Summary
Bu çalışmada, Herpes simpleks virüs tip-1 (HSV-1) enfekte monosit kaynaklı dendritik hücrelerde otofatik akı ile müdahale etmek için inhibitör ve siRNA tabanlı stratejiler sürünmektedir.
Abstract
Herpes simpleks virüs tip-1 (HSV-1) hem de otofaji indükler, olgunlaşmamış dendritik hücreler (iDC) yanı sıra olgun dendritik hücreler (mDC), otofajik akı ise sadece iDC'lerde gözlenir. Mekanistik anlayışlar kazanmak için, HSV-1-indüklenen otofajik ciroile müdahale etmek için etkili stratejiler geliştirdik. HSV-1-indüklenen otofaji modüle etmek için bir inhibitör tabanlı strateji, kolay ve hızlı bir yöntem olduğu için ilk tercihi oluşturmaktadır. Bu tür bileşiklerin potansiyel spesifik olmayan hedef dışı etkilerini atlatmak için, HSV-1 enfeksiyonu üzerine iDC'lerde otofafik ciromodüle etmek için alternatif bir siRNA tabanlı strateji geliştirdik. Nitekim, HSV-1 enfeksiyonu öncesinde FIP200-spesifik siRNA ile iDC elektroporasyon FIP200 protein ekspresyonu ablate ve bu nedenle otofajik akı inhibe etmek için çok özel ve başarılı bir yöntemdir. Sunulan her iki yöntem de iDC'lerde HSV-1 kaynaklı otofajik ciroverimli inhibisyonu ile sonuçlanır, bu nedenle siRNA tabanlı teknik daha hedef özgüdür. KIF1B ve KIF2A'nın protein ekspresyonunu seçici olarak susturmak için siRNA tabanlı ek bir yaklaşım geliştirildi ve mDC'lerde HSV-1 enfeksiyonu üzerine otophagic cirosunu kolaylaştırdı. Sonuç olarak, siRNA elektroporasyon tekniği, seçici farklı proteinlerin ekspresyonunu ablate ve bir HSV-1 enfeksiyonu üzerindeki etkilerini analiz etmek için umut verici bir strateji temsil eder.
Introduction
İnsan monosit türetilmiş dendritik hücrelerin (DCs) üretimi, bu önemli bağışıklık hücresi tipinin işlevlerini ve biyolojisini incelemek için uygun bir in vitro model oluşturmaktadır. İzolasyon yanı sıra DC'ler içine monositfarklılaşması iyi son yıllarda kurulmuştur1,2. Α-herpesvirus herpes simpleks virüs tip-1 (HSV-1) ile DCs enfeksiyonu DC biyoloji2HSV-1 aracılı modülasyonları çalışmak için bir model sistemi olarak hizmet vermektedir,3,4,5,6 . Bu herpesviruses nemspen veya güçlü antiviral bağışıklık yanıtlarını inhibe nasıl açıklamak için özellikle önemlidir, ev sahibi içinde bağışıklık ayrıcalıklı nişlerde gecikme kurmak için7,8. Bu bakımdan, herpesvirüsler, coğrafibölgeyegöre % 90'a varan sero prevalansına ulaşan popülasyonda yaygın olarak yayılmış çok başarılı patojenlerdir 9. Bunu anlamak ve muhtemelen önlemek için, konağın bağışıklık sisteminin HSV-1 aracılı modülasyonları hakkında daha fazla bilgi edinmek ve özellikle DC'ler gibi bağışıklık hücreleri gereklidir.
CC'lerin HSV-1 ile etkileşimi ile ilgili tamamen yeni bir gözlem turan ve ark.10tarafından yakın zamanda yayınlanmıştır. Yazarlar, HSV-1 çoğaltma başarısının kesinlikle DC'lerin olgunlaşma durumuna bağlı olduğunu göstermiştir. IDC'lerde HSV-1'in tam replikasyonu otofajiye bağlı mekanizmalar tarafından kolaylaştırılır. HSV1 her iki, iDC'de ve mDC'lerde otofajiye neden olurken, sadece iDC'lerde otofaji akışı gözlenir. Bu da iDC'lerde nükleer laminlerin otophagic bozunması yoluyla viral kapsidlerin nükleer çıkışını kolaylaştırır. IDC'lerde, mDC'lere karşı bu HSV-1 indüklenen bozulma yolu hakkında mekanistik bilgiler edinmek için, otofajik akı araştırmak için yeni ve verimli stratejiler çok önemlidir.
Makrootophaji (otofaji) hücre içi proteinleri veya tüm organelleri lizomal sindirim için hedefleyen iyi korunmuş çok aşamalı bir süreçtir11. Simplistically, otofaji (i) inisiyasyon, (ii) membran çekirdekasyonu, (iii) vezikül genleşme ve (iv) otofagozom-lyzom füzyonfazı 12ayrılabilir . İnisiyasyon sırasında (i), 200 kD (FIP200) odak yapışma kiaz ailesi etkileşimproteinini içeren aktif ULK1/2 kinaz kompleksi gibi bileşenler, beclin-1-Vps34-AMBRA1 kompleksini aktive etmek için kritik öneme karşıdır. Daha sonra, membran nükleasyonu (ii) p6214gibi moleküller tarafından işaretlenmiş sitoplazmik kargoları içine alan fagoforkoluşumunu başlatır 13. Vezikül genleşmesi ve otofagoforma olgunlaşması sırasında (iii) mikrotübül ilişkili protein ışık zinciri 3 (LC3)-I, otofasomal membrana yerleştirilen lipideli formul3-II'ye dönüştürülür. Böylece, LC3-I -II dönüşüm oranları olgun otofagozom oluşumunu yansıtarak otofaji indüksiyon için bir gösterge vardır15,16. Otofazozom-lizozom füzyon (iv) üzerine, sadece otophagic kargo değil, aynı zamanda ilişkili p62 ve LC3-II proteinleri degradasyon (örneğin, hidroliz tarafından) geçmesi. Böylece, p62 ve LC3-II kaybı otofajik akı için belirteçleri olarak hizmet17. Otofazomların lyzozomlarla füzyonu ve böylece otophagic ciroyu takiben hücre içi lizomal lokalizasyona son derece bağlıdır. Bu, diğerleri arasında, kinesin aile üyeleri KIF1B ve KIF2A tarafından düzenlenir, hangi olumsuz otofagozom-lyzom füzyon etkilemek için gösterilmiştir18. İlginçtir, KIF1B ve KIF2A protein ekspresyonu DC olgunlaşma üzerine indüklenen ve bu nedenle hsv-1-enfekte mDC'lerde verimsiz otophagic akı sorumludur, hangi tam HSV-1 replikasyon10engeller .
Otofaji modüle etmek için deneysel girişimleri neden veya bu özel yolu inhibe bilinen bileşiklerin kullanımını içerir19,20,21. Bu çalışmada, HSV-1-enfekte iDC'lerde otofajik cirosu engellemek için iki inhibitör tabanlı strateji tanımlamıştır. Deneylerimizde kullanılan ilk bileşik spesifik ve güçlü otofaji inhibitörü-1 (spautin-1), hangi otofaji başlangıç aşamasında beclin-1-Vps34-AMBRA1 kompleks bozulma teşvik tarif edildi22. Bu çalışmada kullanılan ikinci bileşik bafilomisin-A1 (BA1), geç otophagic olayları engelleyen bir V-ATPaz inhibitörü (yani., otofazozom-lyzozom füzyon yanı sıra otolizom asitleşme)23,24. HSV-1 ile iDC enfeksiyonu öncesinde bu iki inhibitör kullanımı güçlü otofaji inhibe, ancak verimli viral gen ekspresyonu rahatsız etmez. Böylece, HSV-1 enfeksiyonu öncesinde bu inhibitör tabanlı strateji kolayca farklı hücre tipleri ve virüslerin bir bolluk için genişletilebilir HSV-1-indüklenen otofhagic akı inhibe etmek için güçlü bir araç sunuyor, aynı zamanda potansiyel otofaji neden.
Inhibitör tabanlı bir yaklaşımın (yani spesifikolmayan hedef dışı etkiler) önemli bir dezavantajını aşmak için, (HSV-1-enfekte) iDC'lerde otofajik akısı engellemek için siRNA tabanlı bir yöntem geliştirdik. SiRNA elektroporasyon tekniği, farklı proteinlerin (yani otophagic bileşenlerin) ekspresyonunun seçici ablasyonyoluyla güçlü bir alternatif stratejiyi temsil eder. Deneylerimizde iDC'ler FIP200-spesifik siRNA elektroporasyon cihazı I (bkz. Malzeme Tablosu)ve Gerer et al. (2017) ve Prechtel et al. (2007) tarafından tanımlanan değiştirilmiş bir protokol kullanılarak elektroporated edildi. başlatma aşaması25,26. Bu teknik, hücre canlılığına ve onların olgunlaşmamış fenotiplerine iki gün sonra elektroporasyon dan müdahale etmeden, iDC'lerde FIP200 ifadesini özellikle nakavt etmemizi sağladı. Kayda değer, HSV-1 enfeksiyonu etkin viral protein ekspresyonu ile yansıtılan bu elektroporated iDC'lerde kurulmuştur. Bu siRNA tabanlı teknik benzersiz bir fayda sunuyor (yani, farklı otofatik bileşenlerin çeşitli, hatta birlikte), özellikle ifade ablasyon için hedeflenebilir.
Bu çalışmada, HSV-1-enfekte mDC'lerde de otofatik akı neden olmak için siRNA tabanlı bir yöntem açıklayınız. Bu durumda, iDC'ler DC olgunlaşması öncesinde KIF1B ve KIF2A'ya karşı hedeflenen siRNA ile elektroporated edildi (bkz. Her iki protein de DC olgunlaşma sırasında upregulated ve negatif lyzozomlar ile otofazomların füzyon düzenleyen bilinmektedir beri10,18, HSV-1 enfeksiyonu üzerine mDC'lerde onların knockdown güçlü indüklenen otophagic akı. Böylece, siRNA tabanlı teknik, özellikle mDC'lerde KIF protein ekspresyonuna müdahale ederek otophagic ciroya neden olmamızı sağladı ve böylece iDC'lerdeki ifade düzeylerini taklit edebildi.
Özetle, HSV-1-enfekte iDC'lerde otofajik akı inhibe etmek için iki farklı yöntem salıyoruz. İlk inhibitör tabanlı yaklaşım otonom bozulmaya müdahale etmek için kolay, ucuz ve hızlı bir yol teşkil ederken, ikinci siRNA tabanlı teknik daha spesifik tir ve inhibitör bazlı sonuçları doğrulamak ve doğrulamak için çok uygun bir yöntemdir. Deney. Buna ek olarak, hsv-1-enfekte mDC'lerde de otophagic akı neden olmak için bir yöntem tarif, iki KIF proteinlerin siRNA aracılı nakavt yoluyla.
Protocol
Sağlıklı donörlerin lökapherezis ürünlerinden monosit türetilmiş CD'ler üretildi. Bunun için yerel etik komitesinden olumlu bir oy alınmıştır (referans numarası 4556). Bu çalışmanın deneyleri "Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg" (referans numarası 4556) etik komitesinin önerileri doğrultusunda gerçekleştirilmiştir. Tüm bağışçılar, Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak yazılı bir bilgilendirilmiş onayı onayladılar.
1. Olgunlaşmamış dendritik hücrelerin (iDC) ve olgun dendritik hücrelerin (mDC) üretimi ve işlenmesi
- Daha önceaçıklandığıgibi lökoresyon sistemi odalarından (LRSCs) insan periferik kan mononükleer hücreleri (PBMCs) izole . PBMC'lerin kriyopreservation kaçının ve daha yüksek DC verimleri elde etmek için doğrudan izolasyon üzerine kullanabilirsiniz.
- Daha önce açıklandığı gibi T175 hücre kültürü şişelerinde farklı sağlıklı donörlerin PBMCs insan DC'leri oluşturun10,27. Kısaca, 30 mL DC ortamda 350-400 milyon pBMC kullanın (RPMI 1640 L-glutamin olmadan, 1% (v / v) AB-serum, 100 U/ mL penisilin, 100 mg/mL streptomisin, 0.4 mM L-glutamin, hücre kültürü şişe başına hücre kültürü flask başına hücre kültürü flask mononces tarafından izolasyon için. 1 saat sonra RPMI 1640 kullanarak yapışmaz fraksiyonu yıkayın. 800 U/mL GM-CSF ve 250 U/mL IL-4 ile takviye edilmiş taze DC ortamı nı ekleyin ve 3 gün boyunca kuluçkaya yatırın.
- Gün 3 sonrası bağlılık, DC farklılaşma için, hücre kültür şişesi başına 400 U / mL ve 250 U / mL son konsantrasyonu ile GM-CSF ve IL-4 içeren taze DC orta 5 mL ekleyin.
- IDC'leri hasat etmek için, 4. Bu adımı 2 kez tekrarlayın. MCD'lerin üretimi için, aşağıdaki gibi oluşan olgunlaşma kokteyli ekleyin: GM-CSF (son konsantrasyon: 40 U/mL), IL-4 (son konsantrasyon: 250 U/mL), IL-6 (son konsantrasyon: 1000 U/mL), IL-1β (son konsantrasyon: 200 U/mL), TNF-α (son konsantrasyon: 10 ng/ mL), prostaglandin E2 (PGE2; son konsantrasyon: 1 μg/mL).
- Altı gün sonrası bağlılık (iki gün sonra matürasyon indüksiyon bir sitokin kokteyl kullanarak), hücre kültürü şişesinin altından durulayın mDC' ler. Bu adımı iki kez tekrarlayın.
NOT: Olgunlaşmamış ve olgun DC'ler 1 hücre kültürü şişesinde aynı donörlerden sırayla üretilebilir. Bunu yapmak için, (i) uygun sayıda iDC'yi ayırır ve (ii) adım 1.2.2'de listelenen sitokin kokteylini kullanarak şişelerde kalan hücrelerin olgunlaşmasını sağlar.
- İlgili hücre kültürü ortamındaki CD'leri veya mDC'leri 50 mL'lik tüplere aktarın. 5 dk için 300 x g santrifüj ile hücreleri hasat.
- Hücre kültürü şişesi başına 5-10 mL RPMI 1640'lık cdmi'de yavaşça yeniden askıya alın (=yıkama) DC'leri. İlgili DC süspansiyonları tek bir tüpte birleştirin.
- Bir sayma odası veya alternatif bir yöntem kullanarak hücre numarasını tanımlayın. Henotik değişiklik riskini azaltmak için, iDC'leri kullanırken sıcaklık değişikliklerinden kaçının.
2. Memesel olgunlaşma durumunu izlemek için akış sitometrik analizleri
- 1.3.1 adımından 1,5 mL'lik bir tüpe IDC veya mDC'ler (0,5 x 106)aktarın. Hücreleri 3390 x g'de 1,5 dk. Facs tamponuyla bir kez yıkayın (PBS %2 fetal baldır serumu (FCS) ile birlikte tarayın.
- Tanımlanmış yüzey moleküllerine karşı spesifik florokrom etiketli antikorlar içeren 100 μL antikor boyama çözeltisi (FACS tampon) hücreleri yeniden askıya alın.
- Saflığı (CD3-FITC, CD14-PE) ve DC'lerin olgunlaşma durumunu (CD80-PacBlue/-PE-Cy5, CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, CD86-PE, MHCII-APC-Cy7) doğrulamak için aşağıdaki antikorları kullanın.
- 100 μL'lik FACS tamponuna bir lekesiz örnek hazırlayın.
- 30 dakika boyunca karanlıkta buz üzerinde hücreleri leke.
- Daha sonra 1,5 dakika boyunca 3390 x g FACS tampon ve santrifüj 1 mL hücreleri iki kez yıkayın.
- Son olarak, 200 μL FACS tampon% 2 PFA ile takviye hücreleri yeniden askıya ve akış sitometri ile hücreleri analiz. Sabit hücreler karanlıkta 4° C'de 2 güne kadar saklanabilir.
3. Herpes simpleks virüs tip-1 (HSV-1) ve spautin-1 veya bafilomisin-A1 ile HSV-1-indüklenen otophagic akı girişim ile DCs enfeksiyon prosedürü
NOT: Bu çalışmada kullanılan HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43 (HSV-1 EGFP) suşu HSV-1 suşu 17+ laboratuarından elde edilmiştir. HSV-1 EGFP suşu, CMV promotörü kontrolündeulcu UL43 gen lokusuna yerleştirilen gelişmiş yeşil floresan proteini (EGFP) ifade eder. EGFP HSV-1 enfeksiyonu için bir belirteç olarak hizmet vermektedir. Ayrıca, HSV1-RFPVP26 türü DC enfeksiyon çalışmaları için kullanılmıştır (daha önce Turan vd., 2019'da tanımlanmıştır). Bu virüs, monomer kırmızı floresan protein (mRFP) erimiş capsid yüzey proteini VP26 ifade eder.
- 1.3 adımdan 2 mL'lik birtüpe IDC veya mDC aktarın. Daha sonra, 1,5 dakika boyunca 3390 x g hücreleri santrifüj ve supernatant atın.
- Enfeksiyon ortasındaki hücreleri yavaşça yeniden askıya alın (RPMI 1640 20 mM HEPES ile tamamlanır).
- Otofasomal-lysozomal bozulma yolunu inhibe etmek için, enfeksiyon dan önce spautin-1 veya bafilomisin-A1 1 h ile dcs ön tedavi. Enfeksiyon ortamına 10 μM spautin-1 veya 1 μM BA1 veya işlenmemiş kontrol olarak DMSO ekleyin. Hücreleri 300 rpm'de bir ısıtma bloğunda 37 °C'de 1 saat boyunca titreyerek kuluçkaya yatırın.
- Enfeksiyon çalışmaları için, 2 enfeksiyon (MOI) bir çokluğu hsv-1 virions ile hücreleri aşılamak. Sahte kontrol olarak MNT tampon (30 mM 2-(N-morpholno)etanesülfonik asit (MES), 100 mM NaCl, 20 mM Tris) ilgili hacmi ekleyin. Hücreleri 300 rpm'de bir ısıtma bloğunda 37 °C'de 1 saat boyunca titreyerek kuluçkaya yatırın.
- 1 saat enfeksiyon sonrası (hpi), hücreleri 3390 x g'de 1,5 dk. Aspire inoculum için toplayın ve DC ortamda 40 U/mL GM-CSF, 250 U/mL IL-4 ve 10 μM spautin-1, 1 μM BA1 veya DMSO'yu kontrol olarak içeren hücreleri yavaşça yeniden askıya alın. Tohum mock-treated ve HSV-1-enfekte hücreler son konsantrasyonda 1 x 106/ mL 6-iyi plaka içine.
- 16-24 hpi'de hücreleri durulama (mm) veya hücre kazıyıcı (iCD) kullanarak hasat edin. Hücreleri 1,5 mL'lik bir güvenli kilit tüpüne aktarın.
- 1,5 dk için 3390 x g santrifüj ile hücreleri toplamak ve PBS 1 mL ekleyerek bir kez pelet yıkayın.
- 29 μL 2x Roti-Load, 1 μL 100 mM MgCl2 ve 12.5 U/mL benzonaz içeren lysis karışımındaki hücreleri şiddetle yeniden askıya alın.
- Benzonaz kullanarak hücre lisisi ve DNA sindirimi için numuneleri 37 °C'de 10 dk kuluçkaya yatırın. Daha sonra proteinleri 10 dk boyunca 95 °C'de denatüre edin.
- LC3BI/II, p62, ICP0/5 ve GAPDH protein düzeylerini doğrulamak için SDS-PAGE ve Western blot analizleri yapın.
4. FIP200-siRNA kullanılarak iDC'lerin elektroporasyon yoluyla HSV-1-indüklenen otophagic akısı nın girişim
NOT: SiRNA elektroporasyon için mevcut protokol Prechtel et al. (2007) ve Gerer et al. (2017) tarafından değiştirilmiştir.
- 3.5 posta yapışması sırasında 50 mL'lik bir tüpe iDC'leri (12 x 106)aktarın. Daha sonra, 5 dakika için 300 x g hücreleri santrifüj ve supernatant atın. Buna paralel olarak, adım 2'de açıklandığı gibi olgunlaşma durumunu izlemek için akış sitometrik analizi gerçekleştirin (CD80-PacBlue yerine Life/Dead violet kullanın).
- IDC'leri fenol kırmızısı olmadan 5 mL OptiMEM'de hafifçe yıkayın ve hücreleri 300 x g'de 5 dk. Süpernatant'ı atın ve fenol kırmızısı olmadan 200 μL OptiMEM'deki iCD'leri hafifçe uzaklaştırın ve 6 x 10 6/100 μL'lik bir hücre konsantrasyonunu ayarlayın. Hücreleri buzun üzerine yerleştirmeyin ve sıcaklık değişikliklerini önle. Hızlı hareket edin ve optimem'de fenol kırmızısı olmadan uzun kuluçka sürelerinden kaçının.
- Kontrol olarak 75 pmol FIP200 spesifik siRNA veya 75 pmol çırpılmış siRNA'yı 4 mm elektro cuvettes'e aktarın ve hücre süspansiyonuna 100 μL (6x106 hücre) ekleyin. Elektroporasyon aparatı I kullanarak doğrudan darbe iDC'leri, aşağıdaki ayarları uygulayarak: 500 V 1 ms.
- Deneysel işlemden önce, siRNA süspansiyonları üreticinin talimatına göre hazırlayın, aliquot ve -20 °C'de saklayın. Çözülme ve elektroporasyon için bu siRNA kullanırken buz üzerinde tutun. Örnekleri elektroporating önce, bir test darbesi gerçekleştirin.
- Elektroporasyondan sonra, iDC'yi taze önceden ısıtılmış DC ortamına sahip 6 kuyulu plakalara doğrudan aktarın (GM-CSF'nin 40 U/mL'si ve 250 U/mL IL-4 ile tamamlanır). Hücreleri 1 x 106/mL'lik son konsantrasyonda tohumlayın ve bir kuluçka makinesine yerleştirin. Hücreleri elektro cuvette'den yıkmayın.
- 48 saat sonra ilk olarak elektroporated iDC'lerin morfolojisini mikroskobik olarak inceleyin. Daha sonra, bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri hasat ve 15 mL tüpler halinde aktarın. %0,01 EDTA ile desteklenen 1 mL PBS ile kuyuları durulayın ve çözeltiyi ilgili tüplere aktarın.
- Daha sonra, sonraki adımlarda açıklandığı gibi siRNA durumu başına 6 x 106 iDC'yi bölün.
- Adım 2'de açıklandığı gibi olgunlaşma durumunu ve hücre canlılığını değerlendirmek için 0,5 x 106 hücre kullanın. Aşağıdaki antikorları kullanın: CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, MHCII-APC-Cy7 ve Life/Dead violet.
- FIP200'e özgü nakavt verimliliğini doğrulamak için Batı leke analizleri için 1 x 106 hücre kullanın. Hücreleri 3390 x g'de santrifüj ile 1,5 mL'lik bir safelock tüpüne aktarın ve hasat edin.
- HSV-1 enfeksiyon deneyleri için kalan hücreleri (4,5 x 106)kullanın. Her deneysel durum için 2,25 x 106 iDC'yi 2 mL'lik tüplere aktarın ve 2 moi'de HSV1 ile enfekte edin veya sahte kontrol olarak MNT tamponu ekleyin. 3.3. adımda açıklandığı gibi enfeksiyonu gerçekleştirin.
- 20 hpi'de, hücreleri bir hücre kazıyıcı kullanarak hasat ve adım 3.4 açıklandığı gibi Batı leke analizleri için hücre lysates hazırlamak.
5. KIF1B/2A-siRNA elektroporasyonu kullanılarak HSV-1-enfekte mDC'lerde otofazozom-lizozomal yolun modülasyonu
- 50 mL'lik bir tüpe 4 posta yapışması sırasında iDC'leri (24 x 106)aktarın. Daha sonra, 5 dakika için 300 x g hücreleri santrifüj ve supernatant atın.
- 3 x 10 6/mL'lik son hücre konsantrasyonunu ayarlamak için 8 mL PBS'deki iDC'leri yavaşça yeniden askıya alın (= yıkama) 3 x 106 hücreyi 1,5 mL tüplere aktarın ve hücreleri 3390 x g'de 1,5 dk toplayın.
- Ek karışımı içeren 100 μL tampon P3'teki iDC'lerin (üreticinin talimatlarına göre; elektroporasyon kiti cihazı II) ve (i) 75 pmol KIF1B'ye özgü siRNA, (ii) 75 pmol KIF2A'ya özgü siRNA veya (iii) her ikisini de içeren iDC'leri yeniden askıya alın. (iv) bir kontrol olarak şifreli siRNA ilgili miktarı kullanın. Her siRNA durumu (6 x 106 hücre) için iki tüp hazırlayın ve süspansiyonları ayrı elektro cuvettes'e aktarın. Elektroporasyon cihazı II kullanarak "EH-100" darbesini uygulayan doğrudan darbe lisi.
- Deneysel işlemden önce, siRNA süspansiyonları üreticinin talimatına göre hazırlayın, aliquot ve -20 °C'de saklayın. Çözülme ve elektroporasyon için bu siRNA kullanırken buz üzerinde tutun. IDC'leri buzun üzerine yerleştirmeyin ve sıcaklık değişikliklerini önle. Hızlı hareket edin ve PBS veya tampon P3'teki iDC'lerin uzun kuluçkadan kaçınMasını önleyebilirsiniz.
- Elektroporasyondan hemen sonra, elektro kürlere önceden ısıtılmış 500 μL RPMI 1640 ekleyin. Hücreleri 5-10 dakika boyunca bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın. IDC'leri taze önceden ısıtılmış DC ortamıyla 6 kuyulu plakalara aktarın (GM-CSF'nin 40 U/mL'si ve IL-4'ün 250 U/mL'si ile desteklenir). İlgili koşulları tek bir kuyuda birleştirin, hücreleri 1·106/mL'lik son konsantrasyonda tohumlayın ve bir kuluçka makinesine yerleştirin.
- Kuluçkadan 4 saat sonra, adım 1.2.2'de listelenen sitokinleri içeren olgunlaşma kokteylini ekleyin.
NOT: Elektroporasyon sonrası 2 gün akış sitometrik analizleri için kontrol olarak elektroporated olmayan CD'lerden (1 x 106)bir örnek hazırlayın. Kontrol hücrelerini elektroporated numunelere benzer şekilde tedavi edin. - Elektroporasyondan iki gün sonra, hasat hücreleri yeniden süspansiyon ve 15 mL tüplere aktarılarak. Kuyuları 1 mL PBS ile durulayın ve ilgili tüplerdeki süspansiyonları aktarın. Aşağıdaki adımlarda açıklandığı gibi siRNA durumu başına split 6·106 DCs:
- Adım 2'de açıklandığı gibi olgunlaşma durumunu ve hücre canlılığını kontrol etmek için 0,25 x 106 DC (elektroporated ve non-electroporated) kullanın. Aşağıdaki antikorları kullanın: CD80-PE-Cy5, CD83-APC, CD86-PE, MHCII-APC-Cy7 ve Life/Dead violet.
- KIF1B/2A'ya özgü nakavt verimliliğini değerlendirmek için Batı leke analizleri için 0,75 x 106 hücre kullanın. Hücreleri 3390 x g'de santrifüj ile 1,5 mL'lik bir safelock tüpünde toplayın.
- Her siRNA durumundan kalan hücreleri (5 x 106)kullanın ve HSV-1 enfeksiyon deneylerini yapın. Her deneysel durum için 2,5 x 106 iDC'yi 2 mL'lik tüplere aktarın ve 2 mL'lik bir MOI'da HSV-1 ile bulaştırın veya sahte kontrol olarak MNT tamponu ekleyin. 3.3. adımda açıklandığı gibi enfeksiyonu gerçekleştirin.
- 20 saat enfeksiyon sonrası, hücreleri yeniden süspansiyon ile hasat ve HSV-1-indüklenen otophagic ciro indüksiyon doğrulamak için Batı leke analizleri için hücre lysates hazırlamak, adım yukarıda açıklandığı gibi 3.4.
Representative Results
Bu yazıda, dendritik hücrelerde HSV-1-indüklenen otofaji ile müdahale yöntemleri açıklanmıştır. Buna, akış sitometrisi tarafından fenotipik olarak analiz edilen insan monosit türevi CD'ler ve mCD'lerin oluşumu da dahildir (Şekil 1). Gün 4 sonrası bağlılık, DC'ler CD80 zayıf ifade ile karakterize bir olgunlaşmamış fenotip göstermek, CCR7, ve CD83 yanı sıra yüksek CD11c ve orta MHCII ekspresyonu. CD3 ve CD14 sinyalleri eksik olduğundan, T hücresi ve monosit kontaminasyonları dışlanabilir. Gün 6 sonrası bağlılık (yani, gün 2 doğum sonrası olgunlaşma indüksiyon), DC'ler CD80, CCR7, CD83 ve MHC-II yüzey ifadesinde önemli bir artış yansıyan olgun bir fenotip göstermektedir. EGFP ifade eden HSV-1 suşu(Şekil 2)ile enfeksiyon, iCD'lerin(Şekil 2 A üst panel) veya mCD'lerin(Şekil 2Aalt panel, Şekil 2B), güçlü GFP sinyalleri floresan mikroskopi yanı sıra akış sitometri tarafından analiz.
Son raporumuzda da gösterildiği gibi, HSV-1 hem iDC'lerde hem de mDC'lerde otofajiye neden olur, ancak, otofatik ciro iDC'lerde sadece10olarak gerçekleşir. İlk yaklaşımda, kotofiin inisiyasyonun engellenmesi için (Şekil 3A) - veya bafilomisin-A1 (BA1; Şekil 3B) - son otofazozom-lizozom füzyonu inhibe etmek için. Spautin-1 ve BA1 yokluğunda iDC'lerin HSV-1 enfeksiyonu üzerine, otophagic akı sırasıyla p62 ve LC3B ekspresyonunun azalması ile yansıtılır. Buna karşılık, spautin-1 yokluğunda mDC'lerin HSV-1 enfeksiyonu p62 ekspresyonunu etkilemezken, spautin-1 ve BA1 tedavisi LC3B-II birikimine neden olur. Bu, otofaji indüksiyonu ancak MDC'lerde otofajik ciro başarısızlığını yansıtır. IDC'lerde, spautin-1 ön tedavi kuvvetle HSV-1 enfeksiyonu üzerine p62 otophagic bozulma geri, başlatma aşamasında otofaji inhibisyonu nedeniyle. BA1 ile ön tedavi üzerine, mock- ve HSV-1-enfekte iDC'ler LC3B-II protein düzeylerigüçlü bir birikimi göstermek, geç otofazozom-lizozom füzyon engelleme yoluyla otofatik ciro başarılı inhibisyonu gösteren. Bununla tutarlı olarak, spautin-1 ve BA1'in mDC'lerin ön tedavisi de sırasıyla stabil p62 ve artmış LC3B-II protein düzeyleri ile sonuçlanır.
Otophagic akı bozacak ikinci bir yöntemde, FIP200 hedefleyen siRNA elektroporasyon HSV-1-enfekte iDC'lerde otophagic akısı engellemek için kapasitesi ile ilgili olarak incelenir. Şekil 4A'dagösterildiği gibi, iDC'lerde güçlü derecede azaltılmış FIP200 protein düzeyleri elektroporasyon sonrası 48 h'de tespit edildi, siRNA kontrolüne göre. Bu noktada, ICD'ler hücre ölümü herhangi bir belirti göstermezler(Şekil 4B) ve olgunlaşmamış fenotiplerini korurlar (Şekil 4C). FIP200-susturulmuş iCD'lerin HSV-1 ile enfeksiyonu, siRNA ile tedavi edilen benzerlerine göre otofatik akıda güçlü bir azalma olduğunu ortaya koymaktadır (Şekil 4D). FiP200 HSV-1-enfekte iDC'lerde susturulduğunda bu lc3B protein düzeylerinin yanı sıra p62 artar.
Ters bir girişimde, KIF1B ve KIF2A protein ekspresyonunun siRNA aracılı ablasyonunun HSV-1-enfekte mDC'lerde de otofazomal-lisozomal ciroya olanak verip vermediğini inceledik. Böylece, iDR'ler bu proteinlerden birini veya her ikisini hedefleyen spesifik siRNA'lar kullanılarak elektroporated edildi ve hücreler daha sonra olgunlaştı(Şekil 5). Elektroporasyon sonrası 2 gün, mCD'ler KIF1B ve/veya KIF2A protein ekspresyonunda, spesifik siRNA'lar kullanıldığında güçlü bir azalma gösterir (Şekil 5A). Bu yöntem aynı zamanda ne belirgin hücre ölümüne yol açmadı(Şekil 5B) ne de henotik olgunlaşma durumlarında değişikliklere yol açmadı (Şekil 5C). KIF1B ve KIF2A'nın otofagozomal-lizomal bozulma sırasında ki önemini destekleyen hsv-1 enfeksiyonu öncesinde tükenmeleri, mDC'lerde otophagic akı artışı kolaylaştırır. Bu durum, ilgili kontrol durumunun aksine azalmış p62 protein düzeyleri ile yansıtılır(Şekil 5D).
Şekil 1: Akış sitometrisi kullanılarak insan monosit türevi iDC'lerin ve mDC'lerin henotypik karakterizasyonu. DC'ler saflıklarını doğrulamak için spesifik antikorlarla üretildi ve boyandı: (A) CD3 T hücre kontaminasyonunu dışlamak için, (B) CD14 monositlerle kontaminasyonu dışlamak için, ve (C) CD11c DC'ler için bir belirteç olarak. ( D ) CD80, (E) CCR7, ( F ) CD83 ve ( G ) MHCII: (D) CD80, ( (G) CDCII, ve (G) MHCII, henotibik olgunlaşma durumlarını değerlendirmek için aşağıdaki antikorlar kullanılmıştır. Bu moleküller yüksek mDC'ler üzerinde ifade edilir ve böylece olgunlaşmamış ve olgun DC fenotip arasında ayrımcılık sağlar. Veriler FCS express 5.0 kullanılarak analiz edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: HSV-1-enfekte cd'lerin ve mDC'lerin mikroskobik ve akış sitometrik analizleri. IDC'ler ve mDC'ler, GFP sinyaline dayalı enfeksiyon oranının ölçülmesine olanak sağlamak için EGFP (HSV-1 EGFP) içeren bir HSV-1 suşu ile enfekte edildi. (A) 24 hpi'de enfekte olmayan meslektaşlarına göre 2'lik bir MOI'da enfekte gfp-pozitif HSV-1-enfekte iDC'lerin ve mDC'lerin mikroskobik analizleri. Enfekte hücreleri görselleştirmek için GFP floresansı izlendi. Ölçek çubuğu, enfeksiyon kinetiği sırasında 400 μm. (B) Mock veya HSV-1-enfekte mDC'lerin akış sitometrik ölçümlerini temsil eder. Üst paneller (siyah çizgili histogramlar) sahte durum göstermek, alt paneller (siyah histogramlar) göstermek HSV-1-enfekte hücreleri belirtilen zaman noktaları sonrası enfeksiyon sonra. Veriler FCS express 5.0 kullanılarak analiz edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Spautin-1 ve b afilomisin-A1 HSV-1-enfekte iDC'lerde otophagic akısı modüle. IDC'ler ve mDC'ler enfeksiyondan önce 1 saat süreyle(A) spautin-1 veya (B) bafilomisin-A1 (BA1) ile tedavi edildi. Hücreler daha sonra 2 MOI kullanılarak sahte veya HSV-1-enfekte (HSV1-RFPVP26) idi. 16-18 saat sonra, DCs hasat edildi ve protein lysates otophagic belirteçleri olarak p62 veya LC3B-I/-II ifadesini belirlemek için Batı leketabi tutuldu, enfeksiyon kontrolü olarak ICP0 ve yükleme kontrolü olarak GAPDH. LC3B-I ve LC3B-II protein düzeyleri Bio1D (optik yoğunluk) kullanılarak GAPDH referans proteinine göre ölçüldü ve normalleştirildi. Normalleştirilmiş LC3B-II sinyallerinin normalleştirilmiş LC3B-I sinyallerine oranı gösterilmiştir. Bu rakam ©2019 Turan ve ark. https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: FIP200-siRNA elektroporasyonu üzerine HSV-1-enfekte iDC'lerde otofajik akı analizi. I. (A) DC'ler FiP200 knockdown 48 h sonrası elektroporasyonun verimliliği açısından Batı leke analizleri yaparak kontrol siRNA veya FIP200 spesifik siRNA ile elektroporated edildi. (B) Hücre canlılığı ve (C) olgunlaşma durumu elektroporasyon (açık mavi histogramlar) ve 48 saat sonrası (koyu mavi ve gri histogramlar) elektroporasyondan önce akış sitometrisi ile analiz edildi. Üç farklı donör için ortanca değerler gösterilir. FIP200'ün ve olgunlaşmamış fenotipin etkin bir şekilde yıkılıp atıldığını doğruladıktan sonra hücreler 2 MOI kullanılarak HSV-1-enfekte (HSV-1 EGFP) idi. Veriler FCS express 5.0 kullanılarak analiz edildi. (D) 20 saat sonrası enfeksiyonda hücreler, LC3B-I/-II ve p62'nin otophagic belirteçolarak ekspresyonunu belirlemek için Batı leke analizlerine tabi tutuldu. ICP5 enfeksiyon kontrolü, GAPDH ise yükleme kontrolü olarak saptanır. A ve D panelleri ©2019 Turan ve ark. tarafından değiştirilmiş ve uyarlanmıştır. https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: KIF1B ve/veya KIF2A'nın siRNA aracılı ablasyonunu HSV-1-enfekte mDC'lerde otofhagic ciro modüle eder. II. II' ler KIF1B'ye özgü ve/veya KIF2A'ya özgü siRNA ile elektroporated edildi ve siRNA kontrol edildi. 4 saat sonrası elektroporasyon, olgunlaşma bir olgunlaşma kokteyl imal edilerek indüklendi. 48 saat sonrası elektroporasyonda,(A)Batı lekeleme yoluyla KIF knockdown verimliliği, (B) hücre canlılığı ve akış sitometrik analizleri kullanılarak(C) phenotik olgunlaşma durumu ile ilgili olarak DC'ler analiz edildi (iki farklı donörler gösterilir). "w /o EP" elektroporasyon olmadan anlamına gelir, ancak olgunlaşma sonrası indüksiyon; "post control EP" kontrol siRNA kullanarak post elektroporasyon anlamına gelir; "Post KIF1B, KIF2A, KIF1B/2A EP" KIF1B ve/veya KIF2A'ya özgü siRNA kullanılarak elektroporasyon sonrası anlamına gelir. KIF1B ve/veya KIF2A'nın ve olgun fenotipin etkin bir şekilde nakavt edildiğini doğruladıktan sonra hücreler 2 MOI kullanılarak HSV-1-enfekte (HSV-1 EGFP) idi. Veriler FCS express 5.0 kullanılarak analiz edildi. (D) Hücreler, p62'nin otophagic belirteç olarak ekspresyonunu değerlendirmek için 20 saat sonrası batı leke analizlerine tabi tutuldu. ICP5 bir enfeksiyon kontrolü ve GAPDH yükleme kontrolü olarak kullanılmıştır. A ve D şekilleri değiştirilmiş ve ©2019 Turan ve ark. orijinal JCB'de yayınlanmıştır. https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Bu protokolün kapsamı (i) insan monosit kaynaklı iDR'lerin yanı sıra mCD'lerin işlenmesini, (ii) HSV-1 ile enfeksiyonlarını, (iii) otofajisini inhibe ettikleri bilinen bileşiklerle tedavilerini ve (iv) iki kullanarak siRNA ile elektroporasyonlarını içerir. farklı teknik kurulumlar. Mevcut protokol kullanılarak, otophagic akı Ya HSV-1-enfekte iDC'lerde engellenebilir ya da HSV-1-enfekte mDC'lerde indüklenebilir.
DC'ler ve özellikle iDC'ler çok hassas hücreler olduğundan, bu hücrelerle çalışmak oldukça hassas adımlar içerir. DC üretimi için, daha yüksek hücre verimi elde etmek için taze izole edilmiş PBMC'ler kullanmanızı ve kriyopreservation önlemek için öneririz. Ayrıca, deneyler sırasında, sonraki ekimleri de dahil olmak üzere, iDC'leri kullanırken, sert veya uzun süreli sıcaklık değişikliklerini önler. Aksi takdirde, iDC'ler fenotipik değişikliklere uğrayabilir ve bu nedenle akış sitometrisi ile olgunlaşmamış fenotiplerini doğrulamak gerekir. Not, olgun muadillerinin aksine, iDC'ler CD80, CD83 ve CD8628,29gibi farklı belirteçleri, eksikliği. HSV-1 ile CD'lerin ve mDC'lerin enfeksiyonu2,3,4,5,6,10olmak üzere köklü bir yöntemdir. Biz ve diğerleri, 1 veya 2 moi kullanıldığında DC'lerin HSV-1 enfeksiyonuna karşı son derece duyarlı olduğunu gösterdik(Şekil 2). Elimize göre enfeksiyon ortamının hacmini düşük seviyelerde tutmak (250-350 μL'de 1-3 x 106 hücre) enfeksiyon veriminin daha iyi olmasını sağlayacaktır.
Belirli bir hücresel yolu müdahale etmek için klasik bir yaklaşım belirli bileşiklerin kullanımıdır. Otofaji farklı modülatörleri çeşitli, yani aktivatörler yanı sıra inhibitörleri, şu anda mevcuttur30. DCs HSV-1-indüklenen otofaji ile ilgili olarak, Turan ve ark., (2019) son zamanlarda iDC'lerde otofatik ciro üzerine spautin-1 ve bafilomycin-A1 (BA1) inhibitör etkilerini gösterdi10. Bu otofaji inhibisyonu tekniği, ne enfeksiyon oranı ne de DC'lerin olgunlaşma durumu (özellikle iDC) bozulduğu için, sonraki HSV-1 enfeksiyonu ile kombinasyon için uygundur. Gelecekteki uygulamalarda, bu inhibitör tabanlı yaklaşım diğer enfeksiyöz ajanlar, açlık gibi stres koşulları, yanı sıra farklı hücre tipleri için birlikte de uygulanabilir. Ancak, inhibitörleri kullanırken, sınırlılıklar etkili otofaji inhibisyonu için uygun konsantrasyonu belirlemede ortaya çıkar, ciddi hücre canlılığını etkilemeden. Inhibitörleri kullanırken önemli sınırlama, ancak, potansiyel off-hedef veya yan etkilerin oluşumu, hangi yanıltıcı sonuçlara yol açabilir31,32.
Mevcut protokolde yer alan otofajiile müdahale etmek için ikinci yaklaşım, siRNA33,34,35kullanılarak özel nakavt. Bir yandan, fip200 ifadesini özellikle ablate, bu nedenle iDC'lerde HSV-1-indüklenen otophagic ciro inhibe elektroporasyon cihazı kullanılır. Diğer taraftan, HSV-1-enfekte mDC'lerde otophagic akı kolaylaştırmak için elektroporasyon cihazı II kullanarak iki farklı KIF proteini (yani, KIF1B ve KIF2A) susturduk. Her iki elektroporasyon protokolü de, CD'lerde FIP200 ve MCD'lerde KIF1B/KIF2A'nın neredeyse tamamen ablasyonla sonuçlanmasına neden oldu ve bu durum Batı leke analizleri ile doğrulandı (Şekil 4A, Şekil 5A). DC'lerin canlılığını etkilemeyen elektroporasyon aparatı I'nin aksine, elektroporasyon cihazı II kullanılarak mCD'lerin elektroporasyon uyrması ölü hücrelerin biraz daha yüksek oranlarına yol açsa (Şekil 4B, Şekil 5B ). Bu nedenle, gelecekteki uygulamalarda, ben tercihen hem de, IDC ve mDC'ler için kullanılmalıdır elektroporasyon cihazı. Dikkat çekici bir şekilde, her iki siRNA tabanlı teknikler, otophagic akı modüle etmek için, ya DC veya mDC sonraki HSV-1 enfeksiyonu ile uyumludur. Ayrıca, ne IDC'lerin olgunlaşmamış fenotip ne de mDC olgun fenotip sonra elektroporasyon değiştirilir.
FIP200 spesifik siRNA kullanan iDC'lerin elektroporasyonu, gen nakavtı ve HSV-1 enfeksiyonu üzerine otophagic akı inhibisyonu için etkili ve son derece spesifik bir yöntemdir. FIP200'ün özel susturulma ek olarak, bu protokol otophagic basamak lama sırasında farklı adımlarda katılan diğer otophagic bileşenleri susturmak için uyarlanabilir. Ancak, otofaji verimli siRNA aracılı inhibisyonu için uygun hedef belirlenmesi endişe çeşitli yönlerini içerir. İlk olarak, otofaji ile ilgili genlerin knockdown verimliliği (ATG) mutlaka pozitif otofaji verimli inhibisyonu ile ilişkili değildir ve son derece susturulan belirli ATG proteinbağlıdır36. İkinci olarak, farklı ATG proteinleri ayrıca otofaji farklı yollar da yer almaktadır, böylece ablasyon da yan etkilere yol açabilir37,38,39. Üçüncü olarak, farklı ATG'ler gereksiz fonksiyonlara sahip olabilir, bu nedenle bir bileşenin yıkılması otofajiyi inhibe etmek için yeterli olmayabilir(örn., beclin-1 ve beclin-2)40.
Buna ek olarak, Dcs elektroporasyon cihazı I -tabanlı elektroporasyon protokolü de mRNA'lar için uygundur ve PBMCs25gibi ek birincil hücre tipleri, çeşitli için kullanılabilir. Bu sistem böylece farklı birincil hücre türlerine farklı RNA türleri sunmak için genel bir strateji sağlar. Sonuç olarak, iDC'lerin sonraki HSV-1 enfeksiyonu ile birlikte inhibitör veya siRNA tabanlı bir yaklaşım kullanarak, otophagic akı inhibe etmek için iki protokol salıyoruz. Ayrıca, HSV-1 enfeksiyonu üzerine mDC'lerde otofatik akı neden bir siRNA elektroporasyon yaklaşımı açıklar.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Alman Araştırma Konseyi (DFG) tarafından AS'ye verilen STE 432/11-1 projesi ve LG'ye verilen 18-12-21-1 projesi ile Tıp Fakültesi'nden (Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg) ELAN Programı ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4D-Nucleofector Core Unit (electroporation apparatus II) | Lonza (Basel, Switzerland) | AAF-1002B | |
| AB-Serum | Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | H4522 | Dendritic cell cultivation |
| ACD-A | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | 9007281 | |
| Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (electroporation kit apparatus II) | Lonza (Basel, Switzerland) | V4XP-3024 | |
| Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE Healthcare (Solingen, Germany) | RPN2232 | Western Blot Detection |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | A3678 | |
| anti-mouse-IgG (mouse, polyclonal, HRP) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 7076 | Western Blot detection |
| anti-rabbit-IgG (goat, polyclonal, HRP) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 7074 | Western Blot detection |
| Bafilomycin A1 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | tlrl-baf1 | inhibition of autophagy and lysosomal degradation |
| BD FACS Canto II Flow Cytometer | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 338962 | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | E1014 | |
| Blotting Chamber Fastblot B44 | Biometra (Göttingen, Germany) | 846-015-100 | |
| CCR7 (mouse, Pe-Cy7) | BioLegend (Fell, Germany) | 557648 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: G043H7 |
| CD11c (mouse, Pe-Cy5) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 561692 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: B-ly6 |
| CD14 (mouse, PE) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 555398 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: M5E2 |
| CD3 (mouse, FITC) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 555332 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: UCHT1 |
| CD80 (mouse, V450) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 560442 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: L307.4 |
| CD83 (mouse, APC) | eBioscience Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany) | 17-0839-41 | Flow cytometry Dilution: 1:200 Clone: HB15e |
| CD86 (mouse, PE) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 553692 | Flow cytometry Dilution: 1:100 |
| EVOS FL Cell Imaging | System AMG/Life Technologies (Carlsbad, USA) | AMF4300 | |
| FIP200 (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 12436 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D10D11 |
| GAPDH (mouse) | Merck Millipore (Massachusetts, USA) | AB2302 | Western Blot detection Dilution: 1:5000 Clone: MAB374 |
| Gene Pulser II apparatus (electroporation apparatus I) | BioRad Laboratories GmbH (München, Germany) | 165-2112 | |
| GM-CSF (4x104 U/mL) | Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) | 130-093-868 | |
| HLA?DR (mouse, APC-Cy7) | BioLegend (Fell, Germany) | 307618 | Flow cytometry Dilution: 1:200 Clone: L243 |
| HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43 | BioVex | DC infection |
|
| ICP0 (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-53070 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: 11060 |
| ICP5 (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-56989 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: 3B6 |
| IL-1β (0.1x106 U/mL) | Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany) | 1411-050 | |
| IL-4 (1x106 U/mL) | Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) | 130-093-924 | |
| IL-6 (1x106 U/mL) | Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany) | 1404-050 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare (Solingen, Germany) | 28955810 | |
| KIF1B (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-376246 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: E-12 |
| KIF2A (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-271471 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D-7 |
| LC3B (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 3868 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D11 |
| L-glutamine | Lonza (Basel, Switzerland) | 17-605E | |
| LIVE/DEAD Fixable Violet dead cell stain kit | Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) | L34964 | L/D staining in Flow cytometry |
| Lymphoprep | Alere Technologies AS (Oslo, Norway) | 04-03-9391/01 | |
| Magnesiumchloride | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | A537.1 | |
| Megafuge 2.0 RS | Heraeus (Hanau, Germany) | 75015505 | |
| N, N, N', N'-Tetramethylethylendiamine (TEMED) | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | T9281 | |
| Neubauer counting chamber | Brand (Wertheim, Germany) | 717805 | |
| Nunc Cell culture flasks (175.0 cm2) | Thermo Scientific (Rockford, USA) | 159910 | |
| p62 (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 88588 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D5L7G |
| PageRuler prestained protein ladder | Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany) | 26616 | |
| Paraformaldehyde, 16 % | Alfa Aesar, Haverhill, USA | 43368.9M | |
| PerfectSpin 24 Plus | Peqlab (Erlangen, Germany) | C2500-R-PL | |
| PGE2 (1 mg/mL) | Pfizer (Berlin, Germany) | BE130681 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza (Basel, Switzerland) | 17-512F | |
| Protein gel system MiniProtean II | Bio-Rad Laboratories GmbH (München, Germany) | 1652960 | |
| RestoreTM Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific, Rockford, USA | 21059 | |
| Rocking Platform wt 15 | Biometra (Göttingen, Germany) | 042-590 | |
| RotiBlock | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | A151.4 | |
| Roti-Load 1 (4x) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | K929.3 | |
| Rotiphorese Gel 30 (37.5:1) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 3029.1 | |
| RPMI 1640 | Lonza (Basel, Switzerland) | 12-167F | |
| Sodium dodecyl Sulfate (SDS) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 2326.2 | |
| Thermomixer comfort | Eppendorf (Hamburg, Germany) | 5355 000.011 | |
| TNF-α (10 μg/mL) | Peprotech (Hamburg, Germany) | 300-01A | |
| Tris | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 4855.3 | |
| Trypan blue solution (0.4 %) | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | T8154 | |
| Tween 20 | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 9127.1 | |
| Whatman 0.2 μm nitrocellulose membrane | GE Healthcare (Solingen, Germany) | 10600001 | |
| WhatmanTM Chromatography Paper 3 mm Chr | Fisher Scientific GmbH (Schwerte, Germany) | 3030917 |
References
- Chapuis, F., Rosenzwajg, M., Yagello, M., Ekman, M., Biberfeld, P., Gluckman, J. C. Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro. European Journal of Immunology. 27 (2), 431-441 (1997).
- Kummer, M., et al. Herpes simplex virus type 1 induces CD83 degradation in mature dendritic cells with immediate-early kinetics via the cellular proteasome. Journal of Virology. 81 (12), 6326-6338 (2007).
- Kruse, M., et al. Mature dendritic cells infected with herpes simplex virus type 1 exhibit inhibited T-cell stimulatory capacity. Journal of Virology. 74 (15), 7127-7136 (2000).
- Salio, M., Cella, M., Suter, M., Lanzavecchia, A. Inhibition of dendritic cell maturation by herpes simplex virus. European Journal of Immunology. 29 (10), 3245-3253 (1999).
- Prechtel, A. T., et al. Infection of mature dendritic cells with herpes simplex virus type 1 dramatically reduces lymphoid chemokine-mediated migration. Journal of General Virology. 86, Pt 6 1645-1657 (2005).
- Theodoridis, A. A., Eich, C., Figdor, C. G., Steinkasserer, A. Infection of dendritic cells with herpes simplex virus type 1 induces rapid degradation of CYTIP, thereby modulating adhesion and migration. Blood. 118 (1), 107-115 (2011).
- Cohrs, R. J., Gilden, D. H. Human herpesvirus latency. Brain Pathology. 11 (4), 465-474 (2001).
- Grinde, B. Herpesviruses: latency and reactivation - viral strategies and host response. Journal of Oral Microbiology. 5, (2013).
- Whitley, R. J., Roizman, B. Herpes simplex virus infections. The Lancet. 357 (9267), 1513-1518 (2001).
- Turan, A., et al. Autophagic degradation of lamins facilitates the nuclear egress of herpes simplex virus type 1. The Journal of Cell Biology. 218 (2), 508-523 (2019).
- Takeshige, K., Baba, M., Tsuboi, S., Noda, T., Ohsumi, Y. Autophagy in yeast demonstrated with proteinase-deficient mutants and conditions for its induction. The Journal of Cell Biology. 119 (2), 301-311 (1992).
- Yin, Z., Pascual, C., Klionsky, D. J. Autophagy: machinery and regulation. Microbial Cell. 3 (12), 588-596 (2016).
- Bodemann, B. O., et al. RalB and the exocyst mediate the cellular starvation response by direct activation of autophagosome assembly. Cell. 144 (2), 253-267 (2011).
- Bjorkoy, G., et al. p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death. The Journal of Cell Biology. 171 (4), 603-614 (2005).
- Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. The EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).
- Kabeya, Y., Mizushima, N., Yamamoto, A., Oshitani-Okamoto, S., Ohsumi, Y., Yoshimori, T. LC3, GABARAP and GATE16 localize to autophagosomal membrane depending on form-II formation. Journal of Cell Science. 117, Pt 13 2805-2812 (2004).
- Pankiv, S., et al. p62/SQSTM1 binds directly to Atg8/LC3 to facilitate degradation of ubiquitinated protein aggregates by autophagy. The Journal of Biological Chemistry. 282 (33), 24131-24145 (2007).
- Korolchuk, V. I., Rubinsztein, D. C. Regulation of autophagy by lysosomal positioning. Autophagy. 7 (8), 927-928 (2011).
- Li, Y., et al. A cell-based quantitative high-throughput image screening identified novel autophagy modulators. Pharmacological Research. 110, 35-49 (2016).
- Pampaloni, F., et al. A Novel Cellular Spheroid-Based Autophagy Screen Applying Live Fluorescence Microscopy Identifies Nonactin as a Strong Inducer of Autophagosomal Turnover. SLAS Discovery. 22 (5), 558-570 (2017).
- Deng, Y., Zhu, L., Cai, H., Wang, G., Liu, B. Autophagic compound database: A resource connecting autophagy-modulating compounds, their potential targets and relevant diseases. Cell Proliferation. 51 (3), 12403 (2018).
- Liu, J., et al. Beclin1 controls the levels of p53 by regulating the deubiquitination activity of USP10 and USP13. Cell. 147 (1), 223-234 (2011).
- Mauvezin, C., Neufeld, T. P. Bafilomycin A1 disrupts autophagic flux by inhibiting both V-ATPase-dependent acidification and Ca-P60A/SERCA-dependent autophagosome-lysosome fusion. Autophagy. 11 (8), 1437-1438 (2015).
- Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. Journal of Biological Chemistry. 266 (26), 17707-17712 (1991).
- Gerer, K. F., Hoyer, S., Dorrie, J., Schaft, N. Electroporation of mRNA as Universal Technology Platform to Transfect a Variety of Primary Cells with Antigens and Functional Proteins. Methods in Molecular Biology. 1499, 165-178 (2017).
- Prechtel, A. T., Turza, N. M., Theodoridis, A. A., Steinkasserer, A. CD83 knockdown in monocyte-derived dendritic cells by small interfering RNA leads to a diminished T cell stimulation. The Journal of Immunology. 178 (9), 5454-5464 (2007).
- Pfeiffer, I. A., et al. Leukoreduction system chambers are an efficient, valid, and economic source of functional monocyte-derived dendritic cells and lymphocytes. Immunobiology. 218 (11), 1392-1401 (2013).
- Villadangos, J. A., Heath, W. R. Life cycle, migration and antigen presenting functions of spleen and lymph node dendritic cells: limitations of the Langerhans cells paradigm. Seminars in Immunology. 17 (4), 262-272 (2005).
- Lechmann, M., Berchtold, S., Hauber, J., Steinkasserer, A. CD83 on dendritic cells: more than just a marker for maturation. Trends in Immunology. 23 (6), 273-275 (2002).
- Yang, Y. P., et al. Application and interpretation of current autophagy inhibitors and activators. Acta Pharmacologica Sinica. 34 (5), 625-635 (2013).
- Redmann, M., et al. Inhibition of autophagy with bafilomycin and chloroquine decreases mitochondrial quality and bioenergetic function in primary neurons. Redox Biology. 11, 73-81 (2017).
- Yan, Y., et al. Bafilomycin A1 induces caspase-independent cell death in hepatocellular carcinoma cells via targeting of autophagy and MAPK pathways. Scientific Reports. 6, 37052 (2016).
- Hale, C. M., et al. Identification of modulators of autophagic flux in an image-based high content siRNA screen. Autophagy. 12 (4), 713-726 (2016).
- Lipinski, M. M., et al. A genome-wide siRNA screen reveals multiple mTORC1 independent signaling pathways regulating autophagy under normal nutritional conditions. Developmental Cell. 18 (6), 1041-1052 (2010).
- Orvedahl, A., et al. Image-based genome-wide siRNA screen identifies selective autophagy factors. Nature. 480 (7375), 113-117 (2011).
- Staskiewicz, L., Thorburn, J., Morgan, M. J., Thorburn, A. Inhibiting autophagy by shRNA knockdown: cautions and recommendations. Autophagy. 9 (10), 1449-1450 (2013).
- Lee, I. H., et al. Atg7 modulates p53 activity to regulate cell cycle and survival during metabolic stress. Science. 336 (6078), 225-228 (2012).
- Fremont, S., Gerard, A., Galloux, M., Janvier, K., Karess, R. E., Berlioz-Torrent, C. Beclin-1 is required for chromosome congression and proper outer kinetochore assembly. EMBO Reports. 14 (4), 364-372 (2013).
- Bestebroer, J., V'kovski, P., Mauthe, M., Reggiori, F. Hidden behind autophagy: the unconventional roles of ATG proteins. Traffic. 14 (10), 1029-1041 (2013).
- Galluzzi, L., Kroemer, G. Common and divergent functions of Beclin 1 and Beclin 2. Cell Research. 23 (12), 1341-1342 (2013).
