбца SPE, описанной ниже.

4. Добыча и произвлечения КоАП в тканях

  1. Вскрыть кусочки ткани животных, около 0,5 см в диаметре или меньше, и пятно кратко (1-2 с) на абсорбируемой бумаге, а затем вспышки заморозить в жидком азоте и хранить при -80 градусов по Цельсию до обработки. КоАП в тканях гидролизгируется или преобразуется в тиостер, если не флэш-замороженный. Этот шаг важен для получения максимальной урожайности КоАП в тканях.
  2. Взвешивание замороженных частей ткани (5 - 60 мг) быстро до начала анализа, и записывать вес для каждого образца. Это определение влажного веса используется для расчета содержания КоАП после очистки HPLC. Избегайте полной оттепели частей ткани.
  3. Добавьте 2 мл 1 мМ кОН в стеклянную пробирку (например, 13 мм х 100 мм одноразовые), предназначенные для вставки зонда и нарушения тканей с ротор-статор гомогенизатор. Держите трубку на льду до использования. Это делается для того, чтобы образцы были однородны при холодной температуре и КоАП не разрушались из-за тепла, генерируемого во время гомогенизации.
  4. Передача и гомогенизация ткани (30 - 40 мг) в стеклянной пробирке (содержащей холодный 1 мМ кН) на 30 с. Избегайте полного оттаивания ткани.
  5. Добавить 500 л 0,25 М кНх; вихрь на высоте 10 с и держать на льду, пока все образцы гомогенизированы. Это принесет рН образца выше 12 для гидролизова CoA тиесты для получения общего КоАп (бесплатный КоАП и гидролизмеризированных КоАП тиоэстеров).
  6. Инкубировать образцы при 55 градусах По Цельсию на 2 ч в водяной бане без тряски для поддержки гидролизов.
  7. Добавить 150 зл и 1 М Trizma-HCl и 10 л 100 мМ мбр; вихрь на высоте 10 секунд. Это приносит pH до около 8 для поддержки реакции mBBr с свободным КоАП.
  8. Инкубировать образцы при комнатной температуре 2 ч в темноте, чтобы убедиться, что все КоАп произвобожден с mBBr.
  9. Добавьте 100 кл тесцедической кислоты и вихрь на высоком уровне в течение 10 с, чтобы остановить реакцию.
  10. Центрифуга при 2000 х г в течение 15 мин, чтобы гранулы осаждаемых клеточных мусора.
  11. Удалите и сохраните супернатант в стеклянной пробирке для очистки столбца SPE (описано ниже).

5. Очистка образца с целью извлечения твердой фазы (SPE) колонки

  1. При комнатной температуре уравновешивать каждую одноразовую колонку 2-(2-пиридила)-этиловой кварцевого геля (размер 1 мл) с 1 мл буфера для мытья, чтобы гарантировать, что пиридиловая функциональная группа будет протонацией и будет функционировать как анион-обменник. 2-(2-пиридил)-этиловый кремнеземный гель является слабым анионным обменником, который идеально подходит для CoA-bimane при базовом рН. 2-(2-пиридил)-этил кремнеземгель имеет pKa 6 и elution делается рН No 7.
  2. Добавьте образец супернатанта (шаг 4.11) в столбец и соберите eluate.
  3. Вымойте столбец дважды с 1 мл мыть буфера для удаления любых неудержанных видов.
  4. Вымойте колонку один раз с 1 мл воды.
  5. Дважды вымойте колонку с 1 мл elution Buffer в отдельную стеклянную пробирку (12 мм х 75 мм) для сбора КоАП-бимэ.
  6. Сухой образец CoA-bimane в трубке под азотным газом для сухости. Высушенный образец стабилен при комнатной температуре до дальнейшего использования. Печать и полностью покрыть трубку и хранить.
  7. При готовности к анализу HPLC, resuspend образца в 300 л воды и тщательно перемешать вихрем на высоком уровне в течение 10 с.
  8. Передача повторного образца в фильтр центрифуги (0,22 мкм целлюлозы ацетата, 2 мл размера) и центрифуги на 5000 х г в течение 10 минут, чтобы удалить любой осадок.
  9. Перенесите отфильтрованный образец в стеклянный флакон, подходящий для инъекции HPLC.

6. Очистка HPLC и измерение КоАП-бимэ

  1. Подготовка буферов. Буфер A: 50 мМ KH2PO4,рН 4.6; Буфер B: Ацетонитрил (Оптима Класс).
  2. Включите систему HPLC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Система HPLC в нашей лаборатории представляет собой модуль разъединения Waters e2695, оснащенный детектором абсорбции 2489 Ultraviolet-Visible (UV-Vis) и детектором флуоресценции 2475, управляемым программным обеспечением Empower 3. Система также имеет автоматизированный образец инжектора.
  3. Впрысните каждый образец (например, 20 л) для разделения на Близнецах C18, 3 мкм 100, 4,6 мм х 150 мм колонки, используя программу в таблице 1 с скоростью потока 0,5 мл/ мин. Температура столбца 25 градусов по Цельсию. Измерьте абсорбцию УФ/Видимого детектора на уровне 393 нм, а флуоресцентное обнаружение - в 393 нм, Земе - 470 нм. Время удержания определяется путем запуска стандартной кривой CoA-bimane перед каждым набором образцов.
  4. Запишите область под пиком CoA-bimane для каждого образца и сравните со стандартной кривой для расчета pmol CoA-bimane, вводимого в столбец HPLC. Стандартная кривая абсорбции CoA-bimane используется для образцов тканей, а стандартная кривая флуоресценции CoA-bimane используется для образцов культуры тканей.
  5. Поскольку значения КоАП-бимане представляют собой общий КоАп для каждого образца, нормализуйте количество жизнеспособных клеток для образцов культуры, или мг влажного веса для образцов тканей(рисунок 6). Кроме того, вычислить общие значения КоАП после нормализации ДНК или содержание белка для каждого образца. Содержание ДНК или белка можно определить отдельно с помощью образцов aliquots, которые удаляются во время подготовки образца до KOH добавления.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Относительно быстрый и надежный метод для обнаружения общего КоАп в культивированных клетках и тканях был разработан путем произвождения тиола КоАП к флуоресцентному агенту с использованием mBBr, а затем очищения производной КоА-биман с использованием обратной фазы HPLC. Сначала генерируется стандартная кривая, где известные и увеличивающиеся количества стандарта CoA-bimane вводятся индивидуально, а области под пиками в Хроматограммах CoA-bimane отражаются как функция ввода CoA-bimane(рисунок 4). CoA-bimane имеет максимальную абсорбцию на уровне 393 нм, а репрезентативный профиль HPLC показывает время удержания стандарта CoA-bimane на столбце C18 HPLC(рисунок 3)с использованием программы elution в таблице 1. Репрезентативные стандартные кривые КоАП-бимэна, обнаруженные путем измерения абсорбции или флуоресценции, показаны на рисунке 4A и рисунке 4B,соответственно. Стандартная кривая на рисунке 4А отражает величину абсорбции CoA-bimane на уровне 393 нм, а рисунок 4B представляет флуоресценцию КоАП-бимэ (экскс- 393 нм и Зем- 470 нм), построенного по сравнению с входной суммой КоА-биман. Стандарт CoA-bimane может быть обнаружен от 0,01 до 12 000 рмоль и охватывает диапазон 106сгибов при обнаружении с использованием абсорбции и флуоресценции. В то время как нижний предел обнаружения стандарта составляет 0,01 пм., нижняя граница количественной оценки CoA-bimane в экспериментальных образцах составляет 0,2 пм., что примерно в 5 раз больше базовой или фоновой флуоресценции в хроматограмме. Выбор обнаружения путем абсорбции или флуоресценции CoA-bimane зависит от количества КоАп, обычно присутствуют в тканях или клетках, а также практичности работы с большими или меньшими размерами выборки. Абсорбция, как правило, полезна для образцов тканей, потому что обработка 40-50 мг исходного материала дает лучшее восстановление, чем 5 мг образцов тканей, в то время как флуоресценция, как правило, полезна для культивированных образцов клеток, которые меньше по размеру и есть больше уверенность в интерполировании значений на нижнем конце стандартной кривой флуоресценции. Лаборатории с только обнаружением абсорбции могут рассмотреть вопрос об увеличении или уменьшении размера стартовой выборки, увеличении объема инъекций HPLC или уменьшении объема для повторной работы образцов (раздел 5.9 выше) для измерений в культивированных клетках.

Условия гидролизмации ацил-КоА из тканей и культивированных клеток были оптимизированы за счет корректировки концентрации KOH, а также времени и температуры последующей инкубации (данные не показаны). Оптимальное состояние было установлено, что 0,25 М при 55 градусах по Цельсию в течение 2 часов. Тиол группы свободного КоАП плюс любой КоАп освобождены от thioesters были производные реакции с mBBr после корректировки рН. Последующее разделение HPLC и типичные профили обнаружения для печени мыши или человека культивируемых клеток C3A указаны на рисунке 5 как красные пики, с временем удержания между 11 и 12 минут, используя программу elution, описанную в таблице 1. Типичные количества биологического исходного материала 30-40 мг мурин печени (мокрый вес), 6-8 х 106 клеток для человека "печень, как" C3A клеток, или 1,3 х 107 клеток для человека HEK293T клеток. Клетки C3A были обработаны с panK экспериментальным снадобьем P-2891 на 10 uM который поднимает CoA17 (Рисунок 6). Измерения КоАП в клетках HEK293T, когда изоформы PanK переэкспрессированы, показывают измерения КоАП в широком диапазоне (431-6925 pmole/l) (Рисунок 6). Размеры выборки, необходимые для этой методологии, являются практическими для применения во многих экспериментальных контекстах.

Область под пиком КоАП-биман е была рассчитана с использованием программного обеспечения, предоставленного HPLC. Пиковые пределы могут быть автоматически определены программным обеспечением HPLC до правильной корректировки входных значений для базовой коррекции и определения пика, но наша лаборатория предпочитает вручную обозначить пик КоАП-биман в каждой хроматограмме, в частности для незнакомых биологических образцов.

Время (мин) Скорость потока (мЛ/мин) % A % B Кривой
0 0.5 90 10 0
2 0.5 90 10 6
6 0.5 85 15 6
18 0.5 60 40 6
23 0.5 60 40 6
25 0.5 90 10 6
30 0.5 90 10 66

Таблица 1: Программа HPLC для разделения КоАп-бимэна. Буфер A: 50 мМ KH2PO4,рН 4.6; Буфер B: Ацетонитрил. Смешивание буфера A и Buffer B следует кривой 6, которая является линейным градиентом, с промежуточным кривой 8, который является средним вогнутым градиентом.

Figure 1
Рисунок 1. Коэнзим Путь биосинтеза. Пантотенат киназа (Панк) катализирует фосфорилирование пантотената (витамин B5) до 4-фосфопантотена на первой ступени биосинтеза CoA. Формирование фосфопантотена сопровождается конденсацией с цистеином, катализированным 4-фосфопантотеноилцистеис синтазы, а затем декарбокскиляции в форме 4 "фосхопантеин 4" фосфопантеноилцистеина decarboxylase. 4'-Фоспхопантеин преобразуется в коэнзим A (CoA) в двухступенчатом процессе, катализированном CoA Synthase. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2. mBBr Реакция с КоАП. Монобромобиман (mBBr) смешивается с КоАП-SH (бесплатный КоАП) и инкубируется при комнатной температуре в течение 2 часов в темноте. Нефлуоресцентный mBBr становится флуоресцентным, когда связан с КоАп, чтобы сформировать КоАП-биман. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Абсорванс HPLC След КоАП-биман стандарта. CoA-bimane был отделен на столбце Gemini C18 с помощью программы HPLC в таблице 1. Типичное время удержания (мин) указывается единицами прерывания (AU). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Стандартные кривые КоАП-бимэне, обнаруженные с помощью абсорбции или флуоресценции. (A) Стандартная кривая, измеренная с использованием блоков обнаружения абсорбции для CoA-bimane, была измерена на уровне 393 нм. Образцы тканей обычно оцениваются с использованием стандартной кривой абсорбции. (B) Стандартная кривая, измеренная с использованием флуоресценции обнаружения единиц для CoA-bimane на кекс - 393 нм, Зем 470 нм. Культурные клетки обычно оцениваются на содержание КоАп с использованием стандартной кривой флуоресценции. Регулярно проводится оценка двойных стандартов (и образцов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: HPLC следы типичных образцов печени или культивированных клеток. (A) Коа-биман идентификации и количественного содержания в экстракте печени мыши. Абсорсавианс единиц (AU) указаны. (B) Коап-биман идентификации и количественной оценки содержания в HepG2/C3A культивированных ячеек. Указаны единицы выбросов флуоресценции (ЕС). Пики КоАп-бимане показаны красным цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6. Уровни КоАп в печени мыши, культивированных клеток C3A и HEK293T. (A) КоАп измерения в печени мыши от пантотенат киназы нокаутом (Pank1-/-) и соответствует дикого типа (WT) животных. Pank1-/- животные имеют более низкий КоАП в печени по сравнению с WT животных из-за отсутствия Pank1 выражение9. Данные были получены с использованием 5 мышей мужского пола на генотип и представлены в качестве среднего - SEM. (B) Уровни КоАП в клетках HepG2/C3A, обработанных либо диметилсульфодоксидом (управление транспортным средством), либо С-2891, экспериментальным препаратом, который модулирует активность Панка на уровне 10 u. 17. Клеточный уровень КоАП повышен после 24-часовой инкубации с помощью ПЗ-2891. (C) Уровни КоАП в клетках HEK293T трансфицируются либо пустым вектором pcDNA3.1, либо cDNAs, кодирующих изоформы человека PANK: PANK1, PANK2m, который является зрелой, обработанной изоформой человеческого PANK2, или PANK3. Уровни КоАП повышаются за счет переэкспрессии всех активных изоформ PANK. Данные в (B)и (C) взяты из независимых тройных образцов и представлены в виде среднего ЗНАЧЕНИЯ. Статистический анализ был сделан с использованием непарного t-теста, а значения значимости показаны красным цветом. Данные в панелях(B) и (C) адаптированы из Шарма и др. 12Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы демонстрируем надежную, пошаговую процедуру количественной оценки общего КоАП в клетках и тканях животных с широким спектром линейного обнаружения, который доступен во многих лабораториях, которые имеют HPLC с либо абсорбцией или флуоресценции выходного детектора. Кроме того, масс-спектрометрия является распространенным методом оценки КоАП и КоАП, но не широко доступна из-за стоимости приборов и специализированных знаний, необходимых для разработки методологии и интерпретации данных. Изотопно помечены КоАп, который подходит для использования в качестве внутреннего стандарта для количественной оценки свободного КоАп в масс-спектрометрии не является коммерчески доступным, и свободный КоА не обнаруживается инструментом с той же чувствительностью, как КоАП тиестеров, таких как ацетил-КоА. Таким образом, свободные уровни КоАП часто сильно недооцениваются масс-спектрометрией, если данные о выходе не сопожаты со стандартной кривой калибровки CoA.

Мы сравнили метод, описанный здесь, с другим методом, ранее использованным в нашей лаборатории, и обнаружили большее восстановление CoA из печени мыши, 123,4 и 7,9 пмоль/мг влажного веса, с этим текущим методом по сравнению с 80 pmol/mg влажный вес с использованием ферментативного освасывания, что производной бесплатно КоАп с радиоактивным тегом28. Метод измерения общего КоАП, описанный здесь, значительно менее громоздкий, более быстрый и простой в управлении по сравнению с методом, ранее использованным в нашей лаборатории28. Ранее КоА был определен после гексана извлечения лизата клетки и подвергается ферментативной преобразования в радиоактивныеNo 14C'lauryl-CoA при посредничестве Escherichia coli acyl-CoA синтетазы (FadD). Кислоторастворимый короткоцепочечный ацил-КоА и кислотно-нерастворимый длинноцепочечный ацил-КоА в клеточном лизате были гидролизованы с KOH, чтобы дать свободный КоАп, а затем подвергнутыг гексановой экстракции до ферментативного преобразования в свободный КоАп29. Хотя эта предыдущая процедура имела хорошую специфичность и чувствительность, на практике задача требовала 2 рабочих дня, чтобы завершить и рекомбинантный E. coli acyl-CoA synthetase должен был быть подготовлен, очищен и измерен для ферментатической специфической деятельности до анализа КоАП. Для этого также требовались приборы, способные обнаруживать и количественно изотопы радиоактивных, которые в более новейшей истории были гораздо менее распространены в биомедицинских лабораториях. Текущий метод, описанный здесь, наиболее подходит для наших исследований интерес к пантотенат киназы (PanK). PanK контролирует поток через биосинтетический путь КоАП, и поэтому общий уровень КоАП является считываемым для активности PanK в биологических образцах.

Утоления метаболических реакций в биологическом образце для поддержания истинного количества КоАп требует ухода и быстроты и имеет решающее значение для этой процедуры. Быстрая депротеиализация с кислотой или органическим растворителем, или флэш-замораживание образцов два метода, которые были использованы в последние30,31. В настоящем методе, ледяная ультрачистая вода быстро добавляется в ледяные клетки PBS-промытые из культур, и клетки адептов плюс вода затем соскребли с культуры блюдо перед передачей в KOH. Замораживание культивированных клеточных суспензий в «KOH » для хранения при -80 градусов по Цельсию до подготовки образца является приемлемой остановкой. Тем не менее, значения КоАП из замороженных образцов клеток следует сравнивать с значениями из свежеподготовленных образцов, чтобы определить, есть ли существенная потеря сигнала CoA. Потеря CoA на 10% произошла в наших руках после замораживания образца клеток и может быть связана с длительным временем выборки в KOH, который необходимо контролировать. Кусочки тканей животных быстро замораживаются на небольшой фольге 'плот' плавающие на LN2 сразу после иссечения ткани от эвтаназии животного. Размеры образцов от 5 мг до 60 мг замороженных тканей подходят для этого метода с линейными урожаями КоАп. После замораживания образцы тканей, хранящиеся при -80 градусах Цельсия, стабильны в течение по крайней мере 3 месяцев, при условии, что не происходит периодической оттепели.

Подготовка образца до анализа HPLC не является высокой пропускной результатом и требует полной рабочей половины дня. Оператору рекомендуется обрабатывать не более 30 образцов одновременно, начиная с гомогенизации набора из 15 образцов с последующим гомогениззацией второго набора из 15 образцов во время инкубации 2 ч с KOH для первого набора. Инкубационный период KOH был впервые оптимизирован с использованием закупленных CoA thioesters со временем инкубации от 30 мин до 4 ч, а затем была выбрана инкубация 2 ч для размещения времени для полного гидролизного гидролизи CoA в различных образцах тканей, начиная от скелетной мышцы до печени8. Инкубация для деиватизации CoA с мББр установлена на уровне 2 ч при примерно рН 8 и 20-кратное превышение мБр добавляется для полного преобразования КоАП в биологические образцы. Sulhydryl moieties белков и метаболитов, кроме КоАП, таких как карнитин или глутатион в образце, будет произведен в дополнение к КоАп, а 20-кратный избыток был рассчитан на основе ожидаемого количества общей когтей CoA, которая имеет самый высокий уровень среди тканей. РН уменьшается до инкубации с мББр, потому что bromobimanes в целом менее реактивные по отношению к другим нуклеофилов, как амины и карбоксилаты в более нейтральных входящих растворов. Время произвобления не должно превышать 2 ч, чтобы избежать или уменьшить реакцию с белкамитиол 26. Нужно использовать ненуклеофильные буферы для уменьшения и поддержания рН, потому что наличие буферных анионов в высоких концентрациях может помешать производности МББр CoA.

Очистка образцов на столбце SPE осуществляется вручную в нашей лаборатории и может быть выполнена с помощью вакуумного многообразия, чтобы сократить время, необходимое для этого шага. Хорошее восстановление производной КоА из столбца SPE обычно достижимо, и это было определено отдельно с использованием радиоактивных тиоэтеровC'CoA, которые также сохраняются на столбце SPE. Восстановление13C'acetyl-CoA составило 97,6%, а восстановление13С пальмитоил-КоА составило 96,1%. Испарение eluate SPE-колонки обычно выполняется под азотным газом на ночь в нашей лаборатории в удобном порядке, но сушка может быть завершена в течение 4 часов под азотным газом или с помощью концентратора speedvac. Наиболее важные шаги в методе связаны с регулировкой рН и могут быть проверены с помощью полосок бумаги pH по пути. Для гидролизов KOH, рН должен быть 12, чтобы достичь полного высвобождения тиоэстера из КоАп. рН должен быть 7,8 - 8,5 для поддержки реактивности мББР-дериватизации, и после завершения производной, рН должен быть скорректирован, чтобы стать очень кислым, около рН 1-2, для того, чтобы КоАП-биман привязать к столбце SPE. Колонка SPE очищает образец для устранения избытка неотреагированных mBBr и некоторых несвязанных биологических веществ.

Программа HPLC разработана таким образом, чтобы мытье и повторное равновесие столбца C18 было достаточным для устранения фоновых и переносных сигналов между образцами. Водные пустые образцы вставляются после каждого 5 образцов в экспериментальном наборе образцов в качестве меры предосторожности для мониторинга возможной переноса между наборами и обеспечения чистоты столбца. Случайная ошибка от неправильной инъекции образца может произойти при использовании автоматизированного инжектора образца для HPLC, и это может быть легко проверено путем сравнения объемов, оставшихся в пробных флаконах после инъекций или инспекции не связанных с КоАп пиков в выходная хроматограмма. Если значения CoA превышают линейный диапазон кривой калибровки для обнаружения флуоресценции, значения, скорее всего, будут в диапазоне для обнаружения ультрафиолетового абсорбции. В противном случае разбавление образца известным объемом воды может уменьшить сигнал, направляемый в линейном диапазоне, и расчеты должны учитывать любой фактор разбавления.

Уровни КоАП будут варьироваться между штаммами инбредных мышей с различным генетическим фоном, хотя значения воспроизводимы, когда биологические образцы получены из одного и того же штамма при одних и тех же условиях. Мы оценили КоАп в нескольких различных линий мыши в различных исследованиях10,12,16,17. КоА также измеряется в нескольких культивированных клеточных линиях16,17 с использованием первичных или увековеченных клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

MWF, CS и SJ написали документ, MWF и CS предоставили данные и цифры, COR разработалэксперименты и критически рассмотрел рукопись. SJ и COR являются изобретателями на ожидании патентной заявки (PCT/US17/39037) "Малые молекулы модуляторы пантотенат киназы", состоявшейся Санкт-Джуд Детский научно-исследовательский госпиталь, который охватывает ПЗ-2891 соединения, упомянутые в этой статье.

Acknowledgments

Авторы признают финансирование спонсируемых исследований, предоставляемых CoA Therapeutics, Inc., дочерней компанией BridgeBio LLC, Грантом Национальных институтов здравоохранения GM34496 и американскими ливанскими сирийскими благотворительными организациями.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column Millipore-Sigma 54127-U
coenzyme A Avanti Polar Lipids 870700
Gemini C18 3 μm 100 Å HPLC column Phenomenex 00F-4439-E0
monobromobimane ThermoFisher Scientific M-1378
Omni-Tip probe tissue disrupter Omni International 32750H
Parafilm Fisher S37440
PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer ThermoFisher Scientific NC0530997
Spin-X centrifuge tube filter CoStar 8161
Trizma-HCl Fisher T395-1
Waters 2475 fluorescence detector Waters 2475
Waters 2489 UV-Vis detector Waters 2489
Waters e2695 separations module Waters e2695

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abiko, Y. Metabolic Pathways. Greenburg, D. M. 7, Academic Press, Inc. Ch. 7 1-25 (1975).
  2. Leonardi, R., Zhang, Y. -M., Rock, C. O., Jackowski, S. Coenzyme A: Back in action. Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).
  3. Jackowski, S., Rock, C. O. Regulation of coenzyme A biosynthesis. Journal of Bacteriology. 148, 926-932 (1981).
  4. Robishaw, J. D., Berkich, D. A., Neely, J. R. Rate-limiting step and control of coenzyme A synthesis in cardiac muscle. Journal of Biological Chemistry. 257, 10967-10972 (1982).
  5. Di Meo, I., Carecchio, M., Tiranti, V. Inborn errors of coenzyme A metabolism and neurodegeneration. Journal of Inherited Metabolic Disease. 42, 49-56 (2019).
  6. Zhou, B., et al. A novel pantothenate kinase gene (PANK2) is defective in Hallervorden-Spatz syndrome. Nature Genetics. 28, 345-349 (2001).
  7. Dusi, S., et al. Exome sequence reveals mutations in CoA synthase as a cause of neurodegeneration with brain iron accumulation. American Journal of Human Genetics. 94, 11-22 (2014).
  8. Dansie, L. E., et al. Physiological roles of the pantothenate kinases. Biochemical Society Transactions. 42, 1033-1036 (2014).
  9. Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state. PLoS ONE. 5, 11107 (2015).
  10. Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance. Diabetologia. 57, 1466-1475 (2014).
  11. Israel, B. C., Smith, C. M. Effects of acute and chronic ethanol ingestion on pantothenate and CoA status of rats. The Journal of Nutrition. 117, 443-451 (1987).
  12. Garcia, M., Leonardi, R., Zhang, Y. M., Rehg, J. E., Jackowski, S. Germline deletion of pantothenate kinases 1 and 2 reveals the key roles for CoA in postnatal metabolism. PLoS One. 7, 40871 (2012).
  13. Corbin, D. R., et al. Excess coenzyme A reduces skeletal muscle performance and strength in mice overexpressing human PANK2. Molecular Genetics and Metabolism. 120, 350-362 (2017).
  14. Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver. Journal of Lipid Research. 60, 1005-1019 (2019).
  15. Shumar, S. A., et al. Induction of neuron-specific degradation of Coenzyme A models pantothenate kinase-associated neurodegeneration by reducing motor coordination in mice. PLoS ONE. 10, 0130013 (2015).
  16. Zano, S. P., Pate, C., Frank, M., Rock, C. O., Jackowski, S. Correction of a genetic deficiency in pantothenate kinase 1 using phosphopantothenate replacement therapy. Molecular Genetics and Metabolism. 16, 281-288 (2015).
  17. Sharma, L. K., et al. A therapeutic approach to pantothenate kinase associated neurodegeneration. Nature Communications. 9, 4399 (2018).
  18. Alvarez-Cordoba, M., et al. Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation. Molecular Neurobiology. 56, 3638-3656 (2019).
  19. Arber, C., et al. iPSC-derived neuronal models of PANK2-associated neurodegeneration reveal mitochondrial dysfunction contributing to early disease. PLoS One. 12, 0184104 (2017).
  20. Di Meo, I., et al. Acetyl-4'-phosphopantetheine is stable in serum and prevents phenotypes induced by pantothenate kinase deficiency. Scientific Reports. 7, 11260 (2017).
  21. Nishikawa, T., Edelstein, D., Brownlee, M. The missing link: a single unifying mechanism for diabetic complications. Kidney International Supplements. 77, 26-30 (2000).
  22. Tsuchiya, Y., Pham, U., Gout, I. Methods for measuring CoA and CoA derivatives in biological samples. Biochemical Society Transactions. 42, 1107-1111 (2014).
  23. Demoz, A., Netteland, B., Svardal, A., Mansoor, M. A., Berge, R. K. Separation and Detection of Tissue Coash and Long-Chain Acyl-Coa by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography after Precolumn Derivatization with Monobromobimane. Journal of Chromatography. 635, 251-256 (1993).
  24. Shimada, K., Mitamura, K. Derivatization of Thiol-Containing Compounds. Journal of Chromatography B. 659, 227-241 (1994).
  25. Minkler, P. E., Kerner, J., Ingalls, S. T., Hoppel, C. L. Novel isolation procedure for short-, medium-, and long-chain acyl-coenzyme A esters from tissue. Analytical Biochemistry. 376, 275-276 (2008).
  26. Newton, G. L., Fahey, R. C. Determination of biothiols by bromobimane labeling and high-performance liquid chromatography. Methods in Enzymology. 251, 148-166 (1995).
  27. Radkowsky, A. E., Kosower, E. M. Bimanes .17. (Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones (Halo-9,10-Dioxabimanes) - Reactivity toward the Tripeptide Thiol, Glutathione. Journal of the American Chemical Society. 108, 4527-4531 (1986).
  28. Zhang, Y. M., et al. Chemical knockout of pantothenate kinase reveals the metabolic and genetic program responsible for hepatic coenzyme A homeostasis. Chemistry & Biology. 14, 291-302 (2007).
  29. Tokutake, Y., Onizawa, N., Katoh, H. Toyoda A,Chohnan S. Coenzyme A and its thioester pools in fasted and fed rat tissues. Biochemical and Biophysical Research Communications. 402, 158-162 (2010).
  30. Shibata, K., Nakai, T., Fukuwatari, T. Simultaneous high-performance liquid chromatography determination of coenzyme A, dephospho-coenzyme A, and acetyl-coenzyme A in normal and pantothenic acid-deficient rats. Analytical Biochemistry. 430, 151-155 (2012).
  31. Chohnan, S., Takamura, Y. A simple micromethod for measurement of CoASH and its use in measuring the intracellular levles of CoASH and short chain acyl-CoAs in Escherichia coli K12 cells. Agricultural and Biological Chemistry. 55, 87-94 (1991).

Tags

Биохимия Выпуск 151 Коэнзим А культивированные клетки ткани животных монобромобиман хроматография жидкости высокого давления твердая фаза экстракции
Количественная оценка коэнзима А в клетках и тканях
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Frank, M. W., Subramanian, C., Rock, … More

Frank, M. W., Subramanian, C., Rock, C. O., Jackowski, S. Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues. J. Vis. Exp. (151), e60182, doi:10.3791/60182 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter