在这项研究中,我们提出了基于抑制剂和siRNA的策略,以干扰单纯疱疹病毒类型-1(HSV-1)感染的单细胞衍生树突状细胞中的自噬性通量。
单纯疱疹病毒类型-1(HSV-1)在未成熟的树突状细胞(iDC)和成熟的树突状细胞(mDC)中诱导自噬,而自噬通量仅在iDC中观察到。为了获得机械学的洞察力,我们开发了有效的策略来干扰HSV-1引起的自噬性周转。调节HSV-1诱导自噬的抑制剂策略是首选,因为它是一种简单快捷的方法。为了规避此类化合物的潜在非特异性脱靶效应,我们开发了一种基于siRNA的替代策略,在HSV-1感染后调节iDC的自噬性周转率。事实上,在HSV-1感染之前,用FIP200特异性siRNA对iDC进行电穿孔是一种非常具体和成功的方法,可以抑制FIP200蛋白表达,从而抑制自噬性通量。两种方法均能有效抑制IDC中HSV-1诱导的自噬性周转,从而对基于siRNA的技术更具针对性。开发了一种基于siRNA的另一种方法,选择性地抑制KIF1B和KIF2A的蛋白质表达,促进在MDC中HSV-1感染时的自噬性周转。总之,siRNA电穿孔技术是一种有前途的策略,可以选择性地消减不同蛋白质的表达,并分析其对HSV-1感染的影响。
人类单细胞衍生树突状细胞(DC)的产生构成了研究这一重要免疫细胞类型的功能和生物学的适当体外模型。近年,单核细胞与单核细胞的隔离及分化已确立为DC。DC感染β-疱疹单纯疱疹病毒-1型(HSV-1)作为研究HSV-1介导的DC生物学调制的模型系统2,3,4,5,6.这一点尤其重要,阐明疱疹病毒如何抑制或抑制强效抗病毒免疫反应,在宿主7、8内部建立免疫特权利基的延迟。在这方面,疱疹病毒是非常成功的病原体,在人群中广泛传播,根据地理区域9,血清患病率高达90%。为了理解并可能防止这种情况,需要对宿主免疫系统的HSV-1介导调制,特别是免疫细胞(如DC)的见解。
Turan等人最近发表了一份关于DC与HSV-1相互作用的一个全新的观察。作者证明,HSV-1复制的完成完全取决于DC的成熟状态。在 iDC 中,HSV-1 的完全复制通过自噬依赖机制得到促进。虽然HSV1在iDC和mDC中诱导自噬,但自噬通量仅在iDC中观察到。这反过来又通过iDC中核层状的自噬性降解,促进病毒辣椒的核出口。为了获得对 iDC 与 mDC 中这种 HSV-1 诱导降解途径的机械见解,新的高效策略对于研究自噬通量至关重要。
巨细胞(自噬)是一种保存良好的多步骤过程,针对细胞内蛋白质或整个细胞器的细胞内消化11。简单化,自噬可分为(i)启动,(ii)膜成核,(iii)囊泡扩张,和(iv)自噬体-裂液体融合阶段12。在启动 (i) 期间,含有 200 kD (FIP200) 的焦点粘附激酶家族相互作用蛋白的活性 ULK1/2 激酶复合物等成分对于激活 beclin-1-Vps34-AMBRA1 复合物至关重要。随后,膜核(ii)启动吞噬形成13,吞噬细胞质货物,这些细胞质货物被p6214等分子标记。在囊泡扩张和自噬性成熟(iii)微管相关蛋白光链3(LC3)-I被转换成其脂质形式LC3-II,插入到自噬细胞膜中。因此,LC3-I到-II的转换率是自噬诱导的指标,通过镜像成熟自噬体15,16的形成。在自噬细胞体-裂解体融合(iv)时,不仅自噬性货物,而且相关的p62和LC3-II蛋白发生降解(例如,水解)。因此,p62和LC3-II的损耗作为自噬通量17的标记。自噬体与液化体的融合,从而遵循自噬性流动,高度依赖于细胞内裂液体定位。除其他外,这是由亲子体成员KIF1B和KIF2A调节,它们被证明对自噬体-流合体融合18产生负面影响。有趣的是,KIF1B和KIF2A的蛋白质表达在直流成熟时诱导,从而导致HSV-1感染mDC中低效的自噬通量,从而阻碍HSV-1完全复制10。
调节自噬的实验尝试包括使用已知诱导或抑制这种特定途径的化合物19,20,21。在这项研究中,我们描述了两种基于抑制剂的策略来阻止HSV-1感染iDC的自噬性周转。在我们的实验中使用的第一个化合物是特定和强效的自噬抑制剂-1(斯帕他丁-1),它被描述为在自噬22的起始阶段促进贝克林-1-Vps34-AMBRA1复合降解。本研究使用的第二种化合物是巴菲洛霉素-A1(BA1),一种V-ATPase抑制剂,可阻断晚期自噬事件(即自噬体-裂解体融合以及自体体酸化)23、24。在iDC感染HSV-1之前,这两种抑制剂中的任何一种的使用能有效抑制自噬,但不会干扰有效的病毒基因表达。因此,在HSV-1感染之前,这种基于抑制剂的策略提供了一个强大的工具来抑制HSV-1诱发的自噬通量,这种通量很容易扩展到大量不同的细胞类型和病毒,这也可能导致自噬。
为了克服基于抑制剂的方法(即非特异性脱靶效应)的主要缺点,我们开发了一种基于siRNA的方法来阻止(HSV-1感染)iDC中的自噬性通量。siRNA电穿孔技术代表一种强大的替代策略,通过选择性消融不同蛋白质的表达(即自噬成分)。在我们的实验中,iDC使用电穿孔装置I(见材料表)和Gerer等人(2017年)和Prechtel等人(2007年)描述的改性协议对FIP200特异性siRNA进行电穿孔,以抑制在启动阶段25,26。这种技术使我们能够在iDC中具体敲除FIP200表达,而不会干扰细胞活力及其电穿孔后两天的不成熟表型。值得注意的是,HSV-1感染是在这些电化iDC中建立的,这些电化iDC由有效的病毒蛋白表达所镜像。这种基于siRNA的技术提供了独特的好处(即,各种不同的自噬成分,即使组合在一起),可以专门针对其表达的消融。
在这项研究中,我们进一步描述了一种基于siRNA的方法,在HSV-1感染的mDC中也诱导自噬性通量。在这种情况下,使用电穿孔装置II(参见材料表),在直流成熟前,对KIF1B和KIF2A进行针对的siRNA电镀。由于这两种蛋白质在DC成熟过程中被调节,并且已知对自噬体与裂游体10、18的融合产生负面调节,因此在HSV-1感染后,它们在mDC中具有很强的自噬通量。因此,基于siRNA的技术使我们能够通过干扰mDC中的KIF蛋白表达来专门诱导自噬性周转,从而可以模拟iDC中的表达水平。
总之,我们提出了两种独特的方法来抑制HSV-1感染iDC的自噬性通量。虽然第一种基于抑制剂的方法构成了一种简单、廉价和快速的方式来干扰自噬性降解,但第二种基于siRNA的技术更为具体,是支持和验证基于抑制剂的结果的非常合适的方法。实验。此外,我们描述了一种通过siRNA介导的两种KIF蛋白的敲除,在HSV-1感染的mDC中也诱导自噬性通量的方法。
本议定书的范围包括:(i) 处理人类单核衍生iDC以及mDC,(ii)他们感染了HSV-1,(iii)使用已知能抑制自噬的化合物进行治疗,以及(iv)使用两种不同的技术设置。使用本协议,自噬通量可以在HSV-1感染的iDC中阻断,也可以在HSV-1感染的mDC中诱导。
由于DC,特别是iDC,是非常脆弱的细胞,处理这些细胞涉及相当微妙的步骤。对于直流发电,我们建议使用新鲜分离的PBMC,并避免其冷冻保存,以获得更高的细胞产量。此外,在实验期间处理 iDC 时,包括其后续培养时,可防止剧烈或长时间的温度变化。否则,iDC 可能会经历表型变化,因此有必要通过流动细胞学来验证其不成熟的表型。请注意,与成熟的同行相比,iDC 缺乏明显的标记,如 CD80、CD83 和 CD8628、29。iDC和mDC感染HSV-1是一个公认的方法2,3,4,5,6,10。我们和其他人表明,当使用 1 或 2 的 MOI 时,DC 极易感染 HSV-1(图 2)。在我们手中,将感染介质的体积保持在低水平(250-350 μL中的1-3 x 106个细胞)将能提高感染效率。
干扰给定独特细胞通路的一种经典方法是使用特定化合物。各种不同的自噬调节剂,即活化剂和抑制剂,目前有30种。关于HSV-1诱导的自噬在DC,图兰等人,(2019年)最近显示了斯普他辛-1和巴菲洛霉素-A1(BA1)对iDC10自噬周转的抑制作用。这种自噬抑制技术适用于与后续HSV-1感染的组合,因为DC(特别是iDC)的感染率和成熟状态均不受影响。在未来的应用中,这种基于抑制剂的方法也可以与其他传染性因子、压力条件(如饥饿)以及不同细胞类型结合使用。然而,当使用抑制剂时,在确定有效自噬抑制的适当浓度时会产生限制,而不会严重影响细胞的生存能力。然而,使用抑制剂时的主要限制是发生潜在的偏离目标或不利影响,这可能导致误导性的结果31,32。
干扰自噬的第二种方法,在本协议中涵盖,是使用siRNA33,34,35进行特定的击倒。一方面,我们使用电穿孔装置I专门抑制FIP200的表达,从而抑制HSV-1在iDC中引起的自噬性周转。另一方面,我们使用电穿孔装置II,使两种不同的KIF蛋白(即KIF1B和KIF2A)静音,以促进HSV-1感染的mDC中的自噬通量。两种电穿孔协议都导致iDC中的FIP200和mDC中的KIF1B/KIF2A几乎完全消融,通过西方印版分析验证(图4A,图5A)。与不影响DC生存能力的电穿孔装置I相比,使用电穿孔装置II的mDC电穿孔会导致死电池的速率略高(图4B,图5B)).因此,在未来的应用中,电穿孔装置I应优先用于iDC和mDC。值得注意的是,这两种基于siRNA的技术,调节自噬性通量,都与随后的HSV-1感染iDC或mDC相容。此外,iDC的不成熟表型和mDC的成熟表型在电穿孔后都没有改变。
使用FIP200特异性siRNA对iDC进行电穿孔是一种高效且高度特异性的解毒方法,在HSV-1感染时抑制自噬通量。除了FIP200的特定沉默,该协议可以适应沉默其他自噬成分,参与在自噬级联期间的不同步骤。然而,确定有效siRNA介导抑制自噬的适当目标包括几个令人关切的问题。首先,自噬相关基因(ATG)的敲除效率不一定与有效抑制自噬有正相关,并且高度依赖于沉默36的特异性ATG蛋白。其次,不同的ATG蛋白还参与不同于自噬的通路,因此它们的消融也可能导致副作用37,38,39。第三,不同的ATG可能具有冗余功能,因此一个组件的敲除可能不足以抑制自噬(例如,贝克林-1和贝林-2)40。
此外,DC的电穿孔装置I基电穿孔协议也适用于mRNA,并可用于各种额外的初级细胞类型,如PBMC25。因此,该系统提供了一个一般策略,将不同的RNA物种输送到不同的原细胞类型。最后,我们提出了两种抑制自噬性通量的规程,要么使用抑制剂或siRNA的方法,结合随后的HSV-1感染iDC。此外,我们描述了一种siRNA电穿孔方法,在HSV-1感染后诱导mDC的自噬通量。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了德国研究理事会(DFG)的支持,该项目授予AS的STE 432/11-1项目,以及医学院的ELAN项目(弗里德里希-亚历山大-埃尔兰根-纽伦堡大学)通过授予LG的项目18-12-21-1。
4D-Nucleofector Core Unit (electroporation apparatus II) | Lonza (Basel, Switzerland) | AAF-1002B | |
AB-Serum | Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | H4522 | Dendritic cell cultivation |
ACD-A | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | 9007281 | |
Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (electroporation kit apparatus II) | Lonza (Basel, Switzerland) | V4XP-3024 | |
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE Healthcare (Solingen, Germany) | RPN2232 | Western Blot Detection |
Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | A3678 | |
anti-mouse-IgG (mouse, polyclonal, HRP) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 7076 | Western Blot detection |
anti-rabbit-IgG (goat, polyclonal, HRP) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 7074 | Western Blot detection |
Bafilomycin A1 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | tlrl-baf1 | inhibition of autophagy and lysosomal degradation |
BD FACS Canto II Flow Cytometer | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 338962 | |
Benzonase | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | E1014 | |
Blotting Chamber Fastblot B44 | Biometra (Göttingen, Germany) | 846-015-100 | |
CCR7 (mouse, Pe-Cy7) | BioLegend (Fell, Germany) | 557648 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: G043H7 |
CD11c (mouse, Pe-Cy5) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 561692 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: B-ly6 |
CD14 (mouse, PE) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 555398 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: M5E2 |
CD3 (mouse, FITC) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 555332 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: UCHT1 |
CD80 (mouse, V450) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 560442 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: L307.4 |
CD83 (mouse, APC) | eBioscience Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany) | 17-0839-41 | Flow cytometry Dilution: 1:200 Clone: HB15e |
CD86 (mouse, PE) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 553692 | Flow cytometry Dilution: 1:100 |
EVOS FL Cell Imaging | System AMG/Life Technologies (Carlsbad, USA) | AMF4300 | |
FIP200 (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 12436 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D10D11 |
GAPDH (mouse) | Merck Millipore (Massachusetts, USA) | AB2302 | Western Blot detection Dilution: 1:5000 Clone: MAB374 |
Gene Pulser II apparatus (electroporation apparatus I) | BioRad Laboratories GmbH (München, Germany) | 165-2112 | |
GM-CSF (4×104 U/mL) | Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) | 130-093-868 | |
HLA‐DR (mouse, APC-Cy7) | BioLegend (Fell, Germany) | 307618 | Flow cytometry Dilution: 1:200 Clone: L243 |
HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43 | BioVex | DC infection |
|
ICP0 (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-53070 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: 11060 |
ICP5 (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-56989 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: 3B6 |
IL-1β (0.1×106 U/mL) | Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany) | 1411-050 | |
IL-4 (1×106 U/mL) | Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) | 130-093-924 | |
IL-6 (1×106 U/mL) | Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany) | 1404-050 | |
ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare (Solingen, Germany) | 28955810 | |
KIF1B (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-376246 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: E-12 |
KIF2A (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-271471 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D-7 |
LC3B (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 3868 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D11 |
L-glutamine | Lonza (Basel, Switzerland) | 17-605E | |
LIVE/DEAD Fixable Violet dead cell stain kit | Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) | L34964 | L/D staining in Flow cytometry |
Lymphoprep | Alere Technologies AS (Oslo, Norway) | 04-03-9391/01 | |
Magnesiumchloride | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | A537.1 | |
Megafuge 2.0 RS | Heraeus (Hanau, Germany) | 75015505 | |
N, N, N', N'-Tetramethylethylendiamine (TEMED) | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | T9281 | |
Neubauer counting chamber | Brand (Wertheim, Germany) | 717805 | |
Nunc Cell culture flasks (175.0 cm2) | Thermo Scientific (Rockford, USA) | 159910 | |
p62 (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 88588 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D5L7G |
PageRuler prestained protein ladder | Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany) | 26616 | |
Paraformaldehyde, 16 % | Alfa Aesar, Haverhill, USA | 43368.9M | |
PerfectSpin 24 Plus | Peqlab (Erlangen, Germany) | C2500-R-PL | |
PGE2 (1 mg/mL) | Pfizer (Berlin, Germany) | BE130681 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza (Basel, Switzerland) | 17-512F | |
Protein gel system MiniProtean II | Bio-Rad Laboratories GmbH (München, Germany) | 1652960 | |
RestoreTM Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific, Rockford, USA | 21059 | |
Rocking Platform wt 15 | Biometra (Göttingen, Germany) | 042-590 | |
RotiBlock | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | A151.4 | |
Roti-Load 1 (4x) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | K929.3 | |
Rotiphorese Gel 30 (37.5:1) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 3029.1 | |
RPMI 1640 | Lonza (Basel, Switzerland) | 12-167F | |
Sodium dodecyl Sulfate (SDS) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 2326.2 | |
Thermomixer comfort | Eppendorf (Hamburg, Germany) | 5355 000.011 | |
TNF-α (10 μg/mL) | Peprotech (Hamburg, Germany) | 300-01A | |
Tris | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 4855.3 | |
Trypan blue solution (0.4 %) | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | T8154 | |
Tween 20 | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 9127.1 | |
Whatman 0.2 μm nitrocellulose membrane | GE Healthcare (Solingen, Germany) | 10600001 | |
WhatmanTM Chromatography Paper 3 mm Chr | Fisher Scientific GmbH (Schwerte, Germany) | 3030917 |