इस अध्ययन में, हम दाद सिंप्लेक्स वायरस प्रकार-1 (एचएसवी-1) संक्रमित मोनोसाइट व्युत्पन्न डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं में ऑटोफैगिक फ्रलक्स के साथ हस्तक्षेप करने के लिए अवरोधक- और siRNA आधारित रणनीतियों प्रस्तुत करते हैं।
हरपीज सिंप्लेक्स वायरस टाइप-1 (एचएसवी-1) दोनों में ऑटोफैगी प्रेरित करता है, अपरिपक्व डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं (आईडीसी) के साथ-साथ परिपक्व डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं (एमडीसी), जबकि ऑटोफैगिक फ्रलक्स केवल आईडीसी में मनाया जाता है। मशीनी अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, हमने एचएसवी-1-प्रेरित ऑटोफैगिक टर्नओवर के साथ हस्तक्षेप करने के लिए कुशल रणनीति विकसित की है। एक अवरोधक आधारित रणनीति, एचएसवी -1 प्रेरित autophagy को व्यवस्थित करने के लिए, यह एक आसान और तेजी से विधि है, क्योंकि पहली पसंद का गठन किया। ऐसे यौगिकों के संभावित विशिष्ट ऑफ-लक्ष्य प्रभावों को दरकिनार करने के लिए, हमने एचएसवी-1 संक्रमण पर आईडीसी में ऑटोफैगिक टर्नओवर को मोडाने के लिए एक वैकल्पिक siRNA-आधारित रणनीति विकसित की है। दरअसल, एचएसवी-1 संक्रमण से पहले FIP200-विशिष्ट siRNA के साथ आईडीसी के इलेक्ट्रोपोट्रेशन FIP200 प्रोटीन अभिव्यक्ति को समाप्त करने के लिए एक बहुत ही विशिष्ट और सफल तरीका है और इस तरह autophagic प्रवाह को बाधित करने के लिए। दोनों प्रस्तुत तरीकों iDCs में एचएसवी -1 प्रेरित autophagic कारोबार के कुशल निषेध में परिणाम है, जिससे siRNA आधारित तकनीक अधिक लक्ष्य विशिष्ट है. एक अतिरिक्त siRNA आधारित दृष्टिकोण चुनिंदा KIF1B और KIF2A के प्रोटीन अभिव्यक्ति मौन करने के लिए विकसित किया गया था, mDCs में एचएसवी-1 संक्रमण पर autophagic कारोबार की सुविधा. अंत में, siRNA इलेक्ट्रोपोर्शन की तकनीक एक आशाजनक रणनीति का प्रतिनिधित्व करता है, चुनिंदा अलग प्रोटीन की अभिव्यक्ति ablate करने के लिए और एक एचएसवी -1 संक्रमण पर उनके प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए.
मानव मोनोसाइट व्युत्पन्न डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं (डीसी) की पीढ़ी इस महत्वपूर्ण प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार के कार्यों और जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो मॉडल में एक उपयुक्त का गठन करती है। हाल केवर्षोंमें 1,2में अलग – अलग और डीसी में मोनोसाइट्स का विभेद अच्छी तरह से स्थापित किया गया है . जेड-हर्पीवायरस हर्पस सिंप्लेक्स वायरस टाइप-1 (एचएसवी-1) के साथ डीसी का संक्रमण डीसी जीव विज्ञान2,3,4,5,6 के एचएसवी-1-मध्यस्थ मॉडुलन का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में कार्य करता है . यह विशेष रूप से स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि दादवायरस कैसे नम या शक्तिशाली एंटीवायरल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को बाधित करते हैं, मेजबान7,8 के अंदर प्रतिरक्षा-सुविधा प्राप्त niches में विलंबता स्थापित करनेकेलिए । इस संबंध में, हर्पीवायरस बहुत सफल रोगजनक हैं जो भौगोलिक क्षेत्र9के अनुसार 90 प्रतिशत तक की सीरो-एरो-एरोसिस तक पहुंचने वाली आबादी में व्यापक रूप से फैले हुए हैं। समझने के लिए और संभवतः इस को रोकने के लिए, मेजबान की प्रतिरक्षा प्रणाली के एचएसवी-1-मध्यस्थ मॉडुलन में अधिक अंतर्दृष्टि, और विशेष रूप से प्रतिरक्षा कोशिकाओं जैसे डीसी की आवश्यकता है।
एचएसवी-1 के साथ डीसी की परस्पर क्रिया के बारे में एक पूरी तरह से नया अवलोकन हाल ही में ट्यूरन एट अल10द्वारा प्रकाशित किया गया था। लेखकों का प्रदर्शन किया है कि एचएसवी-1 प्रतिकृति की उपलब्धि सख्ती से डीसी की परिपक्वता स्थिति पर निर्भर है. आईडीसी में, एचएसवी -1 की पूरी प्रतिकृति ऑटोफैगी-निर्भर तंत्र द्वारा सुविधा प्रदान की जाती है। जबकि एचएसवी 1 दोनों, आईडीसी और एमडीसी में ऑटोफैगता पैदा करता है, ऑटोफैगिक फ्रलक्स केवल आईडीसी में मनाया जाता है। यह बदले में iDCs में परमाणु lamins के autophagic गिरावट के माध्यम से वायरल capsids के परमाणु उत्सर्जन की सुविधा. आईडीसी बनाम एमडीसी में इस एचएसवी-1-प्रेरित गिरावट मार्ग में मशीनी अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, ऑटोफैगिक फ्लक्स की जांच करने के लिए नई और कुशल रणनीतियों महत्वपूर्ण हैं।
मैक्रोऑटोफैगी (ऑटोफैगी) एक अच्छी तरह से संरक्षित बहुचरण प्रक्रिया है जो लाइसोसोमल पाचन11के लिए इंट्रासेल्यूलर प्रोटीन या पूरे ऑर्गेनाइन्स को लक्षित करती है। सिम्पलिस्टिक रूप से, स्वभोजिता को (i) दीक्षा, (पप) झिल्ली नाभिक, (पपप) आशय विस्तार, और (iv) स्व-भोजन-lysosome संलयन चरण12में विभाजित किया जा सकता है। दीक्षा के दौरान (i), सक्रिय ULK1/2 kinase परिसर के रूप में घटक, 200 केडी (FIP200) के फोकल आसंजन kinase परिवार बातचीत प्रोटीन युक्त, beclin-1-Vps34-AMBRA1 परिसर को सक्रिय करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. इसके बाद, झिल्ली नाभिक (पप) फागोफोर गठन13की शुरुआत करती है जो कोशिकाद्रव्यी कार्गोओं को घेर लेती है जो च6214जैसे अणुओं से चिह्नित होती हैं। आशय विस्तार और ऑटोफैगोफोर परिपक्वता के दौरान (iii) microtubule-संबद्ध प्रोटीन प्रकाश श्रृंखला 3 (LC3)-मैं अपने lipidated रूप LC3-II है कि autophagosomal झिल्ली में डाला जाता है में परिवर्तित कर दिया जाता है. इस प्रकार, एलसी 3-I से -II रूपांतरण दर परिपक्व स्वाक्षरी के गठन को प्रतिबिंबित करके स्वभोजी प्रेरण के लिए एक संकेतक है15,16. ऑटोफागोसम-लाइसोम संलयन (iv) पर, न केवल ऑटोफैगिक कार्गो बल्कि जुड़े p62 और LC3-II प्रोटीन भी निम्नीकरण से गुजरना (जैसे, हाइड्रोलिसिस द्वारा)। इस प्रकार च62 तथा एलसी 3-II की हानि स्वाक्षाभी फ्रलक्स17के लिए मार्कर के रूप में कार्य करती है। लाइसोसोम के साथ ऑटोफैगोसोम का संलयन, और इस प्रकार स्वाक्षाभ कारोबार के बाद, इंट्रासेल्यूलर लाइसोसोमल स्थानीयकरण पर अत्यधिक निर्भर है। यह है, दूसरों के अलावा, kinesin परिवार के सदस्यों KIF1B और KIF2A द्वारा विनियमित, जो नकारात्मक autophagosome-lysosome संलयन18को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया था. दिलचस्प है, KIF1B और KIF2A के प्रोटीन अभिव्यक्ति डीसी परिपक्वता पर प्रेरित है और इस तरह एचएसवी -1 संक्रमित mDCs में अक्षम autophagic प्रवाह के लिए जिम्मेदार है, जो पूरा एचएसवी -1 प्रतिकृति10बाधा.
स्वत: भोजन को रोकने के प्रायोगिक प्रयासों में इस विशेष मार्ग को प्रेरित करने या बाधित करने के लिए जाने जाने वाले यौगिकों का उपयोग19,20,21शामिल है . इस अध्ययन में, हम एचएसवी-1-संक्रमित आईडीसी में ऑटोफैगिक कारोबार को रोकने के लिए दो अवरोधक-आधारित रणनीतियों का वर्णन करते हैं। हमारे प्रयोगों में प्रयुक्त पहला यौगिक विशिष्ट और शक्तिशाली autophagy अवरोध करनेवाला-1 (spautin-1) है, जो beclin-1-Vps34-AMBRA1 जटिल गिरावट को बढ़ावा देने के लिए वर्णित किया गया था autophagy22के दीक्षा चरण के दौरान . वर्तमान अध्ययन में प्रयुक्त दूसरा यौगिक bafilomycin-A1 (BA1), एक वी-ATPase अवरोध करनेवाला है कि देर autophagic घटनाओं ब्लॉक(यानी, autophagosome-lysosome संलयन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से autolysosome अम्लीकरण)23,24. एचएसवी -1 के साथ आईडीसी संक्रमण से पहले इन दोनों अवरोधकों में से किसी का उपयोग पर्याप्त रूप से ऑटोफैगी को रोकता है, लेकिन कुशल वायरल जीन अभिव्यक्ति को परेशान नहीं करता है। इस प्रकार, एचएसवी-1 संक्रमण से पहले यह अवरोधक-आधारित रणनीति एचएसवी -1-प्रेरित ऑटोफैगिक फ्लक्स को बाधित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करती है जिसे आसानी से विभिन्न सेल प्रकारों और वायरस के ढेर सारे के लिए विस्तारित किया जा सकता है, जो संभावित रूप से ऑटोफैगी को भी प्रेरित करता है।
एक अवरोधक आधारित दृष्टिकोण (यानी, विशिष्ट ऑफ-लक्ष्य प्रभाव) के एक प्रमुख नकारात्मक पक्ष को दूर करने केलिए, हमने एक siRNA-आधारित विधि विकसित की है ताकि ऑटोफैगिक फ्रलक्स को अवरुद्ध किया जा सके (एचएसवी-1-संक्रमित) iDCs. SiRNA इलेक्ट्रोपोरिकेशन की तकनीक एक शक्तिशाली वैकल्पिक रणनीति का प्रतिनिधित्व करता है, अलग प्रोटीन की अभिव्यक्ति के चयनात्मक ablation के माध्यम से (यानी, autophagic घटकों). हमारे प्रयोगों में iDCs FIP200-विशिष्ट siRNA के साथ विद्युतीकृत किया गया इलेक्ट्रोपोरेशन उपकरण I का उपयोग कर (सामग्री की तालिकादेखें) और एक संशोधित प्रोटोकॉल Gerer एट अल द्वारा वर्णित (2017) और Prechtel एट अल (2007), के दौरान autophagy को बाधित करने के लिए दीक्षा चरण25,26. इस तकनीक हमें विशेष रूप से iDCs में FIP200 अभिव्यक्ति दस्तक करने के लिए अनुमति दी, सेल व्यवहार्यता और उनके अपरिपक्व phenotype दो दिन के बाद electroporation के साथ हस्तक्षेप के बिना. ध्यान देने योग्य, एचएसवी-1 संक्रमण इन इलेक्ट्रोपोरेटेड आईडीडीसी में स्थापित किया गया था जो कुशल वायरल प्रोटीन अभिव्यक्ति से प्रतिबिंबित होता है। इस siRNA आधारित तकनीक एक अद्वितीय लाभ प्रदान करता है (यानी, कि विभिन्न autophagic घटकों की एक किस्म, यहां तक कि संयोजन में), विशेष रूप से उनकी अभिव्यक्ति के ablation के लिए लक्षित किया जा सकता है.
इस अध्ययन में, हम आगे एचएसवी-1 संक्रमित mDCs में भी autophagic प्रवाह प्रेरित करने के लिए एक siRNA आधारित विधि का वर्णन. इस मामले में, iDCs को इलेक्ट्रोपोरेशन II का उपयोग करके डीसी परिपक्वता से पहले KIF1B और KIF2A के विरुद्ध लक्षित siRNA के साथ विद्युतीकृत किया गया था (सामग्री की तालिकादेखें)। चूंकि दोनों प्रोटीन डीसी परिपक्वता के दौरान विनियमित होते हैं और lysosomes10,18के साथ autophagosomes के संलयन को नकारात्मक रूप से विनियमित करने के लिए जाना जाता है , उनके knockdown दृढ़ता से प्रेरित HSV-1 संक्रमण पर mDCs में autophagic प्रवाह. इस प्रकार, siRNA आधारित तकनीक हमें विशेष रूप से mDCs में KIF प्रोटीन अभिव्यक्ति के साथ हस्तक्षेप के माध्यम से autophagic कारोबार प्रेरित करने के लिए सक्षम है, और इस तरह iDCs में अपनी अभिव्यक्ति के स्तर की नकल कर सकता है.
संक्षेप में, हम एचएसवी-1-संक्रमित आईडीसी में ऑटोफैगिक फ्रलक्स को बाधित करने के लिए दो अलग-अलग तरीके प्रस्तुत करते हैं। जबकि पहले अवरोधक आधारित दृष्टिकोण autophagic गिरावट के साथ हस्तक्षेप करने के लिए एक आसान, सस्ते और तेजी से तरीका का गठन, दूसरी siRNA आधारित तकनीक अधिक विशिष्ट और समर्थन और अवरोधकरनेवाला के परिणामों को सत्यापित करने के लिए एक बहुत ही उपयुक्त तरीका है आधारित प्रयोगों. इसके अलावा, हम दो KIF प्रोटीन के siRNA-मध्यस्थ दस्तक के माध्यम से, एचएसवी-1 संक्रमित mDCs में भी autophagic प्रवाह प्रेरित करने के लिए एक विधि का वर्णन.
वर्तमान प्रोटोकॉल के दायरे में (i) मानव मोनोसाइट व्युत्पन्न आईडीसी के साथ-साथ एमडीसी की हैंडलिंग, (ii) एचएसवी-1 के साथ उनका संक्रमण, (iii) ऑटोफैगी को बाधित करने के लिए ज्ञात यौगिकों के साथ उनका उपचार, और (iv) दो का उपयोग करके सरना के साथ उनके इलेक्ट्रोपोट्रेशन विभिन्न तकनीकी setups. वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग करना, autophagic प्रवाह या तो HSV-1 संक्रमित iDCs में अवरुद्ध किया जा सकता है या एचएसवी -1 संक्रमित एमडीसी में प्रेरित.
चूंकि डीसी, और विशेष रूप से iDCs, बहुत कमजोर कोशिकाओं रहे हैं, इन कोशिकाओं के साथ काम करने के बजाय नाजुक कदम शामिल है. डीसी पीढ़ी के लिए, हम ताजा अलग PBMCs का उपयोग करने के लिए अनुशंसा करते हैं, और उनके cryopservation से बचने के लिए, उच्च सेल पैदावार प्राप्त करने के लिए. इसके अलावा, जब उनके बाद की खेती सहित प्रयोगों के दौरान iDCs हैंडलिंग, कठोर या लंबे समय तक तापमान परिवर्तन को रोकने के. अन्यथा, iDCs phenotypic परिवर्तन से गुजरना हो सकता है और इस प्रकार यह प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा उनके अपरिपक्व phenotype सत्यापित करने के लिए आवश्यक है. नोट करें, अपने परिपक्व समकक्षों के विपरीत, iDCs में अलग-अलग मार्कर की कमी होती है, जैसे CD80, CD83 और CD8628,29. एचएसवी -1 के साथ आईडीसी और एमडीसी का संक्रमण एक सुस्थापित विधि2,3,4,5,6,10है . हम और दूसरों से पता चला है कि डीसी एचएसवी -1 संक्रमण के लिए अत्यधिक संवेदनशील हैं, जब 1 या 2 के एक MOI इस्तेमाल किया गया है (चित्र 2) . हमारे हाथों में, कम स्तर पर संक्रमण माध्यम की मात्रा रखने (1-3 x 106 कोशिकाओं में 250-350 $L) बेहतर संक्रमण क्षमता के लिए नेतृत्व करेंगे.
एक दिया अलग सेलुलर मार्ग के साथ हस्तक्षेप करने के लिए एक शास्त्रीय दृष्टिकोण विशिष्ट यौगिकों का उपयोग है. ऑटोफैगी के विभिन्न न्यूनाधिक की एक किस्म, यानी उत्प्रेरक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से inhibitors, वर्तमान में उपलब्ध हैं30. के बारे में एचएसवी-1 प्रेरित autophagy में डीसी, Turan एट अल., (2019) हाल ही में iDCs10में autophagic कारोबार पर spautin-1 और bafilomycin-A1 (BA1) के निरोधात्मक प्रभाव से पता चला. autophagy निषेध के लिए इस तकनीक के बाद एचएसवी -1 संक्रमण के साथ संयोजन के लिए उपयुक्त है, के बाद से न तो संक्रमण की दर और न ही डीसी (विशेष रूप से iDCs) की परिपक्वता स्थिति बिगड़ा है. भविष्य के अनुप्रयोगों में, इस अवरोधक आधारित दृष्टिकोण भी अन्य संक्रामक एजेंटों के साथ संयोजन में लागू किया जा सकता है, तनाव की स्थिति, जैसे भुखमरी के रूप में, साथ ही विभिन्न सेल प्रकार के लिए. हालांकि, inhibitors का उपयोग करते समय, सीमाओं सेल व्यवहार्यता को गंभीर रूप से प्रभावित किए बिना, कुशल autophagy अवरोध के लिए उपयुक्त एकाग्रता का निर्धारण करने में उत्पन्न होते हैं। तथापि, अवरोधकों का उपयोग करते समय प्रमुख सीमा संभावित ऑफ-लक्ष्य या प्रतिकूल प्रभावों की घटना है, जिसके परिणामस्वरूप भ्रामक परिणाम31,32हो सकते हैं.
वर्तमान प्रोटोकॉल में शामिल ऑटोफैगी में हस्तक्षेप करने का दूसरा दृष्टिकोण, सिराना33,34,35का उपयोग करते हुए विशिष्ट नॉकडाउन है . एक तरफ, हम इलेक्ट्रोपोरेशन उपकरण मैं विशेष रूप से FIP200 की अभिव्यक्ति ablate करने के लिए इस्तेमाल किया, जिससे iDCs में एचएसवी-1 प्रेरित autophagic कारोबार को बाधित. दूसरी ओर, हम दो अलग KIF प्रोटीन मौन (यानी, KIF1B और KIF2A), विद्युत उपकरण द्वितीय का उपयोग कर, एचएसवी-1 संक्रमित mDCs में autophagic प्रवाह की सुविधा के लिए. दोनों इलेक्ट्रोपोट्रेशन प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप आईडीसी में FIP200 का लगभग पूर्ण अपाहिज हो गया, और एमडीसी में KIF1B/KIF2A, जिसे पश्चिमी धब्बा विश्लेषण ों के माध्यम से सत्यापित किया गया था (चित्र 4ए, चित्र 5ए)। इलेक्ट्रोपोट्रेशन उपकरण I के विपरीत, जो डीसी की व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करता है, विद्युत उपकरण II का उपयोग करके एमडीसी के इलेक्ट्रोपोट्रेशन का परिणाम मृत कोशिकाओं की थोड़ी अधिक दरों में होता है(चित्र 4ठ, चित्र 5ठ ). इसलिए, भविष्य के अनुप्रयोगों में, इलेक्ट्रोपोर्शन उपकरण मैं वरीयता दोनों के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, iDCs और mDCs. उल्लेखनीय है, दोनों siRNA आधारित तकनीक, autophagic प्रवाह को मॉड्युलेट करने के लिए, या तो आईडीसी या mDCs के बाद एचएसवी -1 संक्रमण के साथ संगत कर रहे हैं. इसके अलावा, न तो आईडीसी के अपरिपक्व phenotype और न ही एमडीसी के परिपक्व phenotype पोस्ट इलेक्ट्रोपोट्रेशन बदल दिया है.
FIP200-विशिष्ट siRNA का उपयोग कर iDCs के विद्युतीकरण जीन knockdown के लिए एक कुशल और अत्यधिक विशिष्ट विधि के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एचएसवी-1 संक्रमण पर autophagic प्रवाह के निषेध है. FIP200 के विशिष्ट silencing के अलावा, इस प्रोटोकॉल autophagic झरना के दौरान विभिन्न चरणों में भाग लेने, अन्य autophagic घटकों मौन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. तथापि, ऑटोफैगी के कुशल siRNA-मध्यस्थ निषेध के लिए उपयुक्त लक्ष्य की पहचान करने में चिंता के कई पहलू शामिल हैं। सबसे पहले, autophagy से संबंधित जीन (ATG) की दस्तक दक्षता जरूरी autophagy के कुशल निषेध के साथ सकारात्मक सहसंबंधित नहीं है और विशिष्ट ATG प्रोटीन है कि मौन36है पर अत्यधिक निर्भर है. दूसरे , अलग ATG प्रोटीन अतिरिक्त autophagy से अलग रास्ते में शामिल कर रहे हैं, इस प्रकार उनके ablation भी प्रतिकूल दुष्प्रभाव हो सकता है37,38,39. तीसरे, विभिन्न ATGs अनावश्यक कार्य हो सकता है, इस प्रकार एक घटक की दस्तक autophagy को बाधित करने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है(उदा., beclin-1 और beclin-2)40.
इसके अलावा, इलेक्ट्रोपोरिओशन तंत्र मैं आधारित इलेक्ट्रोपोरेशन प्रोटोकॉल डीसी के mRNAs के लिए भी उपयुक्त है, और अतिरिक्त प्राथमिक सेल प्रकार की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे PBMCs25. इस प्रकार यह प्रणाली अलग-अलग प्राथमिक कोशिकाओं में भिन्न आरएनए प्रजातियों को वितरित करने के लिए एक सामान्य कार्यनीति प्रदान करती है। अंत में, हम autophagic प्रवाह को बाधित करने के लिए दो प्रोटोकॉल मौजूद, या तो एक अवरोध करनेवाला का उपयोग करके- या iRNA आधारित iDCs के बाद एचएसवी -1 संक्रमण के साथ संयुक्त दृष्टिकोण. इसके अलावा, हम एचएसवी-1 संक्रमण पर एमडीसी में ऑटोफैगिक फ्रलक्स पैदा करने के लिए एक siRNA इलेक्ट्रोपोट्रेशन दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को जर्मन अनुसंधान परिषद (DFG) द्वारा परियोजना STE 432/11-1 के माध्यम से सहायता प्रदान की गई थी एएस को और चिकित्सा संकाय से ELAN कार्यक्रम द्वारा प्रदान किया गया (Friedich-Alexander-Universit-t Erlangen-Nrnberg) परियोजना के माध्यम से 18-12-21-1, एलजी को दी.
4D-Nucleofector Core Unit (electroporation apparatus II) | Lonza (Basel, Switzerland) | AAF-1002B | |
AB-Serum | Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | H4522 | Dendritic cell cultivation |
ACD-A | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | 9007281 | |
Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (electroporation kit apparatus II) | Lonza (Basel, Switzerland) | V4XP-3024 | |
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE Healthcare (Solingen, Germany) | RPN2232 | Western Blot Detection |
Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | A3678 | |
anti-mouse-IgG (mouse, polyclonal, HRP) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 7076 | Western Blot detection |
anti-rabbit-IgG (goat, polyclonal, HRP) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 7074 | Western Blot detection |
Bafilomycin A1 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | tlrl-baf1 | inhibition of autophagy and lysosomal degradation |
BD FACS Canto II Flow Cytometer | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 338962 | |
Benzonase | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | E1014 | |
Blotting Chamber Fastblot B44 | Biometra (Göttingen, Germany) | 846-015-100 | |
CCR7 (mouse, Pe-Cy7) | BioLegend (Fell, Germany) | 557648 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: G043H7 |
CD11c (mouse, Pe-Cy5) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 561692 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: B-ly6 |
CD14 (mouse, PE) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 555398 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: M5E2 |
CD3 (mouse, FITC) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 555332 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: UCHT1 |
CD80 (mouse, V450) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 560442 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: L307.4 |
CD83 (mouse, APC) | eBioscience Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany) | 17-0839-41 | Flow cytometry Dilution: 1:200 Clone: HB15e |
CD86 (mouse, PE) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 553692 | Flow cytometry Dilution: 1:100 |
EVOS FL Cell Imaging | System AMG/Life Technologies (Carlsbad, USA) | AMF4300 | |
FIP200 (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 12436 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D10D11 |
GAPDH (mouse) | Merck Millipore (Massachusetts, USA) | AB2302 | Western Blot detection Dilution: 1:5000 Clone: MAB374 |
Gene Pulser II apparatus (electroporation apparatus I) | BioRad Laboratories GmbH (München, Germany) | 165-2112 | |
GM-CSF (4×104 U/mL) | Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) | 130-093-868 | |
HLA‐DR (mouse, APC-Cy7) | BioLegend (Fell, Germany) | 307618 | Flow cytometry Dilution: 1:200 Clone: L243 |
HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43 | BioVex | DC infection |
|
ICP0 (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-53070 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: 11060 |
ICP5 (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-56989 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: 3B6 |
IL-1β (0.1×106 U/mL) | Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany) | 1411-050 | |
IL-4 (1×106 U/mL) | Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) | 130-093-924 | |
IL-6 (1×106 U/mL) | Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany) | 1404-050 | |
ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare (Solingen, Germany) | 28955810 | |
KIF1B (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-376246 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: E-12 |
KIF2A (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-271471 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D-7 |
LC3B (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 3868 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D11 |
L-glutamine | Lonza (Basel, Switzerland) | 17-605E | |
LIVE/DEAD Fixable Violet dead cell stain kit | Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) | L34964 | L/D staining in Flow cytometry |
Lymphoprep | Alere Technologies AS (Oslo, Norway) | 04-03-9391/01 | |
Magnesiumchloride | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | A537.1 | |
Megafuge 2.0 RS | Heraeus (Hanau, Germany) | 75015505 | |
N, N, N', N'-Tetramethylethylendiamine (TEMED) | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | T9281 | |
Neubauer counting chamber | Brand (Wertheim, Germany) | 717805 | |
Nunc Cell culture flasks (175.0 cm2) | Thermo Scientific (Rockford, USA) | 159910 | |
p62 (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 88588 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D5L7G |
PageRuler prestained protein ladder | Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany) | 26616 | |
Paraformaldehyde, 16 % | Alfa Aesar, Haverhill, USA | 43368.9M | |
PerfectSpin 24 Plus | Peqlab (Erlangen, Germany) | C2500-R-PL | |
PGE2 (1 mg/mL) | Pfizer (Berlin, Germany) | BE130681 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza (Basel, Switzerland) | 17-512F | |
Protein gel system MiniProtean II | Bio-Rad Laboratories GmbH (München, Germany) | 1652960 | |
RestoreTM Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific, Rockford, USA | 21059 | |
Rocking Platform wt 15 | Biometra (Göttingen, Germany) | 042-590 | |
RotiBlock | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | A151.4 | |
Roti-Load 1 (4x) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | K929.3 | |
Rotiphorese Gel 30 (37.5:1) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 3029.1 | |
RPMI 1640 | Lonza (Basel, Switzerland) | 12-167F | |
Sodium dodecyl Sulfate (SDS) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 2326.2 | |
Thermomixer comfort | Eppendorf (Hamburg, Germany) | 5355 000.011 | |
TNF-α (10 μg/mL) | Peprotech (Hamburg, Germany) | 300-01A | |
Tris | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 4855.3 | |
Trypan blue solution (0.4 %) | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | T8154 | |
Tween 20 | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 9127.1 | |
Whatman 0.2 μm nitrocellulose membrane | GE Healthcare (Solingen, Germany) | 10600001 | |
WhatmanTM Chromatography Paper 3 mm Chr | Fisher Scientific GmbH (Schwerte, Germany) | 3030917 |