본 연구에서, 우리는 헤르페스 심플렉스 바이러스 타입-1(HSV-1)-감염된 단핵구 유래 수지상 세포에서 자가파전 유속을 방해하는 억제제 및 siRNA 기반 전략을 제시한다.
포진 심플렉스 바이러스 유형-1 (HSV-1)은 성숙 한 수지상 세포 (iDC)뿐만 아니라 성숙한 수지상 세포 (mDC)에서 자가 포식을 유도하는 반면, 자가 파동은 iDC에서만 관찰됩니다. 기계적 통찰력을 얻기 위해, 우리는 HSV-1 유도 자가 전환에 방해하기 위해 효율적인 전략을 개발했다. 억제제 기반 전략, HSV-1 유도 자가 포식을 조절하는 것은 쉽고 빠른 방법이기 때문에 첫 번째 선택을 구성한다. 이러한 화합물의 잠재적비특이적 오프 타겟 효과를 우회하기 위해, 우리는 HSV-1 감염시 iDC의 자가 파기 회전율을 조절하는 대체 siRNA 기반 전략을 개발했습니다. 실제로, HSV-1 감염 이전에 FIP200 특이적 siRNA를 이용한 iDC의 전기천공은 FIP200 단백질 발현을 제거하여 자가파장 증류를 억제하는 매우 구체적이고 성공적인 방법이다. 제시된 두 방법 모두 iDC에서 HSV-1 유도 자가관회전의 효율적인 억제를 초래하며, 이에 의해 siRNA 기반 기술은 보다 표적 특이적이다. 추가 siRNA 기지를 둔 접근은 MDC에 있는 HSV-1 감염에 자동 파기 회전율을 촉진하는 KIF1B와 KIF2A의 단백질 발현을 선택적으로 침묵하기 위하여 개발되었습니다. 결론적으로, siRNA 전기 천공의 기술은 선택적으로 명백한 단백질의 표현을 포기하고 HSV-1 감염에 그들의 영향을 분석하기 위하여 유망한 전략을 나타냅니다.
인간 단핵구 유래 수지상 세포(DC)의 생성은 이 중요한 면역 세포 유형의 기능 및 생물학을 연구하는 적절한 시험관 내 모델을 구성한다. 단핵구를 DC로의 분리뿐만 아니라 최근 몇 년 동안 잘 확립되어 있다1,2. α-헤르페스 바이러스 포진 포진 을 가진 DC의 감염심플렉스 바이러스 타입-1 (HSV-1)은 DC 생물학2,3,4,5,6의 HSV-1 매개 변조를 연구하는 모델 시스템역할을 합니다. . 이는 헤르페스바이러스가 강력한 항바이러스 면역 반응을 약화 또는 억제하는 방법을 해명하고, 숙주7,8내부의 면역 특권 틈새시장에서 대기 시간을 확립하는 데 특히 중요하다. 이와 관련하여 헤르페스바이러스는 지역9에따라 최대 90%의 혈청 유병률에 이르는 인구 전체에 걸쳐 광범위하게 퍼지는 매우 성공적인 병원체이다. 이해하고 가능하게 이것을 방지하기 위하여는, 호스트의 면역 계통의 HSV-1 중재한 변조, 특히 DC와 같은 면역 세포의 더 많은 통찰력이 요구됩니다.
HSV-1과 DC의 상호 작용에 관한 완전히 새로운 관찰은 최근 투란 등10에의해 출판되었다 . 저자는 HSV-1 복제의 성취가 DC의 성숙 상태에 엄격하게 의존한다는 것을 보여주었습니다. iDC에서 HSV-1의 완전한 복제는 자가 포식 의존적 메커니즘에 의해 촉진됩니다. HSV1은 iDC와 mDC 모두에서 자가 포식을 유도하는 반면, 자동 파기 플럭스는 iDC에서만 관찰됩니다. 이것은 차례로 iDC에 있는 핵 적층의 autophagic 분해를 통해 바이러스성 capsids의 핵 출구를 용이하게 합니다. iDC와 mDC의 HSV-1 유도 열화 경로에 대한 기계적 통찰력을 얻으려면 자율 유속을 조사하는 새롭고 효율적인 전략이 중요합니다.
대식세포증(autophagy)은 리소좀 소화를 위한 세포내 단백질 또는 전체 세포기관을 표적으로 하는 잘 보존된 다단계과정(11)이다. 단순하게, 자가포식은 (i) 개시, (ii) 막 핵형성, (iii) 소포 팽창 및 (iv) 자가식포성-리소좀 융합상12단계로나눌 수 있다. 개시 시(i), 활성화된 ULK1/2 키나아제 복합체와 같은 성분, 200 kD(FIP200)의 국소 접착 키나아제 계열 상호작용 단백질을 함유하는 성분은 베클린-1-Vps34-AMBRA1 복합체를 활성화시키는 데 매우 중요하다. 이어서, 막 핵형성(ii)은 p6214와같은 분자에 의해 표시되는 세포질 화물을 삼키는 식서포형성(13)을개시한다. 소포 팽창 및 자가포종 성숙(iii) 미세관 관련 단백질 라이트 체인 3(LC3)-I는 자가포식 막 내로 삽입되는 그의 지질 형태 LC3-II로 전환된다. 따라서, LC3-I to -II 전환율은 성숙한 자가포식의 형성을 미러링함으로써 자가포식 유도에 대한지표(15,16)이다. 자가식-리소좀 융합(iv)에 따라, 자가포식 화물뿐만 아니라 관련 p62 및 LC3-II 단백질도 분해(예를 들어, 가수분해에 의해)를 겪습니다. 따라서, p62 및 LC3-II의 손실은 자가파색플럭스(17)에대한 마커로서 역할을 한다. 자가 식기와 리소좀의 융합, 따라서 autophagic 회전율을 따르는, 세포 내 리소좀 국소화에 크게 의존한다. 이는, 다른 사람의 사이에서, 키네신 가족 구성원 KIF1B 및 KIF2A에 의해 조절되며, 이는 자가식포성-리소좀융합18에부정적인 영향을 미치는 것으로 나타났다. 흥미롭게도, KIF1B 및 KIF2A의 단백질 발현은 DC 성숙시 유도되고, 이로인 하여 완전한 HSV-1 복제10을방해하는 HSV-1 감염mDC에서 비효율적인 자가파전 플럭스를 담당한다.
자가포식을 조절하려는 실험적 시도는 이러한 특정 경로를 유도또는 억제하는 것으로 알려진 화합물의 사용을 포함한다19,20,21. 이 연구에서는, 우리는 HSV-1 감염한 iDC에 있는 자동 파기 회전율을 막기 위하여 2개의 억제제 기지를 둔 전략을 기술합니다. 실험에 사용된 제1 화합물은 특이적이고 강력한 자가포식 억제제-1(spautin-1)이며, 이는 자가포식22의개시 단계 동안 베클린-1-Vps34-AMBRA1 복합 분해를 촉진하도록 기술되었다. 본 연구에서 사용되는 두 번째 화합물은 바필로마이신-A1(BA1), 후기 자가파전 성사건(즉, 자가포아고솜-리소좀 융합뿐만 아니라 자가리소좀 산성화)을 차단하는 V-ATPase 억제제(23,24)이다. HSV-1을 가진 iDC 감염의 앞에 이 2개의 억제제의 사용은 강력하게 autophagy를 억제합니다, 그러나 능률적인 바이러스성 유전자 발현을 방해하지 않습니다. 따라서, HSV-1 감염 이전에 이러한 억제제 기반 전략은 HSV-1 유도자가증 플럭스를 억제하는 강력한 도구를 제공하며, 이는 또한 잠재적으로 자가포식을 유도할 수 있는 다양한 세포 유형 및 바이러스에 대해 쉽게 확장될 수 있다.
억제제 기반 접근법(즉, 비특이적 오프 타겟 효과)의 주요 단점을 극복하기 위해, 우리는 (HSV-1-감염된) iDC에서 자가파전 플럭스를 차단하는 siRNA 기반 방법을 개발했습니다. siRNA 전기 천공의 기술은 뚜렷한 단백질 (즉, 자가 파기 성분)의 발현의 선택적 절제를 통해 강력한 대체 전략을 나타냅니다. 본 실험에서 iDC는 전기개질 장치 I(재료 표참조)을 사용하여 FIP200 특이적 siRNA로 전기포판화되었고, Gerer et al.(2017) 및 Prechtel et al.(2007)에 의해 기술된 변형된 프로토콜을 사용하여, 동안자가포를 억제하였다. 개시 단계25,26. 이 기술을 통해 우리는 세포 생존 가능성과 미성숙한 표현형을 이틀 후 전기 천공 을 방해하지 않고 iDC에서 FIP200 발현을 구체적으로 무너뜨릴 수 있었습니다. 주목할 만한, HSV-1 감염 효율적인 바이러스 성 단백질 발현에 의해 미러링 이러한 전기 iDC에서 설립 되었다. 이러한 siRNA 기반 기술은 독특한 이점(즉, 다양한 상이한 자가관성 성분이 조합되어 있음)을 제공하며, 특히 그들의 발현의 절제에 대해 표적화될 수 있다.
본 연구에서, 우리는 HSV-1 감염 mDC에서도 자가파전 플럭스를 유도하는 siRNA 기반 방법을 더 설명한다. 이 경우, iDC는 전기천공 장치 II를 사용하여 DC 성숙 전에 KIF1B 및 KIF2A를 대상으로 하는 siRNA로 전기포질하였다(재료 표참조). 두 단백질은 DC 성숙 동안 upregulated 및 리소좀과 autophagosomes의 융합을 부정적으로 조절하는 것으로 알려져 있기 때문에10,18,그들의 녹다운은 HSV-1 감염시 mDC에서 강하게 유도된 autophagic 플럭스를 유도했습니다. 따라서, siRNA 기반 기술은 mDC에서 KIF 단백질 발현을 방해함으로써 자가전율을 구체적으로 유도할 수 있게 되었고, 이에 따라 iDC에서의 발현 수준을 모방할 수 있었다.
요약하면, 우리는 HSV-1 감염된 iDC에서 자가파전 유속을 억제하는 두 가지 뚜렷한 방법을 제시한다. 첫 번째 억제제 기반 접근법은 자가 파기 성 분해를 방해하는 쉽고 저렴하고 빠른 방법을 구성하지만, 두 번째 siRNA 기반 기술은 억제제 기반의 결과를 지원하고 확인하는 데 보다 구체적이고 매우 적합한 방법입니다. 실험. 또한, 우리는 두 KIF 단백질의 siRNA 매개 녹다운을 통해 HSV-1 감염 mDC에서도 자가파전 플럭스를 유도하는 방법을 설명한다.
본 프로토콜의 범위는 (i) 인간 단핵구 유래 iDC의 처리뿐만 아니라 mDC, (ii) HSV-1에 대한 감염, (iii) 자가포식을 억제하는 것으로 알려진 화합물로의 그들의 치료, 및 (iv) 두 가지를 사용하여 siRNA를 이용한 그들의 전기개전을 포함한다. 다른 기술 적 설정. 본 프로토콜을 사용하여, 자가파전 플럭스는 HSV-1 감염 iDC에서 차단되거나 HSV-1 감염 mDC에서 유도될 수 있다.
DC, 특히 iDC는 매우 취약한 세포이기 때문에 이러한 세포로 작업하는 것은 다소 섬세한 단계를 수반합니다. DC 생성의 경우, 우리는 더 높은 세포 수율을 얻기 위해, 갓 고립 된 PBMC를 사용하고, 그들의 동결 보존을 방지하는 것이 좋습니다. 또한 후속 재배를 포함하여 실험 중에 iDC를 취급할 때 가혹하거나 장시간 온도 변화를 방지합니다. 그렇지 않으면 iDC는 표현형 변화를 겪을 수 있으므로 유세포 측정에 의한 미성숙 표현형을 검증할 필요가 있습니다. iDC는 성숙한 것과 달리 CD80, CD83 및 CD8628,29와같은 고유한 마커가 없습니다. HSV-1을 가진 iDC 및 mDC의 감염은 잘 확립 된 방법2,3,4,5,6,10. 우리와 다른 사람들은 DC가 1 또는 2의 MOI가 사용되었을 때 HSV-1 감염에 매우 취약하다는 것을 보여주었습니다(그림 2). 우리의 손에, 낮은 수준에서 감염 매체의 부피를 유지 (1-3 x 106 세포 250-350 μL) 더 나은 감염 효율성으로 이어질 것입니다.
주어진 된 별개의 세포 통로 방해 하는 고전적인 접근은 특정 화합물의 사용. autophagy의 다른 변조기의 다양한, 즉 활성제뿐만 아니라 억제제, 현재 사용할 수30. DC에서 의 HSV-1 유도 자가포식에 관해서는, 투란 등(2019)은 최근 iDC10에서자가파마이펙트에 대한 스패틴-1 및 바필로마이신-A1(BA1)의 억제 효과를 보였다. 자가 포식 억제를위한이 기술은 감염율이나 DC (특히 iDC)의 성숙 상태가 손상되지 않기 때문에 후속 HSV-1 감염과의 조합에 적합합니다. 향후 적용에서, 이러한 억제제 기반 접근법은 다른 감염제, 기아와 같은 스트레스 조건뿐만 아니라 상이한 세포 유형에 대해서도 적용될 수 있다. 그러나, 억제제사용시, 세포 생존능력에 심각한 영향을 미치지 않으면서 효율적인 자가포식 억제를 위한 적절한 농도를 결정하는 데 한계가 발생한다. 그러나 억제제 사용 시 주요 제한사항은 잠재적인 오프 타겟 또는 부작용의 발생으로 오해의 소지가 있는 결과31,32로이어질 수 있습니다.
본 프로토콜에서 다루는 자가 포식을 방해하는 두 번째 접근법은 siRNA33,34,35를사용하여 특정 한 녹다운이다. 한편으로는, 우리는 FIP200의 발현을 구체적으로 제거하기 위해 전기 개화 장치를 사용하여, IDC에서 HSV-1 유도 자가파전 회전율을 억제하였다. 한편, 우리는 HSV-1 감염 mDC에서 자가파전 플럭스를 용이하게 하기 위해 전기 천공 장치 II를 사용하여 두 가지 다른 KIF 단백질(즉, KIF1B 및 KIF2A)을 침묵시켰습니다. 두 전기 개화 프로토콜 은 iDC에서 FIP200의 거의 완전한 절제 결과, MDC에서 KIF1B / KIF2A, 이는 서양 블롯 분석을 통해 검증되었다(그림 4A, 그림 5A). DC의 생존력에 영향을 미치지 않는 전기 천공 장치 I과 는 달리, 전기 천공 장치 II를 사용하여 mDC의 전기 천공은 죽은 세포의 약간 더 높은 비율을 초래합니다(그림 4B, 그림 5B ). 따라서, 향후 응용 분야에서, 전기 개화 장치는 iDC 및 mDC 모두에 우선적으로 사용되어야 한다. 놀랍게도, 두 siRNA 기반 기술, 자가 파기 플럭스를 조절하는, iDC 또는 mDC 중 하나의 후속 HSV-1 감염과 호환됩니다. 더욱이, iDC의 미성숙한 표현형도 mDC의 성숙한 표현형도 전기천공 후 변경되지 않습니다.
FIP200 특이적 siRNA를 사용하는 iDC의 전기 포공은 HSV-1 감염 시 자가 파마 플럭스의 억제뿐만 아니라 유전자 녹다운에 대한 효율적이고 매우 구체적인 방법입니다. FIP200의 특정 침묵 이외에, 이 프로토콜은 다른 자동 관성 성분을 침묵하도록 적응될 수 있으며, 자가포식 캐스케이드 동안 다른 단계에 참여한다. 그러나, 자가포식의 효율적인 siRNA 매개 억제에 대한 적절한 표적을 식별하는 것은 우려의 몇몇 양상을 포함한다. 첫째, 자가포식 관련 유전자(ATG)의 녹다운 효율은 반드시 자가포식의 효율적인 억제와 반드시 긍정적으로 상관관계가 있는 것은아니며, 침묵되는특이적 ATG 단백질에 크게 의존한다( 36). 둘째, 뚜렷한 ATG 단백질은 자가 포식과 구별되는 경로에 추가로 관여하므로 절제는 또한 불리한 부작용37,38,39로이어질 수 있습니다. 셋째, 상이한 ATG는 중복 기능을 가질 수 있으며, 따라서 하나의 성분의 녹다운은 자가포식(예를들어, beclin-1 및 beclin-2)40을억제하기에 충분하지 않을 수 있다.
또한, DC의 전기천공 장치 I-기반 전기 천공 프로토콜은 mRNA에도 적합하며, PBMC25와같은 다양한 추가적인 1차 전지 유형에 사용될 수 있다. 이 시스템은 이렇게 다른 1 차적인 세포 모형으로 명백한 RNA 종을 전달하기 위하여 일반적인 전략을 제공합니다. 결론적으로, 우리는 iDC의 후속 HSV-1 감염과 결합된 억제제 또는 siRNA 기반 접근법을 사용하여 자가파기 플럭스를 억제하는 2개의 프로토콜을 제시한다. 더욱이, 우리는 HSV-1 감염에 mDC에 있는 자동 파기 유속을 유도하는 siRNA 전기 천공 접근을 기술합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 프로젝트 STE를 통해 독일 연구위원회 (DFG) 432/11-1 AS에 수여 및 의학 학부에서 ELAN 프로그램에 의해 지원되었다 (프리드리히 – 알렉산더 – Universität 에를랑겐 – 뉘른베르크) 프로젝트를 통해 18-12-21-1, LG에 부여.
4D-Nucleofector Core Unit (electroporation apparatus II) | Lonza (Basel, Switzerland) | AAF-1002B | |
AB-Serum | Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | H4522 | Dendritic cell cultivation |
ACD-A | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | 9007281 | |
Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (electroporation kit apparatus II) | Lonza (Basel, Switzerland) | V4XP-3024 | |
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE Healthcare (Solingen, Germany) | RPN2232 | Western Blot Detection |
Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | A3678 | |
anti-mouse-IgG (mouse, polyclonal, HRP) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 7076 | Western Blot detection |
anti-rabbit-IgG (goat, polyclonal, HRP) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 7074 | Western Blot detection |
Bafilomycin A1 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | tlrl-baf1 | inhibition of autophagy and lysosomal degradation |
BD FACS Canto II Flow Cytometer | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 338962 | |
Benzonase | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | E1014 | |
Blotting Chamber Fastblot B44 | Biometra (Göttingen, Germany) | 846-015-100 | |
CCR7 (mouse, Pe-Cy7) | BioLegend (Fell, Germany) | 557648 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: G043H7 |
CD11c (mouse, Pe-Cy5) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 561692 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: B-ly6 |
CD14 (mouse, PE) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 555398 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: M5E2 |
CD3 (mouse, FITC) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 555332 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: UCHT1 |
CD80 (mouse, V450) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 560442 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: L307.4 |
CD83 (mouse, APC) | eBioscience Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany) | 17-0839-41 | Flow cytometry Dilution: 1:200 Clone: HB15e |
CD86 (mouse, PE) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 553692 | Flow cytometry Dilution: 1:100 |
EVOS FL Cell Imaging | System AMG/Life Technologies (Carlsbad, USA) | AMF4300 | |
FIP200 (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 12436 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D10D11 |
GAPDH (mouse) | Merck Millipore (Massachusetts, USA) | AB2302 | Western Blot detection Dilution: 1:5000 Clone: MAB374 |
Gene Pulser II apparatus (electroporation apparatus I) | BioRad Laboratories GmbH (München, Germany) | 165-2112 | |
GM-CSF (4×104 U/mL) | Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) | 130-093-868 | |
HLA‐DR (mouse, APC-Cy7) | BioLegend (Fell, Germany) | 307618 | Flow cytometry Dilution: 1:200 Clone: L243 |
HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43 | BioVex | DC infection |
|
ICP0 (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-53070 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: 11060 |
ICP5 (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-56989 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: 3B6 |
IL-1β (0.1×106 U/mL) | Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany) | 1411-050 | |
IL-4 (1×106 U/mL) | Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) | 130-093-924 | |
IL-6 (1×106 U/mL) | Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany) | 1404-050 | |
ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare (Solingen, Germany) | 28955810 | |
KIF1B (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-376246 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: E-12 |
KIF2A (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-271471 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D-7 |
LC3B (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 3868 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D11 |
L-glutamine | Lonza (Basel, Switzerland) | 17-605E | |
LIVE/DEAD Fixable Violet dead cell stain kit | Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) | L34964 | L/D staining in Flow cytometry |
Lymphoprep | Alere Technologies AS (Oslo, Norway) | 04-03-9391/01 | |
Magnesiumchloride | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | A537.1 | |
Megafuge 2.0 RS | Heraeus (Hanau, Germany) | 75015505 | |
N, N, N', N'-Tetramethylethylendiamine (TEMED) | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | T9281 | |
Neubauer counting chamber | Brand (Wertheim, Germany) | 717805 | |
Nunc Cell culture flasks (175.0 cm2) | Thermo Scientific (Rockford, USA) | 159910 | |
p62 (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 88588 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D5L7G |
PageRuler prestained protein ladder | Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany) | 26616 | |
Paraformaldehyde, 16 % | Alfa Aesar, Haverhill, USA | 43368.9M | |
PerfectSpin 24 Plus | Peqlab (Erlangen, Germany) | C2500-R-PL | |
PGE2 (1 mg/mL) | Pfizer (Berlin, Germany) | BE130681 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza (Basel, Switzerland) | 17-512F | |
Protein gel system MiniProtean II | Bio-Rad Laboratories GmbH (München, Germany) | 1652960 | |
RestoreTM Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific, Rockford, USA | 21059 | |
Rocking Platform wt 15 | Biometra (Göttingen, Germany) | 042-590 | |
RotiBlock | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | A151.4 | |
Roti-Load 1 (4x) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | K929.3 | |
Rotiphorese Gel 30 (37.5:1) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 3029.1 | |
RPMI 1640 | Lonza (Basel, Switzerland) | 12-167F | |
Sodium dodecyl Sulfate (SDS) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 2326.2 | |
Thermomixer comfort | Eppendorf (Hamburg, Germany) | 5355 000.011 | |
TNF-α (10 μg/mL) | Peprotech (Hamburg, Germany) | 300-01A | |
Tris | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 4855.3 | |
Trypan blue solution (0.4 %) | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | T8154 | |
Tween 20 | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 9127.1 | |
Whatman 0.2 μm nitrocellulose membrane | GE Healthcare (Solingen, Germany) | 10600001 | |
WhatmanTM Chromatography Paper 3 mm Chr | Fisher Scientific GmbH (Schwerte, Germany) | 3030917 |