Bu çalışmada, Herpes simpleks virüs tip-1 (HSV-1) enfekte monosit kaynaklı dendritik hücrelerde otofatik akı ile müdahale etmek için inhibitör ve siRNA tabanlı stratejiler sürünmektedir.
Herpes simpleks virüs tip-1 (HSV-1) hem de otofaji indükler, olgunlaşmamış dendritik hücreler (iDC) yanı sıra olgun dendritik hücreler (mDC), otofajik akı ise sadece iDC’lerde gözlenir. Mekanistik anlayışlar kazanmak için, HSV-1-indüklenen otofajik ciroile müdahale etmek için etkili stratejiler geliştirdik. HSV-1-indüklenen otofaji modüle etmek için bir inhibitör tabanlı strateji, kolay ve hızlı bir yöntem olduğu için ilk tercihi oluşturmaktadır. Bu tür bileşiklerin potansiyel spesifik olmayan hedef dışı etkilerini atlatmak için, HSV-1 enfeksiyonu üzerine iDC’lerde otofafik ciromodüle etmek için alternatif bir siRNA tabanlı strateji geliştirdik. Nitekim, HSV-1 enfeksiyonu öncesinde FIP200-spesifik siRNA ile iDC elektroporasyon FIP200 protein ekspresyonu ablate ve bu nedenle otofajik akı inhibe etmek için çok özel ve başarılı bir yöntemdir. Sunulan her iki yöntem de iDC’lerde HSV-1 kaynaklı otofajik ciroverimli inhibisyonu ile sonuçlanır, bu nedenle siRNA tabanlı teknik daha hedef özgüdür. KIF1B ve KIF2A’nın protein ekspresyonunu seçici olarak susturmak için siRNA tabanlı ek bir yaklaşım geliştirildi ve mDC’lerde HSV-1 enfeksiyonu üzerine otophagic cirosunu kolaylaştırdı. Sonuç olarak, siRNA elektroporasyon tekniği, seçici farklı proteinlerin ekspresyonunu ablate ve bir HSV-1 enfeksiyonu üzerindeki etkilerini analiz etmek için umut verici bir strateji temsil eder.
İnsan monosit türetilmiş dendritik hücrelerin (DCs) üretimi, bu önemli bağışıklık hücresi tipinin işlevlerini ve biyolojisini incelemek için uygun bir in vitro model oluşturmaktadır. İzolasyon yanı sıra DC’ler içine monositfarklılaşması iyi son yıllarda kurulmuştur1,2. Α-herpesvirus herpes simpleks virüs tip-1 (HSV-1) ile DCs enfeksiyonu DC biyoloji2HSV-1 aracılı modülasyonları çalışmak için bir model sistemi olarak hizmet vermektedir,3,4,5,6 . Bu herpesviruses nemspen veya güçlü antiviral bağışıklık yanıtlarını inhibe nasıl açıklamak için özellikle önemlidir, ev sahibi içinde bağışıklık ayrıcalıklı nişlerde gecikme kurmak için7,8. Bu bakımdan, herpesvirüsler, coğrafibölgeyegöre % 90’a varan sero prevalansına ulaşan popülasyonda yaygın olarak yayılmış çok başarılı patojenlerdir 9. Bunu anlamak ve muhtemelen önlemek için, konağın bağışıklık sisteminin HSV-1 aracılı modülasyonları hakkında daha fazla bilgi edinmek ve özellikle DC’ler gibi bağışıklık hücreleri gereklidir.
CC’lerin HSV-1 ile etkileşimi ile ilgili tamamen yeni bir gözlem turan ve ark.10tarafından yakın zamanda yayınlanmıştır. Yazarlar, HSV-1 çoğaltma başarısının kesinlikle DC’lerin olgunlaşma durumuna bağlı olduğunu göstermiştir. IDC’lerde HSV-1’in tam replikasyonu otofajiye bağlı mekanizmalar tarafından kolaylaştırılır. HSV1 her iki, iDC’de ve mDC’lerde otofajiye neden olurken, sadece iDC’lerde otofaji akışı gözlenir. Bu da iDC’lerde nükleer laminlerin otophagic bozunması yoluyla viral kapsidlerin nükleer çıkışını kolaylaştırır. IDC’lerde, mDC’lere karşı bu HSV-1 indüklenen bozulma yolu hakkında mekanistik bilgiler edinmek için, otofajik akı araştırmak için yeni ve verimli stratejiler çok önemlidir.
Makrootophaji (otofaji) hücre içi proteinleri veya tüm organelleri lizomal sindirim için hedefleyen iyi korunmuş çok aşamalı bir süreçtir11. Simplistically, otofaji (i) inisiyasyon, (ii) membran çekirdekasyonu, (iii) vezikül genleşme ve (iv) otofagozom-lyzom füzyonfazı 12ayrılabilir . İnisiyasyon sırasında (i), 200 kD (FIP200) odak yapışma kiaz ailesi etkileşimproteinini içeren aktif ULK1/2 kinaz kompleksi gibi bileşenler, beclin-1-Vps34-AMBRA1 kompleksini aktive etmek için kritik öneme karşıdır. Daha sonra, membran nükleasyonu (ii) p6214gibi moleküller tarafından işaretlenmiş sitoplazmik kargoları içine alan fagoforkoluşumunu başlatır 13. Vezikül genleşmesi ve otofagoforma olgunlaşması sırasında (iii) mikrotübül ilişkili protein ışık zinciri 3 (LC3)-I, otofasomal membrana yerleştirilen lipideli formul3-II’ye dönüştürülür. Böylece, LC3-I -II dönüşüm oranları olgun otofagozom oluşumunu yansıtarak otofaji indüksiyon için bir gösterge vardır15,16. Otofazozom-lizozom füzyon (iv) üzerine, sadece otophagic kargo değil, aynı zamanda ilişkili p62 ve LC3-II proteinleri degradasyon (örneğin, hidroliz tarafından) geçmesi. Böylece, p62 ve LC3-II kaybı otofajik akı için belirteçleri olarak hizmet17. Otofazomların lyzozomlarla füzyonu ve böylece otophagic ciroyu takiben hücre içi lizomal lokalizasyona son derece bağlıdır. Bu, diğerleri arasında, kinesin aile üyeleri KIF1B ve KIF2A tarafından düzenlenir, hangi olumsuz otofagozom-lyzom füzyon etkilemek için gösterilmiştir18. İlginçtir, KIF1B ve KIF2A protein ekspresyonu DC olgunlaşma üzerine indüklenen ve bu nedenle hsv-1-enfekte mDC’lerde verimsiz otophagic akı sorumludur, hangi tam HSV-1 replikasyon10engeller .
Otofaji modüle etmek için deneysel girişimleri neden veya bu özel yolu inhibe bilinen bileşiklerin kullanımını içerir19,20,21. Bu çalışmada, HSV-1-enfekte iDC’lerde otofajik cirosu engellemek için iki inhibitör tabanlı strateji tanımlamıştır. Deneylerimizde kullanılan ilk bileşik spesifik ve güçlü otofaji inhibitörü-1 (spautin-1), hangi otofaji başlangıç aşamasında beclin-1-Vps34-AMBRA1 kompleks bozulma teşvik tarif edildi22. Bu çalışmada kullanılan ikinci bileşik bafilomisin-A1 (BA1), geç otophagic olayları engelleyen bir V-ATPaz inhibitörü (yani., otofazozom-lyzozom füzyon yanı sıra otolizom asitleşme)23,24. HSV-1 ile iDC enfeksiyonu öncesinde bu iki inhibitör kullanımı güçlü otofaji inhibe, ancak verimli viral gen ekspresyonu rahatsız etmez. Böylece, HSV-1 enfeksiyonu öncesinde bu inhibitör tabanlı strateji kolayca farklı hücre tipleri ve virüslerin bir bolluk için genişletilebilir HSV-1-indüklenen otofhagic akı inhibe etmek için güçlü bir araç sunuyor, aynı zamanda potansiyel otofaji neden.
Inhibitör tabanlı bir yaklaşımın (yani spesifikolmayan hedef dışı etkiler) önemli bir dezavantajını aşmak için, (HSV-1-enfekte) iDC’lerde otofajik akısı engellemek için siRNA tabanlı bir yöntem geliştirdik. SiRNA elektroporasyon tekniği, farklı proteinlerin (yani otophagic bileşenlerin) ekspresyonunun seçici ablasyonyoluyla güçlü bir alternatif stratejiyi temsil eder. Deneylerimizde iDC’ler FIP200-spesifik siRNA elektroporasyon cihazı I (bkz. Malzeme Tablosu)ve Gerer et al. (2017) ve Prechtel et al. (2007) tarafından tanımlanan değiştirilmiş bir protokol kullanılarak elektroporated edildi. başlatma aşaması25,26. Bu teknik, hücre canlılığına ve onların olgunlaşmamış fenotiplerine iki gün sonra elektroporasyon dan müdahale etmeden, iDC’lerde FIP200 ifadesini özellikle nakavt etmemizi sağladı. Kayda değer, HSV-1 enfeksiyonu etkin viral protein ekspresyonu ile yansıtılan bu elektroporated iDC’lerde kurulmuştur. Bu siRNA tabanlı teknik benzersiz bir fayda sunuyor (yani, farklı otofatik bileşenlerin çeşitli, hatta birlikte), özellikle ifade ablasyon için hedeflenebilir.
Bu çalışmada, HSV-1-enfekte mDC’lerde de otofatik akı neden olmak için siRNA tabanlı bir yöntem açıklayınız. Bu durumda, iDC’ler DC olgunlaşması öncesinde KIF1B ve KIF2A’ya karşı hedeflenen siRNA ile elektroporated edildi (bkz. Her iki protein de DC olgunlaşma sırasında upregulated ve negatif lyzozomlar ile otofazomların füzyon düzenleyen bilinmektedir beri10,18, HSV-1 enfeksiyonu üzerine mDC’lerde onların knockdown güçlü indüklenen otophagic akı. Böylece, siRNA tabanlı teknik, özellikle mDC’lerde KIF protein ekspresyonuna müdahale ederek otophagic ciroya neden olmamızı sağladı ve böylece iDC’lerdeki ifade düzeylerini taklit edebildi.
Özetle, HSV-1-enfekte iDC’lerde otofajik akı inhibe etmek için iki farklı yöntem salıyoruz. İlk inhibitör tabanlı yaklaşım otonom bozulmaya müdahale etmek için kolay, ucuz ve hızlı bir yol teşkil ederken, ikinci siRNA tabanlı teknik daha spesifik tir ve inhibitör bazlı sonuçları doğrulamak ve doğrulamak için çok uygun bir yöntemdir. Deney. Buna ek olarak, hsv-1-enfekte mDC’lerde de otophagic akı neden olmak için bir yöntem tarif, iki KIF proteinlerin siRNA aracılı nakavt yoluyla.
Bu protokolün kapsamı (i) insan monosit kaynaklı iDR’lerin yanı sıra mCD’lerin işlenmesini, (ii) HSV-1 ile enfeksiyonlarını, (iii) otofajisini inhibe ettikleri bilinen bileşiklerle tedavilerini ve (iv) iki kullanarak siRNA ile elektroporasyonlarını içerir. farklı teknik kurulumlar. Mevcut protokol kullanılarak, otophagic akı Ya HSV-1-enfekte iDC’lerde engellenebilir ya da HSV-1-enfekte mDC’lerde indüklenebilir.
DC’ler ve özellikle iDC’ler çok hassas hücreler olduğundan, bu hücrelerle çalışmak oldukça hassas adımlar içerir. DC üretimi için, daha yüksek hücre verimi elde etmek için taze izole edilmiş PBMC’ler kullanmanızı ve kriyopreservation önlemek için öneririz. Ayrıca, deneyler sırasında, sonraki ekimleri de dahil olmak üzere, iDC’leri kullanırken, sert veya uzun süreli sıcaklık değişikliklerini önler. Aksi takdirde, iDC’ler fenotipik değişikliklere uğrayabilir ve bu nedenle akış sitometrisi ile olgunlaşmamış fenotiplerini doğrulamak gerekir. Not, olgun muadillerinin aksine, iDC’ler CD80, CD83 ve CD8628,29gibi farklı belirteçleri, eksikliği. HSV-1 ile CD’lerin ve mDC’lerin enfeksiyonu2,3,4,5,6,10olmak üzere köklü bir yöntemdir. Biz ve diğerleri, 1 veya 2 moi kullanıldığında DC’lerin HSV-1 enfeksiyonuna karşı son derece duyarlı olduğunu gösterdik(Şekil 2). Elimize göre enfeksiyon ortamının hacmini düşük seviyelerde tutmak (250-350 μL’de 1-3 x 106 hücre) enfeksiyon veriminin daha iyi olmasını sağlayacaktır.
Belirli bir hücresel yolu müdahale etmek için klasik bir yaklaşım belirli bileşiklerin kullanımıdır. Otofaji farklı modülatörleri çeşitli, yani aktivatörler yanı sıra inhibitörleri, şu anda mevcuttur30. DCs HSV-1-indüklenen otofaji ile ilgili olarak, Turan ve ark., (2019) son zamanlarda iDC’lerde otofatik ciro üzerine spautin-1 ve bafilomycin-A1 (BA1) inhibitör etkilerini gösterdi10. Bu otofaji inhibisyonu tekniği, ne enfeksiyon oranı ne de DC’lerin olgunlaşma durumu (özellikle iDC) bozulduğu için, sonraki HSV-1 enfeksiyonu ile kombinasyon için uygundur. Gelecekteki uygulamalarda, bu inhibitör tabanlı yaklaşım diğer enfeksiyöz ajanlar, açlık gibi stres koşulları, yanı sıra farklı hücre tipleri için birlikte de uygulanabilir. Ancak, inhibitörleri kullanırken, sınırlılıklar etkili otofaji inhibisyonu için uygun konsantrasyonu belirlemede ortaya çıkar, ciddi hücre canlılığını etkilemeden. Inhibitörleri kullanırken önemli sınırlama, ancak, potansiyel off-hedef veya yan etkilerin oluşumu, hangi yanıltıcı sonuçlara yol açabilir31,32.
Mevcut protokolde yer alan otofajiile müdahale etmek için ikinci yaklaşım, siRNA33,34,35kullanılarak özel nakavt. Bir yandan, fip200 ifadesini özellikle ablate, bu nedenle iDC’lerde HSV-1-indüklenen otophagic ciro inhibe elektroporasyon cihazı kullanılır. Diğer taraftan, HSV-1-enfekte mDC’lerde otophagic akı kolaylaştırmak için elektroporasyon cihazı II kullanarak iki farklı KIF proteini (yani, KIF1B ve KIF2A) susturduk. Her iki elektroporasyon protokolü de, CD’lerde FIP200 ve MCD’lerde KIF1B/KIF2A’nın neredeyse tamamen ablasyonla sonuçlanmasına neden oldu ve bu durum Batı leke analizleri ile doğrulandı (Şekil 4A, Şekil 5A). DC’lerin canlılığını etkilemeyen elektroporasyon aparatı I’nin aksine, elektroporasyon cihazı II kullanılarak mCD’lerin elektroporasyon uyrması ölü hücrelerin biraz daha yüksek oranlarına yol açsa (Şekil 4B, Şekil 5B ). Bu nedenle, gelecekteki uygulamalarda, ben tercihen hem de, IDC ve mDC’ler için kullanılmalıdır elektroporasyon cihazı. Dikkat çekici bir şekilde, her iki siRNA tabanlı teknikler, otophagic akı modüle etmek için, ya DC veya mDC sonraki HSV-1 enfeksiyonu ile uyumludur. Ayrıca, ne IDC’lerin olgunlaşmamış fenotip ne de mDC olgun fenotip sonra elektroporasyon değiştirilir.
FIP200 spesifik siRNA kullanan iDC’lerin elektroporasyonu, gen nakavtı ve HSV-1 enfeksiyonu üzerine otophagic akı inhibisyonu için etkili ve son derece spesifik bir yöntemdir. FIP200’ün özel susturulma ek olarak, bu protokol otophagic basamak lama sırasında farklı adımlarda katılan diğer otophagic bileşenleri susturmak için uyarlanabilir. Ancak, otofaji verimli siRNA aracılı inhibisyonu için uygun hedef belirlenmesi endişe çeşitli yönlerini içerir. İlk olarak, otofaji ile ilgili genlerin knockdown verimliliği (ATG) mutlaka pozitif otofaji verimli inhibisyonu ile ilişkili değildir ve son derece susturulan belirli ATG proteinbağlıdır36. İkinci olarak, farklı ATG proteinleri ayrıca otofaji farklı yollar da yer almaktadır, böylece ablasyon da yan etkilere yol açabilir37,38,39. Üçüncü olarak, farklı ATG’ler gereksiz fonksiyonlara sahip olabilir, bu nedenle bir bileşenin yıkılması otofajiyi inhibe etmek için yeterli olmayabilir(örn., beclin-1 ve beclin-2)40.
Buna ek olarak, Dcs elektroporasyon cihazı I -tabanlı elektroporasyon protokolü de mRNA’lar için uygundur ve PBMCs25gibi ek birincil hücre tipleri, çeşitli için kullanılabilir. Bu sistem böylece farklı birincil hücre türlerine farklı RNA türleri sunmak için genel bir strateji sağlar. Sonuç olarak, iDC’lerin sonraki HSV-1 enfeksiyonu ile birlikte inhibitör veya siRNA tabanlı bir yaklaşım kullanarak, otophagic akı inhibe etmek için iki protokol salıyoruz. Ayrıca, HSV-1 enfeksiyonu üzerine mDC’lerde otofatik akı neden bir siRNA elektroporasyon yaklaşımı açıklar.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Alman Araştırma Konseyi (DFG) tarafından AS’ye verilen STE 432/11-1 projesi ve LG’ye verilen 18-12-21-1 projesi ile Tıp Fakültesi’nden (Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg) ELAN Programı ile desteklenmiştir.
4D-Nucleofector Core Unit (electroporation apparatus II) | Lonza (Basel, Switzerland) | AAF-1002B | |
AB-Serum | Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | H4522 | Dendritic cell cultivation |
ACD-A | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | 9007281 | |
Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (electroporation kit apparatus II) | Lonza (Basel, Switzerland) | V4XP-3024 | |
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE Healthcare (Solingen, Germany) | RPN2232 | Western Blot Detection |
Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | A3678 | |
anti-mouse-IgG (mouse, polyclonal, HRP) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 7076 | Western Blot detection |
anti-rabbit-IgG (goat, polyclonal, HRP) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 7074 | Western Blot detection |
Bafilomycin A1 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | tlrl-baf1 | inhibition of autophagy and lysosomal degradation |
BD FACS Canto II Flow Cytometer | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 338962 | |
Benzonase | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | E1014 | |
Blotting Chamber Fastblot B44 | Biometra (Göttingen, Germany) | 846-015-100 | |
CCR7 (mouse, Pe-Cy7) | BioLegend (Fell, Germany) | 557648 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: G043H7 |
CD11c (mouse, Pe-Cy5) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 561692 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: B-ly6 |
CD14 (mouse, PE) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 555398 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: M5E2 |
CD3 (mouse, FITC) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 555332 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: UCHT1 |
CD80 (mouse, V450) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 560442 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: L307.4 |
CD83 (mouse, APC) | eBioscience Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany) | 17-0839-41 | Flow cytometry Dilution: 1:200 Clone: HB15e |
CD86 (mouse, PE) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 553692 | Flow cytometry Dilution: 1:100 |
EVOS FL Cell Imaging | System AMG/Life Technologies (Carlsbad, USA) | AMF4300 | |
FIP200 (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 12436 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D10D11 |
GAPDH (mouse) | Merck Millipore (Massachusetts, USA) | AB2302 | Western Blot detection Dilution: 1:5000 Clone: MAB374 |
Gene Pulser II apparatus (electroporation apparatus I) | BioRad Laboratories GmbH (München, Germany) | 165-2112 | |
GM-CSF (4×104 U/mL) | Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) | 130-093-868 | |
HLA‐DR (mouse, APC-Cy7) | BioLegend (Fell, Germany) | 307618 | Flow cytometry Dilution: 1:200 Clone: L243 |
HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43 | BioVex | DC infection |
|
ICP0 (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-53070 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: 11060 |
ICP5 (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-56989 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: 3B6 |
IL-1β (0.1×106 U/mL) | Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany) | 1411-050 | |
IL-4 (1×106 U/mL) | Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) | 130-093-924 | |
IL-6 (1×106 U/mL) | Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany) | 1404-050 | |
ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare (Solingen, Germany) | 28955810 | |
KIF1B (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-376246 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: E-12 |
KIF2A (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-271471 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D-7 |
LC3B (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 3868 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D11 |
L-glutamine | Lonza (Basel, Switzerland) | 17-605E | |
LIVE/DEAD Fixable Violet dead cell stain kit | Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) | L34964 | L/D staining in Flow cytometry |
Lymphoprep | Alere Technologies AS (Oslo, Norway) | 04-03-9391/01 | |
Magnesiumchloride | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | A537.1 | |
Megafuge 2.0 RS | Heraeus (Hanau, Germany) | 75015505 | |
N, N, N', N'-Tetramethylethylendiamine (TEMED) | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | T9281 | |
Neubauer counting chamber | Brand (Wertheim, Germany) | 717805 | |
Nunc Cell culture flasks (175.0 cm2) | Thermo Scientific (Rockford, USA) | 159910 | |
p62 (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 88588 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D5L7G |
PageRuler prestained protein ladder | Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany) | 26616 | |
Paraformaldehyde, 16 % | Alfa Aesar, Haverhill, USA | 43368.9M | |
PerfectSpin 24 Plus | Peqlab (Erlangen, Germany) | C2500-R-PL | |
PGE2 (1 mg/mL) | Pfizer (Berlin, Germany) | BE130681 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza (Basel, Switzerland) | 17-512F | |
Protein gel system MiniProtean II | Bio-Rad Laboratories GmbH (München, Germany) | 1652960 | |
RestoreTM Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific, Rockford, USA | 21059 | |
Rocking Platform wt 15 | Biometra (Göttingen, Germany) | 042-590 | |
RotiBlock | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | A151.4 | |
Roti-Load 1 (4x) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | K929.3 | |
Rotiphorese Gel 30 (37.5:1) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 3029.1 | |
RPMI 1640 | Lonza (Basel, Switzerland) | 12-167F | |
Sodium dodecyl Sulfate (SDS) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 2326.2 | |
Thermomixer comfort | Eppendorf (Hamburg, Germany) | 5355 000.011 | |
TNF-α (10 μg/mL) | Peprotech (Hamburg, Germany) | 300-01A | |
Tris | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 4855.3 | |
Trypan blue solution (0.4 %) | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | T8154 | |
Tween 20 | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 9127.1 | |
Whatman 0.2 μm nitrocellulose membrane | GE Healthcare (Solingen, Germany) | 10600001 | |
WhatmanTM Chromatography Paper 3 mm Chr | Fisher Scientific GmbH (Schwerte, Germany) | 3030917 |