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Biochemistry

Cuantificación de la coenzima A en células y tejidos

Published: September 27, 2019 doi: 10.3791/60182
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Infectious Diseases, St. Jude Children's Research Hospital

Summary

Este método describe la preparación de muestras a partir de células cultivadas y tejidos animales, extracción y derivación de la coenzima A en las muestras, seguida de cromatografía líquida de alta presión para la purificación y cuantificación de la coenzima A derivada por detección de absorbancia o fluorescencia.

Abstract

Investigaciones emergentes han revelado que el suministro de coenzima celular A (CoA) puede llegar a ser limitante con un impacto perjudicial en el crecimiento, metabolismo y supervivencia. La medición del CoA celular es un desafío debido a su relativamente baja abundancia y la conversión dinámica de coa libre a tioestés de CoA que, a su vez, participan en numerosas reacciones metabólicas. Se describe un método que navega a través de posibles escollos durante la preparación de la muestra para producir un ensayo con una amplia gama lineal de detección que es adecuado para su uso en muchos laboratorios biomédicos.

Introduction

La coenzima A (CoA) es un cofactor esencial en todos los organismos vivos y se sintetiza a partir del ácido pantoténico, también llamado pantotenato (la sal de ácido pantoténico) o vitamina B5. El CoA es el principal portador intracelular de ácidos orgánicos, incluyendo ácidos de cadena corta como acetato y succinato, ácidos de cadena ramificada como propionato y metilmalnato, ácidos grasos de cadena larga como palmitato y oleato, ácidos grasos de cadena muy larga como ácidos grasos de cadena muy larga como ácidos grasos de cadena muy larga como ácidos grasos de cadena muy larga como ácidos grasos poliinsaturados, y xenobióticos como el ácido valproico. El ácido orgánico forma un enlace tioésico enzimáticamente con CoA para permitir su uso como sustrato en más de 100 reacciones en el metabolismo intermediario1. Los tióreros de CoA también son reguladores alostéricos y activadores transcripcionales. Ahora se aprecia2 que el suministro de CoA total celular está regulado3,4; por lo tanto, la disponibilidad de CoA puede ser limitante, y que las deficiencias de CoA pueden ser catastróficas, como lo ejemplifican los trastornos genéticos hereditarios que afectan la biosíntesis de CoA5. La pantotenato quinasa cataliza el primer paso de la biosíntesis de CoA (Figura 1) y la Neurodegeneración Asociada a Pantotenato Kinasa, llamada PKAN, es causada por mutaciones en el gen PANK2 6. La coA sintasa, codificada por el gen COASYN, cataliza los dos últimos pasos de la biosíntesis de CoA (Figura 1) y la Neurodegeneración Asociada a Proteína COASY, llamada CoPAN, es causada por una mutación en el gen COASYN 7. Tanto PKAN como CoPAN son enfermedades neurodegenerativas hereditarias asociadas con la acumulación de hierro en el cerebro y las deficiencias de CoA subyacentes a las patologías de la enfermedad.

Los niveles celulares de CoA total varían entre los tejidos8 y el CoA total puede aumentar o disminuir bajo una variedad de estados fisiológicos, patológicos y farmacológicos. El coA hepático aumenta durante el cambio de combustible de la alimentada al estado de ayuno9, y los niveles de CoA hepático son anormalmente altos en ratones obesos con deficiencia de leptina10. El coA hepático disminuye en respuesta a la ingestión crónica de etanol11. Los niveles de CoA cerebral en el modelo de ratón Nocaut Pank2 están deprimidos durante el período perinatal, pero más tarde en la etapa adulta el contenido de CoA del cerebro es equivalente a los niveles de tipo salvaje, lo que indica una respuesta de CoA adaptable durante el desarrollo12. La manipulación del contenido de coA tisular por transgénesis o métodos de administración de genes afecta a las funciones metabólicas y neuronales13,14,15. El desarrollo preclínico de posibles terapias para PKAN o CoPAN incluye mediciones de CoA celular o tisular como indicadores de eficacia16,17,18,19,20 . La evaluación de todas estas condiciones y sus consecuencias metabólicas o funcionales requiere un método cuantitativo para la medición del CoA total.

Un ensayo preciso y fiable para medir el CoA en muestras biológicas es un desafío técnico en muchos laboratorios. Desafortunadamente, no hay sondas disponibles para evaluar o cuantificar tioesters de CoA o CoA en células intactas, aunque los análogos de los tioesters coA naturales se han utilizado ampliamente como sondas mecanicistas en estudios de éster CoA utilizando enzimas21. La conversión de CoA, con una mitad libre de sulfhidilo (-SH), a un tioester de CoA (o viceversa) es rápida en las células o tejidos animales durante la transferencia a un ambiente diferente y durante la lisis celular. Numerosas acomodatinosas y tilatirasas ayl-CoA en células median las interconversiones dentro de la piscina de CoA, y enzimas adicionales que utilizan tióreros de CoA como sustratos permanecen activos en muestras biológicas hasta que son apagones por sustanciaquímica o física Significa. La descarga de grupos de acil de CoA a carnitina por acil-transferasas es un ejemplo dentro de la red de reacciones que pueden alterar la distribución del tioester CoA/CoA. Los trazadores radiactivos se pueden utilizar para medir las tasas de síntesis de CoA en las células. Los métodos actuales para medir los derivados de CoA y CoA en muestras biológicas se han revisado22 e incluyen ensayos espectrofotométricos enzimáticos acoplados, cromatografía líquida de alta presión y procedimientos basados en espectrometría de masas. Sin embargo, estos métodos a menudo se centran en especies moleculares de CoA particulares y son ciegos a la variación de la piscina total de CoA. Los ensayos enzimáticos acoplados generalmente requieren mayores cantidades de material de entrada debido a las sensibilidades de detección bajas y tienen un rango limitado de linealidad.

Nuestro laboratorio ha desarrollado un procedimiento fiable para la cuantificación del CoA total en células cultivadas y tejidos animales. La estrategia incluye hidrólisis de todos los tioesters de CoA para producir sólo CoA libre durante la preparación de la muestra, en lugar de hacer esfuerzos para mantener y analizar todo el espectro de especies de CoA. El procedimiento es una compilación de métodos individuales publicados para la preparación de muestras, derivación de CoA, purificación e identificación después de cromatografía líquida de alta presión (HPLC), y cuantificación del CoA derivatizado por absorbancia o detección de fluorescencia23,24,25. Las determinaciones de CoA obtenidas mediante este procedimiento han permitido nuestra comprensión de la regulación del CdA y el desarrollo de un enfoque terapéutico para el tratamiento de las deficiencias de CoA.

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Protocol

El procedimiento animal mencionado en este protocolo se realizó de acuerdo con los protocolos 323 y 556 y fue aprobado específicamente por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital de Investigación Infantil de St. Jude.

1. Preparación de soluciones

NOTA: Utilice agua ultrapura para todas las soluciones y cuando se indique en los procedimientos.

  1. Preparar 1 mM de hidróxido de potasio (KOH) en agua.
  2. Preparar 0,25 M KOH en agua.
  3. Preparar 1 M Trizma-HCl en agua y ajustar a pH 8.0.
  4. Preparar 100 mM monobromobimane (mBBr) en acetonitrilo (Grado Optima). Las soluciones de stock de mBBr son estables a -20 oC durante muchos meses, siempre que se mantengan en la oscuridad, ya que la exposición a la luz puede fotolizar el monobromobimane a26.
  5. Preparar Wash Buffer para la extracción de fase sólida (SPE) columna: 50% metanol (Grado Optima) + 2% ácido acético.
  6. Preparar el tampón de elución para la columna SPE: 95% etanol (grado HPLC) que contiene 50 mM de formato de amonio.

2. Preparación del estándar CoA-bimane

  1. Comprar un estándar de CoA de alta calidad de una fuente de buena reputación (por ejemplo, Avanti Polar Lipids, Inc.).
  2. Preparar una solución de stock de alta concentración de CoA en Tris de 20 mM, pH 8. La cantidad de CoA en el stock de alta concentración se determina o confirma mediante la absorbancia espectrofotométrica a 260 nm (a 16.800 M-1cm-1). Añadir 4 veces el exceso molar de mBBr; vórtice en alto durante 10 s. Por ejemplo, para 10 mM CoA en el buffer, agregue 40 mM mBBr. El mBBr se agrega en exceso para asegurarse de que todo el CoA se deriva.
  3. Incubar a temperatura ambiente durante 4 h en la oscuridad sin agitar para derivatizar el CoA con mBBr. mBBr reacciona con el grupo tiol del CoA, y depende del pH y la temperatura27. La adición del mBBr convierte el CoA en un CoA-bimane fluorescente soluble en agua (o absorbente ultravioleta) (CoA-bimane; Figura 2).
  4. Añadir ácido acético de 100 l y vórtice a alto durante 10 s para detener la reacción.
  5. Centrifugar a 2.000 x g durante 15 minutos para eliminar cualquier precipitante.
  6. Limpie el sobrenadante utilizando una columna SPE para eliminar el mBBr no reaccionado (descrito a continuación). La filtración y centrifugación del eluido no es necesaria después de la limpieza de la columna SPE (Sección 5.8).
  7. Recoger el eluido de la columna SPE que contiene el CoA-bimane en un tubo prepesado, seco bajo gas nitrógeno, pesar y construir una curva de calibración estándar con cantidades conocidas de CoA-bimane.
    1. Compruebe el estándar CoA-b para la pureza de HPLC (ver más abajo) con detección de absorbancia tanto en 260 o 260 (mitad de adenina) y 393 (moietidad de bimane) y coincidencia de ambos picos en el cromatograma.
    2. Confirme la cantidad del estándar De A.C. en el stock de alta concentración utilizando 260 nm (16.800 M-1cm-1).
  8. Registre el tiempo de retención de HPLC para la identificación de CoA-bimane en muestras experimentales utilizando el estándar CoA-bimane.
  9. Almacene alícuotas del stock de alta concentración del estándar CoA-bimane protegido de la luz y almacenado a -20 oC durante un máximo de 2 años. Evite la descongelación y la recongelación repetidas.

3. Extracción y derivación de CoA en células cultivadas

  1. Cosecha células adherentes en cultivo cuando se acercan a densidades de subconfluentes tardíos. Por ejemplo, las células humanas de HepG2/C3A se cultivan a una densidad de 6-8 x 106,o las células HEK 293T se cultivan a una densidad de 1,3 x 107 por plato de 100 mm.
    1. Utilice cultivos duplicados o triplicados de forma rutinaria para las determinaciones de CoA. Incubar platos de cultivo separados en paralelo con los cultivos celulares de muestra para determinar el número de células viable. Calcular la cantidad de CoA por 106-107 células después de la purificación de HPLC.
  2. Aspirar medio de cultivo fuera del plato. Lave rápidamente las células en el plato con solución salina tamponada con fosfato frío (PBS) para eliminar cualquier medio residual y aspirar el PBS fuera del plato. Lave rápidamente las celdas con agua helada para eliminar PBS residual y aspirar el agua del plato rápidamente. Evite molestar a las células adherentes al agregar el PBS o agua.
  3. Agregue 1 ml de agua helada al plato de cultivo. Raspar las células en el agua fría en el plato y transferir la suspensión celular a un tubo de ensayo de vidrio que contenga 400 ml de 0,25 M KOH y 1,5 ml de agua.
    1. Mezclar la suspensión vigorosamente por vórtice en alto durante 10 s. A continuación, cubra firmemente con película de parafina e incubar a 55 oC durante 1 h sin agitar en un baño de agua. El pH de la muestra debe ser de 12. El pH alto es importante para hidrolizar los tioesters de CoA y se puede ajustar con alícuotas adicionales de KOH si es necesario.
  4. Células cultivadas en la cosecha que crecen en suspensión por centrifugación a baja velocidad: 136 x g durante 6 min a 4oC. Lavar una vez con PBS helado, luego lavar brevemente de nuevo con agua fría, y finalmente resuspender en 2,5 ml de agua fría más 400 sL 0,25 M KOH. Mezclar vigorosamente e incubar a 55oC como se ha descrito anteriormente.
  5. Añadir 160 sl de Trizma-HCl de 1 M y 10 ml de 100 mM mBBr y mezclar por vórtice a alto durante 10 s. Esto lleva el pH a aproximadamente 8 para apoyar la reacción mBBr con CoA libre. Cubrir e incubar muestras a temperatura ambiente durante 2 h en la oscuridad para que el mBBr reaccione con el tiol de CoA.
  6. Añadir 100 s de ácido acético y mezclar por vórtice a alto durante 10 s para detener la reacción
  7. Centrífuga a 2.000 x g durante 15 min para eliminar los residuos celulares precipitados.
  8. Retire y guarde el sobrenadante en un tubo de ensayo de vidrio para la limpieza de la columna SPE que se describe a continuación.

4. Extracción y derivación de CoA en tejidos

  1. Diseccionar las piezas de tejido animal, de aproximadamente 0,5 cm de diámetro o más pequeñas, y borre brevemente (1-2 s) sobre papel absorbente y luego congele el flash en nitrógeno líquido y guárdelos a -80 oC hasta su procesamiento. El CdA en los tejidos se hidroliza o se convierte en un tioester si no se congela con flash. Este paso es importante para obtener el máximo rendimiento de CoA en los tejidos.
  2. Pesar las piezas de tejido congelado (5 – 60 mg) rápidamente antes de comenzar el análisis, y registrar el peso de cada muestra. Esta determinación del peso húmedo se utiliza para el cálculo del contenido de CoA después de la purificación HPLC. Evite el deshielo completo de las piezas de tejido.
  3. Añadir 2 ml de KOH de 1 mM a un tubo de ensayo de vidrio (por ejemplo, 13 mm x 100 mm desechable) destinado a la inserción de una sonda y la interrupción del tejido con un homogeneizador de rotor-estator. Mantenga el tubo en hielo hasta su uso. Esto se hace para asegurar que las muestras se homogeneizan a temperatura fría y coA no se destruye debido al calor generado durante la homogeneización.
  4. Transferir y homogeneizar el tejido (30 – 40 mg) en el tubo de ensayo de vidrio (que contiene frío 1 mM KOH) durante 30 s. Evite la descongelación completa del tejido.
  5. Añadir 500 sL de 0,25 M KOH; vórtice en alto durante 10 s y mantener en hielo hasta que todas las muestras se homogeneizan. Esto traerá el pH de la muestra por encima de 12 para hidrolizar los tioesters coA para producir CoA total (coA libre + tioestes de CoA hidrolizados).
  6. Incubar muestras a 55oC durante 2 h en un baño de agua sin agitar para apoyar la hidrólisis.
  7. Añadir 150 sl de Trizma-HCl de 1 M y 10 ml de 100 mBBr; vórtice en alto durante 10 segundos. Esto lleva el pH a aproximadamente 8 para apoyar la reacción mBBr con CoA libre.
  8. Incubar muestras a temperatura ambiente durante 2 h en la oscuridad para asegurarse de que todo el CoA se deriva con mBBr.
  9. Añadir 100 l de ácido acético y vórtice a alto durante 10 s para detener la reacción.
  10. Centrífuga a 2.000 x g durante 15 minutos a pellet sólaje de residuos celulares precipitados.
  11. Retire y guarde el sobrenadante en un tubo de ensayo de vidrio para la limpieza de la columna SPE (que se describe a continuación).

5. Limpieza de muestras con columna de extracción de fase sólida (SPE)

  1. A temperatura ambiente, equilibre cada columna desechable de gel de sílice 2-(2-piritilo)-etil (tamaño 1 ml) con 1 ml de búfer de lavado para asegurarse de que el grupo funcional de piridil es protentón y funcionará como un intercambiador de aniones. 2-(2-piridyl)-etil silica gel es un intercambiador de aniones débil que es ideal para CoA-bimane a un pH básico. 2-(2-piridyl)-gel de sílice etílica tiene un pKa de 6 y la elución se realiza pH 7.
  2. Agregue el supernadante de muestra (paso 4.11) para columnar y recoger eluido.
  3. Lave la columna dos veces con 1 ml de wash buffer para eliminar cualquier especie no retenida.
  4. Lavar la columna una vez con 1 ml de agua.
  5. Lave la columna dos veces con 1 ml de tampón de elución en un tubo de ensayo de vidrio separado (12 mm x 75 mm) para recoger el CoA-bimane.
  6. Muestra seca de CoA-bimane en tubo bajo gas nitrógeno hasta sequedad. La muestra seca es estable a temperatura ambiente hasta su uso posterior. Selle y cubra completamente el tubo y la tienda.
  7. Cuando esté listo para el análisis de HPLC, resuspenda la muestra en 300 ml de agua y mezcle vigorosamente por vórtice a altas durante 10 s.
  8. Transfiera la muestra resuspendida a un filtro de tubo de centrífuga (acetato de celulosa de 0,22 m, tamaño de 2 ml) y centrífuga a 5.000 x g durante 10 minutos para eliminar cualquier precipitante.
  9. Transfiera la muestra filtrada a un vial de vidrio adecuado para la inyección de HPLC.

6. Purificación y medición hPLC de CoA-bimane

  1. Prepare los buffers. Buffer A: 50 mM KH2PO4, pH 4.6; Buffer B: Acetonitrilo (Grado Optima).
  2. Encienda el sistema HPLC.
    NOTA: El sistema HPLC de nuestro laboratorio es un módulo de separaciones Waters e2695 equipado con un detector de absorbancia 2489 Ultraviolet-Visible (UV-Vis) y un detector de fluorescencia 2475 controlado con el software Empower 3. El sistema también tiene un inyector de muestra automatizado.
  3. Inyectar cada muestra (p. ej., 20 l) para la separación en una columna DeGén C18, 3 m 100, 4,6 mm x 150 mm utilizando el programa de la Tabla 1 con un caudal de 0,5 ml/min. La temperatura de la columna es de 25 oC. Mida la absorbancia del detector UV/Visible a 393 nm, y la detección de fluorescentes en la palabra "ex" a 393 nm, a 470 nm. El tiempo de retención se determina ejecutando una curva estándar CoA-bimane antes de cada conjunto de muestras.
  4. Registre el área bajo el pico CoA-bimane para cada muestra y compare con la curva estándar para calcular el pmol de CoA-bimane inyectado en la columna HPLC. La curva estándar de absorción de CoA-bimane se utiliza para muestras de tejido, y la curva estándar de fluorescencia CoA-bimane se utiliza para muestras de cultivo de tejido.
  5. Como los valores de CoA-bimane representan el CoA total para cada muestra, normalizar el número de células viables para muestras de cultivo, o mg de peso húmedo para muestras de tejido(Figura 6). Alternativamente, calcule los valores totales de CoA después de la normalización al contenido de ADN o proteína para cada muestra. El contenido de ADN o proteínas se puede determinar por separado utilizando alícuotas de muestra que se eliminan durante la preparación de la muestra antes de la adición de KOH.

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Representative Results

Se ha desarrollado un método relativamente rápido y fiable para la detección de CoA total en células y tejidos cultivados mediante la derivación del tiol de CoA a un agente fluorescente utilizando mBBr, y luego purificando el CoA-bimane derivatizado utilizando HPLC de fase inversa. Primero se genera una curva estándar, donde se inyectan individualmente cantidades conocidas y crecientes del estándar CoA-bimane y las áreas bajo los picos de los cromatogramas CoA-bimane se trazan en función de la entrada CoA-bimane(Figura 4). CoA-bimane tiene un máximo de absorbancia a 393 nM y un perfil representativo de HPLC muestra el tiempo de retención del estándar CoA-bimane en una columna HPLC C18(Figura 3) utilizando el programa de elución de la Tabla 1. Las curvas estándar representativas de CoA-bimane, detectadas por unidades de absorbancia o fluorescencia, se muestran en la Figura 4A y la Figura 4B,respectivamente. La curva estándar de la Figura 4A refleja la magnitud de la absorbancia de CoA-bimane a 393 nm y la Figura 4B representa la fluorescencia de CoA-bimane (a ex a 393 nm y a 470 nm) trazada frente a la cantidad de entrada de CoA-bimane. El estándar CoA-bimane se puede detectar de 0,01 a 12.000 pmol y cubre un rango de 106veces cuando se combina la detección mediante absorbancia y fluorescencia. Mientras que el límite inferior de detección de la norma es 0.01 pmol, el límite inferior de la cuantificación de CoA-bimane en muestras experimentales es 0.2 pmol que es aproximadamente 5 veces mayor que la fluorescencia basal o de fondo en el cromatograma. La elección de la detección por absorbancia o fluorescencia de CoA-bimane depende de la cantidad de CoA normalmente presente en tejidos o células, junto con la practicidad de trabajar con tamaños de muestra más grandes o más pequeños. La absorción es generalmente útil para muestras de tejido porque el manejo de 40-50 mg de material de partida produce una mejor recuperación que las muestras de tejido de 5 mg, mientras que la fluorescencia es generalmente útil para muestras de células cultivadas que son más pequeñas en tamaño y hay mayor confianza en la interpolación de valores en el extremo inferior de la curva estándar de fluorescencia. Los laboratorios con detección de absorbancia pueden considerar aumentar o disminuir el tamaño de la muestra inicial, aumentar el volumen de inyección de HPLC o disminuir el volumen para la resuspensión de la muestra (Sección 5.9 anterior) para mediciones en células cultivadas.

Las condiciones para hidrolizar acil-CoAs a partir de tejidos y células cultivadas se optimizaron ajustando la concentración de KOH, y el tiempo y la temperatura de la incubación posterior (datos no mostrados). Se encontró que el estado óptimo era de 0,25 M a 55 oC durante 2 horas. El grupo tiol de CoA libre más cualquier CoA liberado de tioesters fue derivado por reacción con mBBr tras el ajuste del pH. La separación posterior de HPLC y los perfiles de detección típicos para el hígado de ratón o las células C3A cultivadas humanas se indican en la Figura 5 como picos rojos, con un tiempo de retención entre 11 y 12 minutos utilizando el programa de elución descrito en la Tabla 1. Las cantidades típicas de material de partida biológico son 30-40 mg de hígado murino (peso húmedo), 6-8 x 106 células para células C3A humanas "similares al hígado", o 1,3 x 107 células para células HEK293T humanas. Las células C3A fueron tratadas con un fármaco experimental PanK PZ-2891 a 10 uM que eleva CoA17 (Figura 6). Las mediciones de CoA en células HEK293T cuando las isoformas PanK están sobreexpresadas muestran mediciones de CoA en un amplio rango (431-6925 pmoles/L)(Figura 6). Los tamaños de muestra necesarios para esta metodología son prácticos para su aplicación en muchos contextos experimentales.

El área bajo el pico CoA-bimane se calculó utilizando el software proporcionado con el HPLC. Los límites máximos pueden ser determinados automáticamente por el software HPLC a la espera de un ajuste adecuado de los valores de entrada para la corrección de línea de base y la definición de picos, pero nuestro laboratorio prefiere designar manualmente el pico CoA-bimane en cada cromatograma, particularmente para muestras biológicas desconocidas.

Tiempo (min) Caudal (ml/min) % A % B Curva
0 0.5 90 10 0
2 0.5 90 10 6
6 0.5 85 15 6
18 0.5 60 40 6
23 0.5 60 40 6
25 0.5 90 10 6
30 0.5 90 10 66

Tabla 1: Programa HPLC para la Separación CoA-bimane. Buffer A: 50 mM KH2PO4, pH 4.6; Buffer B: Acetonitrilo. La mezcla de Buffer A y Buffer B sigue la Curva 6 que es un gradiente lineal, con una Curva 8 que interviene que es un degradado cóncavo medio.

Figure 1
Figura 1. Vía de biosíntesis de coenzima A. Pantothenate quinase (PanK) cataliza la fosforilación del pantotenato (vitamina B5)a 4o-fosfopantotenato en el primer paso de la biosíntesis de CoA. La formación de fosfopantotenato es seguida por condensación con cisteína catalizada por 4o-fosfopantothenoylcisteína sintasa y luego descarboxilación para formar 4o-fosfoferanteteína por 4o-fosfopanthenoylcylysteine decarboxilasa. 4o-Fosfosanttheina se convierte en coenzima A (CoA) en un proceso de dos pasos catalizado por CoA Synthase. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. mBBr Reaction con CoA. Monobromobimane (mBBr) se mezcla con CoA-SH (CoA libre) e incuba a temperatura ambiente durante 2 horas en la oscuridad. MBBr no fluorescente se vuelve fluorescente cuando se une a CoA para formar CoA-bimane. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Absorba HPLC Trace del estándar CoA-bimane. CoA-bimane se separó en una columna Gemini C18 utilizando el programa HPLC en la Tabla 1. El tiempo de retención típico (min) se indica mediante unidades de aburrición (AU). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Curvas estándar CoA-bimane detectadas por absorbancia o fluorescencia. (A) La curva estándar medida utilizando unidades de detección de absorbancia para CoA-bimane se midió a 393 nm. Las muestras de tejido generalmente se evalúan utilizando la curva estándar de absorbancia. (B) La curva estándar medida utilizando unidades de detección de fluorescencia para CoA-bimane a la palabra "ex" a 393 nm, a 470 nm. Las células cultivadas generalmente se evalúan para el contenido de CoA utilizando la curva estándar de fluorescencia. Los estándares duplicados (y las muestras) se evalúan rutinariamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Rastros hPLC de muestras típicas de hígado o células cultivadas. (A) Identificación y cuantificación de coA-bimane de contenido en extracto de hígado de ratón. Se indican las unidades de absorción (AU). (B) Identificación y cuantificación de contenidos en células cultivadas en HepG2/C3A. Se indican las unidades de emisión de fluorescencia (UE). Los picos de CoA-bimane se muestran en rojo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6. Niveles de CoA en hígado de ratón, células C3A cultivadas y células HEK293T. (A) Medición de CoA en hígado de ratón a partir de nocaut quinasa pantotenato (Pank1-/-) y animales de tipo salvaje (WT) emparejados. Los animales Pank1-/- tienen un CoA más bajo en el hígado en comparación con los animales WT debido a la ausencia de expresión Pank1 9. Los datos se obtuvieron utilizando 5 ratones machos por genotipo y se representan como la media de los niveles de CoA de SEM. (B) en células Dec2/C3A tratadas con dimetilsulfóxido (control de vehículos) o PZ-2891, un fármaco experimental que modula la actividad de PanK a 10 uM 17. El nivel de CoA celular es elevado después de la incubación de 24 horas con PZ-2891. (C) niveles de CoA en células HEK293T transtróficadas con vector escinestés vacío pcDNA3.1, o cDNAs que codifican isoformas PANK humanas: PANK1, PANK2m, que es la isoforma madura y procesada de PANK2 humano, o PANK3. Los niveles de CoA se elevan por sobreexpresión de todas las isoformas PANK activas. Los datos de (B) y (C) proceden de muestras de triplicado independientes y se representan como la media de SEM. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba t no emparejada y los valores de significancia se muestran en rojo. Los datos de los paneles (B) y (C) están adaptados de Sharma et al. 12Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Aquí demostramos un procedimiento fiable, paso a paso para cuantificar el CoA total en células y tejidos animales con una amplia gama de detección lineal que es accesible en muchos laboratorios que tienen un HPLC con un detector de salida de absorbancia o fluorescencia. Alternativamente, la espectrometría de masas es una técnica común para evaluar los tioesters de CoA y CoA, pero no está ampliamente disponible debido al costo de la instrumentación y los conocimientos especializados necesarios para el desarrollo de la metodología y la interpretación de datos. El CoA etiquetado isotópicamente que es adecuado para su uso como estándar interno para la cuantificación de CoA libre en espectrometría de masas no está disponible comercialmente, y el CoA libre no es detectado por el instrumento con la misma sensibilidad que los tioesters de CoA como acetil-CoA. Por lo tanto, los niveles de CoA libres a menudo son muy subestimados por espectrometría de masas a menos que los datos de salida se comparen con una curva de calibración estándar de CoA.

Comparamos el método descrito aquí con un método diferente utilizado anteriormente en nuestro laboratorio y encontramos una mayor recuperación de CoA del hígado del ratón, 123,4 x 7,9 pmol/mg de peso húmedo, con este método actual en comparación con el peso húmedo de 80 pmol/mg utilizando un ensayo enzimático que CoA libre derivatizado con una etiqueta radiactiva28. El método para medir el CoA total que se describe aquí es considerablemente menos engorroso, más rápido y más fácil de controlar en comparación con el método utilizado anteriormente en nuestro laboratorio28. Anteriormente, el CoA se determinó tras la extracción de hexano del lisato celular y se sometió a una conversión enzimática a radiactiva [14C]lauryl-CoA mediada por la Escherichia coli acyl-CoA synthetase (FadD). Los acilados de cadena corta solubles en ácido y los acilo-CoA de cadena larga insolubles en ácido en el lisado celular fueron hidrolizados con KOH para producir CoA libre y luego sometidos a extracción de hexano antes de la conversión enzimática a CoA29libre. Aunque este procedimiento anterior tenía buena especificidad y sensibilidad, en la práctica la tarea requería 2 días hábiles para completarse y la sintetas acilo-coA recombinante tenía que ser preparada, purificada y medida para la actividad específica enzimática antes del análisis del CdA. También requería instrumentación capaz de detectar y cuantificar isótopos radiactivos, que es mucho menos común en laboratorios biomédicos en la historia más reciente. El método actual como se describe aquí es más adecuado para nuestro interés de investigación en pantotenato quinasa (PanK). PanK controla el flujo a través de la vía biosintética de CoA y por lo tanto el nivel total de CoA es la lectura para la actividad de PanK en muestras biológicas.

El enfriamiento de las reacciones metabólicas en una muestra biológica para mantener una verdadera cantidad de CoA requiere cuidado y rapidez y es crítico para este procedimiento. La rápida deproteinización con un disolvente ácido o orgánico, o la congelación flash de muestras son dos métodos que se han utilizado en los últimos30,31. En el método actual, el agua ultrapura helada se añade rápidamente a las células lavadas con PBS heladas de los cultivos, y las células adherentes más el agua se raspan del plato de cultivo antes de transferirlo a KOH. La congelación de la suspensión celular cultivada en [KOH + agua] para su almacenamiento a -80 oC antes de la preparación de la muestra es un punto de parada aceptable. Sin embargo, los valores de CoA de las muestras de células congeladas deben compararse con los de las muestras recién preparadas para determinar si hay una pérdida sustancial de la señal de CoA. La pérdida de 10% de CoA se ha producido en nuestras manos después de la congelación de la muestra celular y puede estar relacionada con el tiempo prolongado de la muestra en el KOH que necesita ser controlado. Las piezas de tejido animal se congelan rápidamente en una pequeña lámina 'raft' flotando en LN2 inmediatamente después de la escisión del tejido de un animal eutanasiado. Los tamaños de las muestras de 5 mg a 60 mg de tejido congelado son adecuados para este método con rendimientos lineales de CoA. Una vez congeladas, las muestras de tejido almacenadas a -80 oC son estables durante al menos 3 meses, siempre que no se produzca un deshielo intermitente.

La preparación de la muestra antes del análisis hPLC no es de alto rendimiento y requiere un medio día de trabajo completo. Se recomienda que el operador maneje un máximo de 30 muestras a la vez, comenzando con la homogeneización de un conjunto de 15 muestras seguida de la homogeneización del segundo conjunto de 15 muestras durante la incubación de 2 horas con KOH para el primer conjunto. El período de incubación de KOH se optimizó primero utilizando tioesters de CoA comprados con tiempos de incubación que van de 30 min a 4 h, y luego la incubación de 2 h fue elegida para acomodar el tiempo para la hidrólisis completa de tioester coA en una variedad de muestras de tejido, que van desde el músculo esquelético hasta el hígado8. La incubación para la derivación de CoA con mBBr se establece en 2 h a aproximadamente pH 8 y se añade un exceso de 20 veces de mBBr para convertir completamente el CoA en las muestras biológicas. Las mitades de Sulhydryl de proteínas y metabolitos distintos de CoA como la carnitina o el glutatión en la muestra serán derivatizadas además de CoA, y el exceso de 20 veces se calculó sobre la base de la cantidad esperada de hígado de CoA total que tiene el nivel más alto entre los tejidos. El pH se reduce antes de la incubación con mBBr porque los bromobimanes en general son menos reactivos hacia otros nucleófilos como aminas y carboxilatos en soluciones acuosas más neutrales. El tiempo de derivación no debe exceder de 2 h para evitar o disminuir la reacción con proteínas tioles26. Es necesario utilizar tampones no nucleófilos para reducir y mantener el pH porque la presencia de aniones tampón a altas concentraciones puede interferir con la derivación de mBBr de CoA.

La limpieza de muestras en la columna SPE se realiza manualmente en nuestro laboratorio y se puede realizar con la ayuda de un colector de vacío para acortar el tiempo necesario para este paso. Una buena recuperación del CoA derivatizado de la columna SPE es rutinariamente alcanzable y esto se determinó por separado utilizando tioesters radioactivos [13C]CoA que también se conservan en la columna SPE. La recuperación de [13C]acetil-CoA fue del 97,6% y la recuperación de [13C] palmitoyl-CoA fue del 96,1%. La evaporación del eluido de columna SPE se realiza generalmente bajo gas nitrógeno durante la noche en nuestro laboratorio como una cuestión de conveniencia, pero el secado se puede completar dentro de las 4 horas bajo gas nitrógeno o utilizando un concentrador de velocidad. Los pasos más críticos en el método están relacionados con el ajuste del pH y se pueden comprobar con tiras de papel de pH a lo largo del camino. Para la hidrólisis KOH, el pH debe ser de 12 euros para lograr la liberación completa del tioester del CoA. El pH debe ser de 7,8 – 8,5 para apoyar la reactividad de la derivación de mBBr, y una vez completada la derivación, el pH debe ajustarse para que se vuelva muy ácido, alrededor del pH 1-2, para que el CoA-bimane se una a la columna SPE. La columna SPE limpia la muestra para eliminar el exceso de mBBr sin reaccionar y algunas sustancias biológicas no relacionadas.

El programa HPLC está diseñado para que el lavado y el reequilibrio de la columna C18 sean suficientes para eliminar las señales de fondo y de arrastre entre las muestras. Las muestras en blanco de agua se insertan después de cada 5 muestras en el conjunto de muestras experimentales como precaución para supervisar un posible traspaso entre conjuntos y para garantizar la limpieza de las columnas. Se puede producir un error ocasional por inyección de muestra inadecuada cuando se utiliza un inyector de muestra automatizado para el HPLC, y esto se puede comprobar fácilmente comparando los volúmenes restantes en los viales de muestra después de la inyección o inspección de los picos no relacionados con el CoA en el cromatograma de salida. Si los valores de CoA superan el rango lineal de la curva de calibración para la detección de fluorescencia, lo más probable es que los valores estén en rango para la detección de absorbancia ultravioleta. Si no es así, la dilución de la muestra con un volumen conocido de agua puede reducir la señal para estar en el rango lineal y los cálculos deben tener en cuenta cualquier factor de dilución.

Los niveles de CoA variarán entre cepas de ratón endogámicas con diferentes orígenes genéticos, aunque los valores son reproducibles cuando se obtienen muestras biológicas de la misma cepa en las mismas condiciones. Hemos estimado El CoA en varias líneas de ratón diferentes en varios estudios10,12,16,17. El CoA también se midió en varias líneas celulares cultivadas16,17 usando células primarias o inmortalizadas.

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Disclosures

MWF, CS y SJ escribieron el documento, MWF y CS proporcionaron los datos y las cifras, COR diseñó los experimentos y revisó críticamente el manuscrito. SJ y COR son inventores de una solicitud de patente pendiente (PCT/US17/39037) "Pequeños moduladores de moléculas de quinasas pantotenatos" en poder del Hospital de Investigación Infantil DeS.

Acknowledgments

Los autores reconocen la financiación para la investigación patrocinada proporcionada por CoA Therapeutics, Inc., una subsidiaria de BridgeBio LLC, la subvención de los Institutos Nacionales de Salud GM34496, y las Organizaciones Benéficas Asociadas Sirias Libanesas Estadounidenses.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column Millipore-Sigma 54127-U
coenzyme A Avanti Polar Lipids 870700
Gemini C18 3 μm 100 Å HPLC column Phenomenex 00F-4439-E0
monobromobimane ThermoFisher Scientific M-1378
Omni-Tip probe tissue disrupter Omni International 32750H
Parafilm Fisher S37440
PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer ThermoFisher Scientific NC0530997
Spin-X centrifuge tube filter CoStar 8161
Trizma-HCl Fisher T395-1
Waters 2475 fluorescence detector Waters 2475
Waters 2489 UV-Vis detector Waters 2489
Waters e2695 separations module Waters e2695

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References

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Bioquímica Número 151 Coenzima A células cultivadas tejidos animales monobromobimane cromatografía líquida de alta presión extracción de fase sólida
Cuantificación de la coenzima A en células y tejidos
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Frank, M. W., Subramanian, C., Rock, C. O., Jackowski, S. Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues. J. Vis. Exp. (151), e60182, doi:10.3791/60182 (2019).

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