Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Hücre ve Dokularda Koenzim A'nın Sayısallaştırılması

Published: September 27, 2019 doi: 10.3791/60182
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Infectious Diseases, St. Jude Children's Research Hospital

Summary

Bu yöntem, kültürhücreleri ve hayvan dokularından örnek hazırlanmasını, örneklerde koenzim A'nın çıkarılması nı ve türebenizasyonunu, türevleştirilmiş koenzim A'nın saflaştırılması ve nicelleştirilmesi için yüksek basınçlı sıvı kromatografisi absorbans veya floresan algılama.

Abstract

Ortaya çıkan araştırmalar hücresel koenzim A (CoA) kaynağı büyüme, metabolizma ve sağkalım üzerinde zararlı bir etkisi ile sınırlayıcı hale gelebileceğini ortaya koymuştur. Hücresel CoA ölçümü nispeten düşük bolluk ve coa thioesters için ücretsiz CoA dinamik dönüşüm nedeniyle bir meydan okuma, sırayla, çok sayıda metabolik reaksiyonlar katılmak. Bir yöntem, numune hazırlama sırasında birçok biyomedikal laboratuvarda kullanıma uygun geniş bir doğrusal algılama aralığıile bir test verim potansiyel tuzaklar arasında gezinir açıklanmıştır.

Introduction

Koenzim A (CoA) tüm canlıorganizmalarda önemli bir kofaktördür ve pantotenik asitten sentezlenir, pantotenat (pantotenik asit tuzu) veya B5 vitamini olarak da adlandırılır. CoA organik asitlerin büyük hücre içi taşıyıcısıdır, asetat ve sinkinat gibi kısa zincirli asitler, propiyonat ve metimalonat gibi dal zincirli asitler, palmitat ve oleat gibi uzun zincirli yağ asitleri, çok uzun zincirli yağ asitleri gibi çoklu doymamış yağ asitleri, ve valproik asit gibi kkneobiyotikler. Organik asit, ara metabolizma1'de 100'den fazla reaksiyonda substrat olarak kullanılmasını sağlamak için CoAile enzimatik olarak bir tiyoester bağlantısı oluşturur. CoA tiyoesterler de allosterik düzenleyiciler ve transkripsiyonel aktivatörler vardır. Şimdi takdir2 hücresel toplam CoA kaynağı düzenlenir3,4; böylece, CoA kullanılabilirliği sınırlayıcı olabilir, ve CoA eksiklikleri felaket olabilir, CoA biyosentezi etkileyen kalıtsal genetik bozukluklar tarafından örneklenen5. Pantotenat kinazi CoA biyosentezinin ilk adımını katalizler (Şekil 1) ve Pantotenat Kiaz İlişkili Nörodejenerasyon, PKAN denilen, PANK2 genmutasyonları neden 6 . COA synthase, COASYN geni tarafından kodlanmış, CoA biyosentezinde son iki adımı katalizler(Şekil 1) ve COASY Protein İlişkili Nörodejenerasyon, CoPAN olarak adlandırılan, COASYN genmutasyonuna neden olur7. Hem PKAN hem de CoPAN beyinde demir birikimi ve CoA eksiklikleri ile ilişkili kalıtsal nörodejeneratif hastalıklardır.

Total CoA hücresel düzeyleri dokular arasında değişir8 ve toplam CoA fizyolojik, patolojik ve farmakolojik durumların çeşitli altında artırabilir veya azalabilir. Karaciğer CoA açlık durumuna beslenen yakıt geçiş sırasında artar9, ve karaciğer CoA düzeyleri leptin eksikliği obez farelera anormal derecedeyüksek10. Karaciğer CoA kronik etanol alımına yanıt olarak azalır11. Pank2 nakavt fare modelinde Beyin CoA düzeyleri perinatal dönemde depresif, ancak daha sonra yetişkin aşamasında beyin CoA içeriği vahşi tip düzeyleri eşdeğerdir, geliştirme sırasında adaptif CoA yanıtı gösteren12. Transgenez veya gen iletim yöntemleri ile doku CoA içeriğinin manipülasyonu metabolik ve sinirsel fonksiyonları etkiler13,14,15. PKAN veya CoPAN için potansiyel tedavilerin preklinik gelişimi etkinlik göstergesi olarak hücre veya doku CoA ölçümleri içerir16,17,18,19,20 . Tüm bu durumların ve bunların metabolik veya fonksiyonel sonuçlarının değerlendirilmesi, toplam CoA'nın ölçümü için nicel bir yöntem gerektirir.

Biyolojik numunelerde CoA'nın ölçülmesi için doğru ve güvenilir bir tahlil birçok laboratuvarda teknik bir sorundur. Doğal CoA tiyoesterlerinin analogları enzimleri kullanan CoA esteri çalışmalarında mekanistik problar olarak yaygın olarak kullanılmış olsa da, ne yazık ki, bozulmamış hücrelerde CoA veya CoA tiyoesterlerini değerlendirmek veya ölçmek için kullanılabilir problar bulunmamaktadır21. CoA dönüşüm, serbest sulfhydryl ile (-SH) moiety, bir CoA tiyoester (veya tersi) farklı bir ortama transfer sırasında hücre veya hayvan dokularında hızlı ve hücre lisis sırasında. Hücrelerdeki çok sayıda ayl-CoA sentezi ve acyl-CoA tiyostazları CoA havuzundaki dönüşümlere aracılık eder ve substratlar biyolojik numunelerde kimyasal veya fiziksel olarak söndürülene kadar aktif kalırlar. Anlamına gelir. Acil-transferazlar ile CoA'dan karnitin'e kadar olan asil gruplarının off-loading'i, CoA/CoA tiyoester dağılımını değiştirebilecek reaksiyonlar ağı içinde bir örnektir. Radyoaktif izleyiciler hücrelerde CoA sentezoranlarını ölçmek için kullanılabilir. Biyolojik numunelerde CoA ve CoA türevlerinin ölçülmesi için kullanılan mevcut yöntemler22 gözden geçirilmiştir ve birleştirilmiş enzimatik spektrofotometrik tahliller, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresi tabanlı prosedürleri içermektedir. Ancak, bu yöntemler genellikle belirli CoA moleküler türler üzerinde duruldu ve toplam CoA havuzu varyasyon için kör. Birleştirilmiş enzimatik tahliller genellikle düşük algılama hassasiyetleri nedeniyle daha büyük miktarlarda giriş malzemesi gerektirir ve doğrusallık sınırlı bir aralığına sahiptir.

Laboratuvarımız kültürlü hücrelerde ve hayvan dokularında toplam CoA'nın sayısallaştırılması için güvenilir bir prosedür geliştirmiştir. Strateji, coa türlerinin tüm spektrumu korumak ve analiz etmek için çaba sarf etmek yerine, numune hazırlama sırasında sadece serbest CoA verim için tüm CoA tiyoesterlerin hidroliziçerir. Prosedür, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) sonrasında numune hazırlama, CoA türevileştirme, saflaştırma ve tanımlama için bireysel olarak yayınlanan yöntemlerin bir derlemesidir ve türemiş CoA'nın absorbasyon veya floresan algılama23,24,25. Bu prosedür kullanılarak elde edilen CoA tayini, CoA regülasyonu ve CoA eksikliklerinin tedavisi için terapötik bir yaklaşım geliştirilmesini anlamamızı sağlamıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu protokolde belirtilen hayvan prosedürü 323 ve 556 sayılı protokollere göre gerçekleştirilmiştir ve Özellikle St. Jude Çocuk Araştırma Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Çözümlerin hazırlanması

NOT: Tüm çözeltiler için ve prosedürlerde belirtildiği zaman ultra saf su kullanın.

  1. Suda 1 mM potasyum hidroksit (KOH) hazırlayın.
  2. Suda 0,25 M KOH hazırlayın.
  3. Suda 1 M Trizma-HCl hazırlayın ve pH 8.0'a ayarlayın.
  4. Asetonitril (Optima Grade) içinde 100 mM monobromobimane (mBBr) hazırlayın. mBBr'nin stok çözümleri -20 °C'de aylarca sabittir, ışığa maruz kalmanın monobromobimane'yi bimane26'yafotolik olarak sunması koşuluyla aylarca.
  5. Katı faz ekstraksiyonu (SPE) kolonu için Yıkama Tamponu hazırlayın: %50 metanol (Optima Grade) + %2 asetik asit.
  6. SPE sütun için Elüsyon Tamponhazırlayın: 50 mM amonyum formatı içeren% 95 etanol (HPLC Grade).

2. CoA-bimane standardının hazırlanması

  1. Saygın bir kaynaktan (örneğin, Avanti Polar Lipidler, Inc.) yüksek kaliteli bir CoA standardı satın alın.
  2. 20 mM Tris, pH 8'de CoA'nın yüksek konsantrasyonda stok çözeltisi hazırlayın. Yüksek konsantrasyondaki CoA miktarı λ260 nm'de spektrofotometrik absorbans ile belirlenir veya doğrulanır (16.800 M-10cm-1). mBBr 4 kat molar fazla ekleyin; 10 s için yüksek girdap. Örneğin, arabellekteki 10 mM CoA için 40 mM mBBr ekleyin. MBBr, tüm CoA'nın türevleştirilmiş olmasını sağlamak için fazla eklenir.
  3. MBBr ile CoA türevleştirmek için sallayarak olmadan karanlıkta 4 saat oda sıcaklığında kuluçka. mBBr CoA thiol grubu ile reaksiyona girer ve pH ve ısıya bağlı27. mBBr eklenmesi bir suda çözünen floresan CoA dönüştürür (veya ultraviyole emici) CoA-bimane (CoA-bimane; Şekil 2).
  4. Reaksiyonu durdurmak için 100°L asetik asit ve girdap ekleyin.
  5. Herhangi bir çökelti kaldırmak için 15 dakika boyunca 2.000 x g santrifüj.
  6. Tepkimeye alamayan mBBr'yi kaldırmak için bir SPE sütunu kullanarak supernatant'ı temizleyin (aşağıda açıklanmıştır). SPE kolon temizliğinden sonra eluate filtrasyon ve santrifüj gerekli değildir (Bölüm 5.8).
  7. Önceden tartılmış bir tüpte CoA-bimaniçeren SPE sütunundan eluate toplayın, azot gazı altında kurulayın, bilinen miktarlarda CoA-bimane ile standart bir kalibrasyon eğrisi tartılayın ve inşa edin.
    1. Hem λ260 (adennine moiety) hem de λ393 (bimane moiety) ve kromatogramda her iki tepede de emici lik tespiti ile HPLC ile saflık için CoA-bimane standardını kontrol edin (aşağıya bakın).
    2. Yüksek konsantrasyonlu stoktaki CoA-biman standardının miktarını λ260 nm (16.800 M-100cm-1)kullanarak doğrulayın.
  8. CoA-bimane standardını kullanarak deneysel numunelerde CoA-bimane'nin tanımlanması için HPLC saklama süresini kaydedin.
  9. CoA-bimane standardının yüksek konsantrasyonlu stokunun aliquot'larını ışıktan koruyun ve -20 °C'de 2 yıla kadar saklayın. Tekrar tekrar çözülme ve yeniden donma kaçının.

3. Kültürlü hücrelerde CoA'nın çıkarılması ve türevi

  1. Geç subconfluent yoğunlukları yaklaşırken kültürde toplama yapışık hücreleri. Örneğin, insan HepG2/C3A hücreleri 6-8 x 106yoğunluğuna kadar yetiştirilir veya HEK 293T hücreleri 100 mm çanak başına ~1,3 x 107 yoğunluğuna yetiştirilir.
    1. CoA belirlemeleri için düzenli olarak yinelenen veya üç kat kültürleri kullanın. Canlı hücre sayısını belirlemek için örnek hücre kültürlerine paralel olarak ayrı kültür yemeklerini kuluçkaya yatırın. HPLC saflaştırma sonra 106-107 hücreleri başına CoA miktarını hesaplayın.
  2. Çanak kapalı aspire kültür ortamı. Herhangi bir artık orta kaldırmak ve çanak kapalı PBS aspire buz gibi fosfat tamponlu salin (PBS) ile çanak hücreleri hızlı bir şekilde yıkayın. Kalıntı PBS'yi temizlemek ve bulaşıktaki suyu hızlı bir şekilde aspire etmek için hücreleri buz gibi suyla hızlı bir şekilde yıkayın. PBS veya su eklerken yapışık hücreleri rahatsız etmekten kaçının.
  3. Kültür yemeğine 1 mL buz gibi su ekleyin. Hücreleri çanaktaki soğuk suya kazıyın ve hücre süspansiyonuna 400 μL 0,25 M KOH ve 1,5 mL su içeren bir cam test tüpüne aktarın.
    1. Süspansiyonu 10 s'lik yüksek bir girdap ile şiddetle karıştırın. Daha sonra parafin filmi ile sıkıca kaplayın ve 55 °C'de su banyosunda titremeden 1 saat kuluçkaya yatırın. Numunenin pH'ı ≥ 12 olmalıdır. Yüksek pH CoA tiyoesterleri hidrolize etmek için önemlidir ve gerekirse KOH ek aliquots ile ayarlanabilir.
  4. Düşük hızda santrifüj ile süspansiyon da büyüyen kültürlü hücreleri hasat: 4 °C'de 6 dakika için 136 x g. Buz gibi PBS ile bir kez yıkayın, sonra soğuk su ile tekrar yıkayın ve son olarak 2,5 mL soğuk su artı 400 μL 0,25 M KOH'da tekrar yıkayın. Yukarıda açıklandığı gibi 55 °C'de şiddetle karıştırın ve kuluçkaya yatırın.
  5. 160 μL 1 M Trizma-HCl ve 10 00 mM mBBr 10 000 mBBr ekleyin ve 10 s yüksek girdap ile karıştırın. Bu da pH'ı serbest CoA ile mBBr reaksiyonu için yaklaşık 8'e çıkarır. MBBr'nin CoA'nın tiolile reaksiyona girip tepki göstermesi için karanlıkta 2 saat oda sıcaklığında kapak ve kuluçka numuneleri.
  6. Reaksiyonu durdurmak için 100°L asetik asit ekleyin ve 10 s yüksekgirtile karıştırın
  7. Çökelmiş hücre enkazkaldırmak için 15 dakika için 2.000 x g santrifüj.
  8. Aşağıda açıklanan SPE sütun temizliği için cam test tüpündeki supernatant'ı çıkarın ve kaydedin.

4. Dokularda CoA çıkarılması ve türevi

  1. Hayvan dokusu parçalarını, yaklaşık 0,5 cm veya daha küçük parçalar, ve leke kısa bir süre (1-2 s) emici kağıt üzerinde ve sonra sıvı azot içinde flaş dondurma ve işleme kadar -80 °C'de saklayın. Dokularda CoA hidrolize veya dondurulmuş flaş değilse bir tiyoester dönüştürülür. Bu adım dokularda CoA maksimum verim elde etmek için önemlidir.
  2. Analize başlamadan önce dondurulmuş doku parçalarını (5 – 60 mg) hızlı bir şekilde tartın ve her numuneiçin ağırlığı kaydedin. Bu ıslak ağırlık tayini, HPLC saflaştırmasını takiben CoA içeriğinin hesaplanmasında kullanılır. Doku parçalarının tamamen çözülmesinden kaçının.
  3. Bir rotor-stator homogenizer ile bir prob ve doku bozulması takılması için mukadder bir cam test tüpü (örneğin, 13 mm x 100 mm tek kullanımlık) 2 mL 1 mM KOH ekleyin. Tüpü kullanıma kadar buzda tutun. Bu, numunelerin soğuk sıcaklıkta homojenleştirilmesini ve homojenizasyon sırasında oluşan ısı nedeniyle CoA'nın yok olmamasını sağlamak için yapılır.
  4. 30 s. 30 s. Doku ların tamamen erimesini önlemek için cam test tüpünde (soğuk 1 mM KOH içeren) doku transferi ve homojenize.
  5. 0,25 M KOH 500 μL ekleyin; 10 s için yüksek girdap ve tüm örnekler homojenize olana kadar buz üzerinde tutun. Bu toplam CoA (serbest CoA + hidrolize CoA tia thioesters) verim CoA tiyoesters hidrolize 12 yukarıdaki numunenin pH getirecektir.
  6. Hidrolizi desteklemek için sallayarak bir su banyosunda 2 saat için 55 °C'de kuluçka numuneleri.
  7. 150 μL 1 M Trizma-HCl ve 10 00 mM mBBr ekleyin; 10 saniye boyunca yüksek girdap. Bu da pH'ı ücretsiz CoA ile mBBr reaksiyonuna destek olarak yaklaşık 8'e çıkarır.
  8. Tüm CoA'nın mBBr ile türetilmesini sağlamak için karanlıkta 2 saat oda sıcaklığında kuluçka numuneleri.
  9. Reaksiyonu durdurmak için 100°L asetik asit ve girdap ekleyin.
  10. 15 dk için 2.000 x g santrifüj çökelmiş hücre enkaz pelet.
  11. SPE sütun temizliği için cam test tüpündeki supernatant'ı çıkarın ve kaydedin (aşağıda açıklanmıştır).

5. Katı faz ekstraksiyonu (SPE) sütunu ile numune temizleme

  1. Oda sıcaklığında, piriyl fonksiyonel grubun protonated olduğundan ve bir aniyon değiştirici olarak işlev görmek için 1 mL Yıkama Tamponu ile her tek kullanımlık 2-(2-piriridyl)-etil silika jel kolon (1 mL boyutu) dengeleyin. 2-(2-piril)-etil silika jel temel pH CoA-bimaniçin ideal zayıf bir aniyon değiştirici. 2-(2-piriridil)-etil silika jel pKa 6 ve elüsyon pH ≥ 7 yapılır.
  2. Sütun ve eluate toplamak için örnek supernatant (adım 4.11) ekleyin.
  3. Herhangi bir istinatsız türü temizlemek için sütunu 1 mL Yıkama Tamponu ile iki kez yıkayın.
  4. 1 mL su ile kolon bir kez yıkayın.
  5. CoA-bimane'i toplamak için ayrı bir cam test tüpüne (12 mm x 75 mm) 1 mL Elütion Tampon uyla iki kez kolonu yıkayın.
  6. Kuru CoA-bimane numunesi tüpte azot gazı altında kuruluk için. Kurutulmuş numune daha fazla kullanıma kadar oda sıcaklığında stabildir. Mühür ve tamamen tüp ve mağaza kapağı.
  7. HPLC analizi için hazır olduğunuzda, 300 μL suda numuneyi yeniden askıya alın ve 10 s'lik yüksek girdap ile şiddetle karıştırın.
  8. Herhangi bir çökelti çıkarmak için bir santrifüj tüp filtresi (0,22 μm selüloz asetat, 2 mL boyutu) ve santrifüj 5.000 x g 10 dk için resuspended örnek aktarın.
  9. Filtrelenmiş numuneyi HPLC enjeksiyonuna uygun bir cam şişeye aktarın.

6. HPLC arıtma ve CoA-bimane ölçümü

  1. Arabellekleri hazırlayın. Tampon A: 50 mM KH2PO4, pH 4.6; Tampon B: Asetonitril (Optima Grade).
  2. HPLC sistemini güçle.
    NOT: Laboratuvarımızdaki HPLC sistemi, 2489 Ultraviyole Görünür (UV-Vis) emici dedektörü ve Empower 3 yazılımı ile kontrol edilen 2475 floresan dedektörü ile donatılmış bir Waters e2695 Ayırma Modülüdür. Sistemde ayrıca otomatik numune enjektörü de vardır.
  3. Tablo 1'deki programı kullanarak her numuneyi (örneğin, 20 μL) Bir İkizler C18, 3 μm 100 Å, 4,6 mm x 150 mm kolonüzerinde 0,5 mL/dk akış hızıyla enjekte edin. Sütun sıcaklığı 25 °C'dir. Λ393 nm'de UV/Görünür dedektör emiciliğini ve λex = 393 nm, λem = 470 nm'de floresan algılamayı ölçün. Bekletme süresi, her örnek kümesinden önce bir CoA-bimane standart eğrisi çalıştırılarak belirlenir.
  4. Her örnek için CoA-bimane tepe noktasının altındaki alanı kaydedin ve HPLC sütununa enjekte edilen CoA-bimane pmolünü hesaplamak için standart eğriyle karşılaştırın. Doku örnekleri için CoA-bimane absorbans standart eğrisi, doku kültürü örnekleri için CoA-bimane floresan standart eğrisi kullanılır.
  5. CoA-biman değerleri her örnek için toplam CoA'yı temsil ettikçe, kültür örnekleri için canlı hücre sayısına veya doku örnekleri için mg ıslak ağırlığına normalleşin(Şekil 6). Alternatif olarak, her örnek için DNA veya protein içeriğinormalleştirme sonrasında toplam CoA değerlerini hesaplayın. DNA veya protein içeriği, KOH ilavesi öncesinde numune hazırlama sırasında çıkarılan numune aliquotları kullanılarak ayrı ayrı belirlenebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kültürlü hücre ve dokularda toplam CoA tespiti için nispeten hızlı ve güvenilir bir yöntem mBBr kullanarak bir floresan ajan CoA tiyol türevi ve daha sonra ters faz HPLC kullanarak türev coa-biman arındırıcı tarafından geliştirilmiştir. CoA-bimane standardının bilinen ve artan miktarlarının tek tek enjekte edildiği ve CoA-bimane kromatogramlarında zirvelerin altındaki alanların CoA-bimane girişinin bir fonksiyonu olarak çizildiği standart bir eğri ilk olarak oluşturulur (Şekil 4). CoA-bimane λ393 nM'de maksimum bir absorbans süresine sahiptir ve temsili bir HPLC profili, Tablo 1'dekielüsyon programını kullanarak C18 HPLC sütununda(Şekil 3)CoA-bimane standardının bekletme süresini gösterir. Absorbans veya floresan birimlerinin ölçülmesiyle tespit edilen CoA-bimane'nin temsili standart eğrileri sırasıyla Şekil 4A ve Şekil 4B'degösterilmiştir. Şekil 4 A'daki standart eğri, λ393 nm'deki CoA-bimane absorbansının büyüklüğünü yansıtır ve Şekil 4B, CoA-bimane'nin floresanını (λex = 393 nm ve λem = 470 nm) CoA-bimane. CoA-bimane standardı 0.01 ile 12.000 pmol arasında saptanabilir ve hem emicilik hem de floresan kullanılarak tespit edildiğinde 106kat aralığı nı kapsar. Standardın tespit alt sınırı 0.01 pmol iken, deneysel numunelerde CoA-bimane nicelliğin alt sınırı 0,2 pmol olup, bu da kromatogramdaki taban çizgisi veya arka plan floresanından yaklaşık 5 kat daha büyüktür. CoA-bimane emicilik veya floresan tarafından algılama seçimi normalde doku veya hücrelerde mevcut CoA miktarına bağlıdır, birlikte daha büyük veya daha küçük örnek boyutları ile çalışma pratikliği ile. Başlangıç materyalinin 40-50 mg'ının kullanılması 5 mg doku örneğinden daha iyi iyileşme sağlarken, floresans genellikle boyutu daha küçük olan ve daha büyük olan kültürlü hücre örnekleri için genellikle yararlıdır. floresan standart eğrisinin alt ucundaki değerlerin enterpolasyonuna güven. Sadece emici lik tespiti ne kadar algılandırılsa da, başlangıç numune boyutunu artırmayı veya azaltmayı, HPLC enjeksiyon hacmini artırmayı veya kültürlü hücrelerdeki ölçümler için numune geri süspansiyonu (Yukarıdaki Bölüm 5.9) hacmini azaltmayı düşünebilirler.

Dokulardan ve kültürlü hücrelerden ayl-COA'ların hidrolize edilmesi için koşullar KOH konsantrasyonu ve sonraki kuluçka zamanı ve sıcaklığı (veriler gösterilmedi) ayarlayarak optimize edilmiştir. Optimum durum 2 saat boyunca 55 °C'de 0.25 M olarak bulundu. Serbest CoA'nın thiol grubu artı tiyoesterlerden kurtarılan herhangi bir CoA, pH'nın ayarını takiben mBBr ile reaksiyon akıtılarak türetilmiştir. Sonraki HPLC ayırma ve fare karaciğeri veya insan kültürlü C3A hücreleri için tipik algılama profilleri Şekil 5'te kırmızı zirveler olarak gösterilir ve Tablo 1'deaçıklanan elüsyon programı kullanılarak 11 ile 12 dakika arasında bir bekletme süresi ile gösterilir. Biyolojik başlangıç materyalinin tipik miktarları 30-40 murine karaciğer mg (ıslak ağırlık), insan için 6-8 x 106 hücre "karaciğer gibi" C3A hücreleri, ya da ~ 1.3 x 107 insan HEK293T hücreleri için hücrelerdir. C3A hücreleri 10 uM'de PanK deneysel ilaç PZ-2891 ile tedavi edildi ve bu da CoA17'yi yükseltir(Şekil 6). PanK isoformları aşırı ifade edildiğinde HEK293T hücrelerindeki CoA ölçümleri geniş bir aralıkta CoA ölçümlerini göstermektedir (431-6925 pmols/μL)(Şekil 6). Bu metodoloji için gerekli örneklem boyutları birçok deneysel bağlamın uygulanması için pratiktir.

CoA-bimane zirvesinin altındaki alan HPLC ile sağlanan yazılım kullanılarak hesaplanmıştır. Tepe limitleri, temel düzeltme ve pik tanımı için giriş değerlerinin uygun şekilde ayarlananıncaya kadar HPLC yazılımı tarafından otomatik olarak belirlenebilir, ancak laboratuvarımız her renktogramında CoA-bimane tepe noktasını el ile belirlemeyi tercih eder, özellikle yabancı biyolojik numuneler için.

Süre (dk) Akış Hızı (mL/dk) % A % B Eğri
0 0.5 90 10 0
2 0.5 90 10 6
6 0.5 85 15 6
18 0.5 60 40 6
23 0.5 60 40 6
25 0.5 90 10 6
30 0.5 90 10 66

Tablo 1: CoA-bimane Ayırma için HPLC Programı. Tampon A: 50 mM KH2PO4, pH 4.6; Tampon B: Asetonitril. Arabellek A ve Arabellek B'nin karıştırılması, orta içbükey bir degrade olan bir ara eğri 8 ile doğrusal bir degrade olan Eğri 6'yı izler.

Figure 1
Şekil 1. Koenzim Bir biyosentez yolu. Pantotenat kizaz (PanK) CoA biyosentezinin ilk adımında pantotenat (B5vitamini) ile 4′-fosfopantotenat fosforilasyon katalizler. Fosfopantotheat oluşumu 4′-fosfopantothenoylsistein synthase tarafından katalize sistein ile yoğuşma takip ve daha sonra dekarboksilasyon oluşturmak için 4′-fosfopantetheine tarafından 4′-fosfopanthenoylsisteine dekarboksilaz. 4′-Fosfopantetein CoA Synthase tarafından katalize iki aşamalı bir süreç içinde Koenzim A (CoA) dönüştürülür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2. coa ile mBBr Reaksiyon. Monobromobimane (mBBr) CoA-SH (serbest CoA) ile karıştırılır ve karanlıkta 2 saat oda sıcaklığında kuluçkaya yatırılır. Floresan olmayan mBBr, CoA-bimane oluşturmak için CoA'ya bağlandığında floresan olur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Emme HPLC Koa-bimane Standart İzi. CoA-bimane Tablo 1'dekiHPLC programı kullanılarak İkizler C18 sütununda ayrılmıştır. Tipik bekletme süresi (min) iptal birimleri (AU) ile gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Emme veya floresan tarafından algılanan CoA-bimane standart eğrileri. (A) CoA-bimane için emici algılama üniteleri kullanılarak ölçülen standart eğri λ393 nm olarak ölçüldü. Doku örnekleri genellikle absorbans standart eğrisi kullanılarak değerlendirilir. (B) Λex = 393 nm, λem = 470 nm'de CoA-bimane floresan algılama üniteleri kullanılarak ölçülen standart eğri. Kültürlü hücreler genellikle floresan standart eğrisi kullanılarak CoA içeriği için değerlendirilir. Yinelenen standartlar (ve örnekler) rutin olarak değerlendirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Tipik karaciğer veya kültürlü hücre örneklerinin HPLC izleri. (A) Fare karaciğer ekstresinde coa-bimane tanımlama ve içeriğin niceliği. Emici birimler (AU) belirtilir. (B) HepG2/C3A kültürlü hücrelerde coa-bimane tanımlama ve içeriğin niceliği. Floresan emisyon birimleri (AB) belirtilmiştir. CoA-bimane zirveleri kırmızı ile gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6. Fare karaciğeri, kültürlü C3A ve HEK293T hücrelerinde CoA düzeyleri. (A) Pantotenat kinaz nakavt fare karaciğerinde CoA ölçümü (Pank1-/-) ve eşleşen yabani tip (WT) hayvanlar. Pank1-/- hayvanlar pank1 ifade9yokluğunda nt hayvanlara göre karaciğerde daha düşük CoA var . Veriler genotip başına 5 erkek fare kullanılarak elde edilmiştir ve 10 uM'de PanK aktivitesini modüle eden deneysel bir ilaç olan HepG2/C3A hücrelerinde ortalama ± SEM. (B) CoA düzeyleri olarak ifade edilir. 17. PZ-2891 ile 24 saatlik kuluçka sonrasında hücresel CoA düzeyi yükselir. (C) HEK293T hücrelerinde CoA düzeyleri ya boş vektör pcDNA3.1, ya da insan PANK izoformları kodlama cDNA'lar ile transfected: PANK1β, PANK2m olan olgun, işlenmiş insan PANK2 veya PANK3. CoA düzeyleri tüm aktif PANK isoformlarının aşırı ekspresyonu ile yükselir. (B) ve (C)'deki veriler bağımsız üçlaç örneklerinden elde edilir ve ortalama ± SEM olarak temsil edilir. İstatistiksel analiz eşleşmemiş t-testi kullanılarak yapıldı ve anlamlılık değerleri kırmızı ile gösterilmiştir. Panellerde yer alan veriler (B) ve (C) Sharma ve ark. 12Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, bir emicilik veya floresan çıkış dedektörü ile bir HPLC'ye sahip birçok laboratuvarda erişilebilen çok çeşitli doğrusal algılama ile hücre ve hayvan dokularında toplam CoA'nın ölçülmesi için güvenilir, adım adım bir prosedür gösteriyoruz. Alternatif olarak, kütle spektrometresi CoA ve CoA tiyoesterlerinin değerlendirilmesinde yaygın bir tekniktir, ancak enstrümantasyon maliyeti ve metodoloji ve verilerin yorumlanması için gerekli özel bilgi nedeniyle yaygın olarak mevcut değildir. Kütle spektrometresinde serbest CoA'nın ölçülmesi için dahili bir standart olarak kullanıma uygun izotopik olarak etiketlenmiş CoA ticari olarak mevcut değildir ve serbest CoA asetil-CoA gibi CoA tiyoesterleri ile aynı hassasiyete sahip alet tarafından tespit edilmez. Bu nedenle, çıktı verileri CoA standart kalibrasyon eğrisi ile karşılaştırıldığında sürece serbest CoA düzeyleri genellikle kütle spektrometresi tarafından büyük ölçüde hafife alınır.

Burada açıklanan yöntemi daha önce laboratuarımızda kullanılan farklı bir yöntemle karşılaştırdık ve fare karaciğerinden daha fazla CoA geri kazanımı, 123.4 ± 7.9 pmol/mg ıslak ağırlık, bu akım yöntemi ile ~80 pmol/mg ıslak ağırlık ile karşılaştırıldığında enzimatik bir test radyoaktif bir etiket28ile serbest CoA türevi . Burada açıklanan toplam CoA ölçme yöntemi çok daha az hantal, daha hızlı ve daha önce bizim laboratuvar28kullanılan yönteme göre kontrol etmek daha kolaydır. Daha önce, CoA hücre lisatının heksan ekstraksiyonu sonrasında belirlendi ve enzimatik dönüşüme maruz kaldı [14C]lauryl-CoA Escherichia coli acyl-CoA synthetase (FadD) aracılığında. Asit çözünür kısa zincirli asil-COAs ve hücre lizatas çözünmez uzun zincirli acyl-CoAs serbest CoA verim koh ile hidrolize edildi ve daha sonra serbest CoA enzimaya dönüştürme önce hekzane ekstraksiyon tabi29. Bu önceki işlem iyi özgüllük ve duyarlılık olmasına rağmen, uygulamada görevin tamamlanması için 2 iş günü gerekli ve rekombinant E. coli acyl-CoA synthetase hazırlanması, saflaştırılması ve enzimatik özel aktivite için ölçülmesi gerekiyordu CoA analizinden önce. Ayrıca, yakın tarihte biyomedikal laboratuvarlarda çok daha az yaygın olan radyoaktif izotopları tespit etme ve ölçme yeteneğine sahip aletlere ihtiyaç dilmiştir. Burada açıklandığı gibi mevcut yöntem pantotenat kinizel (PanK) bizim araştırma ilgi için en uygundur. PanK, CoA biyosentetik yolu üzerinden akısı kontrol eder ve böylece toplam CoA düzeyi biyolojik numunelerde PanK aktivitesi için okunur.

CoA gerçek bir miktar korumak için biyolojik bir örnek metabolik reaksiyonların quenching bakım ve hız gerektirir ve bu işlem için çok önemlidir. Bir asit veya organik çözücü ile hızlı deproteinizasyon, ya da örneklerin flaş dondurma son30,31kullanılan iki yöntemdir. Mevcut yöntemde, buz gibi ultrasaf su hızla kültürlerden buz gibi PBS yıkanmış hücrelere eklenir ve yapışık hücreler artı su sonra KOH aktarılmadan önce kültür çanak kazınmış. Numune hazırlama dan önce -80 °C'de depolama için [KOH + su] içinde kültürlü hücre süspansiyonunun dondurulması kabul edilebilir bir durdurma noktasıdır. Ancak, dondurulmuş hücre örneklerinden elde edilen CoA değerleri, CoA sinyalinin önemli ölçüde kaybolup olmadığını belirlemek için taze hazırlanmış numunelerle karşılaştırılmalıdır. Hücre numunesinin dondurulmasını takiben elimizde ≤ %10 CoA kaybı meydana gelmiştir ve kontrol edilmesi gereken KOH'daki numunenin uzun süre ile ilgili olabilir. Hayvan doku parçaları hızla bir ötenazi hayvan doku eksizyonu hemen ardından LN2 üzerinde yüzen küçük bir folyo 'sal' üzerinde dondurulur. 5 mg'dan 60 mg'a kadar olan numune boyutları lineer CoA verimleri ile bu yöntem için uygundur. Dondurulduktan sonra -80 °C'de saklanan doku örnekleri aralıklı çözülme olmaması koşuluyla en az 3 ay stabil dir.

HPLC analizi öncesinde ki numune hazırlama yüksek iş gücü değildir ve yarım gün boyunca tam bir çalışma gerektirir. İşleticinin, 15 numuneden oluşan bir setin homojenizasyonundan başlayarak, ilk set için KOH ile 2 saat kuluçka sırasında 15 numuneden oluşan ikinci setin homojenleştirilmesiyle başlayan en fazla 30 numuneyi tek seferde işlemesi önerilir. KOH kuluçka dönemi ilk olarak 30 dakika ile 4 saat arasında değişen kuluçka süreleri ile satın alınan CoA tiyoesterleri kullanılarak optimize edildi ve daha sonra 2 saat kuluçka doku örnekleri çeşitli tam CoA tiyoester hidroliz için zaman karşılamak için seçildi, değişen iskelet kasından karaciğer8'ekadar. mBBr ile CoA türevasyonu için kuluçka yaklaşık pH 8'de 2 saat olarak ayarlanır ve biyolojik numunelerde CoA'yı tamamen dönüştürmek için 20 kat fazla mBBr eklenir. Örnekteki karnitin veya glutatyon gibi CoA dışındaki protein ve metabolitlerin sulhydryl moieties CoA ek olarak türemiş olacak, ve 20 kat fazlalık en yüksek düzeyde toplam CoA karaciğer beklenen miktar temelinde hesaplanmıştır dokular arasında. Genel olarak bromobimanes daha nötr sulu çözeltilerde amin ler ve karboksiller gibi diğer nükleofillere karşı daha az reaktif olduğundan, mBBr ile kuluçkadan önce pH azalır. Türevleştirme süresi 26 protein tiyolleri ile reaksiyonu önlemek veyaazaltmak için 2 saat geçmemelidir. Yüksek konsantrasyonlarda tampon anyon varlığı CoA mBBr türevi ile engelleyebilir, çünkü pH azaltmak ve korumak için nonnükleofilik tamponlar kullanmak gerekir.

SPE kolondaki numune temizliği laboratuarımızda elle yapılır ve bu adım için gereken süreyi kısaltmak için vakum manifoldu yardımı ile yapılabilir. SPE sütunundan türemiş CoA'nın iyi bir şekilde geri kazanımı rutin olarak elde edilebilir ve bu da SPE sütununda tutulan radyoaktif [13C] CoA tiyoesterleri kullanılarak ayrı ayrı tespit edilmiştir. [13C]asetil-CoA'nın iyileşmesi %97.6,[13C] palmitoyl-CoA'nın iyileşmesi %96.1 idi. SPE-kolon eluate buharlaşma genellikle kolaylık açısından laboratuarımızda bir gecede azot gazı altında gerçekleştirilir, ancak kurutma azot gazı altında 4 saat içinde veya bir speedvac konsantratörü kullanılarak tamamlanabilir. Yöntemdeki en kritik adımlar pH ayarı ile ilgilidir ve yol boyunca pH kağıt şeritleri ile kontrol edilebilir. KOH hidroliziçin, pH ' ın KoA' dan tiyoesterin tam salınımını elde etmek için ≥ 12 olması gerekir. MBBr türevizasyonunun reaktivitesini desteklemek için pH'Nın 7.8 - 8.5 olması gerekir ve türevleştirme tamamlandıktan sonra, CoA-bimane'nin SPE sütununa bağlanması için pH 1-2 hakkında çok asidik olacak şekilde ayarlanmalıdır. SPE sütunu aşırı tepkisiz mBBr ve bazı ilgisiz biyolojik maddeleri ortadan kaldırmak için numuneyi temizler.

HPLC programı, C18 sütununun yıkanması ve yeniden dengelenmesinin, numuneler arasındaki arka plan ve taşıma sinyallerini ortadan kaldırmak için yeterli olacak şekilde tasarlanmıştır. Su boş numuneler, setler arasındaki olası taşımayı izlemek ve kolon temizliğini sağlamak için önlem olarak deneysel numune setindeki her 5 örnekten sonra eklenir. HPLC için otomatik bir numune enjektörü kullanılarak yanlış numune enjeksiyonundan kaynaklanan zaman zaman bir hata oluşabilir ve bu durum, coa ile ilgili olmayan zirvelerin enjeksiyonu veya denetiminden sonra numune şişelerinde kalan hacimler karşılaştırılarak kolayca kontrol edilebilir. çıkış kromatogramı. CoA değerleri floresan algılama için kalibrasyon eğrisinin doğrusal aralığını aşarsa, değerler büyük olasılıkla ultraviyole emici algılama için aralıkta olacaktır. Aksi takdirde, numunenin bilinen bir su hacmi ile seyreltilmesi, doğrusal aralıkta olması için sinyalazaltabilir ve hesaplamalar dikkate herhangi bir seyreltme faktörü almalıdır.

Aynı koşullar altında aynı zorlanmadan biyolojik numuneler elde edildiğinde değerler tekrarlanabilir olsa da, coa düzeyleri farklı genetik geçmişe sahip inbred fare suşları arasında değişir. Biz çeşitli çalışmalarda birkaç farklı fare hatları CoA tahmin var10,12,16,17. CoA da çeşitli kültürlü hücre hatları ölçüldü16,17 ya birincil veya ölümsüzleştirilmiş hücreler kullanılarak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

MWF, CS ve SJ kağıt yazdı, MWF ve CS veri ve rakamlar sağlanan, COR deneyler tasarlanmış ve eleştirel el yazması gözden geçirdi. SJ ve COR bekleyen bir patent başvurusu (PCT/ US17/39037) "Pantotenat kinazların küçük molekül modülatörleri" PZ-2891 bileşik bu makalede başvurulan kapsayan St Jude Çocuk Araştırma Hastanesi tarafından düzenlenen mucitler vardır.

Acknowledgments

Yazarlar CoA Therapeutics, Inc, BridgeBio LLC, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe GM34496 ve Amerikan Lübnan Suriye Associated Charities bir yan kuruluşu tarafından sağlanan sponsorlu araştırma için finansman kabul.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column Millipore-Sigma 54127-U
coenzyme A Avanti Polar Lipids 870700
Gemini C18 3 μm 100 Å HPLC column Phenomenex 00F-4439-E0
monobromobimane ThermoFisher Scientific M-1378
Omni-Tip probe tissue disrupter Omni International 32750H
Parafilm Fisher S37440
PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer ThermoFisher Scientific NC0530997
Spin-X centrifuge tube filter CoStar 8161
Trizma-HCl Fisher T395-1
Waters 2475 fluorescence detector Waters 2475
Waters 2489 UV-Vis detector Waters 2489
Waters e2695 separations module Waters e2695

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abiko, Y. Metabolic Pathways. Greenburg, D. M. 7, Academic Press, Inc. Ch. 7 1-25 (1975).
  2. Leonardi, R., Zhang, Y. -M., Rock, C. O., Jackowski, S. Coenzyme A: Back in action. Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).
  3. Jackowski, S., Rock, C. O. Regulation of coenzyme A biosynthesis. Journal of Bacteriology. 148, 926-932 (1981).
  4. Robishaw, J. D., Berkich, D. A., Neely, J. R. Rate-limiting step and control of coenzyme A synthesis in cardiac muscle. Journal of Biological Chemistry. 257, 10967-10972 (1982).
  5. Di Meo, I., Carecchio, M., Tiranti, V. Inborn errors of coenzyme A metabolism and neurodegeneration. Journal of Inherited Metabolic Disease. 42, 49-56 (2019).
  6. Zhou, B., et al. A novel pantothenate kinase gene (PANK2) is defective in Hallervorden-Spatz syndrome. Nature Genetics. 28, 345-349 (2001).
  7. Dusi, S., et al. Exome sequence reveals mutations in CoA synthase as a cause of neurodegeneration with brain iron accumulation. American Journal of Human Genetics. 94, 11-22 (2014).
  8. Dansie, L. E., et al. Physiological roles of the pantothenate kinases. Biochemical Society Transactions. 42, 1033-1036 (2014).
  9. Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state. PLoS ONE. 5, 11107 (2015).
  10. Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance. Diabetologia. 57, 1466-1475 (2014).
  11. Israel, B. C., Smith, C. M. Effects of acute and chronic ethanol ingestion on pantothenate and CoA status of rats. The Journal of Nutrition. 117, 443-451 (1987).
  12. Garcia, M., Leonardi, R., Zhang, Y. M., Rehg, J. E., Jackowski, S. Germline deletion of pantothenate kinases 1 and 2 reveals the key roles for CoA in postnatal metabolism. PLoS One. 7, 40871 (2012).
  13. Corbin, D. R., et al. Excess coenzyme A reduces skeletal muscle performance and strength in mice overexpressing human PANK2. Molecular Genetics and Metabolism. 120, 350-362 (2017).
  14. Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver. Journal of Lipid Research. 60, 1005-1019 (2019).
  15. Shumar, S. A., et al. Induction of neuron-specific degradation of Coenzyme A models pantothenate kinase-associated neurodegeneration by reducing motor coordination in mice. PLoS ONE. 10, 0130013 (2015).
  16. Zano, S. P., Pate, C., Frank, M., Rock, C. O., Jackowski, S. Correction of a genetic deficiency in pantothenate kinase 1 using phosphopantothenate replacement therapy. Molecular Genetics and Metabolism. 16, 281-288 (2015).
  17. Sharma, L. K., et al. A therapeutic approach to pantothenate kinase associated neurodegeneration. Nature Communications. 9, 4399 (2018).
  18. Alvarez-Cordoba, M., et al. Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation. Molecular Neurobiology. 56, 3638-3656 (2019).
  19. Arber, C., et al. iPSC-derived neuronal models of PANK2-associated neurodegeneration reveal mitochondrial dysfunction contributing to early disease. PLoS One. 12, 0184104 (2017).
  20. Di Meo, I., et al. Acetyl-4'-phosphopantetheine is stable in serum and prevents phenotypes induced by pantothenate kinase deficiency. Scientific Reports. 7, 11260 (2017).
  21. Nishikawa, T., Edelstein, D., Brownlee, M. The missing link: a single unifying mechanism for diabetic complications. Kidney International Supplements. 77, 26-30 (2000).
  22. Tsuchiya, Y., Pham, U., Gout, I. Methods for measuring CoA and CoA derivatives in biological samples. Biochemical Society Transactions. 42, 1107-1111 (2014).
  23. Demoz, A., Netteland, B., Svardal, A., Mansoor, M. A., Berge, R. K. Separation and Detection of Tissue Coash and Long-Chain Acyl-Coa by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography after Precolumn Derivatization with Monobromobimane. Journal of Chromatography. 635, 251-256 (1993).
  24. Shimada, K., Mitamura, K. Derivatization of Thiol-Containing Compounds. Journal of Chromatography B. 659, 227-241 (1994).
  25. Minkler, P. E., Kerner, J., Ingalls, S. T., Hoppel, C. L. Novel isolation procedure for short-, medium-, and long-chain acyl-coenzyme A esters from tissue. Analytical Biochemistry. 376, 275-276 (2008).
  26. Newton, G. L., Fahey, R. C. Determination of biothiols by bromobimane labeling and high-performance liquid chromatography. Methods in Enzymology. 251, 148-166 (1995).
  27. Radkowsky, A. E., Kosower, E. M. Bimanes .17. (Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones (Halo-9,10-Dioxabimanes) - Reactivity toward the Tripeptide Thiol, Glutathione. Journal of the American Chemical Society. 108, 4527-4531 (1986).
  28. Zhang, Y. M., et al. Chemical knockout of pantothenate kinase reveals the metabolic and genetic program responsible for hepatic coenzyme A homeostasis. Chemistry & Biology. 14, 291-302 (2007).
  29. Tokutake, Y., Onizawa, N., Katoh, H. Toyoda A,Chohnan S. Coenzyme A and its thioester pools in fasted and fed rat tissues. Biochemical and Biophysical Research Communications. 402, 158-162 (2010).
  30. Shibata, K., Nakai, T., Fukuwatari, T. Simultaneous high-performance liquid chromatography determination of coenzyme A, dephospho-coenzyme A, and acetyl-coenzyme A in normal and pantothenic acid-deficient rats. Analytical Biochemistry. 430, 151-155 (2012).
  31. Chohnan, S., Takamura, Y. A simple micromethod for measurement of CoASH and its use in measuring the intracellular levles of CoASH and short chain acyl-CoAs in Escherichia coli K12 cells. Agricultural and Biological Chemistry. 55, 87-94 (1991).

Tags

Biyokimya Sayı 151 Koenzim A kültürlü hücreler hayvan dokuları monobromobimane yüksek basınçlı sıvı kromatografisi solid faz ekstraksiyonu
Hücre ve Dokularda Koenzim A'nın Sayısallaştırılması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Frank, M. W., Subramanian, C., Rock, … More

Frank, M. W., Subramanian, C., Rock, C. O., Jackowski, S. Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues. J. Vis. Exp. (151), e60182, doi:10.3791/60182 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter