במחקר זה, אנו מציגים מעכב-ו siRNA אסטרטגיות מבוססות להתערב השטף האוטומטי הזרע בנגיף הרפס סוג 1 (HSV-1)-הנגועים מונוציט הנגזרים התאים הדנדריטים.
וירוס הרפס סוג-1 (HSV-1) מעורר בצורה אוטומטית בשניהם, תאים דנדריטים לא בוגרים (iDCs), כמו גם תאים דנדריטים בוגרת (mDCs), ואילו שטף הזרע האוטומטי נצפה רק ב-iDCs. כדי לזכות בתובנות מכניסטיות, פיתחנו אסטרטגיות יעילות להתערב במחזור האוטומטי של HSV-1 המושרה. אסטרטגיה מבוססת מעכב, כדי לווסת את האוטומטי HSV-1 המושרה, מהווה את הבחירה הראשונה, שכן היא שיטה קלה ומהירה. כדי לעקוף את ההשפעות הפוטנציאליות מחוץ ליעד של תרכובות כאלה, פיתחנו מבוסס siRNA האסטרטגיה החלופית, כדי לווסת מחזור האנדרורגיות אוטומטי ב-iDCs על זיהום HSV-1. אכן, אלקטרופורציה של idcs עם FIP200-ספציפי sirna לפני הזיהום HSV-1 היא שיטה ספציפית מאוד ומוצלחת ביטוי FIP200 חלבון ablate אוחר ובכך לעכב שטף הידרורגיות אוטומטי. שתי שיטות מוצגות כתוצאה עיכוב יעיל של מחזור HSV-1 המושרה אוטומטי ב-iDCs, לפיה הטכניקה מבוססת siRNA הוא יותר ספציפי היעד. גישה נוספת מבוססת siRNA פותחה כדי להשתיק באופן סלקטיבי את ביטוי החלבון של KIF1B ו KIF2A, הקלה על תחלופת מחזור אוטומטי על זיהום HSV-1 ב mDCs. לסיכום, הטכניקה של sirna אלקטרופורציה מייצגת אסטרטגיה מבטיחה, כדי באופן סלקטיבי ביטוי של חלבונים ברורים לנתח את השפעתם על זיהום HSV-1.
הדור של התאים הדנדריטים הנגזרים האנושי (DCs) מהווה מודל מתאים בתחום החיצוני כדי ללמוד את הפונקציות ואת הביולוגיה של סוג זה תא החיסון החשוב. בידוד, כמו גם הבדלה של מונוציטים לתוך DCs הוקמה היטב בשנים האחרונות1,2. הזיהום של DCs עם הרפס α-her, וירוס מסוג וירוס-1 (HSV-1) משמש מערכת מודל ללמוד HSV-1-תיווך ומאפדי ביולוגיה DC2,3,4,5,6 . זה חשוב במיוחד כדי להבהיר כיצד היפסח לחלח או לעכב את התגובות החיסונית אנטי וירוס חזק, כדי ליצור השהיה של נישות החיסון המורשה בתוך המארח7,8. במובן זה, הרבה וירוסים הם פתוגנים מוצלחים מאוד, כי הם רחבים מתפשטים ברחבי האוכלוסייה להגיע sero-שכיחות של עד 90% על פי האזור הגיאוגרפי9. כדי להבין ואולי למנוע את זה, תובנות נוספות לתוך המודולוניות HSV-1 בתיווך של המערכת החיסונית של המחשב המארח, ובמיוחד של תאים חיסוניים כגון DCs, נדרשים.
התבוננות חדשה לחלוטין לגבי הגומלין של DCs עם HSV-1 פורסמה לאחרונה על ידי Turan ואח ‘10. המחברים הפגינו כי ההישג של שכפול HSV-1 תלוי לחלוטין במצב ההבשלה של DCs. ב-iDCs, השכפול השלם של HSV-1 הוא הקלה על ידי מנגנונים התלויים האוטומטית. בעוד HSV1 מעורר האוטומטית בשני, iDCs ו mDCs, שטף ההכולינרגיות האוטומטי נצפה רק ב-iDCs. זה בתורו מקלה על היציאה הגרעינית של הקפידים ויראלי באמצעות השפלה אוטומטית של הלבינים גרעינית ב-iDCs. כדי לקבל תובנות מכניסטיות לתוך מסלול השפלה זה HSV-1 המושרה ב-iDCs לעומת mDCs, אסטרטגיות חדשות ויעילות הם קריטיים כדי לחקור שטף מחדש בצורה אוטומטית.
מקרואוטומטיים האגי (תצוגה מקדימה) הוא תהליך רב שימור היטב מיקוד של חלבונים תאיים או אורגלים שלמים לעיכול ליזוזומא11. במידה מרבית, ניתן לחלק את החלקים האוטומטיים לתוך הייזום (i), (ii) התגרדת ממברנה, (iii) הרחבת שלפוחית, ו (iv) בתצוגה מקדימה של חלק היתוך שלב12. במהלך הייזום (i), רכיבים כגון מתחם ULK1/2 קינאז המופעל, המכיל את החלבון המפעיל של משפחה הדבקה קינאז של 200 kD (FIP200), הם קריטיים להפעלת מורכבות beclin-1-Vps34-AMBRA1. לאחר מכן, הנוקלאוציה ממברנה (ii) יוזם היווצרות phagophore13, אשר בולע את cartoplasmic כאשר מסומנים על ידי מולקולות כגון p6214. במהלך התרחבות שלפוחית לפוחית והתבגרות באופן אוטומטי (iii) שרשרת אור חלבון משויך 3 (LC3)-אני מומר לתוך הטופס lipidated LC3-II כי הוא מוכנס לתוך הקרום האוטומטי הפזומלית. לפיכך, שיעורי ההמרה של LC3-I-II הם מחוון של השראה אוטומטית על-ידי שיקוף היווצרות של הגוזומים האוטומטיים בוגרים15,16. על פי הוראות היתוך (iv), לא רק את המטען האוטומטי, אלא גם הקשורים p62 ו-LC3-II חלבונים עוברים השפלה (למשל, על ידי הידרוליזה). כך, אובדן של p62 ו-LC3-II לשמש סמנים עבור שטף הזרם האוטומטי17. המיזוג של הגוזומים אוטומטיים עם lysosomes, ולכן בעקבות מחזור הנקרא אוטומטית, הוא תלוי מאוד על לוקליזציה ליסוזומתאיים. זה, בין היתר, מוסדר על ידי בני משפחה KIF1B ו KIF2A, אשר הוכחו לרעה להשפיע על האוטומטי מסוימים היתוך כמה-lysosome מיזוג18. מעניין, ביטוי החלבון של KIF1B ו KIF2A הוא המושרה על התבגרות DC והוא אחראי על ובכך את השטף האוטומטי יעיל ה ב HSV-1-הנגועים mDCs, אשר הסלים השלם HSV-1 שכפול10.
ניסיונות ניסיוניים לווסת את התצוגה האוטומטית האוטומטי כוללים את השימוש של תרכובות ידוע לגרום או לעכב את השביל המסוים הזה19,20,21. במחקר זה, אנו מתארים שתי אסטרטגיות מעכבי מבוססי לחסום מחזור הכולינרגיות אוטומטי ב HSV-1-הנגועים iDCs. התרכובת הראשונה המשמשת בניסויים שלנו הוא מעכב האוטומטי והחזק מעכבי-1 (spautin-1), אשר תוארה לקדם beclin-1-Vps34-AMBRA1 מורכבים השפלה במהלך שלב החניכה של התצוגה האוטומטית22. התרכובת השנייה המשמשת במחקר הנוכחי הוא bafilomycin-A1 (BA1), מעכב V-atpase החוסם את האירועים האוטומטיים המאוחרת (כלומר, היתוך האוטומטי-lysosome פיוז’ן, כמו גם את החמצה)23,24. השימוש של אחת משתי מעכבי אלה לפני הזיהום במרכז הבינתחומי עם HSV-1 מעכב את הבחירה האוטומטית, אך אינו מפריע יעיל ביטוי גנים ויראלי. Thus, זו אסטרטגיה מבוססת מעכב לפני הזיהום HSV-1 מציע כלי רב עוצמה כדי לעכב את HSV-1 המושרה שטף ההכולינרגיות זה יכול בקלות להיות מורחבת עבור שפע של סוגים שונים של תאים ווירוסים, אשר גם פוטנציאלי לגרום אוטומטית.
כדי להתגבר על החיסרון העיקרי של גישה מבוססת מעכב (כלומר, תופעות לא ספציפיות מחוץ ליעד), פיתחנו שיטה מבוססת sirna לחסום שטף הכולינרגיות האוטומטי ב (HSV-1-נגוע) idcs. הטכניקה של sirna אלקטרופורציה מייצגת אסטרטגיה חלופית רבת עוצמה, באמצעות אבלציה סלקטיבית של הביטוי של חלבונים ברורים (כלומר, רכיבים אוטומטיים). בניסויים שלנו idcs היו electroporated עם FIP200 ספציפי sirna באמצעות מנגנון אלקטרופורציה I (לראות את לוח החומרים) ופרוטוקול שונה שתוארה על ידי gerer et al. (2017) ו prechtel ואח ‘ (2007), כדי לעכב את התצוגה האוטומטית במהלך ה שלבהחניכה 25,26. טכניקה זו אפשרה לנו במיוחד להוריד את הביטוי FIP200 ב-iDCs, מבלי להפריע לכדאיות התאים ואת הפנוטיפים בלתי בוגרים שלהם יומיים לאחר ההודעה. לציין, HSV-1 הזיהום הוקמה ב-Idporated אלה שיקוף על ידי יעיל חלבון נגיפי הביטוי. טכניקה זו מבוססת siRNA מציעה יתרון ייחודי (כלומר, כי מגוון של רכיבים שונים הניתנים לבחירה אוטומטית, גם בשילוב), ניתן לפלח במיוחד עבור אבלציה של הביטוי שלהם.
במחקר זה, אנו עוד לתאר שיטה מבוססת siRNA כדי לגרום השטף ההכולינרגיות גם ב HSV-1-הנגועים mDCs. במקרה זה, iDCs היו electroporated עם siRNA ממוקד נגד KIF1B ו KIF2A לפני התבגרות DC באמצעות מנגנון electroporated השני (ראה טבלת חומרים). מכיוון ששני החלבונים הם upregulated במהלך התבגרות DC ידוע שלילי להסדיר פיוז’ן של הגוזומים אוטומטיים עם lysosomes10,18, הנוק שלהם המושרה בחוזקה השטף השני באופן אוטומטי ב mdcs על זיהום HSV-1. כך, הטכניקה מבוססת siRNA אפשרה לנו במיוחד לזרז מחזור המולא אוטומטי באמצעות הפרעה ביטוי החלבון קיף ב mDCs, ובכך יכול ובכך לחקות את רמות הביטוי שלהם ב-iDCs.
לסיכום, אנו מציגים שתי שיטות נפרדות כדי לעכב שטף הכולינרגיות אוטומטי ב HSV-1-מושפע iDCs. בעוד הגישה המבוססת על מעכב הראשון מהווה קל, דרך זולה ומהירה להפריע השפלה האוטומטית, טכניקה מבוססת siRNA השני הוא ספציפי יותר, שיטה מתאימה מאוד לתמוך ולאמת את התוצאות של מעכב מבוססי ניסויים. בנוסף, אנו מתארים שיטה לגרום השטף הדו האוטומטי גם ב HSV-1-הנגועים mDCs, באמצעות הסתרה siRNA-מתווכת של שני חלבונים קיף.
היקף הפרוטוקול הנוכחי כולל (i) הטיפול של האדם מונוציט הנגזר iDCs, כמו גם mDCs, (ii) הזיהום שלהם עם HSV-1, (iii) הטיפול שלהם עם תרכובות ידוע לעכב את התצוגה האוטומטית, ו (iv) האלקטרופורציה שלהם עם siRNA באמצעות שני הגדרות טכניות שונות. באמצעות הפרוטוקול הנוכחי, השטף הניתן לשימוש אוטומטי יכול להיות חסום HSV-1-נגועים iDCs או המושרה ב HSV-1-הנגועים mDCs.
מאז DCs, ובמיוחד iDCs, הם תאים פגיעים מאוד, עבודה עם תאים אלה כרוך צעדים עדינים למדי. עבור דור DC, אנו ממליצים להשתמש PBMCs מבודדים טריים, וכדי להימנע הקפאת שלהם, כדי לקבל התשואות תאים גבוהים יותר. יתרה מזאת, בעת טיפול ב-iDCs במהלך ניסויים, כולל הטיפוח-תרגול הבאים, מונעים שינויים בטמפרטורה קשה או ממושכת. אחרת, iDCs יכול לעבור שינויים פנוטיפ ולכן יש צורך לאמת הפנוטיפים בלתי בוגרים שלהם על ידי זרימה cy, לנסות. הערה, בניגוד לעמיתיהם הבוגרים, idcs חסרים סמנים שונים, כגון CD80, CD83, ו CD8628,29. הזיהום של idcs ו mdcs עם HSV-1 היא שיטה מבוססת היטב2,3,4,5,6,10. אנו ואחרים הראו כי DCs הם רגישים מאוד עבור זיהום HSV-1, כאשר משרד משנה של 1 או 2 נעשה שימוש (איור 2). בידינו, שמירה על עוצמת הקול של המדיום זיהום ברמות נמוכות (1-3 x 106 תאים ב 250-350 μl) יוביל יעילות זיהום טוב יותר.
גישה קלאסית להתערב עם מסלול סלולרי נתון ברורים הוא השימוש של תרכובות ספציפיות. מגוון של מודולטורים שונים של הבחירה האוטומטית, כלומר , הפעלות כמו גם מעכבי, זמינים כעת30. לגבי HSV-1-המושרה אוטומטי הנגרמת ב DCs, Turan ואח ‘, (2019) לאחרונה הראה את ההשפעות המעעכבות של spautin-1 ו-bafilomycin-A1 (BA1) במחזור האוטומטי מחזור iDCs10. טכניקה זו עבור עיכוב משני השלבים מתאים לשילוב עם זיהום HSV-1 לאחר מכן, מאז לא שיעור זיהום ולא מעמד התבגרות של DCs (במיוחד iDCs) הוא לקוי. ביישומים עתידיים, הגישה המבוססת על מעכב זה יכולה להיות מיושמת גם בשילוב עם גורמים מדבקים אחרים, תנאי לחץ, כגון רעב, כמו גם עבור סוגי תאים שונים. עם זאת, בעת שימוש במעכבי, מגבלות עולות בקביעת הריכוז המתאים לעיכוב יעיל באופן אוטומטי של המערכת, מבלי להשפיע באופן חמור על הכדאיות התאית. המגבלה העיקרית בעת שימוש מעכבי היא, עם זאת, התרחשות של פוטנציאל מחוץ ליעד או תופעות לוואי, אשר עלול להוביל לתוצאות מטעה31,32.
הגישה השנייה כדי להפריע האוטומטית, מכוסה בפרוטוקול הנוכחי, הוא הנוק הספציפי באמצעות sirna33,34,35. מצד אחד, השתמשנו מנגנון אלקטרופורציה אני במיוחד לאחר הביטוי של FIP200, ובכך מעכב HSV-1 המושרה מחזור השני באופן אוטומטי ב-iDCs. מצד שני, השתקתי שני חלבונים שונים של הקיף (כלומר, KIF1B ו KIF2A), באמצעות מנגנון אלקטרופורציה II, כדי להקל על השטף הדו האוטומטי ב HSV-1 הנגועים mDCs. הפרוטוקולים של אלקטרופורציה הובילו לצריבה כמעט מלאה של FIP200 ב-iDCs, ו-KIF1B/KIF2A ב-mDCs, אשר אומת באמצעות ניתוחיכתמי אבן מערביים(איור 4א, איור 5א). בניגוד למנגנון אלקטרופורציה I, אשר אינו משפיע על הכדאיות של DCs, אלקטרופורציה של mDCs באמצעות מנגנון אלקטרופורציה השני מביא שיעור גבוה יותר של תאים מתים (איור 4ב’, איור 5ב ). מכאן, ביישומים עתידיים, מנגנון האלקטרופורציה אני צריך להיות מעדיף בשימוש עבור שניהם, iDCs ו-mDCs. באופן מדהים, שניהם siRNA מבוססי טכניקות, כדי לווסת שטף האנטי אוטומטי, הם תואמים HSV-1 בעקבות הזיהום של iDCs או mDCs. יתרה מזאת, לא הפנוטיפ הילדותי של iDCs או הפנוטיפים הבוגרים של mDCs שינו את הפוסט-אלקטרופורציה.
אלקטרופורציה של iDCs באמצעות FIP200-ספציפי siRNA היא שיטה יעילה וספציפית מאוד עבור הסתרה גנטית, כמו גם עיכוב של שטף הכולינרגיות אוטומטית על זיהום HSV-1. בנוסף להשתקה הספציפית של FIP200, ניתן להתאים פרוטוקול זה כדי להשתיק רכיבים אוטומטיים אחרים, המשתתפים בשלבים שונים במהלך המפל האוטומטי. עם זאת, זיהוי היעד המתאים לעיכוב יעיל siRNA-בתיווך של התצוגה האוטומטית כוללת מספר היבטים של דאגה. ראשית, מנומת יעילות של גנים הקשורים לתצוגה מקדימה (ATG) אינו בהכרח לתאם חיובי עם עיכוב יעיל של התצוגה האוטומטית והוא תלוי מאוד בחלבון ATG ספציפי כי הוא מושתק36. שנית, חלבונים atg ברורים מעורבים בנוסף מסלולים ברורים מפני התצוגה האוטומטית, ולכן אבלציה שלהם יכול גם להוביל תופעות לוואי שליליות37,38,39. שלישית, ATGs שונים עשויים להיות פונקציות עודפות, ולכן מנוק של רכיב אחד לא יכול להיות מספיק כדי לעכב את הבחירה האוטומטית (g., beclin-1 ו-beclin-2)40.
בנוסף, פרוטוקול האלקטרופורציה המבוססת על מנגנוני החשמל של DCs מתאים גם ל-mRNAs, וניתן להשתמש בו למגוון סוגי תאים ראשיים נוספים, כגון PBMCs25. מערכת זו מספקת ובכך אסטרטגיה כללית כדי לספק מינים שונים של RNA לתוך סוגי תאים הראשי השונים. לסיכום, אנו מציגים שני פרוטוקולים כדי לעכב שטף הכולינרגיות אוטומטי, על ידי שימוש בגישה מעכב או siRNA מבוססי בשילוב עם זיהום HSV-1 הבאים של iDCs. יתר על כן, אנו מתארים גישה sirna אלקטרופורציה כדי לזרז שטף הכולינרגיות ב mdcs על זיהום HSV-1.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכת על ידי מועצת המחקר הגרמנית (DFG) באמצעות הפרויקט STE 432/11-1 הוענק כמו ובאמצעות תוכנית ELAN מהפקולטה לרפואה (פרידריך-אלכסנדר-אוניברסיטת ארלנגן-נירנברג) דרך הפרויקט 18-12-21-1, שהוענקו LG.
4D-Nucleofector Core Unit (electroporation apparatus II) | Lonza (Basel, Switzerland) | AAF-1002B | |
AB-Serum | Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | H4522 | Dendritic cell cultivation |
ACD-A | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | 9007281 | |
Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (electroporation kit apparatus II) | Lonza (Basel, Switzerland) | V4XP-3024 | |
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE Healthcare (Solingen, Germany) | RPN2232 | Western Blot Detection |
Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | A3678 | |
anti-mouse-IgG (mouse, polyclonal, HRP) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 7076 | Western Blot detection |
anti-rabbit-IgG (goat, polyclonal, HRP) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 7074 | Western Blot detection |
Bafilomycin A1 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | tlrl-baf1 | inhibition of autophagy and lysosomal degradation |
BD FACS Canto II Flow Cytometer | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 338962 | |
Benzonase | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | E1014 | |
Blotting Chamber Fastblot B44 | Biometra (Göttingen, Germany) | 846-015-100 | |
CCR7 (mouse, Pe-Cy7) | BioLegend (Fell, Germany) | 557648 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: G043H7 |
CD11c (mouse, Pe-Cy5) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 561692 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: B-ly6 |
CD14 (mouse, PE) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 555398 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: M5E2 |
CD3 (mouse, FITC) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 555332 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: UCHT1 |
CD80 (mouse, V450) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 560442 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: L307.4 |
CD83 (mouse, APC) | eBioscience Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany) | 17-0839-41 | Flow cytometry Dilution: 1:200 Clone: HB15e |
CD86 (mouse, PE) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 553692 | Flow cytometry Dilution: 1:100 |
EVOS FL Cell Imaging | System AMG/Life Technologies (Carlsbad, USA) | AMF4300 | |
FIP200 (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 12436 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D10D11 |
GAPDH (mouse) | Merck Millipore (Massachusetts, USA) | AB2302 | Western Blot detection Dilution: 1:5000 Clone: MAB374 |
Gene Pulser II apparatus (electroporation apparatus I) | BioRad Laboratories GmbH (München, Germany) | 165-2112 | |
GM-CSF (4×104 U/mL) | Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) | 130-093-868 | |
HLA‐DR (mouse, APC-Cy7) | BioLegend (Fell, Germany) | 307618 | Flow cytometry Dilution: 1:200 Clone: L243 |
HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43 | BioVex | DC infection |
|
ICP0 (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-53070 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: 11060 |
ICP5 (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-56989 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: 3B6 |
IL-1β (0.1×106 U/mL) | Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany) | 1411-050 | |
IL-4 (1×106 U/mL) | Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) | 130-093-924 | |
IL-6 (1×106 U/mL) | Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany) | 1404-050 | |
ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare (Solingen, Germany) | 28955810 | |
KIF1B (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-376246 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: E-12 |
KIF2A (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-271471 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D-7 |
LC3B (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 3868 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D11 |
L-glutamine | Lonza (Basel, Switzerland) | 17-605E | |
LIVE/DEAD Fixable Violet dead cell stain kit | Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) | L34964 | L/D staining in Flow cytometry |
Lymphoprep | Alere Technologies AS (Oslo, Norway) | 04-03-9391/01 | |
Magnesiumchloride | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | A537.1 | |
Megafuge 2.0 RS | Heraeus (Hanau, Germany) | 75015505 | |
N, N, N', N'-Tetramethylethylendiamine (TEMED) | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | T9281 | |
Neubauer counting chamber | Brand (Wertheim, Germany) | 717805 | |
Nunc Cell culture flasks (175.0 cm2) | Thermo Scientific (Rockford, USA) | 159910 | |
p62 (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 88588 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D5L7G |
PageRuler prestained protein ladder | Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany) | 26616 | |
Paraformaldehyde, 16 % | Alfa Aesar, Haverhill, USA | 43368.9M | |
PerfectSpin 24 Plus | Peqlab (Erlangen, Germany) | C2500-R-PL | |
PGE2 (1 mg/mL) | Pfizer (Berlin, Germany) | BE130681 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza (Basel, Switzerland) | 17-512F | |
Protein gel system MiniProtean II | Bio-Rad Laboratories GmbH (München, Germany) | 1652960 | |
RestoreTM Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific, Rockford, USA | 21059 | |
Rocking Platform wt 15 | Biometra (Göttingen, Germany) | 042-590 | |
RotiBlock | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | A151.4 | |
Roti-Load 1 (4x) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | K929.3 | |
Rotiphorese Gel 30 (37.5:1) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 3029.1 | |
RPMI 1640 | Lonza (Basel, Switzerland) | 12-167F | |
Sodium dodecyl Sulfate (SDS) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 2326.2 | |
Thermomixer comfort | Eppendorf (Hamburg, Germany) | 5355 000.011 | |
TNF-α (10 μg/mL) | Peprotech (Hamburg, Germany) | 300-01A | |
Tris | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 4855.3 | |
Trypan blue solution (0.4 %) | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | T8154 | |
Tween 20 | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 9127.1 | |
Whatman 0.2 μm nitrocellulose membrane | GE Healthcare (Solingen, Germany) | 10600001 | |
WhatmanTM Chromatography Paper 3 mm Chr | Fisher Scientific GmbH (Schwerte, Germany) | 3030917 |