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Chemistry

फ्रीक्वेंसी-डोमेन-आधारित कैमरा सिस्टम के साथ ओ2 की ल्यूमिनेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग

Published: December 16, 2019 doi: 10.3791/60191
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1,4, 5
1Marine Biological Section, Department of Biology, University of Copenhagen, 2Center for Electromicrobiology, Aarhus University, 3PCO AG, 4Climate Change Cluster, University of Technology Sydney, 5Aarhus University Centre for Water Technology, Section for Microbiology, Department of Bioscience, Aarhus University
* These authors contributed equally

Summary

हम ऑप्टिकल सेंसर पन्नी के साथ 2D O2 वितरण मानचित्रण के लिए एक उपन्यास, आवृत्ति-डोमेन ल्यूमिनेसेंस लाइफटाइम कैमरा के उपयोग का वर्णन करते हैं। जलीय पौधों के राइजोस्फीयर में ओ2 माइक्रोएनवायरमेंट की कल्पना करने के लिए सेंसर पन्नियों की तैयारी, अंशांकन और अनुप्रयोग के साथ कैमरा सिस्टम और छवि विश्लेषण प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है।

Abstract

हम 2D में उच्च स्थानिक (< 50-100 μm) और लौकिक (< 10 s) संकल्प पर छवि भंग ऑक्सीजन (O2)की एक विधि का वर्णन करते हैं । विधि आवृत्ति-डोमेन में ल्यूमिनेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग के लिए एक विशेष कैमरा सिस्टम के संयोजन में ओ2 संवेदनशील ल्यूमिनेसेंट सेंसर पन्नी (प्लैनार ऑप्टोड्स) को नियोजित करती है। प्लैपर ऑप्टोड्स को एक बहुलक में ओ2-संवेदनशीलसंकेतक रंगे को भंग करके और चाकू कोटिंग के माध्यम से एक परिभाषित मोटाई में ठोस समर्थन पर मिश्रण फैलाकर तैयार किया जाता है। सॉल्वेंट के वाष्पीकरण के बाद, प्लानर ऑप्टोड को ब्याज के नमूने के साथ निकट संपर्क में रखा जाता है - यहां जलीय पौधे लिटोरेला यूनिफ्लोराकी जड़ों के साथ प्रदर्शन किया गया। प्लैनार ऑप्टोड के भीतर संकेतक रंग के ल्यूमिनेसेंस जीवनकाल में ओ2 एकाग्रता-निर्भर परिवर्तन एक विशेष कैमरे का उपयोग करपारदर्शी वाहक पन्नी और मछलीघर दीवार की पीठ के माध्यम से चित्रित किया गया है। यह कैमरा एक संग्राहक उत्तेजना संकेत और उत्सर्जन संकेत के बीच चरण कोण में बदलाव के माध्यम से ल्यूमिनेसेंस लाइफटाइम (μs) को मापता है। यह विधि ल्यूमिनेसेंस तीव्रता इमेजिंग विधियों से बेहतर है, क्योंकि संकेत उत्तेजित स्रोत की रंग एकाग्रता या तीव्रता से स्वतंत्र है, और पूरी तरह से ल्यूमिनेसेंस क्षय समय पर निर्भर करता है, जो एक आंतरिक रूप से संदर्भित पैरामीटर है। नतीजतन, एक अतिरिक्त संदर्भ रंग या संदर्भ के अन्य साधनों की जरूरत नहीं है। हम पौधे राइजोस्फीयर के स्थूल ओ2 इमेजिंग के लिए प्रणाली के उपयोग को प्रदर्शित करते हैं, लेकिन कैमरा सिस्टम को आसानी से माइक्रोस्कोप से जोड़ा जा सकता है।

Introduction

तलछट और मिट्टी में घुली हुई गैसों और आयनों का वितरण और गतिशीलता बायोजियोकेमिकल प्रक्रियाओं जैसे माइक्रोबियल श्वसन1,2,या पौधों की जड़ों से रेडियल ऑक्सीजन हानि3,4,5और रोगाणुओं के रासायनिक सूक्ष्म वातावरण6,7,संयंत्र राइजोस्फीयर5,8,9 और पशु बिल10, 11,12. इस तरह के प्रसार-सीमित वातावरण में जैविक और रासायनिक गतिविधि रासायनिक सब्सट्रेट्स या बायोजियोकेमिकल प्रक्रियाओं के उत्पादों के भारी ढाल बना सकती है। विशेष रूप से, ओ2 उपलब्धता का बायोजियोकेमिकल प्रक्रियाओं पर बहुत बड़ा प्रभाव पड़ता है और इस प्रकारसिस्टम 13के जीव विज्ञान और पारिस्थितिकी का। इसलिए, उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प पर ओ2 सांद्रता का विश्लेषण जलीय और स्थलीय विज्ञान में प्रमुख महत्व का है । सबसे पहले, इस महत्वपूर्ण एनालाइट को मापने के लिए इलेक्ट्रोकेमिकल और ऑप्टिकल माइक्रोसेंसर14,15 विकसित किए गए थे। बाद में, प्लैपर ऑप्टोड्स के साथ ओ2 की 2 आयामी (2डी) इमेजिंग12,16,17,18,19पेश की गई, जिसने मिट्टी और तलछट में विषम ओ2 वितरण के दृश्य और मात्राकोनीकरण को सक्षम किया।

प्लानर ओ2 ऑप्टोड्स में ओ2-सेंसिटिव इंडिकेटर डाइ20होता है, जो एक उपयुक्त बहुलक21में भंग हो जाता है । संकेतक रंग विशिष्ट ऑप्टिकल तरंगदैर्ध्य पर उत्साहित है और ल्यूमिनेसेंस के रूप में विश्राम पर लाल-स्थानांतरित प्रकाश उत्सर्जित करता है। ओ2की उपस्थिति में, उत्तेजित संकेतक रंग टक्कर पर ओ2 अणु के लिए अपनी ऊर्जा स्थानांतरित कर सकते हैं, जिसे टकराव आधारित ल्यूमिनेसेंस शमन22के रूप में जाना जाता है। इसलिए, ल्यूमिनेसेंस तीव्रता के साथ-साथ ल्यूमिनेसेंस जीवनकाल23में वृद्धि के साथ कम हो जाता है। एक आदर्श मामले में तीव्रता और जीवनकाल में परिवर्तन स्टर्न-वोल्मर समीकरण (समीकरण 1) का पालन करता है या तो अनुपस्थिति में चमक तीव्रता या जीवनकाल का उपयोग कर (मैं0;α0)या उपस्थिति (I, α) ओ2 की एक दी गई एकाग्रता[क्यू]पर । स्टर्न-वोल्मर स्थिर (Ksv)ओ2के प्रति ऑप्टोड की संवेदनशीलता के लिए एक उपाय है; कश्मीरएसवी तापमान और दबाव जैसे पर्यावरणीय चरों पर निर्भर है।

(1)

एक कैमरा सिस्टम के साथ एक प्लानर सेंसर पन्नी पर ल्यूमिनेसेंस में इस तरह के परिवर्तनरिकॉर्डिंग O2 वितरण में इसी परिवर्तन की कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रारंभ में, सरल ल्यूमिनेसेंस तीव्रता आधारित ओ2 इमेजिंग का उपयोग18किया गया था। हालांकि, ऐसी कार्यप्रणाली बाहरी हस्तक्षेपों के प्रति बहुत संवेदनशील है, जो विषम रोशनी, उत्तेजना स्रोत या कैमरे में उतार-चढ़ाव के साथ-साथ प्लैपर ऑप्टोड के भीतर संकेतक रंगे का असमान वितरण के कारण परिणामों की विश्वसनीयता से समझौता करती है।

इनमें से कुछ सीमाओं को रेशियोमेट्रिक इमेजिंग17,24के लिए प्लानर ऑप्टोड्स का उपयोग करके समाप्त किया जा सकता है, जहां ओ2-संवेदनशीलसंकेतक डाइ को ओ2-संकेतककी तुलना में एक अलग स्पेक्ट्रल रेंज में एक असंवेदनशील संदर्भ रंगभेद के साथ प्लानर ऑप्टोड की बहुलक परत में सह-स्थिर किया जाता है। दो स्पेक्ट्रल खिड़कियों में प्राप्त उत्सर्जन छवियों के आधार पर, ओ2-संवेदनशील उत्सर्जन संकेत संदर्भ संकेत द्वारा विभाजित किया गया है, एक अनुपात छवि उत्पन्न करता है जो उपरोक्त हस्तक्षेप5,17से कम प्रवण होता है। विधि के लिए एक दूसरे रंग के उपयोग की आवश्यकता होती है, जिसे आदर्श रूप से एक ही उत्तेजना स्रोत से उत्साहित किया जा सकता है, लेकिन कैमरे की एक और स्पेक्ट्रल खिड़की (जैसे, आरजीबी कैमरे के एक अन्य रंग चैनल में) में एक अलग तरंगदैर्ध्य (महत्वपूर्ण स्पेक्ट्रल ओवरलैप के बिना) में उत्सर्जित होता है।

वैकल्पिक रूप से, ओ2 इमेजिंग संकेतक रंग के ल्यूमिनेसेंस जीवनकाल में ओ2-निर्भरपरिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने पर आधारित हो सकती है, जो संकेतक एकाग्रता25में असमान रोशनी या विषमताओं से प्रभावित नहीं होती है। पहले ल्यूमिनेसेंस लाइफटाइम-आधारित ओ2 इमेजिंग सिस्टम एक गेट-सक्षम चार्ज्ड डिवाइस (सीसीडी) कैमरा सिस्टम26के साथ समय-डोमेन मापन पर आधारित थे, जहां एक स्पंदित उत्तेजना स्रोत का उपयोग किया जाता है और ल्यूमिनेसेंस छवियों को संकेतक8,23,27के उत्तेजना या उत्सर्जन के भीतर परिभाषित समय अंतराल पर लिया जाता है। ऐसी छवियों से, ल्यूमिनेसेंस जीवनकाल को अंशांकन में इसी ओ2 एकाग्रता से निर्धारित और सहसंबद्ध किया जा सकता है। बाद में, प्लानर ऑप्टोड के खिलाफ दबाए गए दिए गए नमूने के लिए ल्यूमिनेसेंस लाइफटाइम छवियों को ओ2 एकाग्रता के इसी 2डी वितरण की छवियों में परिवर्तित किया जा सकता है। इस प्रणाली का उपयोग प्रयोगशाला और सीटू16,28दोनों में कई अनुप्रयोगों में किया गया है, लेकिन आवश्यक गेट-सक्षम सीसीडी कैमरा अब व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है।

हाल ही में, एक अलग ल्यूमिनेसेंस लाइफटाइम कैमरा सिस्टम जारी किया गया था, जो आवृत्ति-डोमेन8में छवियों का अधिग्रहण करता है। सिस्टम उत्तेजना के लिए लगातार संग्राहक प्रकाश स्रोत पर निर्भर करता है। यह या तो एक स्पंदित उत्तेजना के बजाय एक सिनसोइडल या वर्ग तरंग हो सकती है, जिसका उपयोग समय-डोमेन में छवि अधिग्रहण के लिए किया जाता है। इस मॉड्यूलेशन के परिणामस्वरूप ओ2 संकेतक रंग े की एक संग्राहक ल्यूमिनेसेंस उत्सर्जन होता है, जो एक कोण द्वारा चरण-स्थानांतरित होता है, जो संकेतक रंग (α α) (समीकरण 2 देखें) के ल्यूमिनेसेंस जीवनकाल पर निर्भर करता है।

(2)

उत्तेजना और उत्सर्जन आयाम (यानी, तथाकथित मॉड्यूलेशन इंडेक्स या गहराई (निरंतर ल्यूमिनेसेंस भाग द्वारा विभाजित आयाम)) के बीच परिवर्तन भी पागलपन जीवनकाल पर निर्भर है। इसलिए, एक ज्ञात मॉड्यूलेशन आवृत्ति स्थापित करके कैमरे के भीतर विशेष सीएमओएस छवि सेंसर एनएस में ल्यूमिनेसेंस लाइफटाइम को मापने में सक्षम है, जैसा कि कहींऔर विस्तार से वर्णितहै। ऑपरेशन सिद्धांत पर एक सामान्य गाइड पाया जा सकता है (निम्नलिखितलिंक https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8 का उपयोग करना)।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम 2D9,31में जलीय मीठे पानी के पौधे लिटोरेला यूनिफ्लोरा की जड़ों के चारों ओर ओ2 एकाग्रता के वितरण को इमेजिंग करने के लिए उपन्यास कैमरा सिस्टम के उपयोग को प्रदर्शित करते हैं। हम इस बात पर जोर देना चाहेंगे कि यह विधि इस आवेदन तक सीमित नहीं है। ऑक्सीजन के प्रति संवेदनशील ऑप्टोड्स या सेंसर कण27 का उपयोग चिकित्सा अनुसंधान32में किया गया है, बायोप्रिंटिंग33में, दबाव संवेदनशील पेंट34,35के लिए, या फोटोसिंथेटिक सिस्टम का अध्ययन करने के लिए2,36,37,बस आवेदन के कुछ अन्य क्षेत्रों का नाम लेने के लिए।

Protocol

1. प्लानर ओ2 ऑप्टोड का निर्माण

  1. 1.5 मिलीग्राम ल्यूमिनेसेंट ओ2 इंडिकेटर डाये प्लेटिनम (II) को भंग करें- 5,10,15,20- टेट्राकिस - (2,3,4,5,6- पेंटाफ्लोरफिन) - पोर्फिरिन (पीटीएफपीपी) और 100 मिलीग्राम पॉलीस्टीरिन (पीएस) तथाकथित 'सेंसर कॉकटेल' प्राप्त करने के लिए।
    नोट: कॉकटेल फ्रिज और अंधेरे में कुछ घंटों के लिए एक बंद, गैस तंग ग्लास शीशी में रखा जा सकता है जब तक आगे का उपयोग करें ।
  2. पानी या इथेनॉल (70%) की मदद से साफ कांच की प्लेट पर एक साफ, धूल मुक्त पॉलीथीन टेरेफ्थैलेट (पीईटी) पन्नी (आवेदन पर निर्भर आकार) को ठीक करें फिल्म(चित्रा 1ए)।
  3. पन्नी पर साफ चाकू कोटिंग डिवाइस (120 माइक्रोन) रखें और ग्लास पिपेट(चित्रा 1बी)का उपयोग करके डिवाइस के सामने सेंसर कॉकटेल की एक लाइन लागू करें। फिर, कॉकटेल को समान रूप से फैलाने के लिए चाकू-कोटिंग डिवाइस को धीरे-धीरे और समान रूप से पीईटी पन्नी पर खींचें।
    नोट: सभी सामग्री और उपकरणों को अच्छी तरह से साफ किया जाना चाहिए और निर्माण एक धूल मुक्त वातावरण में किया जाना चाहिए, जैसे एक धुएं हुड, प्रवाह बेंच या एक बिंदु सक्शन डिवाइस के नीचे । अंतिम सेंसर पन्नी में विषमता ओं से बचने के लिए, पन्नी पर सेंसर कॉकटेल के आवेदन के बाद कदम तेजी से किया जाना चाहिए, क्योंकि क्लोरोफॉर्म तेजी से वाष्पित हो जाता है।
  4. तैयार प्लानर ओ2-संवेदनशील ऑप्टोड को 1 एच के लिए परिवेश की हवा में और फिर 50-60 डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग कैबिनेट में रात को सुखालें, जिसके परिणामस्वरूप ~ 1 μm के सॉल्वेंट वाष्पीकरण के बाद अंतिम परत मोटाई होती है। आगे उपयोग तक अंधेरे में उत्पादित ऑप्टोडेस (जैसे, एक कागज लिफाफे में) स्टोर करें(चित्र1 1सी)।
    नोट: Planar O2 ऑप्टोड्स का उपयोग करने से पहले कई महीनों से वर्षों तक शुष्क और अंधेरे में संग्रहीत किया जा सकता है। 1-20 माइक्रोन से लेकर एक अंतिम परत मोटाई पर्याप्त ल्यूमिनेसेंस सिग्नल और पर्याप्त प्रतिक्रिया समय के साथ अच्छे परिणाम देने के लिए साबित हुई है।

2. राइज़ो-सैंडविच चैंबर

  1. 96% इथेनॉल के साथ दो ग्लास प्लेट (24.5 x 14 सेमी2,मोटाई: 4 मिमी) साफ करें।
  2. एक लंबी बढ़त को खुला छोड़ते हुए, पहले ग्लास प्लेट (यानी, रियर चैंबर साइड) के किनारों के साथ माइक्रोस्कोप स्लाइड (76 x 26 मिमी2,मोटाई: 1 मिमी) गोंद करने के लिए प्रकाश-उपचारीय, ऐक्रेलिक-आधारित त्वरित चिपकने वाला (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें। जरूरत के अनुसार माइक्रोस्कोप स्लाइड को छोटा करने के लिए एक ग्लासकटर का उपयोग करें।
    सावधानी: कांच काटने से तेज किनारों का कारण बन सकता है और देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए।
    नोट: माइक्रोस्कोप स्लाइड सामने और पीछे के बीच spacers के रूप में कार्य करते हैं, और जड़ों और पौधों के आकार की मोटाई के आधार पर, माइक्रोस्कोप स्लाइड की कई परतों को एक दूसरे के शीर्ष पर चिपकाया जा सकता है।
  3. चिपके माइक्रोस्कोप स्लाइड के बीच अंतरिक्ष में फिट करने के लिए प्लैनर ऑप्टोड को आवश्यक आकार और आकार में काट लें। इसे ऊपर की ओर लेपित पक्ष के साथ सामने ग्लास प्लेट के अंदर रखें, जब इसके खिलाफ दबाया जाता है तो ब्याज के नमूने के साथ संपर्क की अनुमति देते हैं।
  4. कांच की प्लेट में ऑप्टोड पन्नी के एक किनारे को टेप करें और कांच की प्लेट और ऑप्टोड पन्नी(चित्रा 2ए)के बीच में नल के पानी की कुछ बूंदें जोड़ें। धीरे-धीरे इन पानी की बूंदों पर पन्नी को कम करें जिससे यह कांच की सतह पर खुद को सीधा कर सके।
  5. सेंसर कोटिंग के खरोंच से बचते हुए, एक नरम ऊतक का उपयोग करके प्लैपर ऑप्टोड और ग्लास प्लेट के बीच में फंसे हवा के बुलबुले को ध्यान से हटा दें। कांच की प्लेट को सूखा पोंछें और ऑप्टोड पन्नी के शेष किनारों को कांच की प्लेट(चित्रा 2बी)में टेप करें।
    नोट: पानी के नीचे उपयुक्त आसंजन के साथ एक टेप चुना जाना चाहिए।
  6. 0.5 मिमी के जाल के आकार का उपयोग करतल को छलनी करें। पहली ग्लास प्लेट(चित्रा 2सी)पर एक चम्मच गीला तलछट रखें।
    नोट: जाल का आकार स्पेसर मोटाई से आधे से बड़ा नहीं होना चाहिए।
  7. तलछट को समान रूप से वितरित करें और इसे एक फ्लैट ग्लास प्लेट का उपयोग करके माइक्रोस्कोप स्लाइड स्पेसर के समान मोटाई में समायोजित करें। यह सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोस्कोप स्लाइड की ऊपरी सतह को सावधानीपूर्वक साफ करें कि दूसरी ग्लास प्लेट कक्ष को ठीक से सील कर दे।
  8. माइक्रोस्कोप स्लाइड सतह पर सिलिकॉन तेल लागू करें। एक पतली पानी फिल्म के साथ तलछट को कवर करें, जबकि ध्यान से हवा के बुलबुले के गठन से परहेज करें।
  9. ध्यान से लिटोरेला यूनिफ्लोरा का एक शूट धोएं और इसे तलछट पर रखें, पौधे के पत्तों के साथ ऊपरी खुली ओर से चिपके हुए(चित्रा 2डी)।
  10. दूसरी कांच की प्लेट रखें, इसके साथ जुड़े ऑप्टोड के साथ, तलछट पर और पौधे की जड़ों और आसपास के तलछट के साथ निकट संपर्क में ऑप्टोड लाने के लिए कोमल दबाव लागू करें।
    नोट: तलछट में फंसे हवा के बुलबुले को एक साथ लाते समय कांच की प्लेटों को झुकाकर हटाया जा सकता है।
  11. क्लैंप(चित्रा 2ई)का उपयोग करके कांच की प्लेटों को एक साथ जकड़ें। ऊतक कागज के साथ बाहरी किनारों को सुखाएं। राइज़ो-सैंडविच (उदाहरण के लिए, पानी की कुछ बूंदों के लगातार जोड़कर) की पूरी विधानसभा में पत्तियों को मॉइस्चराइज रखें।
  12. विनाइल इलेक्ट्रिकल टेप का उपयोग करराइज़ो-सैंडविच चैंबर को कस लें। मॉडलिंग मिट्टी के साथ किनारों सील और इसके अतिरिक्त विनाइल विद्युत टेप(चित्रा 2एफ)के साथ उन्हें टेप।
    नोट: यदि तलछट में कई हवा बुलबुले हैं, या स्पेसर माइक्रोस्कोप स्लाइड और दूसरी ग्लास प्लेट के बीच में तलछट अनाज हैं, तो कक्ष को फिर से इकट्ठा किया जाना चाहिए क्योंकि पोर पानी बाहर रिसाव कर सकता है (दोहराएं कदम 2.4 - 2.8)।
  13. राइज़ो-सैंडविच को कवर करने के लिए एक अपारदर्शी प्लास्टिक का उपयोग करें, लेकिन पौधे की पत्तियों के लिए पन्नी में एक भट्ठा छोड़ दें। प्लास्टिक की पन्नी में एक खिड़की काटें, इसलिए इसे खुलासा करके प्रयोगों के लिए खोला जा सकता है। पौधे को इनक्यूबेटेड करते समय ऑप्टोड को फोटो ब्लीचिंग से बचाने के लिए रबर बैंड(चित्रा 2जी)का उपयोग करके अनुकूलन समय के दौरान खिड़की बंद करें।
    नोट: के रूप में शैवाल विकास संभवतः O2 सांद्रता मापा के साथ हस्तक्षेप कर सकता है, हम इसे कम करने की कोशिश कर की सिफारिश, फ़िल्टर पानी का उपयोग करके, पूर्व साफ प्रयोगात्मक उपकरण और गठन पर शैवाल को हटाने ।

3. राइज़ो-सैंडविच चैंबर ऊष्मायन

  1. प्लानर ऑप्टोड के खिलाफ रूट ग्रोथ को प्रोत्साहित करने के लिए थोड़ा झुका हुआ स्थिति में राइज़ो-सैंडविच चैंबर (32 x 7 x 28 सेमी3)में रखें।
  2. पौधे की पत्तियों को पूरी तरह से जलमग्न करने के लिए पानी की टंकी को पर्याप्त पानी से भरें।
  3. समय नियंत्रित दीपक का उपयोग करके पौधे के अनुकूलन के लिए 14 घंटे का प्रकाश, 10 एच डार्क चक्र स्थापित करें। पानी की वातारण और मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए टैंक में एक हवा-पत्थर या पानी पंप रखें(चित्रा 2एच)।

4. इमेजिंग

  1. इमेजिंग सेटअप
    1. राइज़ो-सैंडविच चैंबर में प्लैपर ऑप्टोड को कवर करने वाली प्लास्टिक की पन्नी निकालें। मछलीघर की दीवार के खिलाफ ऑप्टोड सीधे के साथ कांच की दीवार के साथ कक्ष की स्थिति। मछलीघर की दीवार के खिलाफ राइज़ो-सैंडविच चैंबर को दबाने के लिए एक स्पेसर का उपयोग करें।
      नोट: मछलीघर की दीवार की समग्र मोटाई के साथ-साथ राइज़ो-सैंडविच चैंबर की दीवार बहुत मोटी नहीं होनी चाहिए, हालांकि, बिखरे हुए प्रकाश के क्षीणता को बढ़ाकर स्थानिक क्रॉस-टॉक को कम करने के लिए ल्यूमिनेसेंस इमेजिंग के लिए एक्वारिया दीवारों के लिए कांच की मोटाई की सिफारिश की जाती है। सामग्री इंटरफेस पर प्रकाश बिखरने को कम करने के लिए कांच की दीवारों (एक ही रिफ्रैक्टरी इंडेक्स) दोनों के लिए एक ही सामग्री का उपयोग करना महत्वपूर्ण है; के रूप में यह एक धुंधला छवि के रूप में अच्छी तरह से12करने के लिए नेतृत्व करेंगे .
    2. एक्वेरियम के सामने एक उद्देश्य (सामग्री की तालिकादेखें) से लैस आवृत्ति-डोमेन-आधारित ल्यूमिनेसेंस लाइफटाइम कैमरा रखें और ब्याज के क्षेत्र (जलीय पौधे लिटोरेला यूनिफ्लोराकी जड़ें), जो प्लैपर ऑप्टोड के सीधे संपर्क में हैं)(चित्रा 3)।
      नोट: कैमरे के आसान ऊंचाई समायोजन की अनुमति देने के लिए कैमरे को लैब स्टैंड पर रखा जा सकता है। लैब स्टैंड की स्थिति चिह्नित कर उसे ठीक रखा जाए। इसके अतिरिक्त, प्रयोग के दौरान कैमरे की आकस्मिक आवाजाही से बचने के लिए कैमरे को लैब स्टैंड पर टेप किया जा सकता है।
    3. चित्रपाठ स्रोत से निष्कर्षों को दूर करने के लिए, कैमरा उद्देश्य पर संकेतक रंग (सामग्री की तालिकादेखें) के रूप में इमेजिंग PtTFPP के लिए एक उपयुक्त उत्सर्जन फिल्टर पेंच।
      नोट: स्क्रू-ऑन फ़िल्टर आदर्श हैं, लेकिन स्क्वायर फ़िल्टर का उपयोग या तो उपयुक्त एडाप्टर के साथ किया जा सकता है, या उद्देश्य के लिए उन्हें सावधानीपूर्वक टेप करके।
    4. कैमरे के मॉड्यूलेशन और डार्क गेट आउटपुट से एक एलईडी उत्तेजना स्रोत (सामग्री की तालिकादेखें) कनेक्ट करें।
      नोट: पूर्व प्रकाश स्रोत के लिए मॉड्यूलेशन सिग्नल बचाता है, जबकि बाद छवि सेंसर की छवि readout के दौरान प्रकाश बंद कर देता है । एलईडी उत्तेजना स्रोत और कैमरे को कंप्यूटर से कनेक्ट करें। पृष्ठभूमि प्रकाश को छवि readout के दौरान कम किया जाना चाहिए, या तो पूरे कमरे को काला करके या पूरे सेट-अप पर एक घने, काले कपड़े डालकर। बाद के मामले में, कैमरे के गर्म होने से बचने के लिए पर्याप्त वेंटिलेशन सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है।
    5. एलईडी उत्तेजना स्रोत में प्रकाश गाइड को ठीक करें और ब्याज के क्षेत्र को कवर करने वाले प्लानर ऑप्टोड पन्नी को समान रूप से रोशन करने के लिए इसे स्थिति दें।
      नोट: उपयोग किए गए एलईडी उत्तेजना स्रोत में 3 अलग-अलग एलईडी (460 एनएम, 528 एनएम, 625 एनएम) के बीच स्विच करना संभव है, जिसकी तीव्रता को नियंत्रण सॉफ्टवेयर के माध्यम से समायोजित किया जा सकता है।
  2. सेटिंग्स और कैमरा ऑपरेशन
    नोट: वर्णित प्रयोगों के लिए, हमने व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर पैकेज (सामग्री की तालिकादेखें) में लाइफटाइम इमेजिंग के लिए एक समर्पित मॉड्यूल के संयोजन में आवृत्ति-डोमेन-आधारित लाइफटाइम कैमरा का उपयोग किया।
    1. उपयोग करने से पहले चुने हुए सॉफ़्टवेयर में कैमरे का चयन करें।
      नोट: सॉफ्टवेयर और कैमरा ड्राइवरों को निर्माताओं के दिशा निर्देशों का पालन करने के लिए इमेजिंग से पहले स्थापित करने की आवश्यकता है ।
    2. एलईडी नियंत्रण सॉफ्टवेयर खोलें (प्रयोग शुरू करने से पहले फिर से स्थापित) और स्टैंडबाय को टिक करउपयुक्त एलईडी (यहां: 528 एनएम) चुनें। एलईडी तीव्रता को आवश्यकतानुसार सेट करें (यहां 30%) सुनिश्चित करें कि एलईडी बाहरी टीटीएल द्वारा ट्रिगर किया जाता है; यह एलईडी के लिए एनालॉग और सिंक को टिक करके किया जाता है।
      नोट: एलईडी तीव्रता को व्यक्तिगत रूप से समायोजित करने की आवश्यकता होती है, क्योंकि बहुत अधिक लेजर शक्ति संकेतक या संदर्भ रंग की त्वरित फोटो ब्लीचिंग का कारण बन सकती है।
    3. कैमरे पर ध्यान केंद्रित करें और उद्देश्य के अपर्चर को मैन्युअल रूप से समायोजित करें (वर्तमान अध्ययन में एफ = 2.8 का उपयोग करें)।
      नोट: कैमरे को प्लानर ऑप्टोड पर केंद्रित करना महत्वपूर्ण है न कि एक्वेरियम ग्लास पर; यह पैमाने के लिए एक शासक के साथ एक छवि लेने के द्वारा सुनिश्चित किया जा सकता है, और वास्तविक शासक के बजाय ऑप्टोड पर शासक की छाया पर ध्यान केंद्रित कर के।
    4. सॉफ्टवेयर के कैमरा कंट्रोल पैनल के भीतर निम्नलिखित पैरामीटर सेट करें: आंतरिक मॉड्यूलेशन स्रोत; आउटपुट वेवफॉर्म के लिए सीन वेव; अतिरिक्त चरण नमूना (हां); 8 चरण के नमूने, चरण आदेश विपरीत, टैप ए + बी रीडआउट; 5 किलोवाट मॉड्यूलेशन फ्रीक्वेंसी।
      नोट: ये पैरामीटर छवि की गुणवत्ता को प्रभावित करते हैं और यदि आवश्यक हो तो बदला जा सकता है। कैमरा का निर्माता व्यक्तिगत मापदंडों के बारे में दिशानिर्देश प्रदान करता है (जब भी सॉफ़्टवेयर अपडेट हो जाता है तो कैमरा निर्माता दिशानिर्देश और अपडेट जारी कर रहा है)।
    5. प्रयोगों से पहले एक संदर्भ छवि लें।
      नोट: यह या तो एक अंशांकन मानक (एक ज्ञात जीवनकाल (एनएस या μs) के साथ एक ल्यूमिनेसेंट रंग इमेजिंग द्वारा किया जा सकता है, या एलईडी के परिलक्षित प्रकाश का उपयोग करके। बाद के मामले में, उत्सर्जन लांग पास फिल्टर को उद्देश्य से हटाने की आवश्यकता है और ज्ञात जीवनकाल को 1 एनएस तक सेट किया जा सकता है।
    6. सामान्यीकृत ल्यूमिनेसेंस तीव्रता छवि के लिए आरओआई स्टैटिस्टिक्स रीडआउट (इस पैनल के नीचे) तक समर्पित इमेजिंग सॉफ़्टवेयर के अंशांकन अनुभाग में एक्सपोजर समय समायोजित करें 0.68 - 0.72 की सीमा में है।
      नोट: अब संदर्भ जीवनकाल (जैसे, 1 एनएस) सॉफ्टवेयर के लिए इनपुट के रूप में दिया जाता है ।
    7. एक संदर्भ मापने श्रृंखला के अधिग्रहण शुरू करने के लिए प्रेस कैप्चर संदर्भ।
      नोट: समाप्त होने पर, संदर्भ डेटा संग्रहीत किए जाते हैं और नमूनों पर एकल या समय चूक माप किया जा सकता है।
  3. ओ2 ऑप्टोड का अंशांकन
    1. एक (छोटे) ग्लास एक्वेरियम में एक प्लानर ओ2-संवेदनशीलऑप्टोड का एक टुकड़ा रखें। पहले वर्णित अंशांकन कक्ष की कांच की दीवार पर प्लानर ऑप्टोड को ठीक करें (अनुभाग 2.3 देखें)। अंशांकन मछलीघर को कैमरे के सामने रखें। एलईडी द्वारा रोशनी भी सुनिश्चित करें, साथ ही साथ ऑप्टोड देखने के पूरे क्षेत्र को भरता है।
      नोट: प्लानर ऑप्टोड पन्नी के एक ही टुकड़े से होना चाहिए या वास्तविक प्रयोग में इस्तेमाल पन्नी के रूप में एक ही सेंसर कॉकटेल से बनाया जाना चाहिए ।
    2. प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले उसी तरल माध्यम से मछलीघर भरें।
      नोट: अंशांकन और प्रयोगों के लिए विभिन्न मीडिया का उपयोग माप को प्रभावित कर सकते हैं, (उदाहरण के लिए, सेंसर प्रतिक्रिया और/ इस प्रकार, अंशांकन एक ही माध्यम में किया जाना चाहिए, और वास्तविक प्रयोग के रूप में एक ही तापमान पर। तापमान में उतार-चढ़ाव से ल्यूमिनेसेंस सिग्नल प्रभावित होगा और इससे बचना चाहिए। हालांकि, यदि तापमान को स्थिर नहीं रखा जा सकता है, तो विभिन्न (प्रासंगिक) तापमान पर ओ2-संवेदनशीलऑप्टोड (कई बिंदुओं) को अंशांकित करके और मूल्यों की बाद में पुनर्गणना करके तापमान मुआवजा किया जाना चाहिए।
    3. एक गैस मिश्रण डिवाइस का उपयोग कर, ज्ञात O2 एकाग्रता के एक हवा/N2 गैस मिश्रण के साथ पानी निस्तब्धता द्वारा अंशांकन मछलीघर के भीतर O2 एकाग्रता समायोजित करें । सुनिश्चित करें कि पानी पर्याप्त समय के लिए aerating द्वारा इस्तेमाल गैस मिश्रण के साथ अच्छी तरह से समान है (प्रवाह दर और मछलीघर के आकार पर निर्भर करता है) ।
      नोट: हम तापमान मुआवजे के साथ एक बाहरी, कैलिब्रेटेड ओ2 सेंसर के साथ अंशांकन मछलीघर में ओ2 स्तर की निगरानी की सलाह देते हैं (उदाहरण के लिए, फाइबर ऑप्टिक या इलेक्ट्रोकेमिकल ओ2 सेंसर का उपयोग करके)।
    4. अंशांकन कक्ष में विभिन्न ओ2 सांद्रता पर छवियों की एक श्रृंखला लें।
      नोट: अधिग्रहीत अंशांकन डेटा के लिए एक उचित वक्र फिट सक्षम करने के लिए कम से कम पांच अलग-अलग ओ2 सांद्रता को मापा जाना चाहिए। 0 एचपीए (एनोक्सिक स्थितियों) पर मापना महत्वपूर्ण है, और फिर अपने विशिष्ट संकेतक रंग की गतिशील सीमा पर अन्य मूल्यों को वितरित करें। यहां हमने पीटीटीएफपीपी का उपयोग ओ2-संवेदनशीलसंकेतक रंग के रूप में किया जो पॉलीस्टीरिन मैट्रिक्स में स्थिर है। छवियों को 0, 48, 102, 156, और 207 एचपीए पर लिया गया; 207 एचपीए दिए गए लवणता और दबाव पर 100% वायु संतृप्ति से मेल खाता है।
  4. नमूना इमेजिंग
    1. नमूने को कैमरे के सामने रखें और रोशनी भी सुनिश्चित करें।
    2. पौधे की चमक जीवन भर की छवि प्राप्त करने से ठीक पहले पौधे (और अन्य सभी प्रकाश स्रोतों) के लिए विकिरण की आपूर्ति करने वाली रोशनी को बंद करें। तीव्रता छवि के आधार पर अधिग्रहण समय समायोजित करें, यह सुनिश्चित करना है कि संकेत न तो अतिसंतृप्त है और न ही जीवन भर के निर्धारण में शोर (एस/एन) अनुपात के लिए एक अच्छा संकेत के लिए बहुत कमजोर है ।
    3. पौधे को अलग-अलग प्रकाश स्थितियों (जैसे, प्रकाश/अंधेरे) में बेनकाब करें और छवियों का एक सेट प्राप्त करें।
    4. संरचनात्मक छविप्राप्त करने के लिए कमरे में प्रकाश को चालू करें।
      नोट: जब पृष्ठभूमि प्रकाश चालू हो जाता है, तो कैमरा यथार्थवादी आजीवन छवि को मापनहीं पाएगा। हालांकि, तीव्रता छवि अब देखने के पूरे क्षेत्र के रूप में अर्धपारदर्शी ऑप्टोड के माध्यम से देखा दिखाता है ।
    5. अधिग्रहीत छवियों के बाद स्केलिंग सक्षम करने के लिए देखने के क्षेत्र में एक शासक या एक जैसे के साथ एक छवि ले लो।

5. डेटा विश्लेषण

  1. कैमरा निर्माता द्वारा प्रदान किए गए मैक्रो का उपयोग करके, समर्पित इमेजिंग सॉफ्टवेयर से सीधे चरण आजीवन और तीव्रता छवियों का निर्यात करें।
  2. स्वतंत्र रूप से उपलब्ध छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके आगे छवि विश्लेषण करें।
  3. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में अंशांकन के चरण आजीवन छवियों को खोलें और उपाय फ़ंक्शन का उपयोग करके पूरी छवि का मतलब निर्धारित करें। अंशांकन समारोह(चित्रा 4ए)निर्धारित करने के लिए ज्ञात ओ2 सांद्रता के खिलाफ मापा जीवन काल की साजिश ।
  4. सभी डेटा से α0/α की गणना करें (0 ओ2की अनुपस्थिति में मापा चरण जीवनकाल है)। ज्ञात ओ2 सांद्रता बनाम इन मूल्यों की साजिश(चित्रा 4बी)।
  5. पैरालेशन प्लॉट से पैरामीटर ्सवी और एफ निर्धारित करें, गतिशील टकराव शमन (समीकरण 3)38,39 के लिए सरलीकृत दो-साइट मॉडल का उपयोग करके जहां [क्यू] ओ2 एकाग्रता है। डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में फिट-फ़ंक्शन को परिभाषित करें, जो तब Ksv और एफ निर्धारित करता है।

(3)

  1. निर्धारित मापदंडों कश्मीरएसवी,एफ और α0का उपयोग करके, इमेजड लाइफटाइम को ओ2 सांद्रता में बदलने के लिए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में अधिग्रहीत नमूना छवियों को खोलें।
    नोट: एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में भी अधिग्रहीत अंशांकन चरण आजीवन मूल्यों(चित्र4ए)सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है। इस मामले में, कर्व फिट फ़ंक्शन का उपयोग करके एक घातीय फिट का उपयोग अंशांकन के लिए किया जाता है।
  2. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में अगले शासक के साथ छवि खोलें और मापने वाले उपकरण का उपयोग करके एक ज्ञात दूरी को मापें। सेट स्केलके तहत इस माप को वैश्विक स्तर के रूप में सेट करें ।

Representative Results

नई इमेजिंग प्रणाली के लिए एक आवेदन उदाहरण के रूप में, हम एक जटिल जैविक नमूने (यानी, जलीय पौधे लिट्टोरेला यूनिफ्लोराके राइजोस्फीयर) की 2D O2 इमेजिंग दिखाते हैं।

सबसे पहले, विधि एक प्लानर सेंसर फिल्म, एक तथाकथित planar ऑप्टोड के निर्माण का वर्णन करता है । जैसा कि चित्र 1में देखा गया है, इस तरह के ऑप्टोड एक पॉलीमर मैट्रिक्स में ऑप्टिकल संकेतक की एक पतली परत से बना होता है जो पारदर्शी समर्थन पर फैलता है। वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करके, चाकू कोटिंग डिवाइस के अंतर से परिभाषित एक समान मोटाई के साथ एक सजातीय सेंसर फिल्म प्राप्त की जाती है। यदि उत्पादित ऑप्टोड में एक बद सेंसर सामग्री वितरण (उदाहरण के लिए, कोटिंग में छेद, धारियों, या रंग के समुच्चय दिखाता है (इसका नेत्रहीन मूल्यांकन किया जा सकता है, और यूवी लैंप की मदद से नेत्रहीन)), प्रोटोकॉल को दोहराया जाना चाहिए और सभी सामग्रियों को एसीटोन का उपयोग करके अच्छी तरह से साफ करने की आवश्यकता है।

एक बार प्लानर ऑप्टोड तैयार होने के बाद, नमूना प्लानर ऑप्टोड की संवेदन परत के साथ निकट संपर्क में लाया जा सकता है, जैसा कि एक राइज़ो-सैंडविच चैंबर में एकीकृत प्लानर ऑप्टोड के साथ दिखाया गया है, जहां एक आसपास के तलछट मैट्रिक्स के भीतर एक पौधे की जड़ें प्लैपर ऑप्टोड(चित्रा 2)के निकट संपर्क में तैनात की जा सकती हैं। यदि सही ढंग से तैयार किया जाता है, तो राइज़ो-सैंडविच कक्ष आसानी से एक मछलीघर (ऊष्मायन) से दूसरे (माप) में आसानी से जंगम होना चाहिए। यदि सही ढंग से निर्माण नहीं किया जाता है, तो राइज़ो-सैंडविच कक्ष स्थिर हो सकता है, तलछट खो सकता है या हवा के बुलबुले शामिल हो सकते हैं। विधानसभा के बाद सीधे राइज़ो-सैंडविच कक्ष की दृश्य परीक्षा की सिफारिश की जाती है।

दिया गया प्रोटोकॉल आवृत्ति-डोमेन-आधारित ल्यूमिनेसेंस लाइफटाइम कैमरा का उपयोग करके प्लानर ऑप्टोड के संपर्क में नमूने की आवृत्ति-डोमेन-आधारित ल्यूमिनेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग को सक्षम बनाता है। इस कैमरा सिस्टम जैसे छवि अधिग्रहण की विधा और वैज्ञानिक पूरक धातु-ऑक्साइड-सेमीकंडक्टर (एससीएमओएस) कैमरा विशेषताओं के बारे में अधिक जानकारी हाल के प्रकाशनों8,29में दी गई है ।

सेटअप ही सरल है और केवल कैमरा शामिल है जो एक प्रकाश स्रोत (इस मामले में, एक एलईडी उत्तेजना स्रोत) और ऑप्टोड(चित्रा 3)के साथ नमूना को नियंत्रित करता है। सुनिश्चित करें कि सभी भागसही ढंग से जुड़े हुए हैं और नमूना सजातीय रूप से प्रकाशित किया गया है। माप को पहले से बनाते समय पृष्ठभूमि प्रकाश से बचने की आवश्यकता है।

नमूने की इमेजिंग करने से पहले, ऑप्टोड को कैलिब्रेट करने की आवश्यकता है। जैसा कि चित्र 4एमें देखा गया है, मापा गया चिकनाई जीवनकाल अर्ध-घातीय क्षय के बाद ओ2 एकाग्रता बढ़ाने के साथ कम हो जाता है। इस रिश्ते को सरलीकृत दो साइट मॉडल(चित्रा 4बी और समीकरण 3) का उपयोग करके भी वर्णित किया जा सकता है। दिए गए उदाहरण में, बाद में ओ2 एकाग्रता की गणना करने के लिए आवश्यक मापदंडों का पालन किया गया; τ0 = 56.26 μs, कश्मीरएसवी = 0.032 एचपीए-1 और एफ = 0.86.

अंशांकन करना भी यह परीक्षण करने का एक आदर्श तरीका है कि सिस्टम सही ढंग से काम कर रहा है। यदि सभी घटकों को यहां (या निर्माताओं के दिशा-निर्देशों के भीतर) वर्णित के रूप में स्थापित किया जाता है, तो मापा गया जीवनकाल उसी ओ2 निर्भरता को दिखाना चाहिए जैसा कि चित्र4में देखा गया है। इसके अलावा, ओ2 संवेदन सामग्री (बहुलक और डाइ) के समान संयोजन के लिए, मापा गया α0 एक ही सीमा (± कुछ μs) में होना चाहिए जैसा कि यहां मापा जाता है (मुख्य रूप से प्रयोगात्मक तापमान से प्रभावित)। यदि समान अंशांकन वक्र प्राप्त करने में असमर्थ है, तो यह सुनिश्चित करें कि सभी चरणों का सही ढंग से पालन किया गया था। कभी-कभी ऑप्टोड गलती से नमूने के बजाय कांच की दीवार का सामना कर रहे संवेदनशील पक्ष के साथ तय हो जाता है, या अधिग्रहीत छवियां अधिक या अंडरएक्सपोज की जाती हैं।

अंशांकन मापदंडों के साथ, ल्यूमिनेसेंस लाइफटाइम (α) इमेजिंग करके ओ2 एकाग्रता का निर्धारण करना संभव है। यह चित्रा 5ए, बीमें प्रदर्शित किया गया है, जहां लिटोरेला यूनिफ्लोरा के राइजोस्फीयर में ओ2 एकाग्रता का वितरण अंधेरे में और 12 घंटे के लिए क्रमशः 500 μmol फोटॉन एम-2 एस-1 के प्रकाश संपर्क के बाद किया गया था। पौधे की फोटोसिंथेटिक गतिविधि के कारण, प्रकाश जोखिम के बाद राइजोस्फीयर में ओ2 एकाग्रता बढ़ गई। आजीवन छवियों के अलावा, इमेजिंग ज्यामिति को ठीक रखते हुए, बाहरी रोशनी के तहत "संरचनात्मक" छवियों को भी प्राप्त किया जा सकता है। इस तरह, ओ2 छवियों को संरचनात्मक छवि(चित्रा 5सी),क्रॉस सेक्शन या ब्याज के क्षेत्रों से ठीक सहसंबद्ध किया जा सकता है। एक उदाहरण के रूप में, एक ही रूट में ओ2 एकाग्रता प्रोफाइल क्रमशः अंधेरे और प्रकाश में प्राप्त छवि से निकाले गए थे(चित्र 5डी)।

Figure 1
चित्रा 1: एक प्लानर ओ2 ऑप्टोड का निर्माण। (A)एक पालतू पन्नी एक कांच की थाली पर तय की जाती है और चाकू-कोटिंग डिवाइस को पन्नी पर रखा जाता है। (ख)तैयार सेंसर कॉकटेल पीईटी पन्नी पर चाकू-कोटिंग डिवाइस के सामने पतली लाइन के रूप में फैला हुआ है । (ग)चाकू-कोटिंग डिवाइस को पीईटी पन्नी पर एक पतली फिल्म के रूप में सेंसर कॉकटेल फैलाने के लिए नीचे की ओर ले जाया जाता है, जो सॉल्वेंट वाष्पीकरण के परिणामस्वरूप प्लानर ऑप्टोड का उपयोग करने के लिए तैयार होता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एक प्लानर ओ2 ऑप्टोड के एकीकरण के साथ Rhizo-सैंडविच चैंबर विधानसभा। (क)ऑप्टोड एक पानी की फिल्म का उपयोग कर कांच की प्लेटों में से एक पर तय किया जाता है । (ख)ऑप्टोड बिजली के टेप के साथ थाली से चिपका हुआ है । (ग)तलछट को संलग्न स्पेसर्स (यानी माइक्रोस्कोप स्लाइड) के साथ विरोधी प्लेट में भरा जाता है। (द)पौधे की जड़ों को समान रूप से फैलने वाली तलछट पर रखा जाता है । (ई)राइज़ो-सैंडविच चैंबर बंद है और अस्थायी रूप से क्लैंप के साथ तय किया गया है। (एफ)पूरी तरह से बंद कर दिया और rhizo-सैंडविच चैंबर इकट्ठे हुए । (जी)इनक्यूबेशन लैंप द्वारा ऑप्टोड को प्रकाश जोखिम से बचाने के लिए और शैवाल विकास से बचने के लिए इकट्ठे राइज़ो-सैंडविच चैंबर के ऊपर प्लास्टिक का कवर रखा जाता है । (एच)राइज़ो-सैंडविच चैंबर एक मछलीघर में इनक्यूबेटेड । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: फ्रीक्वेंसी-डोमेन-आधारित ल्यूमिनेसेंस लाइफटाइम कैमरा युक्त इमेजिंग सेटअप, उद्देश्य के साथ पारदर्शी मछलीघर और राइज़ो-सैंडविच चैंबर दीवारों के माध्यम से पीछे से ऑप्टोड के साथ नमूने पर केंद्रित है। एलईडी उत्तेजना स्रोत के प्रकाश गाइड नमूना समान रूप से रोशन करने के लिए तैनात है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: प्लानर ओ2 ऑप्टोड के लिए कैलिब्रेशन घटता है। (क)पानी से भरे अंशांकन कक्ष में संबंधित ओ2 सांद्रता पर मापा गया विभिन्न फॉस्फोरेसेंस लाइफटाइम। (ख)डायनेमिक टकराव शमन (समीकरण 3) के लिए सरलीकृत दो साइट मॉडल का उपयोग करके लगे अंशांकन डेटा का स्टर्न-वोल्मर प्लॉट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: जलीय पौधे लिटोरेला यूनिफ्लोराके राइजोस्फीयर में ओ2 वितरण की लाइफटाइम इमेजिंग। }ओ2 वितरण पौधे को 12 घंटे तक लगभग 500 माइक्रोमोल फोटॉन्स एम-2 एस-1पर प्रकाश में रखने के बाद । (ख)ओ2 वितरण 1 घंटे के लिए अंधेरे में संयंत्र रखने के बाद(सी)पौधे की जड़ों की संरचनात्मक छवि के रूप में प्लैपर ऑप्टोड के माध्यम से देखा । (घ)क्रॉस-सेक्शनल ओ2 एकाग्रता प्रोफ़ाइल (स्थान पैनल ए और बी में पीली रेखा द्वारा इंगित किया जाता है) प्रकाश (लाल) में 12 घंटे और अंधेरे में 1 घंटे (काला) के बाद। (कोरेन, के., Moßhammer, M., Scholz, V.V., बोरिसोव, एसएम, होल्स्ट, जी, कुहल, एम ल्यूमिनेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग ऑफ केमिकल सेंसर - टाइम-डोमेन और फ्रीक्वेंसी-डोमेन आधारित कैमरा सिस्टम के बीच तुलना से अनुमति के साथ अनुकूलित। विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान। 91 (5), 3233-3238, दोई: 10.1021/acs.analchem.8b05869 (2019)) । कॉपीराइट (2019) अमेरिकन केमिकल सोसायटी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

इस प्रोटोकॉल में, ऑप्टोड तैयारी से ओ2 छवि विश्लेषण तक पूरे कार्य-प्रवाह को कवर किया गया है। इस प्रोटोकॉल का पालन करके, रासायनिक छवियों को उपन्यास आवृत्ति-डोमेन-आधारित ल्यूमिनेसेंस लाइफटाइम कैमरा का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। आवेदन के आधार पर, प्लानर ऑप्टोड्स को विभिन्न आकारों और सेंसर परत की परत मोटाई में गढ़ा जा सकता है, जो मजबूत 50-100 माइक्रोन मोटी प्लैनर ऑप्टोडेस से लेकर वर्ग सेंटीमीटर के कई दसवें हिस्से के माइक्रोस्कोप कवर स्लिप के साथ माइक्रोस्कोप कवर स्लिप6,40तक हो सकता है। इस विधि की क्षमता को एक विशेष अनुप्रयोग के साथ प्रदर्शित किया गया था, बल्कि न केवल12,28संयंत्र राइजोस्फीयर में ओ2 इमेजिंग तक सीमित है।

शुद्ध ल्यूमिनेसेंस तीव्रता-आधारित रासायनिक इमेजिंग विधियों की तुलना में इस विधि के कई लाभ हैं। ल्यूमिनेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग असमान रोशनी, असमान ऑप्टोड मोटाई और फोटो ब्लीचिंग25से प्रभावित नहीं है। इसके अलावा, यह विधि रेशियोमेट्रिक इमेजिंग17,37में एक अतिरिक्त संदर्भ रंगके के उपयोग से बचती है। अन्य लाइफटाइम आधारित कैमरा सिस्टम की तुलना में, जैसे आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले गेटेड टाइम-डोमेन कैमरे8,26,उपन्यास कैमरा सिस्टम और यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल तुलनीय परिणाम दे सकते हैं। हाल ही में एक प्रकाशन में, उन दो प्रणालियों की विश्लेषणात्मक विशेषताओं की तुलना की गई थी और यह पाया गया कि आवृत्ति-डोमेन आधारित ल्यूमिनेसेंस लाइफटाइम कैमरा सिस्टम कम से कम बंद समय-डोमेन आधारित पूर्ववर्ती8के बराबर है।

हमने सबसे सरल ओ2 ऑप्टोड प्रस्तुत किया है जिसमें केवल बहुलक मैट्रिक्स में एक संकेतक शामिल है। कई अन्य संभावित ओ 2 संकेतकोंके अलावा जिनका उपयोग किया जा सकता है,20 को शामिल किया जा सकता है, यानी, ऑप्टोड की पारदर्शिता को कम करते हुए सेंसर सिग्नल बढ़ाने के लिए टीओ2 या डायमंड पाउडर2 जैसे बिखरने वाले एजेंटों को शामिल किया जा सकता है। इसके अलावा अतिरिक्त रंगों का उपयोग ऊर्जा हस्तांतरण41के माध्यम से सिग्नल तीव्रता को बढ़ाने के लिए किया जा सकता है।

प्लानर ऑप्टोड फैब्रिकेशन के लिए, हम वर्णित सेंसर कॉकटेल संरचना का उपयोग करते समय सॉल्वेंट वाष्पीकरण (उपयोग किए गए अंतर का लगभग 10%) के बाद लगभग 7.5 से 12 माइक्रोन की अंतिम सेंसर परत मोटाई पैदा करने के लिए 75 - 120 माइक्रोन के चाकू-कोटिंग डिवाइस में अंतर का उपयोग करने की सलाह देते हैं। यह संकेत तीव्रता के बीच एक अच्छा समझौता है, जिसे उच्च रंग लोडिंग द्वारा संशोधित किया जा सकता है, या उच्च चमक के संकेतक और संदर्भ रंगों और प्रतिक्रिया समय का चयन करके। परत की मोटाई में वृद्धि के परिणामस्वरूप प्रतिक्रिया समय में वृद्धि होती है, क्योंकि एनालिएट के लिए आसपास के मीडिया के साथ संवेदन परत में थर्मोडायनामिक संतुलन तक पहुंचने के लिए आवश्यक समय अवधि12बढ़ जाती है।

ऑप्टोड्स, जैसा कि यहां वर्णित है, ओ2 एकाग्रता में कुछ सेकंड17 के भीतर परिवर्तन ों पर प्रतिक्रिया करते हैं, जबकि अभी भी पर्याप्त रूप से मजबूत ल्यूमिनेसेंस संकेत हैं। सब-सेकंड रिस्पांस टाइम के साथ अल्ट्राथिन सेंसर कोटिंग्स स्पिन-कोटिंग6के साथ महसूस की जा सकती हैं । यदि समर्थन या चाकू-कोटिंग डिवाइस अच्छी तरह से साफ नहीं हैं, तो इसके परिणामस्वरूप असंगत सेंसर परतें हो सकती हैं। इसके अलावा, जब कॉकटेल पूरी तरह से समरूप नहीं है या कोटिंग डिवाइस के सामने फैलने के बाद बहुत तेजी से लागू होता है तो इस तरह के एक अवांछित परिणाम को देखा जा सकता है। इसलिए, इष्टतम ऑप्टोड्स तैयार करने के लिए कुछ अभ्यास की आवश्यकता हो सकती है।

विधि का उपयोग नमूनों को छवि देने के लिए किया जा सकता है जिसे ऑप्टोड के निकट संपर्क में रखा जा सकता है, जैसे कि कुछ समुद्री जानवर42,बायोफिल्म6 और मिट्टी31 सिर्फ कुछ नाम के लिए। हम एक उद्देश्य का उपयोग करके एक स्टैंडअलोन सेटअप पेश करते हैं, हालांकि, कैमरे को आसानी से उच्च रिज़ॉल्यूशन केमिकल इमेजिंग43के लिए माइक्रोस्कोप पर जोड़ा जा सकता है।

जबकि समय-डोमेन आधारित ल्यूमिनेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग ने पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस26का दमन सक्षम किया, यह नई आवृत्ति-डोमेन-आधारित कैमरा सिस्टम8का उपयोग करते समय एक मुद्दा है। निरंतर छवि अधिग्रहण के कारण, यह कैमरा नमूने की किसी भी पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस को रिकॉर्ड करेगा जो चयनित एलईडी से उत्साहित हो सकता है और चयनित स्पेक्ट्रल विंडो में उत्सर्जित करता है जैसा कि कैमरा उद्देश्य पर उत्सर्जन फिल्टर द्वारा परिभाषित किया गया है। यह एक जाहिरा तौर पर कम जीवनकाल में परिणाम होगा और फलस्वरूप झूठी रीडिंग में । यदि आप ओ2 सेंसर उत्तेजना और उत्सर्जन के साथ एक महत्वपूर्ण आंतरिक फ्लोरेसेंस ओवरलैपिंग के साथ नमूनों के साथ काम करते हैं, तो कार्बन ब्लैक2,17युक्त एक अतिरिक्त परत कोटिंग करके ऑप्टोड के शीर्ष पर एक अतिरिक्त ऑप्टिकल अलगाव लागू करना आवश्यक है। इस प्रकार, केवल प्लानर ऑप्टोड से उत्सर्जित ल्यूमिनेसेंस कैमरे तक पहुंच जाएगा। पृष्ठभूमि ल्यूमिनेसेंस की जांच करने के लिए ऑप्टोड के बिना एक छवि ली जा सकती है, जो तब विशेष रूप से नमूने की आंतरिक चिकनाई दिखाएगी। संकेतक रंगे की ल्यूमिनेसेंस तीव्रता को बढ़ाने के लिए सेंसर कॉकटेल में टीआईओ2 या डायमंड पाउडर2,44जैसे बिखरने वाले एजेंटों को जोड़ना भी संभव है। हालांकि, यह तेजी से फोटो ब्लीचिंग का कारण भी बन सकता है और टीओ2 एक ज्ञात फोटो उत्प्रेरक है, जो एक रंग41की फोटोस्थिरता को ख़राब कर सकता है। एक और पहलू पर विचार करने के लिए पृष्ठभूमि प्रकाश है । जब कल्पना चिकनाई जीवन काल, पृष्ठभूमि प्रकाश के रूप में कुशलता से संभव के रूप में बचा जाना चाहिए । इसलिए, इस इमेजिंग विधि के लिए सेटअप को अंधेरे वातावरण में रखने की आवश्यकता होती है और छवि अधिग्रहण के दौरान किसी भी बाहरी प्रकाश स्रोत को अस्थायी रूप से बंद करने की आवश्यकता होती है।

सारांश में, ल्यूमिनेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग एक मजबूत रासायनिक इमेजिंग विधि है जिसे कई अलग-अलग अनुप्रयोगों के अनुकूल किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल (अनुभाग 1 -5 देखें) ओ2 छवि उत्पन्न करने के लिए सभी आवश्यक चरणों को कवर करता है और वर्तमान में सबसे लचीला आवृत्ति-डोमेन ल्यूमिनेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करता है, जो प्लैपर ऑप्टोड्स के साथ 2डी ओ2 इमेजिंग के लिए बंद गेटेड टाइम-डोमेन कैमरा को बदल सकता है।

Disclosures

लेखक गेरहार्ड होल्स्ट पीसीओ एजी का एक कर्मचारी है जो इस लेख में उपयोग किए जाने वाले कैमरा सिस्टम का निर्माण करता है। पीसीओ एजी आर्थिक रूप से इस लेख के प्रकाशन और खुली पहुंच लागत में योगदान दिया ।

Acknowledgments

हम तकनीकी सहायता के लिए सोफी लिंडेगार्ड जैकबसेन (कोपेनहेगन विश्वविद्यालय) और लार्स बोरेगार्ड पेडरसन (आरोहस विश्वविद्यालय) का शुक्रिया अदा करते हैं । इस अध्ययन के लिए वित्तपोषण स्वतंत्र अनुसंधान कोष डेनमार्क (DFF-1323-00065B) से एक Sapere-Aude उन्नत अनुदान से प्राप्त किया गया था; एमके), स्वतंत्र अनुसंधान कोष डेनमार्क से परियोजना अनुदान । प्राकृतिक विज्ञान (DFF-8021-00308B; एमके) और तकनीकी और उत्पादन विज्ञान (DFF-8022-00301B और DFF-4184-00515B; एमके), डेनिश नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (DNRF136), और Poul कारण जेंसेन फाउंडेशन (केके) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air pump with air stone and water pump Local aquarium store
Chloroform Sigma Aldrich 67-66-3
DC4 silicone compound Dow Corning GmbH 2793695
Gas mixer Vögtlin Instruments GmbH red-y compact meter GCM This is just one possible instrument. Several companies offer gas mixing devices
Glass plates and aquaria Local aquarium or hardware store
ImageJ Software ImageJ Freely available imaging software (imagej.nih.gov/ij/index.html)
Knife-coating device

BYK-GARDNER GMBH byk.com		 2021 This is a four sided film applicator enabling easy variation of the film thickness. Other versions are also available. We recommend a thickness of the applied film between 75-120 µm, which yields a final sensor layer thickness of ~10% of the applied thickness before solvent evaporation.
LED lamp, Reflector PAR38 Megaman MM17572
LED LEDHUB Omicon Laserage, Germany Can be configured with a variety of LEDs. For the presented example, the green LED (528 nm) is essential
LOCTITE AA 3494 Henkel AG & Co. KGaA NA Acrylic-based instant adhesive
NIS Elements AR Software Nikon Inc Software package used for image acquisition
pco.flim PCO AG, Germany Frequency domain based luminescence lifetime camera
platinum(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentafluorphenyl)-porphyrin (PtTFPP) Frontier Scientific PtT975 O2 indicator
polyethylene terephthalate (PET) foil Goodfellow 320-992-72 Such foils might also be found from other providers and serve as solid support
Polystyrene (PS) Sigma Aldrich 9003-53-6 Polymer matrix
Schott RG610 filter www.uviroptics.com Here 52mm screw on Filters can obtained. Other sources offer square glass filters from Schott glass that can be fixed in front of the objective
Vinyl electrical tape Scotch, Super 33+ NA
Zeiss Makro Planar 2/100 with Hama C for Nikon adaptor delivered with the camera Here any other objective might also be used in combination with an adaptor if the objective does not have a C-mount

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References

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Moßhammer, M., Scholz, V. V., Holst, G., Kühl, M., Koren, K. Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System. J. Vis. Exp. (154), e60191, doi:10.3791/60191 (2019).

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