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Chemistry

주파수 도메인 기반 카메라 시스템을 갖춘 O2의 발광 평생 이미징

Published: December 16, 2019 doi: 10.3791/60191
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1,4, 5
1Marine Biological Section, Department of Biology, University of Copenhagen, 2Center for Electromicrobiology, Aarhus University, 3PCO AG, 4Climate Change Cluster, University of Technology Sydney, 5Aarhus University Centre for Water Technology, Section for Microbiology, Department of Bioscience, Aarhus University
* These authors contributed equally

Summary

2DO2 분포를 광학 센서 포일로 매핑하기 위한 새로운 주파수 영역 발광 수명 카메라의 사용에 대해 설명합니다. 카메라 시스템 및 이미지 분석 절차는 수생 식물의 뿌리 구에서O2 미세 환경을 시각화하기위한 센서 포일의 준비, 교정 및 적용과 함께 설명됩니다.

Abstract

우리는 용존 산소(O2)높은 공간 (&50-100 μm) 및 시간 (&10 초) 해상도에서 2D에서 이미지화하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 주파수 영역에서 발광 수명을 이미징하기 위한 특수 카메라 시스템과 함께O2 민감한 발광 센서 포일(평면 광도)을 사용합니다. 평면 광형은O2-민감성표시기 염료를 중합체에 용해시키고 칼 코팅을 통해 정의된 두께로 고체 지지체에 혼합물을 확산시킴으로써 제조된다. 용매의 증발 후, 평면 optode는 관심샘플과 밀접한 접촉을 하게 된다 - 여기에 수생 식물 리토렐라 유니플로라의뿌리를 입증하였다. 평면 안편 내의 표시기 염료의 발광 수명에 대한O2 농도 의존적 변화는 특수 카메라를 사용하여 투명 캐리어 호일 및 수족관 벽의 뒷면을 통해 이미지화된다. 이 카메라는 변조된 여기 신호와 방출 신호 사이의 위상 각도 변화를 통해 발광 수명(μs)을 측정합니다. 이 방법은 신호가 염료 농도 또는 여기 소스의 강도와 독립적이기 때문에 발광 강도 이미징 방법보다 우수하며 본질적으로 참조 된 매개 변수인 발광 붕괴 시간에만 의존합니다. 따라서 추가 참조 염료 또는 다른 참조 수단이 필요하지 않습니다. 우리는 식물 뿌리 구의 거시 O2 이미징에 대한 시스템의 사용을 입증하지만, 카메라 시스템은 현미경에 쉽게 결합 될 수있다.

Introduction

퇴적물과 토양에서 용존 가스와 이온의 분포와 역학은 미생물 호흡1,2,또는 식물 뿌리에서 방사형 산소 손실과 같은 생물 지구 화학 과정에 대한 주요 정보를 제공합니다3,4,5,미생물의 화학 미세 환경6,7,식물 뿌리구5,8,9 및동물 굴10, 11,12. 이러한 확산 제한 환경에서 생물학적 및 화학적 활성은 화학 기질 또는 생물 지구 화학 공정의 제품의 가파른 구배를 만들 수 있습니다. 특히,O2 가용성은 생물지구화학 적 공정 및 따라서 시스템13의생물학 및 생태학에 큰 영향을 미친다. 따라서 높은 공간 및 시간적 해상도에서O2 농도를 분석하는 것은 수생 및 육상 과학에서 매우 중요합니다. 먼저, 전기화학및광학마이크로센서(14,15)는 이러한 중요한 분석을 측정하기 위해 개발되었다. 이후, 평면 광단을 이용한O2의 2차원(2D) 이미징이도입되었고, 12,16,17,18,19,토양 및 퇴적물에서 이질O2 분포의 시각화 및 정량화를 가능하게 하였다.

평면O2 광층은O2-민감성표시기염료(20)로구성되며, 이는 적합한중합체(21)에용해된다. 표시기 염료는 특정 광학 파장에서 흥분하고 발광의 형태로 이완시 적색 이동 빛을 방출한다. O2의존재에서, 흥분된 표시기 염료는 충돌 시O2 분자로 에너지를 전달할 수 있으며, 이는 충돌 기반 발광 담금질(22)이라고 한다. 따라서,O2 농도(23)가증가함에 따라 발광 세기뿐만 아니라 발광 세기도 감소된다. 이상적인 경우에 강도 및 수명의 변화는 주어진 농도에서O2의 발광 강도 또는 수명(I0;θ0)또는 존재(I, θ)를 사용하여 스턴-볼머 방정식(수학식1)을따른다. 스턴 볼머 상수 (Ksv)는O2를향한 광도의 감도에 대한 측정이다; KSV는 온도 및 압력과 같은 환경 변수에 의존합니다.

(1)

카메라 시스템으로 평면 센서 호일을 통해 이러한 발광 변화를 기록하여O2 분포에서 대응하는 변화를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 처음에는 간단한 발광 강도 기반O2 이미징을 18개사용했습니다. 그러나 이러한 방법론은 외부 간섭에 매우 민감하며, 이는 이질적인 조명, 여기 소스 또는 카메라의 변동뿐만 아니라 평면 안단 내의 표시기 염료의 고르지 않은 분포로 인한 결과의 신뢰성을 손상시킵니다.

이러한 제한 사항 중 일부는 O2-민감성 표시기 염료가O2-표시량보다다른 스펙트럼 범위에서 방출되는 둔감한 기준 염료를 가진 평면 광검의 중합체 층에서 공존하는 비율측정 이미징17,24를위해 평면 광단을 사용하여 완화될 수 있다. 2개의 스펙트럼 윈도우에서 획득한 방출 영상을 기반으로,O2-민감성방출 신호는 기준 신호로 나누어, 상기 언급한간섭에덜 취약한 비 영상을 생성한다5,17. 이 방법은 이상적으로 동일한 여기 소스에 의해 흥분 될 수 있지만, 카메라의 다른 스펙트럼 창 (예를 들어, RGB 카메라의 다른 컬러 채널에서) 다른 파장에서 방출 할 수있는 두 번째 염료의 사용을 필요로한다.

대안적으로,O2 이미징은 지표농도(25)에서고르지 않은 조명 또는 이질성에 의해 영향을 받지 않는 지표 염료의 발광 수명에 있는O2-의존적변화를 정량화하는 것을 기초로 할 수 있다. 제1 발광 수명 기반O2 이미징 시스템은 게이트 가능 충전 장치(CCD) 카메라시스템(26)을이용한 시간 영역 측정을 기반으로 하였으며, 여기서 펄스 여기 소스가 사용되고 발광 이미지는 표시기8,23,27의여기 또는 방출 내에서 정의된 시간 간격을 통해 촬영된다. 이러한 이미지로부터, 발광 수명은 캘리브레이션에서 상응하는O2 농도와 결정되고 상관될 수 있다. 이어서, 평면 광에 대해 가압된 주어진 샘플에 대한 발광 수명 이미지는O2 농도의 상응하는 2D 분포의 이미지로 변환될 수 있다. 이 시스템은 실험실 및 situ16,28에서모두 많은 응용 프로그램에서 사용되었지만 필수 게이트 가능 CCD 카메라는 더 이상 상업적으로 사용할 수 없습니다.

최근에는 주파수 영역8에서이미지를 획득하는 다른 발광 수명 카메라 시스템이 출시되었습니다. 시스템은 여기를 위해 지속적으로 변조된 광원에 의존합니다. 이는 시간 영역에서 이미지 수집에 사용되는 펄스 여기 대신 정현파 또는 사각 파일 수 있습니다. 이러한 변조는O2 표시기 염료의 변조 발광 방출을 초래하며, 이는 표기염료(θ)의 발광 수명에 의존하는 각도, φ에 의해 위상 이동된다(수학식 2 참조).

(2)

여기와 방출 진폭 사이의 변화 (즉, 소위 변조 지수 또는 깊이 (상수 발광 부분으로 나눈 진폭)) 또한 발광 수명에 의존한다. 따라서, 공지된 변조 주파수를 설정함으로써 카메라 내의 특수 CMOS 이미지 센서는 다른 곳에서 8,29,30에상세히 설명된 바와 같이 ns에서 μs 범위로 발광 수명을 측정할 수 있게 된다. 작동 원리에 대한 일반적인 가이드를 찾을 수 있습니다(다음 링크 https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8사용).

이하의 프로토콜에서, 우리는 2D9,31에서수생 담수 식물 리토렐라 유니플로라의 뿌리 주위에O2 농도의 분포를 이미징하기 위한 신규한 카메라 시스템의 사용을 입증한다. 우리는이 방법은 결코이 응용 프로그램에 국한되지 않는다는 것을 강조하고 싶습니다. 산소에 민감한 광파 또는 센서입자(27)는 다양한 이미징 방법과 조합하여 의학 연구32,바이오프린팅33,압력 감지 도료34,35,광합성 시스템2,36,37,단지 몇 가지 다른 분야의 응용 분야에 사용되었다.

Protocol

1. 평면 O2 광단의 제작

  1. 발광O2 지표 염료 백금 (II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-펜타플루오르페닐)-포르피린(PtTFPP) 및 100 mg의 폴리스티렌(PS)을 엽록소 1g에 용해하여 소위 '센서 칵테일'을 얻습니다.
    참고: 칵테일은 냉장고와 어둠 속에서 몇 시간 동안 닫혀 있는 가스가 단단한 유리 병에 넣어 보관할 수 있습니다.
  2. 깨끗한 먼지가없는 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET) 호일 (용도에 따라 크기)을 물이나 에탄올 (70 %)의 도움으로 청소 유리 판에 고정하십시오. 필름(그림 1A)을참조하십시오.
  3. 세척된 나이프 코팅 장치(120 μm)를 호일에 놓고 유리 파이펫을 사용하여 장치 앞에 센서 칵테일의 라인을 적용합니다(도1B). 그런 다음 칼 코팅 장치를 PET 호일 위에 천천히 균일하게 드래그하여 칵테일을 고르게 펴립니다.
    참고: 모든 재료와 공구는 철저히 세척해야 하며, 제조는 연기 후드, 플로우 벤치 또는 점 흡입 장치 아래와 같은 먼지가 없는 환경에서 이루어져야 합니다. 최종 센서 호일에서 이질성을 피하기 위해 클로로폼이 빠르게 증발함에 따라 호일에 센서 칵테일을 적용한 다음 단계는 신속하게 수행해야 합니다.
  4. 완성된 평면O2-민감광을주변 공기에서 1시간 동안 건조한 다음 50-60°C에서 가열 캐비닛에서 밤새 도록 건조시키고, 용매 증발 후 최종 층 두께를 ~12 μm로 건조시키고, 생성된 광도를 암흑 속에서 저장한다(예를 들어, 종이 봉투에) 추가 사용시까지(도1C).
    참고 : 평면 O2 광도는 사용하기 전에 몇 달에서 몇 년 동안 건조하고 어둠 속에서 저장할 수 있습니다. 1-20 μm에 이르는 최종 층 두께는 충분한 발광 신호와 적절한 응답 시간을 통해 좋은 결과를 제공하는 것으로 입증되었습니다.

2. 라이조 샌드위치 챔버

  1. 96 % 에탄올로 두 개의 유리 판 (24.5 x 14cm2, 두께 : 4mm)을 청소하십시오.
  2. 첫 번째 유리 판 (즉, 후면 챔버 측)의 가장자리를 따라 현미경 슬라이드 (76 x 26mm2, 두께 : 1mm)를 접착제로 경화, 아크릴 기반의 인스턴트 접착제 (재료 표참조)를 사용하여 하나의 긴 가장자리를 열어 둡니다. 필요에 따라 유리 커터를 사용하여 현미경 슬라이드를 줄입니다.
    주의: 유리를 절단하면 날카로운 모서리가 발생할 수 있으므로 주의해서 취급해야 합니다.
    참고 : 현미경 슬라이드는 앞면과 뒷면 사이의 스페이서 역할을하며 뿌리와 식물 크기의 두께에 따라 여러 층의 현미경 슬라이드를 서로 위에 붙일 수 있습니다.
  3. 접착된 현미경 슬라이드 사이의 공간에 맞게 필요한 모양과 크기로 평면 광도를 잘라냅니다. 코팅된 면을 위쪽으로 향하게 하여 전면 유리 판의 안쪽에 놓고, 이에 대해 누를 때 관심 있는 샘플과 접촉할 수 있도록 합니다.
  4. 유리 판에 광호 박의 한 쪽 가장자리를 테이프로 붙이고 유리 판과 광도 호일 사이에 수돗물을 몇 방울 떨어뜨립니다(그림2A). 이 물방울의 호일을 천천히 낮추어 유리 표면에 곧게 펴줍니다.
  5. 센서 코팅의 긁힘을 피하면서 부드러운 조직을 사용하여 평면 광섬유와 유리 판 사이에 갇힌 기포를 조심스럽게 제거하십시오. 유리판을 건조하게 닦고 광섬유 호일의 남은 가장자리를 유리판에 테이프로 채우십시오(그림2B).
    참고: 물 속에서 적절한 접착력이 있는 테이프를 선택해야 합니다.
  6. 0.5 mm의 메쉬 크기를 사용하여 퇴적물을 체질합니다.
    참고: 메시 크기는 스페이서 두께의 절반보다 커서는 안 됩니다.
  7. 침전물을 균등하게 분배하고 평평한 유리 판을 사용하여 현미경 슬라이드 스페이서와 동일한 두께로 조정하십시오. 두 번째 유리 판이 챔버를 제대로 밀봉할 수 있도록 현미경 슬라이드의 상부 표면을 조심스럽게 청소하십시오.
  8. 현미경 슬라이드 표면에 실리콘 그리스를 바릅니다. 조심스럽게 기포의 형성을 피하면서 얇은 물 필름으로 퇴적물을 덮습니다.
  9. 조심스럽게 Littorella uniflora의 한 번의 싹을 씻고 퇴적물 위에 놓고 식물 잎이 위쪽 열린 면에서 튀어 나와 있습니다(그림 2D).
  10. 두 번째 유리 판을 부착된 퇴적물 위에 놓고 완강압을 가하여 광섬유를 식물 뿌리와 주변 퇴적물과 밀접한 접촉을 유도합니다.
    참고: 퇴적물 속에 갇힌 기포는 유리판을 기울이면서 제거할 수 있습니다.
  11. 클램프를 사용하여 유리 판을 함께 고정합니다(그림2E). 티슈 페이퍼로 바깥쪽 가장자리를 건조시면 됩니다. 뿌리 줄기 샌드위치의 전체 조립에 걸쳐 보습 잎을 유지 (예를 들어, 물 몇 방울의 빈번한 추가에 의해).
  12. 비닐 전기 테이프를 사용하여 뿌리 줄기 샌드위치 챔버를 조입니다. 모델링 점토로 가장자리를 밀봉하고 비닐 전기 테이프로 추가로 테이프(그림 2F).
    참고 : 침전물, 또는 두 번째 유리 판 사이에 침전물, 또는 퇴적물 입자가있는 경우, 챔버는 모공 물이 누출 될 수 로 재 조립되어야한다 (반복 단계 2.4 - 2.8).
  13. 불투명 한 플라스틱을 사용 하 여 뿌리-샌드위치를 커버 하지만 식물 잎 밖으로 튀어 나뭇잎에 대 한 호 일에 슬릿을 두고. 플라스틱 호일에 창을 잘라, 그래서 그것은 전개하여 실험을 열 수 있습니다. 고무 밴드(그림 2G)를사용하여 적응 시간 동안 창을 닫아 식물이 배양되는 동안 사진 표백으로부터 광석을 보호합니다.
    참고: 조류 의 성장은 잠재적으로 측정 된O2 농도를 방해 할 수 있으므로 여과 된 물, 사전 세척 된 실험 장비를 사용하고 형성 시 조류를 제거하여 이를 최소화하는 것이 좋습니다.

3. 라이조 샌드위치 챔버 배양

  1. 뿌리 줄기 샌드위치 챔버를 물 탱크 (32 x 7 x 28cm3)에약간 기울어진 위치에 놓고 평면 장편에 대한 뿌리 성장을 장려합니다.
  2. 식물 잎을 완전히 잠수하기에 충분한 물로 물 탱크를 채웁니다.
  3. 시간 제어 램프를 사용하여 식물의 적응을 위해 14 시간 빛, 10 h 다크 사이클을 설정합니다. 공기 석재 또는 물 펌프를 탱크에 놓고 물의 폭기와 혼합을 보장합니다(그림 2H).

4. 이미징

  1. 이미징 설정
    1. 뿌리 샌드위치 챔버에서 평면 광을 덮고 있는 플라스틱 호일을 제거합니다. 수족관 벽에 optode를 똑바로 유리 벽으로 챔버를 배치합니다. 수족관 벽에 뿌리 줄기 샌드위치 챔버를 눌러 스페이서를 사용합니다.
      참고 : 수족관 벽과 뿌리 줄기 샌드위치 챔버 벽의 전체 두께가 너무 두꺼워서는 안되지만 발광 이미징을위한 아쿠아 리아 벽의 유리 두께는 산란 된 빛의 감쇠를 증가시켜 공간 크로스 토크를 줄이기 위해 > 1cm를 사용하는 것이 좋습니다. 재료 인터페이스에서 광 산란을 최소화하기 위해 두 유리 벽 (동일한 내화 지수)에 동일한 재료를 사용하는 것이 중요합니다. 이 뿐만 아니라 흐린된 이미지로 이어질 것 이다12.
    2. 수족관 앞의 목표(재료 표참조)를 갖춘 주파수 도메인 기반 발광 수명 카메라를 배치하고 관심 영역(수생 식물 의 뿌리 인 리토렐라 유니플로라,평면 광원과 직접 접촉)(그림3).
      참고: 카메라를 랩 스탠드에 배치하여 카메라를 쉽게 높이 조정할 수 있습니다. 랩 스탠드의 위치를 표시하고 고정해야 합니다. 또한 실험 중 실수로 카메라가 움직이지 않도록 랩 스탠드에 카메라를 테이프로 녹화할 수 있습니다.
    3. 표시기 염료로 PtTFPP 이미징에 적합한 방출 필터를 나사 (재료 표참조) 카메라 목표에, 여기 소스에서 추론을 제거하기 위해.
      참고: 나사 온 필터는 이상적이지만 정사각형 필터는 적절한 어댑터와 함께 사용하거나 목표에 신중하게 테이핑하여 사용할 수도 있습니다.
    4. LED 여기 소스(재료 표 참조)를 카메라의변조 및 다크 게이트 출력에 연결합니다.
      참고 : 전자는 광원에 대한 변조 신호를 전달하고 후자는 이미지 센서의 이미지 판독 중에 빛을 끕습니다. LED 여기 소스와 카메라를 컴퓨터에 연결합니다. 배경 광은 전체 방을 어둡게 하거나 전체 설정에 조밀한 검은 천을 두어 이미지 판독 중에 최소화해야 합니다. 후자의 경우, 카메라의 가열을 피하기 위해 충분한 환기를 보장하는 것이 중요하다.
    5. LED 여기 소스에 라이트 가이드를 고정하고 관심 영역을 덮는 평면 광호 호일을 균일하게 비춥히 비춥히 비춥시하도록 배치합니다.
      참고: 사용된 LED 여기 소스에서는 3개의 상이한 LED(460 nm, 528 nm, 625 nm) 사이를 전환할 수 있으며, 그 강도는 제어 소프트웨어를 통해 조정할 수 있습니다.
  2. 설정 및 카메라 작동
    참고: 설명된 실험에서는 상용 소프트웨어 패키지의 수명 이미징전용 모듈과 함께 주파수 도메인 기반 수명 카메라를 사용했습니다(재료 표참조).
    1. 사용하기 전에 선택한 소프트웨어에서 카메라를 선택하십시오.
      참고: 소프트웨어 및 카메라 드라이버는 제조업체 지침에 따라 이미징하기 전에 설치해야 합니다.
    2. (실험을 시작하기 전에 다시 설치) LED 제어 소프트웨어를 열고 대기를 똑딱하여 적합한 LED (여기 : 528 nm)를 선택합니다. 필요에 따라 LED 강도를 설정합니다(여기서는 30%). LED가 외부 TTL에 의해 트리거되었는지 확인합니다. 이 작업은 LED에 대한 아날로그 및 동기화를 똑딱으로 수행됩니다.
      참고: 레이저 전력이 너무 높으면서 표시기 또는 기준 염료의 사진 표백이 가속화될 수 있기 때문에 LED 강도를 개별적으로 조정해야 합니다.
    3. 카메라에 초점을 맞추고 수동으로 목표의 조리개를 조정합니다(본 연구에서 사용 f = 2.8).
      참고 : 수족관 유리가 아닌 평면 광에 카메라를 집중하는 것이 중요합니다. 이것은 규모에 대한 눈금자가있는 이미지를 취하고 실제 통치자가 아닌 광도의 통치자의 그림자에 초점을 맞추어 보장 할 수 있습니다.
    4. 소프트웨어의 카메라 제어판 내에서 다음 매개 변수를 설정합니다. 출력 파형에 대한 사네 파; 추가 위상 샘플링(예); 8 단계 샘플, 위상 순서 반대, 탭 A + B 판독; 5 kHz 변조 주파수.
      참고: 이러한 매개 변수는 이미지 품질에 영향을 미치며 필요한 경우 변경할 수 있습니다. 카메라 제조업체는 개별 매개 변수에 대한 지침을 제공합니다(카메라 제조업체는 소프트웨어가 업데이트될 때마다 지침및 업데이트를 발표합니다).
    5. 실험 전에 참조 이미지를 찍습니다.
      참고: 교정 표준(알려진 수명(ns 또는 μs)이 있는 발광 염료)를 이미징하거나 LED의 반사광을 사용하여 수행할 수 있습니다. 후자의 경우, 방출 긴 패스 필터는 목표에서 제거되어야 하며 알려진 수명은 1ns로 설정할 수 있습니다.
    6. 정규화된 발광 강도 이미지에 대한 ROI 통계 판독(이 패널 의 하단)이 0.68-0.72 의 범위에 도달할 때까지 전용 이미징 소프트웨어의 캘리브레이션 섹션에서 노출 시간을 조정합니다.
      참고: 이제 참조 수명(예: 1ns)이 소프트웨어에 대한 입력으로 제공됩니다.
    7. 캡처 참조를 눌러 참조 측정 계열의 수집을 시작합니다.
      참고: 완료되면 참조 데이터가 저장되고 샘플에서 단일 또는 타임랩스 측정을 수행할 수 있습니다.
  3. O2 광안의 교정
    1. 평면 O2-민감한광단조각을 (작은) 유리 수족관에 배치합니다. 앞에서 설명한 대로 교정 챔버의 유리 벽에 평면 광섬유를 고정합니다(섹션 2.3 참조). 교정 수족관을 카메라 앞에 놓습니다. LED에 의한 조명도 보장하고 광구가 전체 시야를 채웁니다.
      참고: 평면 광형은 동일한 호일 조각이거나 실제 실험에 사용된 호일과 동일한 센서 칵테일로 만들어야 합니다.
    2. 실험에 사용된 것과 동일한 액체 매체로 수족관을 채웁니다.
      참고: 교정 및 실험에 서로 다른 매체를 사용하면 측정에 영향을 미칠 수 있습니다(예: 센서 응답 및/또는O2 용해도변경). 따라서, 교정은 실제 실험과 동일한 매체, 그리고 동일한 온도에서 이루어져야 한다. 온도의 변동은 발광 신호에 영향을 미치며 피해야 합니다. 그러나 온도를 안정적으로 유지하지 못하는 경우 O2-민감한광원(다중 점)을 서로 다른(관련) 온도에서 보정하고 값의 후속 재계산을 통해 온도 보상을 수행해야 합니다.
    3. 가스 혼합 장치를 사용하여 알려진O2 농도의 공기/N2 가스 혼합물로 물을 플러시하여 보정 수족관 내의O2 농도를 조절합니다. 충분한 시간 동안 (수족관의 유량과 크기에 따라 다름)에 의해 물이 사용 된 가스 혼합물과 잘 균형을 이루는지 확인하십시오.
      참고: 온도 보상(예: 광섬유 또는전기화학O2 센서 사용)으로 외부 보정O2 센서를 사용하여 교정 수족관의O2 레벨을 모니터링하는 것이 좋습니다.
    4. 교정 챔버에서 서로 다른O2 농도에서 일련의 이미지를 가져 가라.
      참고: 획득한 교정 데이터에 적절한 곡선 맞춤을 구현하기 위해서는 최소 5개의 서로 다른O2 농도를 측정해야 합니다. 0 hPa (항산소 조건)에서 측정 한 다음 특정 표시기 염료의 동적 범위에 다른 값을 배포하는 것이 중요합니다. 여기에서 우리는 폴리스티렌 매트릭스에 고정 O2-민감한 표시염료로 PtTFPP를 사용했다. 이미지는 0, 48, 102, 156 및 207 hPa에서 촬영되었습니다. 207 hPa는 주어진 된 의 성도 및 압력에서 100 % 공기 포화에 해당합니다.
  4. 샘플 이미징
    1. 샘플을 카메라 앞에 놓고 조명도 확인합니다.
    2. 식물의 발광 수명 이미지를 획득하기 직전에 공장(및 기타 모든 광원)에 대한 조사를 공급하는 광을 끄세요. 강도 이미지에 따라 수집 시간을 조정하여 신호가 과포화되지 않고 너무 약해서 수명 결정에서 노이즈(S/N) 비율로 양호한 신호가 발생하도록 합니다.
    3. 다양한 조명 조건(예: 라이트/어둡게)에 식물을 노출시키고 이미지 세트를 획득합니다.
    4. 구조 이미지를얻기 위해 방에있는 빛을 켭타.
      참고: 배경 광이 켜져 있으면 카메라가 사실적인 수명 이미지를 측정하지 않습니다. 그러나 강도 이미지는 이제 반투명 광단을 통해 보이는 전체 시야를 보여줍니다.
    5. 뷰 필드에서 눈금자 또는 모두와 함께 이미지를 가져 가서 나중에 수집된 이미지의 배율을 조정합니다.

5. 데이터 분석

  1. 카메라 제조업체에서 제공하는 매크로를 사용하여 전용 이미징 소프트웨어에서 위상 수명 및 강도 이미지를 직접 내보냅니다.
  2. 자유롭게 사용할 수 있는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 추가 이미지 분석을 수행합니다(재료 표참조).
  3. 이미지 분석 소프트웨어에서 교정의 위상 수명 이미지를 열고 측정 기능을 사용하여 전체 이미지의 평균을 결정합니다. 알려진O2 농도에 대해 측정된 수명을 플롯하여 교정 기능을 결정합니다(도4A).
  4. 모든 데이터에서 θ0/θ를 계산합니다(θ0은 O2가없는 상태에서 측정된 위상 수명입니다). 이러한 값을 알려진O2 농도와 비교하여 플로팅합니다(그림4B).
  5. 동적 충돌 담금질(수학식 3)38,39 [Q]가O2 농도인 경우, 단순화된 2사이트 모델을 사용하여 캘리브레이션 플롯에서 Ksv 및 f 파라미터를 결정합니다. 데이터 분석 소프트웨어에서 맞춤 함수를 정의한 다음 Ksv 및 f를 결정합니다.

(3)

  1. 이미지 분석 소프트웨어에서 획득한 샘플 이미지를 열어 결정된 매개변수 Kv,f 및 θ0을사용하여 이미지수명을O2 농도로 변환합니다.
    참고: 대체 접근법으로 획득한 교정 단계 수명값(그림 4A)도직접 사용할 수 있습니다. 이 경우 곡선 맞춤 기능을 사용하는 지수 맞춤이 교정에 사용됩니다.
  2. 이미지 분석 소프트웨어에서 눈금자와 함께 이미지를 열고 측정 도구를 사용하여 알려진 거리를 측정합니다. 이 측정값을 설정 눈금 아래 전역 축척으로설정합니다.

Representative Results

새로운 이미징 시스템에 대한 적용 예로서, 우리는 복잡한 생물학적 샘플의 2DO2 이미징(즉, 수생 식물 인 리토렐라 유니플로라의근강구)를 보여준다.

첫째, 이 방법은 평면 센서 필름, 소위 평면 광당의 제작을 설명합니다. 도 1에서볼 수 있듯이, 이러한 광층은 투명 지지체 상에 확산되는 폴리머 매트릭스에서 광학 표시기의 얇은 층으로 이루어진다. 기재된 프로토콜을 따짐으로써, 나이프 코팅 장치의 갭에 의해 정의된 균일한 두께의 균일한 센서 필름이 얻어진다. 생산된 광도에 누덕성 센서 재료 분포가 있는 경우(예: 코팅의 구멍, 줄무늬 표시 또는 염료 응집체 표시)(UV 램프의 도움으로 시각적으로 평가할 수 있으며 시각적으로 평가할 수 있음) 프로토콜을 반복해야 하며 모든 재료를 아세톤을 사용하여 철저히 세척해야 합니다.

평면 광반이 준비되면, 샘플은 주변 퇴적물 매트릭스 내의 식물의 뿌리를 평면 광반에 가까운 접촉에 배치 할 수있는 뿌리 줄기 샌드위치 챔버에 통합 된 평면 optode와 여기에 도시 된 바와 같이, 평면 optode의 감지 층과 밀접한 접촉을 가져올 수있다(그림 2). 올바르게 준비하면 뿌리 줄기 샌드위치 챔버가 한 수족관 (배양)에서 다른 수족관 (측정)으로 쉽게 이동할 수 있어야합니다. 제대로 구성되지 않은 경우, 뿌리 줄기 샌드위치 챔버가 불안정 할 수 있습니다, 퇴적물을 잃거나 기포를 포함. 따라서 조립 직후 뿌리 줄기 샌드위치 챔버의 육안으로 검사하는 것이 좋습니다.

주어진 프로토콜은 주파수 도메인 기반 발광 수명 카메라를 사용하여 평면 광과 접촉하는 샘플의 주파수 도메인 기반 발광 수명 이미징을 가능하게 합니다. 이 카메라 시스템에 대한 자세한 내용은 이미지 수집 모드 및 과학적인 보완 금속 산화물 반도체(SCMOS) 카메라 특성과 같은 최근 간행물8,29에나와 있다.

설정 자체는 다소 간단하며 광원(이 경우 LED 여기 소스)을 제어하는 카메라와 광원이 있는 샘플만포함됩니다(그림 3). 모든 부품이 올바르게 연결되어 있고 샘플이 균일하게 조명되었는지 확인합니다. 측정을 미리 포고하는 동안 배경 광을 피해야 합니다.

샘플을 이미징하기 전에 광도를 교정해야 합니다. 그림 4A에서볼 수 있듯이, 측정된 발광 수명은 준지수 붕괴 에 따른O2 농도 증가와 함께 감소한다. 이러한 관계는 또한 단순화된 2사이트모델(도 4B 및 수학식 3)을 사용하여 설명될 수 있다. 주어진 예에서,O2 농도를 이후에 계산하는 데 필요한 파라미터는 다음과 같이; θ0 = 56.26 μs, Ksv = 0.032 hPa-1 및 f = 0.86.

교정을 수행하는 것도 시스템이 올바르게 작동하는지 테스트하는 이상적인 방법입니다. 여기에 설명된 대로 모든 구성 요소가 설치되는 경우(또는 제조업체 지침 내에서) 측정된 수명은 그림 4와동일한O2 종속성으로 표시되어야 합니다. 또한,O2 감지 물질(중합체 및 염료)의 동일한 조합에 대해, 측정된 θ0은 여기서 측정된 것과 동일한 범위(±몇 μs)에 있어야 한다(주로 실험 온도에 의해 영향을 됨). 유사한 교정 곡선을 얻을 수 없는 경우 모든 단계가 올바르게 수행되었는지 확인합니다. 경우에 따라 광도는 샘플이 아닌 유리 벽을 향한 민감한 면으로 실수로 고정되거나 획득된 이미지가 과다 또는 노출 부족인 경우가 있습니다.

캘리브레이션 파라미터를 사용하면 발광 수명(θ)을 이미징하여O2 농도를 결정할 수 있다. 이는 도 5A,B에서입증되었으며, 리토렐라 유니플로라의 근구에서O2 농도의 분포는 어둠 속에서 그리고 12시간 동안 500 μmol 광자m-2 s-1에 광 노출 후 각각 이미지화되었다. 식물의 광합성 활성으로 인해, 뿌리구에서의O2 농도는 빛 노출 후 증가하였다. 수명 이미지 외에도 이미징 지오메트리를 고정하면서 외부 조명아래에서 "구조적" 이미지를 획득할 수 있습니다. 이러한 방식으로,O2 이미지는 구조이미지(도5C),단면 또는 관심 영역과 정확하게 상관될 수 있다. 일례로, 단일 루트에 걸친O2 농도 프로파일은 각각 어둠과 빛에서 획득한 이미지로부터 추출되었다(도5D).

Figure 1
그림 1: 평면 O2 광언의 제작. (A)PET 호일은 유리 판에 고정되어 있으며 칼 코팅 장치는 호일에 놓입니다. (B)준비된 센서 칵테일은 칼 코팅 장치 앞의 얇은 선으로 PET 호일에 퍼진다. (C)칼 코팅 장치는 PET 호일에 박막으로 센서 칵테일을 확산하기 위해 아래쪽으로 이동, 이는 용매 증발 후 평면 광대를 사용할 준비가 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 평면O2 광안의 통합을 가진 라이조 샌드위치 챔버 어셈블리. (A)광막은 물 필름을 사용하여 유리 판 중 하나에 고정되어 있습니다. (B)편도는 전기 테이프로 플레이트에 붙어 있습니다. (C)침전소는 부착된 스페이서(즉, 현미경 슬라이드)로 반대판에 채워져 있다. (D)식물 뿌리를 퇴적물 밖으로 고르게 펴 놓습니다. (E)뿌리 줄기 샌드위치 챔버가 닫혀 일시적으로 클램프로 고정됩니다. (F)완전히 닫고 조립 된 뿌리 샌드위치 챔버. (G)인큐베이션 램프에 의한 광 노출로부터 광을 보호하고 조류 성장을 방지하기 위해 플라스틱 커버를 조립된 뿌리-샌드위치 챔버 위에 놓는다. (H)수족관에서 배양된 뿌리 샌드위치 챔버. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 투명 한 수족관 및 뿌리 샌드위치 챔버 벽을 통해 뒤에서 광과 샘플에 초점을 맞춘 주파수 도메인 기반 발광 수명 카메라를 포함하는 이미징 설정. LED 여기 소스의 라이트 가이드가 시료를 고르게 비추도록 배치됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 평면O2 광당에 대한 보정 곡선. (a)수분 충전 된 교정 챔버에서 각각의O2 농도에서 측정 된 상이한 인광 수명. (B)동적 충돌 담금질에 대한 단순화된 2사이트 모델을 사용하여 장착된 교정 데이터의 스턴-볼머 플롯(수학식 3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
도 5: 수생 식물 리토렐라 유니플로라의근구에서O2 분포의 일생 화상 진찰. (A)O2 분포는 식물을 약 500 μmol 광자m -2 s -1에서12 시간 동안 빛 아래 유지 한 후 분포. (B)O2 분포는 식물을 1시간 동안 어둠 속에 유지한후(C)평면 을 통해 보이는 식물 뿌리의 구조적 이미지이다. (D)단면O2 농도 프로파일(위치는 패널 A 및 B의 노란색 선으로 표시되어 있음) 12시간 후 빛(빨간색)과 어둠 속에서 1시간(검은색). (코렌, K., 모스해머, M., 슐츠, V., 보리소프, S.M., 홀스트, G., Kühl, M. 발광 화학 센서의 평생 이미징 - 시간 도메인 및 주파수 도메인 기반 카메라 시스템 간의 비교) 허가하에 적응. 분석 화학. 91 (5), 3233-3238, doi: 10.1021/acs.analchem.8b05869 (2019).). 저작권 (2019) 미국 화학 협회. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 프로토콜에서는 광대 준비에서O2 이미지 분석에 이르는 전체 작업 흐름이 다룹니다. 이 프로토콜을 따르면, 화학적 이미지는 새로운 주파수 도메인 기반 발광 수명 카메라를 사용하여 얻을 수 있다. 적용 용도에 따라 평면 광섬유는 센서 층의 다양한 크기와 층 두께로 제작될 수 있으며, 50-100 μm 두께의 강력한 평면 광섬유부터 현미경 커버 슬립까지 <1 μm 두께의 센서 레이어6,40을사용할 수 있습니다. 이 방법의 잠재력은 특정 적용으로 입증되었지만, 식물 뿌리구12,28에서O2 이미징에 한정되는 것은 아니다.

이 방법은 순수한 발광 강도 기반 화학 이미징 방법과 비교할 때 몇 가지 이점이 있습니다. 발광 일생 화상 진찰은, 적어도 훨씬 적게, 고르지 않은 조명, 고르지 않은 광층 두께 및 사진표백(25)에의해 영향을 받지 않는다. 또한, 이 방법은 비메트릭이미징(17,37)에서공통적인 추가 참조 염료의 사용을 방지한다. 일반적으로 사용되는 게이트 타임 도메인 카메라8,26과같은 다른 수명 기반 카메라 시스템과 비교하여 여기에 제시된 새로운 카메라 시스템 및 프로토콜은 비교 가능한 결과를 제공할 수 있습니다. 최근 발표된 바에 따르면, 이들 두 시스템의 분석 적 특성을 비교하고 주파수 도메인 기반 발광 수명 카메라 시스템은 적어도 단종된 시간 도메인 기반 전임자8과비교할 수 있는 것으로 나타났다.

우리는 폴리머 매트릭스의 표시기로만 구성된 가장 간단한O2 광언을 제시했습니다. 첨가제를 사용할 수 있는 여러 가지 가능한O2 지표(20)를 제외한, 즉 TiO2 또는 다이아몬드 파우더2와 같은 산란제는 광안의 투명성을 감소시키면서 센서 신호를 증가시키는 것이다. 또한 추가 염료는 에너지 전달41을통해 신호 강도를 향상시키기 위해 사용될 수있다.

평면 광섬유 제조의 경우, 설명된 센서 칵테일 조성물을 사용할 때 75-120 μm의 나이프 코팅 장치의 간격을 사용하여 용매 증발 후 약 7.5 ~12 μm의 최종 센서 층 두께를 산출하는 것이 좋습니다. 이는 더 높은 염료 로딩에 의해 수정될 수 있는 신호 강도 또는 더 높은 밝기의 표시기 및 참조 염료 및 응답 시간 사이에 좋은 손상입니다. 층 두께의 증가는 주위 매체와 함께 감지 층에서 열역학적 평형에 도달하는 데 필요한 시간 범위가12증가함에 따라 반응 시간의 증가를 초래한다.

여기에 설명된 바와 같이 광도는, 충분히 강한 발광 신호를 가지면서 몇초(17) 내에O2 농도의 변화에 반응한다. 스핀 코팅6을통해 초초 이하의 응답 시간을 가진 초박형 센서 코팅을 실현할 수 있습니다. 지지대 또는 나이프 코팅 장치가 잘 세척되지 않으면 센서 층이 불균일할 수 있습니다. 또한, 칵테일이 완전히 균일하지 않거나 코팅 장치 앞에 퍼진 후 너무 빠르게 도포되지 않으면 원치 않는 결과를 관찰할 수 있다. 따라서 최적의 광도를 준비하는 데 몇 가지 연습이 필요할 수 있습니다.

이 방법은 특정 해양동물(42,생물막6 및토양(31)과 같은 광단에 밀착될 수 있는 시료를 이미지화하는데 사용될 수 있다. 우리는 객관식을 사용하여 독립형 설정을 제시하지만, 카메라는 고해상도 화학이미징(43)을위해 현미경에 쉽게 결합될 수 있다.

시간 영역 기반 발광 수명 이미징이 배경 형광억제(26)를가능하게 하는 반면, 이것은 새로운 주파수 도메인 기반 카메라 시스템8을사용할 때 문제가 된다. 연속 이미지 수집으로 인해 이 카메라는 선택한 LED에 의해 흥분될 수 있는 샘플의 배경 형광을 기록하고 카메라 대물렌즈의 방출 필터에 정의된 대로 선택한 스펙트럼 창에서 방출합니다. 이렇게 하면 수명이 분명히 낮아지고 결과적으로 잘못된 판독이 발생합니다. O2 센서 여기 및 방출과 중첩되는 상당한 본질형 형광을 가진 시료로 작업하는 경우, 카본 블랙2,17을포함하는 추가 층을 코팅하여 광도 위에 추가 광학 절연을 적용하는 것이 필수적이다. 따라서 평면 광당에서 방출된 발광만 카메라에 도달합니다. 배경 발광을 확인하기 위해 광도없이 이미지를 촬영 할 수 있습니다, 이는 독점적으로 샘플의 본질적인 발광을 표시 할 것이다. 또한 TiO2 또는 다이아몬드 파우더2,44와같은 산란제를 센서 칵테일에 첨가하여 표시기 염료의 발광 강도를 높일 수 있습니다. 그러나, 이것은 또한 더 빠른 사진 표백으로 이어질 수 있고 TiO2는 염료(41)의광안정성을 손상시킬 수 있는 공지된 광 촉매이다. 고려해야 할 또 다른 측면은 배경 라이트입니다. 발광 수명을 이미징할 때 배경 광은 가능한 한 효율적으로 피해야 합니다. 따라서 이 이미징 방법은 어두운 환경에 설치해야 하며 이미지 수집 중에 외부 광원을 일시적으로 꺼야 합니다.

요약하면, 발광 수명 화상 진찰은 많은 다른 응용에 적응될 수 있는 강력한 화학 화상 진찰 방법입니다. 이 프로토콜(섹션 1 - 5 참조)은O2 이미지를 생성하는 모든 필수 단계를 다루며 현재 가장 유연한 주파수 영역 발광 수명 이미징 시스템을 사용하여 단종된 게이트 타임 도메인 카메라를 2D O2 이미징용 평면 광활수로 대체할 수 있습니다.

Disclosures

저자 게르하르트 홀스트는이 문서에 사용되는 카메라 시스템을 제조 PCO AG의 직원입니다. PCO AG는 이 문서의 게시 및 공개 액세스 비용에 재정적으로 기여했습니다.

Acknowledgments

우리는 기술 지원을 위해 소피 린데가르드 야콥센 (코펜하겐 대학)과 라스 보레가드 페데르센 (오르후스 대학)에 감사드립니다. 이 연구를 위한 자금조달은 독립적인 연구 기금 덴마크 (DFF-1323-00065B)에서 Sapere-Aude 고급 교부금에서 얻어졌습니다; MK), 덴마크 독립연구기금 프로젝트 보조금 | 자연 과학 (DFF-8021-00308B; MK) 및 기술 및 생산 과학 (DFF-8022-00301B 및 DFF-4184-00515B; MK), 덴마크 국립 연구 재단 (DNRF136), 그리고 폴 듀 젠슨 재단 (KK).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air pump with air stone and water pump Local aquarium store
Chloroform Sigma Aldrich 67-66-3
DC4 silicone compound Dow Corning GmbH 2793695
Gas mixer Vögtlin Instruments GmbH red-y compact meter GCM This is just one possible instrument. Several companies offer gas mixing devices
Glass plates and aquaria Local aquarium or hardware store
ImageJ Software ImageJ Freely available imaging software (imagej.nih.gov/ij/index.html)
Knife-coating device

BYK-GARDNER GMBH byk.com		 2021 This is a four sided film applicator enabling easy variation of the film thickness. Other versions are also available. We recommend a thickness of the applied film between 75-120 µm, which yields a final sensor layer thickness of ~10% of the applied thickness before solvent evaporation.
LED lamp, Reflector PAR38 Megaman MM17572
LED LEDHUB Omicon Laserage, Germany Can be configured with a variety of LEDs. For the presented example, the green LED (528 nm) is essential
LOCTITE AA 3494 Henkel AG & Co. KGaA NA Acrylic-based instant adhesive
NIS Elements AR Software Nikon Inc Software package used for image acquisition
pco.flim PCO AG, Germany Frequency domain based luminescence lifetime camera
platinum(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentafluorphenyl)-porphyrin (PtTFPP) Frontier Scientific PtT975 O2 indicator
polyethylene terephthalate (PET) foil Goodfellow 320-992-72 Such foils might also be found from other providers and serve as solid support
Polystyrene (PS) Sigma Aldrich 9003-53-6 Polymer matrix
Schott RG610 filter www.uviroptics.com Here 52mm screw on Filters can obtained. Other sources offer square glass filters from Schott glass that can be fixed in front of the objective
Vinyl electrical tape Scotch, Super 33+ NA
Zeiss Makro Planar 2/100 with Hama C for Nikon adaptor delivered with the camera Here any other objective might also be used in combination with an adaptor if the objective does not have a C-mount

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Moßhammer, M., Scholz, V. V., Holst, G., Kühl, M., Koren, K. Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System. J. Vis. Exp. (154), e60191, doi:10.3791/60191 (2019).

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