I denna studie presenterar vi hämmare-och siRNA-baserade strategier för att störa autofagi Flux i herpes simplex virus typ-1 (HSV-1)-infekterade monocyte-härledda dendritiska celler.
Herpes simplex virus typ-1 (HSV-1) inducerar autofagi i båda, omogen dendritiska celler (iDCs) samt mogna dendritiska celler (mDCs), medan autofagi Flux endast observeras i iDCs. För att få mekanistiska insikter, utvecklade vi effektiva strategier för att störa HSV-1-inducerad autofagi omsättning. En hämmare-baserad strategi, att modulera HSV-1-inducerad autofagi, utgör det första valet, eftersom det är en enkel och snabb metod. För att kringgå potentiella ospecifika off-mål effekter av sådana föreningar, vi utvecklat en alternativ siRNA-baserad strategi, att modulera autofagi omsättning i iDCs på HSV-1 infektion. Faktum är att elektroporation av iDCs med FIP200-specifika siRNA före HSV-1 infektion är en mycket specifik och framgångsrik metod för att ablera FIP200 proteinuttryck och därmed hämma autofagi Flux. Båda presenterade metoder resultera i en effektiv hämning av HSV-1-inducerad autofagi omsättning i iDCs, varvid siRNA-baserade tekniken är mer målspecifika. En ytterligare siRNA-baserade strategi utvecklades för att selektivt tysta protein uttrycket av KIF1B och KIF2A, vilket underlättar autofagi omsättning vid HSV-1 infektion i mDCs. Sammanfattningsvis, tekniken för siRNA elektroporation representerar en lovande strategi, att selektivt avlägsna uttrycket av distinkta proteiner och att analysera deras inflytande på en HSV-1 infektion.
Generering av Human monocyte-härledda dendritiska celler (DCs) utgör en lämplig in vitro-modell för att studera funktioner och biologi av denna viktiga immun cells typ. Isolering samt differentiering av monocyter i DCS har varit väl etablerad under de senaste åren1,2. Infektion av DCS med α-herpesvirus herpes simplex virus typ-1 (HSV-1) fungerar som ett modellsystem för att studera HSV-1-medierade modulationer av DC-biologi2,3,4,5,6 . Detta är särskilt viktigt att belysa hur herpesviruses dämpa eller hämma potenta antivirala immunsvar, att etablera latens i immun-privilegierade nischer inne i Host7,8. I detta avseende är herpesviruses mycket framgångsrika patogener som är brett spridda över hela befolkningen når en sero-prevalens av upp till 90% enligt den geografiska regionen9. Att förstå och möjligen förhindra detta, mer insikter i HSV-1-medierade modulationer av värdens immunförsvar, och särskilt av immunceller såsom DCs, krävs.
En helt ny observation om samspelet mellan DCs och HSV-1 publicerades nyligen av Turan et al.10. Författarna visade att utförandet av HSV-1 replikering är strikt beroende av mogningen status DCs. I iDCs, är fullständig replikering av HSV-1 underlättas av autofagi-beroende mekanismer. Medan HSV1 inducerar autofagi i både, iDCs och mDCs, autofagi flöde observeras endast i iDCs. Detta i sin tur underlättar nukleära avstigning av viral capsids via autofagi nedbrytning av nukleära laminer i iDCs. För att få mekanistiska insikter i denna HSV-1-inducerad nedbrytning väg i iDCs kontra mDCs, nya och effektiva strategier är avgörande för att undersöka autofagi Flux.
Macroautofagi (autofagi) är en väl bevarad i flera steg process riktad intracellulära proteiner eller hela organeller för lysosomala nedbrytning11. Förenklat kan autofagi delas in i (i) initiering, (II) membran kärnbildning, (III) vesikler expansion, och (IV) autofagi-lysosome fusion fas12. Under initiering (i) är komponenter som det aktiverade ULK1/2-kinaskomplexet, som innehåller det fokala adhesionkinasfamiljen som interagerar med proteinet 200 kD (FIP200), avgörande för att aktivera komplexet beclin-1-Vps34-AMBRA1. Därefter initierar membran kärnbildning (II) phagophore formation13, som uppslukar cytoplasmiska laster som kännetecknas av molekyler som P6214. Under vesikler expansion och autofagi mognad (III) Microtubule-Associated protein ljus Chain 3 (LC3)-jag omvandlas till dess lipidated form LC3-II som sätts in i autofagi membranet. Sålunda, LC3-I till-II omräkningskurserna är en indikator för autofagi induktion genom att spegla bildandet av mogna autofagi15,16. Vid autofagi-lysosome fusion (IV), inte bara den autofagi lasten utan också tillhörande P62 och LC3-II proteiner genomgår nedbrytning (e.g., genom hydrolys). Således, förlust av P62 och LC3-II fungera som markörer för autofagi Flux17. Den fusion av autofagi med lysosomer, och därmed efter autofagi omsättning, är starkt beroende av den intracellulära lysosomala lokalisering. Detta är bland annat reglerat av kinesinet familjemedlemmar KIF1B och KIF2A, som visade sig inverka negativt på autofagi-lysosome fusion18. Intressant, proteinuttryck av KIF1B och KIF2A induceras på DC mognad och är därmed ansvarig för ineffektiv autofagi Flux i HSV-1-infekterade mDCs, som hämmar komplett HSV-1 replikering10.
Experimentella försök att modulera autofagi inkluderar användning av föreningar kända för att inducera eller hämma denna väg19,20,21. I denna studie beskriver vi två inhibitionsbaserade strategier för att blockera autofagi omsättning i HSV-1-infekterade iDCs. Den första föreningen som används i våra experiment är specifik och potent autofagi inhibitor-1 (spautin-1), som beskrevs för att främja beclin-1-Vps34-AMBRA1 komplex nedbrytning under inledningsfasen av autofagi22. Den andra föreningen som används i den aktuella studien är bafilomycin-a1 (Ba1), en V-ATPas hämmare som blockerar de sena autofagi händelser (dvs., autofagi-lysosome fusion samt autolysosome försurning)23,24. Användningen av någon av dessa två hämmare före iDC-infektion med HSV-1 hämmar kraftigt autofagi, men stör inte effektivt viral genuttryck. Sålunda, denna hämmare-baserade strategi före HSV-1 infektion erbjuder ett kraftfullt verktyg för att hämma HSV-1-inducerad autofagi flöde som lätt kan utökas för en uppsjö av olika celltyper och virus, som också potentiellt inducera autofagi.
För att övervinna en stor nackdel med en inhibitor-baserad metod (dvs. ospecifik off-mål effekter), utvecklade vi en siRNA-baserad metod för att blockera autofagi Flux i (HSV-1-infekterade) idcs. Tekniken för siRNA elektroporation representerar en kraftfull alternativ strategi, via selektiv ablation av uttrycket av distinkta proteiner (dvs, autofagi komponenter). I våra experiment var iDCs electroporated med FIP200-specifika siRNA använda elektroporation apparaten I (se tabell över material) och ett modifierat protokoll som beskrivs av gerer et al. (2017) och Prechtel et al. (2007), att hämma autofagi under inledande fas25,26. Denna teknik tillät oss att specifikt knockdown FIP200 uttryck i iDCs, utan att störa cellernas lönsamhet och deras omogen fenotyp två dagar efter elektroporation. Anmärkningsvärt, HSV-1 infektion fastställdes i dessa elektroporated iDCs speglas av effektiva virala proteinuttryck. Denna siRNA-baserade teknik erbjuder en unik fördel (dvs. att en mängd olika autofagi komponenter, även i kombination), kan vara särskilt riktade för ablation av deras uttryck.
I denna studie, beskriver vi ytterligare en siRNA-baserad metod för att inducera autofagi Flux även i HSV-1-infekterade mDCs. I detta fall var iDCs electroporated med siRNA riktade mot KIF1B och KIF2A före DC mogningen med hjälp av elektroporation apparaten II (se tabell över material). Eftersom båda proteiner är uppreglerad under DC mognad och kända för att negativt reglera fusion av autofagi med lysosomer10,18, deras knockdown starkt inducerad autofagi Flux i MDCs vid HSV-1 infektion. Den siRNA-baserade tekniken gjorde det möjligt för oss att specifikt inducera autofagi-omsättningen genom att störa KIF-proteinuttrycket i mDCs, och därmed kunna efterlikna deras uttrycks nivåer i iDCs.
Sammanfattnings, presenterar vi två olika metoder för att hämma autofagi Flux i HSV-1-infekterade iDCs. Medan den första inhibitorbaserade metoden utgör ett enkelt, Billigt och snabbt sätt att störa autofagi-nedbrytning, är den andra siRNA-baserade tekniken mer specifik och en mycket lämplig metod för att stödja och kontrollera resultaten av inhibitorbaserade Experiment. Dessutom beskriver vi en metod för att inducera autofagi Flux även i HSV-1-infekterade mDCs, via siRNA-medierad knockdown av två KIF proteiner.
Tillämpningsområdet för detta protokoll omfattar (i) hantering av humana monocyte-härledda iDCs samt mDCs, (II) deras infektion med HSV-1, (III) deras behandling med substanser som är kända för att hämma autofagi, och (IV) deras elektroporation med siRNA med två olika tekniska inställningar. Med hjälp av det nuvarande protokollet kan autofagi Flux antingen blockeras i HSV-1-infekterade iDCs eller induceras i HSV-1-infekterade mDCs.
Eftersom DCs, och särskilt iDCs, är mycket sårbara celler, arbetar med dessa celler innebär ganska känsliga steg. För DC-generationen, rekommenderar vi att använda nyligen isolerade PBMCs, och för att undvika deras kryopreservation, för att få högre cell avkastning. Dessutom, vid hantering av iDCs under experiment, inklusive efterföljande odling, förhindra hårda eller långvariga temperaturförändringar. Annars kan iDCs genomgå fenotypiska förändringar och därför är det nödvändigt att kontrollera deras omogna fenotyp med flödescytometri. I motsats till sina mogna motsvarigheter saknar idcs distinkta markörer, till exempel CD80, CD83 och CD8628,29. Infektionen av idcs och MDCs med HSV-1 är en väletablerad metod2,3,4,5,6,10. Vi och andra visade att DCs är mycket mottagliga för HSV-1 infektion, när en MOI av 1 eller 2 har använts (figur 2). I våra händer, att hålla volymen av infektionen mediet på låga nivåer (1-3 x 106 celler i 250-350 μl) kommer att leda till bättre infektions effektivitet.
En klassisk metod för att störa en given distinkt cellulära väg är användningen av specifika föreningar. En mängd olika modulatorer av autofagi, dvs aktivatorer och hämmare, finns för närvarande30. När det gäller HSV-1-inducerad autofagi i DCs, Turan et al., (2019) visade nyligen de hämmande effekterna av spautin-1 och bafilomycin-a1 (BA1) på autofagi omsättning i iDCs10. Denna teknik för autofagi hämning är lämplig för kombinationen med en efterföljande HSV-1 infektion, eftersom varken infektionsfrekvensen eller mogningen status DCs (särskilt iDCs) är nedsatt. I framtida tillämpningar, detta inhibitionsbaserade tillvägagångssätt kan tillämpas även i kombination med andra smittämnen, stress villkor, såsom svält, samt för olika celltyper. Men när man använder hämmare, begränsningar uppstår vid bestämning av lämplig koncentration för effektiv autofagi hämning, utan att allvarligt påverka cellernas lönsamhet. Den största begränsningen vid användning av hämmare är dock förekomsten av potentiella off-Target eller negativa effekter, vilket kan leda till vilseledande resultat31,32.
Den andra metoden för att störa autofagi, som omfattas av detta protokoll, är den specifika knockdown med siRNA33,34,35. Å ena sidan använde vi elektroporation apparaten jag att specifikt avlägsna uttrycket av FIP200, och därmed hämma HSV-1-inducerad autofagi omsättning i idcs. Å andra sidan tystade vi två olika KIF proteiner (dvs KIF1B och KIF2A), med hjälp av elektroporation apparaten II, för att underlätta autofagi Flux i HSV-1-infekterade mDCs. Både elektroporation protokoll resulterade i en nästan fullständig ablation av FIP200 i iDCs, och KIF1B/KIF2A i mDCs, som kontrollerades via Western blot analyser (figur 4a, figur 5a). I motsats till elektroporationsapparaten i, som inte påverkar DCs, resulterar elektroporering av mDCs med hjälp av elektroporationapparaturen II i något högre frekvens av döda celler (figur 4b, figur 5b ). Därför, i framtida tillämpningar, den elektroporation apparat jag bör företrädesvis användas för både, iDCs och mDCs. Anmärkningsvärt, båda siRNA-baserade tekniker, att modulera autofagi Flux, är förenliga med efterföljande HSV-1 infektion av antingen iDCs eller mDCs. Vidare ändras inte heller den omogna fenotypen av iDCs eller den mogna fenotypen för mDCs efter elektroporation.
Elektroporation av iDCs med FIP200-specifik siRNA är en effektiv och mycket specifik metod för genknockdown samt hämning av autofagi Flux vid HSV-1-infektion. Förutom den specifika Tystning av FIP200, kan detta protokoll anpassas för att tysta andra autofagi komponenter, deltar i olika steg under autofagi kaskad. Men att identifiera lämpliga mål för effektiv siRNA-medierad hämning av autofagi omfattar flera aspekter av oro. För det första, knockdown effektivitet av autofagi-relaterade gener (ATG) inte nödvändigtvis positivt korrelerar med effektiv hämning av autofagi och är starkt beroende av den specifika ATG protein som är tystade36. För det andra, distinkta ATG proteiner är dessutom involverade i vägar som skiljer sig från autofagi, vilket deras ablation kan också leda till negativa biverkningar37,38,39. För det tredje kan olika ATGs ha redundanta funktioner, vilket innebär att en komponent inte kan vara tillräcklig för att hämma autofagi (t. ex. beclin-1 och beclin-2)40.
Dessutom är elektroporation apparat I-baserade elektroporation protokoll av DCs också lämplig för mRNAs, och kan användas för en mängd ytterligare primära celltyper, såsom PBMCs25. Detta system ger således en allmän strategi för att leverera distinkta RNA-arter till olika primära celltyper. Sammanfattningsvis presenterar vi två protokoll för att hämma autofagi Flux, genom att antingen använda en inhibitor-eller siRNA-baserad metod kombinerat med efterföljande HSV-1 infektion av iDCs. Dessutom beskriver vi en siRNA elektroporation metod för att inducera autofagi Flux i mDCs vid HSV-1 infektion.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av det tyska forskningsrådet (DFG) via projektet STE 432/11-1 tilldelas som och av ELAN programmet från medicinska fakulteten (Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg) via projektet 18-12-21-1, beviljats LG.
4D-Nucleofector Core Unit (electroporation apparatus II) | Lonza (Basel, Switzerland) | AAF-1002B | |
AB-Serum | Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | H4522 | Dendritic cell cultivation |
ACD-A | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | 9007281 | |
Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (electroporation kit apparatus II) | Lonza (Basel, Switzerland) | V4XP-3024 | |
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE Healthcare (Solingen, Germany) | RPN2232 | Western Blot Detection |
Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | A3678 | |
anti-mouse-IgG (mouse, polyclonal, HRP) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 7076 | Western Blot detection |
anti-rabbit-IgG (goat, polyclonal, HRP) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 7074 | Western Blot detection |
Bafilomycin A1 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | tlrl-baf1 | inhibition of autophagy and lysosomal degradation |
BD FACS Canto II Flow Cytometer | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 338962 | |
Benzonase | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | E1014 | |
Blotting Chamber Fastblot B44 | Biometra (Göttingen, Germany) | 846-015-100 | |
CCR7 (mouse, Pe-Cy7) | BioLegend (Fell, Germany) | 557648 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: G043H7 |
CD11c (mouse, Pe-Cy5) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 561692 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: B-ly6 |
CD14 (mouse, PE) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 555398 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: M5E2 |
CD3 (mouse, FITC) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 555332 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: UCHT1 |
CD80 (mouse, V450) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 560442 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: L307.4 |
CD83 (mouse, APC) | eBioscience Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany) | 17-0839-41 | Flow cytometry Dilution: 1:200 Clone: HB15e |
CD86 (mouse, PE) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 553692 | Flow cytometry Dilution: 1:100 |
EVOS FL Cell Imaging | System AMG/Life Technologies (Carlsbad, USA) | AMF4300 | |
FIP200 (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 12436 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D10D11 |
GAPDH (mouse) | Merck Millipore (Massachusetts, USA) | AB2302 | Western Blot detection Dilution: 1:5000 Clone: MAB374 |
Gene Pulser II apparatus (electroporation apparatus I) | BioRad Laboratories GmbH (München, Germany) | 165-2112 | |
GM-CSF (4×104 U/mL) | Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) | 130-093-868 | |
HLA‐DR (mouse, APC-Cy7) | BioLegend (Fell, Germany) | 307618 | Flow cytometry Dilution: 1:200 Clone: L243 |
HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43 | BioVex | DC infection |
|
ICP0 (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-53070 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: 11060 |
ICP5 (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-56989 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: 3B6 |
IL-1β (0.1×106 U/mL) | Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany) | 1411-050 | |
IL-4 (1×106 U/mL) | Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) | 130-093-924 | |
IL-6 (1×106 U/mL) | Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany) | 1404-050 | |
ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare (Solingen, Germany) | 28955810 | |
KIF1B (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-376246 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: E-12 |
KIF2A (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-271471 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D-7 |
LC3B (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 3868 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D11 |
L-glutamine | Lonza (Basel, Switzerland) | 17-605E | |
LIVE/DEAD Fixable Violet dead cell stain kit | Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) | L34964 | L/D staining in Flow cytometry |
Lymphoprep | Alere Technologies AS (Oslo, Norway) | 04-03-9391/01 | |
Magnesiumchloride | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | A537.1 | |
Megafuge 2.0 RS | Heraeus (Hanau, Germany) | 75015505 | |
N, N, N', N'-Tetramethylethylendiamine (TEMED) | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | T9281 | |
Neubauer counting chamber | Brand (Wertheim, Germany) | 717805 | |
Nunc Cell culture flasks (175.0 cm2) | Thermo Scientific (Rockford, USA) | 159910 | |
p62 (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 88588 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D5L7G |
PageRuler prestained protein ladder | Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany) | 26616 | |
Paraformaldehyde, 16 % | Alfa Aesar, Haverhill, USA | 43368.9M | |
PerfectSpin 24 Plus | Peqlab (Erlangen, Germany) | C2500-R-PL | |
PGE2 (1 mg/mL) | Pfizer (Berlin, Germany) | BE130681 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza (Basel, Switzerland) | 17-512F | |
Protein gel system MiniProtean II | Bio-Rad Laboratories GmbH (München, Germany) | 1652960 | |
RestoreTM Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific, Rockford, USA | 21059 | |
Rocking Platform wt 15 | Biometra (Göttingen, Germany) | 042-590 | |
RotiBlock | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | A151.4 | |
Roti-Load 1 (4x) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | K929.3 | |
Rotiphorese Gel 30 (37.5:1) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 3029.1 | |
RPMI 1640 | Lonza (Basel, Switzerland) | 12-167F | |
Sodium dodecyl Sulfate (SDS) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 2326.2 | |
Thermomixer comfort | Eppendorf (Hamburg, Germany) | 5355 000.011 | |
TNF-α (10 μg/mL) | Peprotech (Hamburg, Germany) | 300-01A | |
Tris | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 4855.3 | |
Trypan blue solution (0.4 %) | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | T8154 | |
Tween 20 | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 9127.1 | |
Whatman 0.2 μm nitrocellulose membrane | GE Healthcare (Solingen, Germany) | 10600001 | |
WhatmanTM Chromatography Paper 3 mm Chr | Fisher Scientific GmbH (Schwerte, Germany) | 3030917 |